CN109091472B - 含α,β不饱和酮的查尔酮类似物在制备抗肺癌药物中的应用 - Google Patents

含α,β不饱和酮的查尔酮类似物在制备抗肺癌药物中的应用 Download PDF

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CN109091472B CN201811004444.7A CN201811004444A CN109091472B CN 109091472 B CN109091472 B CN 109091472B CN 201811004444 A CN201811004444 A CN 201811004444A CN 109091472 B CN109091472 B CN 109091472B
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Abstract

本发明属药物化学领域，具体涉及含α,β不饱和酮的查尔酮类似物在制备抗肺癌药物中的应用，这些查尔酮类似物具有很好的抑制肺癌细胞NCI‑H460、A549和H1975生长的活性。其中，化合物8表现出最佳的抗肿瘤活性，其在NCI‑H460、A549和H1975细胞上的IC50值分别为2.3±0.3，3.2±0.0和5.7±1.4μM，可以通过诱导肿瘤细胞ROS的产生起到抗肿瘤作用。

Description

含α,β不饱和酮的查尔酮类似物在制备抗肺癌药物中的应用
技术领域
本发明属药物化学领域，具体而言，本发明涉及含α,β不饱和酮的查尔酮类似物在制备抗肺癌药物中的应用，这些化合物具有很好的抑制肺癌细胞生长的活性。
背景技术
肺癌是危害人类最大的恶性肿瘤之一。化疗是临床治疗的主要方法。目前临床肺癌治疗的细胞毒性药物具有胃肠道反应，肝功能不全，肾衰竭，心血管并发症等不良反应。而靶向治疗药物只针对带有特异性分子标记物的患者，其使用范围有限。开发新型、低毒、高效的化疗药物，仍然十分迫切。
以自然界存在的天然产物为先导化合物仍然是新药研发的主要手段之一。查尔酮或(E)-1,3-二苯基-2-丙烯-1-酮是一类存在于天然化合物的简单化学骨架，广泛分布在蔬菜，水果，茶叶和其他植物中。目前，许多天然的查尔酮已被广泛报道，展现出抗炎，抗糖尿病，抗氧化，抗菌等生物活性，其中特别是抗癌活性。但是天然查尔酮活性普遍较低。
本发明人经过长期和艰苦的研究实践，在没有结构-功能定向启示的情况下，从大量的查尔酮类化合物中获得了特定的含有α,β不饱和酮结构单元的查尔酮类似物，它们具有良好的抗肺癌活性。
发明内容
本发明目的在于提供17个特定的含有α,β不饱和酮结构单元的查尔酮类似物在制备抗肺癌药物中的应用。
本发明的另一目的是提供一种用于治疗肺癌的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的权利要求1所述的查尔酮类似物中的任何一种或多种或其可药用盐及其药用辅料。
具体而言，本发明所述17个特定的含有α,β不饱和酮结构单元的查尔酮类似物，及其他对照化合物结构如下(实施例1)：有效化合物：
Figure BDA0001783686290000021
对比化合物：
Figure BDA0001783686290000022
阳性对照药：
Figure BDA0001783686290000031
其中，化合物1的分子式为C15H12ClNO，化学名称为：(E)-1-(4-aminophenyl)-3-(2-chlorophenyl)prop-2-en-1-one。化合物2的分子式为C22H16ClNO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)benzamid。化合物3的分子式为C22H15Cl2NO2，化学名称为：(E)-4-chloro-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)benzamide。化合物4的分子式为C23H18ClNO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)-2-phenylacetamide。化合物6的分子式为C23H16ClNO4，化学名称为：(E)-2-((4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)carbamoyl)benzoicacid。化合物7的分子式为C22H15ClFNO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)-2-fluorobenzamide。化合物8的分子式为C18H14ClNO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物9的分子式为C18H16ClNO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)propionamide。化合物11的分子式为C11H11NO2，化学名称为：N-(4-acetylphenyl)acrylamide。化合物12的分子式为C18H13Cl2NO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2,4-dichlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物14的分子式为C19H17NO3，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(4-methoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物15的分子式为C18H14FNO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2-fluorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物16的分子式为C18H13F2NO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2,6-difluorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物17的分子式为C18H14FNO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(3-fluorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物18的分子式为C18H15NO2，化学名称为：N-(4-cinnamoylphenyl)acrylamide。化合物19的分子式为C20H19NO4，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2,3-dimethoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物20的分子式为C19H14F3NO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2-(trifluoromethyl)phenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物21的分子式为C20H19NO4，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2,5-dimethoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物22的分子式为C18H14BrNO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2-bromopheny l)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物23的分子式为C18H14ClNO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(4-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物24的分子式为C18H13Cl2NO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(3,4-dichlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物25的分子式为C18H13F2NO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(3,4-difluorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物26的分子式为C21H21NO5，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamid e。化合物28的分子式为C18H13Cl2NO2，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2,3-dichlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。化合物29的分子式为C19H16FNO3，化学名称为：(E)-N-(4-(3-(2-fluoro-5-methoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide。
实验结果表明，同对比化合物(1、2、3、4、6、7、9、11)，及阳性对照药BMS-345541(BMS)和天然查尔酮化合物黄腐酚(xanthohumol，Xn)相比，本发明有效化合物(8、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29)对3种肺癌细胞株NCI-H460、A549和H1975均具有较好的体外生长抑制活性(实施例2)。尤其8、22、26，对NCI-H460、A549和H1975细胞的IC50值在2.0-5.7μM的水平，三个化合物对三种肺癌细胞的生长抑制活性均明显强于阳性对照药黄腐酚(实施例3)。
化合物8、22、26在5μM浓度时，均能够时间依赖性地(随着时间延长，细胞生长抑制率逐渐增大)抑制NCI-H460细胞生长，相同时间点时化合物的抑制率均明显大于黄腐酚，即活性均明显强于黄腐酚(实施例3)。集落形成实验显示，化合物8、22、26均能浓度剂量依赖性地抑制NCI-H460细胞集落的形成，浓度为2.5μM时，均能几乎全部抑制集落的形成，三者活性均明显强于黄腐酚(实施例3)。
NCI-H460细胞经8孵育后，能明显升高细胞内ROS的水平，且在化合物处理12小时后ROS水平达到最高(实施例4)，ROS的抑制剂NAC能明显降低8诱导的ROS的生成(实施例4)。NAC处理后，化合物8抑制H460细胞集落形成的活性被逆转(实施例4)。这说明8能通过诱导ROS的产生发挥抗肿瘤作用。化合物8能明显诱导NCI-H460细胞中凋亡蛋白pro-caspase3表达的降低(实施例5)。
BALB/c小鼠的急性毒性实验显示，在一次性给予500mg/kg的化合物8后，连续观察2周，小鼠全部存活，未表现出明显的体内毒性，而相同给药剂量下的对照化合物EF24(含α,β不饱和酮结构，且具有良好抗肿瘤活性的化合物)则表现出较大的毒性，2周时有35％的小鼠死亡(实施例6)。
本发明还提供了一种用于治疗肺癌的药物组合物，其含有治疗有效量的活性成分和药用辅料，所述活性成分至少含有以上所述17个特定的含有α,β不饱和酮结构单元的查尔酮类似物或其可药用盐及其药用辅料。作为优选，所述的活性成分同时含有所述3个类似物(化合物8、22、26)中的任何一种或多种。
本文中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素、磷酸钙等；润湿剂如蒸馏水