CN109453170A - NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用 - Google Patents

NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用 Download PDF

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CN109453170A CN201811503816.0A CN201811503816A CN109453170A CN 109453170 A CN109453170 A CN 109453170A CN 201811503816 A CN201811503816 A CN 201811503816A CN 109453170 A CN109453170 A CN 109453170A
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Abstract

本发明公开了一种NF‑κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用，包括用于治疗肺癌的药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的活性成分和药用辅料，所述活性成分至少含有化合物6d、化合物7d和化合物13d三种NF‑κB抑制剂中的其中一种，通过抑制NF‑κB通路诱导细胞凋亡及焦亡治疗肺癌。通过对EF24骨架上的N基团进行修饰，发现了多个高效的NF‑κB抑制剂，其中活性化合物13d的毒性明显低于EF24。通过对活性化合物13d的抗肺癌机制进行研究，发现活性化合物13d能通过抑制NF‑κB信号通路诱导细胞凋亡及焦亡达到很好的抗肺癌作用，NF‑κB抑制剂13d有望成为高效低毒的抗肺癌靶向治疗药物。

Description

NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用。
背景技术
靶向药物由于能部分克服化疗药物的缺陷，具有高效低毒的治疗优势，成为目前抗肿瘤研究的热点。NF-κB信号通路被报道能在肺癌细胞中持续激活，异常激活的NF-κB通路参与肺癌的发生发展。NF-κB有望成为肺癌治疗的有效靶点。
EF24是目前用于抗肿瘤研究的“明星药物”。EF24也被报道能抑制NF-κB激活，诱导细胞凋亡从而发挥抗肿瘤作用。但EF24具有较大的毒性，这可能是EF24临床发展受限的因素之一。
因此，寻找高效低毒的NF-κB抑制剂具有重要的研究价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物的应用，通过抑制NF-κB信号通路诱导细胞凋亡及焦亡达到很好的抗肺癌作用，且高效低毒。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用，包括用于治疗肺癌的药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的活性成分和药用辅料，所述活性成分至少含有化合物6d、化合物7d和化合物13d三种NF-κB抑制剂中的其中一种，通过抑制NF-κB通路诱导细胞凋亡及焦亡治疗肺癌；三种NF-κB抑制剂的结构如下式所示：
其中，化合物6d的分子式为C28H21F2NO2；
化学名称为：1-cinnamoyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one；
其中，化合物7d的分子式为C26H21F2NO；
化学名称为：1-benzyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one；
其中，化合物13d的分子式为C20H17F2NO；
化学名称为：3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-methylpiperidin-4-one。
所述药用辅料包括稀释剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和着色剂；各药用辅料具体如下：
稀释剂：淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素或磷酸钙；
润湿剂：蒸馏水或乙醇；
粘合剂：淀粉浆、纤维素衍生物、聚维酮、明胶、聚乙二醇或海藻酸钠溶液；
崩解剂：干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羌丙基纤维素或泡腾崩解剂；
润滑剂：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类或十二烷基硫酸钠；
着色剂：二氧化钛、日落黄、亚甲蓝或药用氧化铁红。
所述药物组合物的活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成颗粒剂、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释、缓释剂或纳米制剂。
所述化合物13d对肺癌细胞株H460、A549及H1975肺癌细胞株均具有体外抑制活性，且对正常细胞株HL7702表现出低于EF24的体外抑制活性；化合物13d的毒性低于EF24。
所述化合物13d具备浓度依赖及时间依赖性的抑制细胞活性。
所述药物组合物的活性成分同时含有所述化合物6d、化合物7d和化合物13d三种NF-κB抑制剂中的任何一种或多种。
本发明的优点是：通过对EF24骨架上的N基团进行修饰，从大量的化合物中获得了特定的化合物，发现了多个高效的NF-κB抑制剂，其中活性化合物13d的毒性明显低于EF24。
此外，通过对活性化合物13d的抗肺癌机制进行研究，发现活性化合物13d能通过抑制NF-κB信号通路诱导细胞凋亡及焦亡达到很好的抗肺癌作用，
NF-κB抑制剂13d有望成为高效低毒的抗肺癌靶向治疗药物。
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明实施例NF-κB抑制剂的合成示意图；
图2为本发明实施例活性化合物筛选的实验示意图；
图3为本发明实施例化合物13d抗肿瘤活性和毒性的实验示意图；
图4为本发明实施例化合物13d诱导细胞周期停滞，细胞凋亡和细胞焦亡的实验示意图；
图5为本发明实施例化合物13d通过抑制NF-κB信号通路诱导细胞凋亡和细胞焦亡的实验示意图；
图6为本发明实施例化合物13d体内抗肺癌活性的实验示意图；
图7为本发明实施例化合物13d抗肿瘤机制的示意图。
具体实施方式
参见图1至图7，本发明公开的一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用，提供一种用于治疗肺癌的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的所述的NF-κB抑制剂中的任何一种或多种或其可药用盐及其药用辅料。
从多种NF-κB抑制剂中筛选出了高效低毒的活性化合物。研究了活性化合物发挥抗肺癌作用的分子机制。活性化合物能抑制NF-κB通路诱导细胞凋亡和焦亡发挥抗肺癌作用。
具体而言，本发明设计合成三种NF-κB抑制剂(化合物6d、化合物7d、化合物13d)，及其它对照化合物结构如下：
其中，化合物1d的分子式为C25H25F2NO2，
化学名称为：
1-(2,2-dimethylbutanoyl)-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one。
化合物2d的分子式为C23H19F2NO2，
化学名称为：
1-(cyclopropanecarbonyl)-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one。
化合物3d的分子式为C24H21F2NO2，
化学名称为：
3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-(3-methylbut-2-enoyl)piperidin-4-one。
化合物4d的分子式为C22H19F2NO，
化学名称为：1-cyclopropyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one。
化合物5d的分子式为C22H18BrF2NO2，
化学名称为：
1-(3-bromopropanoyl)-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one。
化合物6d的分子式为C28H21F2NO2，
化学名称为：1-cinnamoyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one。
化合物7d的分子式为C26H21F2NO，
化学名称为：1-benzyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one。
化合物8d的分子式为C24H23F2NO2，
化学名称为：3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-pivaloylpiperidin-4-one(8d)。
化合物9d的分子式为C23H19F2NO2，
化学名称为：
1-((E)-but-2-enoyl)-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(9d)。
化合物10d的分子式为C23H21F2NO2，
化学名称为：1-butyryl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one。
化合物11d的分子式为C23H21F2NO2，
化学名称为：1-butyryl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one。
化合物12d的分子式为C21H19F2NO，
化学名称为1-ethyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one。
化合物13d的分子式为C20H17F2NO，
化学名称为3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-methylpiperidin-4-one。
化合物14d的分子式为C22H19F2NO2，
化学名称为3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-propionylpiperidin-4-one。
实验结果表明，同其它化合物(化合物1d，化合物2d，化合物3d，化合物4d，化合物5d，化合物8d，化合物9d，化合物10d，化合物11d，化合物12d)和阳性对照药EF24相比，化合物6d、化合物7d和化合物13d具有较好的NF-κB抑制活性，且对肺癌细胞株H460具有较好的体外抑制活性。尤其化合物13d表现相对最佳的NF-κB抑制活性和细胞体外抑制活性。
此外，进一步的MTT实验结果表明化合物13d对多种肺癌细胞株H460、A549及H1975均具有较好的体外抑制活性，且对正常细胞株HL7702表现出低于EF24的体外抑制活性。急毒实验也表明化合物13d毒性低且优于EF24。同时，集落克隆及MTT实验表明化合物13d能浓度依赖及时间依赖性的抑制细胞活性。
同时，细胞周期实验发现用化合物13d处理的H460细胞可以使G2/M期的DNA含量增加，即L61H10可以阻滞G2/M期。Western blot实验发现化合物13d能浓度依赖性的抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，诱导促凋亡蛋白Bax的表达，说明化合物13d能诱导凋亡的发生。此外，化合物13d能诱导细胞焦亡的形态学变化。
接着，通过western blot实验发现化合物13d能浓度依赖性的抑制IκBα的降解，进一步说明了化合物13d具有NF-κB抑制活性。
此外，通过MTT检测发现H460细胞高表达IKKβ后，化合物13d对其抑制活性会明显削弱，这说明L61H10确实能通过抑制NF-κB通路发挥抗肺癌作用。进一步地，通过westernblot实验发现，在高表达IKKβ的H460细胞系中，由化合物13d诱导的Cle-PARP的表达明显弱于对照组。且高表达IKKβ后，化合物13d诱导的细胞焦亡明显减弱。
以上结果表明化合物13d能通过抑制NF-κB通路诱导细胞凋亡和焦亡发挥抗肺癌作用。
此外，在移植瘤小鼠模型中，化合物13d能明显抑制肿瘤的生长，且对小鼠体重没有明显的影响。
综上所述，我们的研究结果表明，化合物13d不仅毒性较低，且能通过抑制NF-κB通路诱导细胞凋亡及焦亡发挥抗肺癌作用，具有开发为抗肺癌药物的前景。
因此，作为优选，本发明提供了一种高效低毒的NF-κB抑制剂13d在制备抗肺癌药物中的应用，抗肺癌药物通过抑制NF-κB通路诱导细胞凋亡及焦亡而发挥治疗肺癌的作用。
本发明还提供了一种用于治疗肺癌的药物组合物，其含有治疗有效量的活性成分和药用辅料，所述活性成分至少含有以上所述三种NF-κB抑制剂或其可药用盐及其药用辅料。作为优选，所述的活性成分同时含有所述三种NF-κB抑制剂中的任何一种或多种。
本发明中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素、磷酸钙等；润湿剂如蒸馏水、乙醇；粘合剂如淀粉浆、纤维素衍生物、聚维酮、明胶、聚乙二醇、海藻酸钠溶液等；崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羌丙基纤维素、泡腾崩解剂等；润滑剂如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、十二烷基硫酸钠等；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括颗粒剂、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
下面参见附图1至7，对本发明的技术方案进行更详细的说明：
图1：NF-κB抑制剂的合成路径和条件。
图2：活性化合物的筛选。(A)化合物对NF-κB系统的抑制活性表示为平均荧光强度(MFI)。在该实验中使用的化合物浓度均为10μM。(B)化合物对肺癌细胞的半数生长抑制浓度(IC50)值。
图3：化合物13d的抗肿瘤活性和毒性。(A)使用MTT测定法测定13d和EF24作用72小时后对肺癌细胞株H460、A549、H1975和正常细胞株HL7702的细胞毒性。(B)空白组(6％蓖麻油)，13d(0.1g/kg)和EF24(0.1g/kg)对BALB/C小鼠体重的影响。(C)13d对集落形成的影响。(D)分别经13d和EF24作用12h，24h，48h，和72h后，通过MTT测定法检测细胞存活率。
图4：13d诱导细胞周期停滞，细胞凋亡和细胞焦亡。(A)使用流式细胞术检测13d在细胞周期中的作用。计算并分析G1/G0，S，G2/M的频率分布和G2/M的DNA含量。(B)通过western blot分析13d对Bcl-2，Bax的表达的影响，BMS345541为阳性对照。(C)在13d(10μM)或顺铂(Pt，20μM)作用28小时后观察细胞焦亡的形态，选择Pt作为阳性对照。*p<0.05,**p<0.01,and***p<0.001vs DMSO group.
图5：13d通过抑制NF-κB信号通路诱导细胞凋亡和细胞焦亡。(A)H460细胞与13d(5,10,20μM)或BMS345541(20μM)预孵育，2小时后用TNF-α刺激15分钟。Western blot检测IкBα的表达。(B)用质粒IKKβ-lip2000复合物(2ng/mL)转染H460细胞。通过western blot证实转染效果。(C)13d(20,6.67,2.22μM)作用于转染有IKKβ-lip2000复合物及单lip2000转染的H460细胞72小时。通过MTT测定确定13d对细胞活力的影响。(D)通过western blot实验检测13d对转染组，非转染组和模拟载体组24小时后凋亡相关蛋白(Cle-PARP)表达的影响。(E)与质粒IKKβ转染组和非药物组相比，空白载体转染组中13d(10μM)能明显诱导焦亡的产生。*p<0.05,**p<0.01,and***p<0.001vs control.#p<0.05,##p<0.01,and###p<0.001relative to(DMSO+TNFα)or(NC+13d)..
图6：13d体内抗肺癌活性。(A-B)空白组及药物组对BALB/c裸鼠肿瘤体积和肿瘤重量的影响。(C)空白组和药物组裸鼠体重变化。***p<0.001vs vehicle group.
图7：13d抗肿瘤机制的示意图。
实验1
化合物的合成：
(1)化合物EF24的一般合成步骤
在搅拌状态下，将4-哌啶酮盐酸盐水合物(5.0mmol)和2-氟苯甲醛(10.0mmol)溶于乙醇和水(10:1)的混合溶剂中，滴加40％NaOH水溶液催化。在室温下搅拌12小时，期间有沉淀生成。过滤并用水洗涤后，用乙醇重结晶，得到所需产物。
(2)化合物1d-14d的一般合成步骤
在搅拌状态下，将NaH(60％矿物油分散液，2.0mmol)加入于冰浴中冷却的EF24(2.0mmol)的无水THF(10.0mL)溶液中。所得混合物在室温条件下搅拌30分钟后，滴加含不同酰氯(3.0mmol)的无水THF(3.0mL)溶液。待完全反应后，减压蒸发。粗产物通过硅胶色谱纯化，使用己烷和乙酸乙酯的流动相梯度洗脱，纯化获得所需产物1d-14d。
1d-14d的理化性质如下所述：
对比化合物：1-(2,2-dimethylbutanoyl)-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(1d):yellow powder,58.6％yield,mp 120.5～121.6℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.958(s,2H,α-H×2),7.441～7.373(m,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.242(t,J＝14.4Hz,2H,Ar-H4×2),7.177(t,J＝18.0Hz,2H,Ar-H5×2),4.796(s,4H,CCH2N×2),1.315～1.278(m,2H,γ-CH2),1.027(s,6H,β-CH3×2),0.703(t,J＝15.0Hz,3H,CH3).LC-MSm/z:410.26(M+H)+,calcd for C25H25F2NO2:409.19.
对比化合物：1-(cyclopropanecarbonyl)-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(2d):yellow powder,49.5％yield,mp 120.0～121.6℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.927(s,2H,α-H×2),7.422(s,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.235(s,2H,Ar-H4×2),7.179(s,2H,Ar-H5×2),4.820(s,4H,CCH2N×2),1.468～1.426(m,1H,CH),0.914～0.876(m,2H,CH2),0.648～0.606(m,2H,CH2).LC-MS m/z:380.18(M+H)+,calcd forC23H19F2NO2:379.14.
对比化合物：3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-(3-methylbut-2-enoyl)piperidin-4-one(3d):yellow powder,61.5％yield,mp 104.6～106.8℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.938(s,1H,α-H),7.828(s,1H,α’-H),7.404(s,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.221(s,2H,Ar-H4×2),7.165(d,J＝10.2Hz,2H,Ar-H5×2),3.451(s,1H,β-H),3.737～3.702(m,4H,CCH2N×2),1.735(s,3H,CH3),1.508(s,3H,CH3).LC-MS m/z:394.08(M+H)+,calcd for C24H21F2NO2:393.15.
对比化合物：1-cyclopropyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(4d):yellow powder,60.3％yield,mp 142.6～143.5℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.909(s,2H,α-H×2),7.415～7.345(m,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.229(t,J＝15.0Hz,2H,Ar-H4×2),7.161(t,J＝18.6Hz,2H,Ar-H5×2),3.891(s,4H,CCH2N×2),1.944～1.910(m,1H,CH),0.489～0.460(m,2H,CH2),0.396～0.373(m,2H,CH2).LC-MS m/z:352.18(M+H)+,calcd for C22H19F2NO:351.14.
对比化合物：1-(3-bromopropanoyl)-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(5d):yellow powder,49.5％yield,mp 106.0～108.3℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.910(d,J＝32.4Hz,2H,α-H×2),7.459-7.375(m,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.206(t,J＝18.6Hz,2H,Ar-H4×2),7.136(t,J＝18.0Hz,2H,Ar-H5×2),3.732-3.708(m,4H,CCH2N×2),2.970(t,J＝13.2Hz,2H,γ-CH2),2.706(t,J＝13.8Hz,2H,β-CH2).LC-MSm/z:445.89(M+H)+,calcd for C22H18BrF2NO2:445.05.
有效化合物：1-cinnamoyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(6d):yellow powder,56.8％yield,mp 155.0～157.3℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.506(d,J＝15.6Hz,2H,α-H×2),7.434(brs,4H,Ar’-H3,Ar’-H4,Ar’-H5,γ-H),7.306(t,J＝14.4Hz,2H,Ar’-H2,Ar’-H6),7.256(t,J＝4.8Hz,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.177(brs,2H,Ar-H4×2),7.111(d,J＝7.2Hz,2H,Ar-H5×2),6.410(d,J＝15.6Hz,1H,β-H),3.738～3.703(m,4H,CCH2N×2).LC-MS m/z:442.23(M+H)+,calcd for C28H21F2NO2:441.15.
有效化合物：1-benzyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(7d):yellow powder,59.2％yield,mp 146.0～147.9℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.910(s,2H,α-H×2),7.339～7.290(m,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.191～7.166(m,5H,Ar’-H×5),7.119～7.078(m,4H,Ar-H4×2,Ar-H5×2),3.740～3.705(m,4H,CCH2N×2),3.645(s,2H,Ar-CH2-N).LC-MS m/z:402.10(M+H)+,calcd for C26H21F2NO:401.16.
对比化合物：3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-pivaloylpiperidin-4-one(8d):yellow powder,52.6％yield,mp 137.0～138.2℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.939(s,2H,α-H×2),7.409～7.351(m,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.218(t,J＝15.0Hz,2H,Ar-H4×2),7.153(t,J＝18.6Hz,2H,Ar-H5×2),3.738～3.703(m,4H,CCH2N×2),1.253～1.168(m,9H,CH3×3).LC-MS m/z:396.16(M+H)+,calcd for C24H23F2NO2:395.17.
对比化合物：1-((E)-but-2-enoyl)-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(9d):yellow powder,56.3％yield,mp 147.9～149.5℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.942(s,2H,α-H×2),7.445～7.411(m,2H,Ar-H6×2),7.354(d,2H,J＝6.0Hz,2H,Ar-H3×2),7.236(t,J＝14.4Hz,2H,Ar-H4×2),7.173(t,J＝18.6Hz,2H,Ar-H5×2),4.918(s,1H,γ-H),4.864(s,1H,β-H),4.747(s,4H,CCH2N×2),1.628(s,3H,CH3).LC-MSm/z:380.24(M+H)+,calcd for C23H19F2NO2:379.41.
对比化合物：1-butyryl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(10d):yellow powder,58.9％yield,mp 129.6～132.0℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.906(s,2H,α-H×2),7.435(s,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.257(s,2H,Ar-H4×2),7.188(s,2H,Ar-H5×2),4.867～4.644(m,4H,CCH2N×2),1.697～1.625(m,7H,CH2CH2CH3).LC-MS m/z:381.15.(M+H)+,calcd for C23H21F2NO2:380.18.
对比化合物：1-butyryl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(11d):yellow powder,54.4％yield,mp 121.0～123.5℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.950(s,1H,α-H),7.892(s,1H,α-H),7.459(s,2H,Ar-H6×2),7.403(s,2H,Ar-H3×2),7.238～7.201(m,2H,Ar-H4×2),7.152(t,J＝18.0Hz,2H,Ar-H5×2),4.825(s,2H,CCH2N),4.576(s,2H,CCH2N),2.101(t,J＝15.0Hz,2H,β-CH2),1.532～1.470(m,2H,γ-CH2),0.770(t,J＝14.4Hz,3H,CH3).LC-MS m/z:382.07(M+H)+,calcd for C23H21F2NO2:381.15.
对比化合物：1-ethyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one(12d):yellow powder,57.6％yield,mp 136.7～137.6℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.928(s,2H,α-H×2),7.405～7.393(m,2H,Ar-H6×2),7.336～7.311(m,2H,Ar-H3×2),7.212(t,J＝15.0Hz,2H,Ar-H4×2),7.153(t,J＝18.6Hz,2H,Ar-H5×2),3.739(s,4H,CCH2N×2),2.603～2.567(m,2H,NCH2),1.033(t,J＝13.8Hz,3H,CH3).LC-MS m/z:340.17(M+H)+,calcdfor C21H19F2NO:339.14.
有效化合物：3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-methylpiperidin-4-one(13d):yellow powder,54.9％yield,mp 137.5～138.6℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.899(s,2H,α-H×2),7.383～7.346(m,2H,Ar-H6×2),7.294(t,J＝13.2Hz,2H,Ar-H3×2),7.188(t,J＝15.0Hz,2H,Ar-H4×2),7.131(t,J＝18.6Hz,2H,Ar-H5×2),7.737(m,4H,CCH2N×2),2.406(s,3H,NCH3).LC-MS m/z:326.14(M+H)+,calcd for C20H17F2NO:325.13.
对比化合物：3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-propionylpiperidin-4-one(14d):yellow powder,55.8％yield,mp 129.7～132.1℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:7.947(s,1H,α-H),7.901(s,1H,α’-H),7.462～7.399(m,4H,Ar-H6×2,Ar-H3×2),7.241～7.196(m,2H,Ar-H4×2),7.153(t,J＝18.0Hz,2H,Ar-H5×2),4.827(s,2H,CCH2N),4.589(s,2H,CCH2N),2.183～2.146(m,2H,β-CH2),1.015(t,J＝15.0Hz,3H,CH3).LC-MS m/z:368.10(M+H)+,calcd for C22H19F2NO2:367.14.
实验2
NF-κB抑制剂对NF-κB体系的抑制活性及对肺癌细胞的体外抑制活性：
通过流式细胞术及MTT实验检测化合物对NF-κB体系的抑制活性及对肺癌细胞的体外抑制活性。实验结果见图2。其中(A)的操作步骤为将RAW264.7-NFκB-RE-EGFP细胞(3×105个细胞/孔)接种在6孔板中。待其贴壁后加药处理，药物浓度均为10μM。2小时后将LPS(0.5μg/mL)加入培养基中作用6小时，使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences，CA)检测绿色荧光蛋白的水平。(B)的操作步骤为将H460细胞以每孔3000个细胞接种在96孔板中24小时。当肺癌细胞与不同浓度的化合物(60，20，20/3，20/9，20/27，20/81μM)孵育72小时后，将磷酸盐缓冲溶液(PBS)制备的MTT溶液(5mg/mL)在37℃下加入各孔中的细胞，再处理4小时。然后吸出MTT，每孔加入150μL DMSO，震动10分钟，最后在490nm纳米波长下用酶标仪定量(SpectraMax M2/M2e，Molecular Devices，Sunnyvale，USA)测定OD值。通过与溶剂组的比较来计算药物生长抑制率的百分比。通过GraphPad Pro 5.0计算每个化合物的IC50值(San Diego,CA)。
实验3
化合物13d的体外抗肿瘤活性及毒性：
通过MTT、集落克隆实验评估13d的体外抗肿瘤活性，并通过急毒实验评估13d的毒性。实验结果见图3。将H460，A549，H1975和HL7702细胞以每孔3000个细胞接种在96孔板中72小时。肺癌细胞和正常细胞与化合物13d以不同浓度孵育72小时后，将磷酸盐缓冲溶液(PBS)制备的MTT溶液(5mg/mL)在37℃下加入各孔中的细胞，再处理4小时。然后吸出MTT，每孔加入150μL DMSO，震动10分钟，最后在490nm纳米波长下用酶标仪定量(SpectraMax M2/M2e，Molecular Devices，Sunnyvale，USA)测定OD值。通过与溶剂组的比较来计算药物生长抑制率的百分比。通过GraphPad Pro 5.0计算每个化合物的IC50值(San Diego,CA)，结果见图3A。图3B表示13d具有优于EF24的毒性。实验步骤为将BALB/C小鼠随机分成三组，每组六只小鼠。通过腹腔注射给予所有小鼠相同体积的药物后，密切观察小鼠的体重变化。图3C结果表示13d能浓度依赖性的抑制集落的生长。实验步骤如下：将H460细胞(每2mL培养基1000个细胞)铺在6孔板中并使其粘附过夜。隔天用不同浓度的13d与细胞进行孵育。24小时后，用常规生长培养基替换含有药物的培养基。继续培养细胞14天后，除去培养基，用PBS洗涤细胞，以4％多聚甲醛固定，结晶紫染色。图3D表示药物(13d，EF24)作用不同时间(12h,24h，48h，72h)后对细胞活性的影响。
实验4
化合物13d处理H460细胞使G2/M期阻滞并诱导细胞凋亡和焦亡：
H460接种于6孔板中，检测13d对细胞周期，细胞凋亡及细胞焦亡的影响，结果见图4。其中图4A表示13d对细胞周期的影响。实验步骤如下：将H460细胞(6×105个细胞/孔)接种在直径为60mm的培养皿中。经13d及载体(DMSO)处理细胞20小时后，用PBS洗涤，固定在75％冰冷的乙醇中过夜。然后将细胞用含有核糖核酸酶(550825，BD Biosciences35Clontech，San Jose，CA，USA)的500μL碘化丙啶(PI)在4℃远离光线染色10分钟，并用200目纱布过滤。在FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences，CA)中进行细胞周期分析。图4B表示13d对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。图4C表示13d对细胞焦亡形态学的影响。
实验5
化合物13d可以抑制NF-κB信号通路诱导细胞凋亡及焦亡：
将H460细胞接种在6孔组织培养板上，经13d处理转染有IKKβ-载体复合物及空载体的H460细胞，检测高表达IKKβ后L61H10对细胞凋亡及焦亡的影响。机制图见图7。其中，细胞转染实验过程如下：将H460细胞以3×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中，在开始转染时，将原培养基弃掉，换成饥饿培养基进行培养。将IKKβ质粒及空载体(lipofectamine2000)分别置于饥饿培养基中静置5分钟，然后将IKKβ质粒和空载体混合静置20分钟，最后将IKKβ-载体复合物及空载体转入细胞，在37℃含5％CO2的培养箱中培养6小时。6小时后，弃原培养基，换成正常培养基继续培养12小时。结果见图5，其中(A)表示13d抑制IкBα降解的效果。(B)表示IKKβ质粒的转染效率。(C)表示13d分别对转染有IKKβ-载体复合物及空载体的H460细胞生存率的影响。(D)表示13d分别对转染有IKKβ-载体复合物及空载体的H460细胞中凋亡相关蛋白表达的影响。(E)表示13d分别对转染有IKKβ-载体复合物及空载体的H460细胞焦亡形态学变化的影响。
实验6
化合物13d的体内抗肿瘤效果：
雌性BALB/c裸鼠(18-22g)购自SLRC Laboratory Animal LLC(中国上海)。将H460细胞皮下注射到小鼠右侧腹股沟处(2×106个细胞/100μLPBS)。一旦肿瘤体积达到100-200mm3，小鼠腹腔注射L61H10(药物溶解在6％蓖麻油中)，剂量为3mg/kg/day，对照组小鼠腹腔注射6％蓖麻油(每组n＝8)。使用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度。使用V＝0.52×L×W2公式计算肿瘤体积。每周记录小鼠的体重，并在小鼠死亡当天记录肿瘤大小。结果见图6。其中(A)表示肿瘤的体积。(B)表示肿瘤的大小。(C)表示小鼠的体重变化。
本发明通过对EF24骨架上的N基团进行修饰，从大量的化合物中获得了特定的化合物，发现了多个高效的NF-κB抑制剂，其中活性化合物13d的毒性明显低于EF24。
此外，通过对活性化合物13d的抗肺癌机制进行研究，发现活性化合物13d能通过抑制NF-κB信号通路诱导细胞凋亡及焦亡达到很好的抗肺癌作用，
NF-κB抑制剂13d有望成为高效低毒的抗肺癌靶向治疗药物。
上述实施例对本发明的具体描述，只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，本领域的技术工程师根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整均落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用，包括用于治疗肺癌的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含有治疗有效量的活性成分和药用辅料，所述活性成分至少含有化合物6d、化合物7d和化合物13d三种NF-κB抑制剂中的其中一种，通过抑制NF-κB通路诱导细胞凋亡及焦亡治疗肺癌；三种NF-κB抑制剂的结构如下式所示：
其中，化合物6d的分子式为C28H21F2NO2；
化学名称为：1-cinnamoyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one；
其中，化合物7d的分子式为C26H21F2NO；
化学名称为：1-benzyl-3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)piperidin-4-one；
其中，化合物13d的分子式为C20H17F2NO；
化学名称为：3,5-bis((E)-2-fluorobenzylidene)-1-methylpiperidin-4-one。
2.根据权利要求1所述的一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述药用辅料包括稀释剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂和着色剂；各药用辅料具体如下：
稀释剂：淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素或磷酸钙；
润湿剂：蒸馏水或乙醇；
粘合剂：淀粉浆、纤维素衍生物、聚维酮、明胶、聚乙二醇或海藻酸钠溶液；
崩解剂：干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羌丙基纤维素或泡腾崩解剂；
润滑剂：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类或十二烷基硫酸钠；
着色剂：二氧化钛、日落黄、亚甲蓝或药用氧化铁红。
3.根据权利要求1所述的一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述药物组合物的活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成颗粒剂、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释、缓释剂或纳米制剂。
4.根据权利要求1所述的一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述化合物13d对肺癌细胞株H460、A549及H1975肺癌细胞株均具有体外抑制活性，且对正常细胞株HL7702表现出低于EF24的体外抑制活性；化合物13d的毒性低且EF24。
5.根据权利要求1所述的一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述化合物13d具备浓度依赖及时间依赖性的抑制细胞活性。
6.根据权利要求1所述的一种NF-κB抑制剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述药物组合物的活性成分同时含有所述化合物6d、化合物7d和化合物13d三种NF-κB抑制剂中的任何一种或多种。
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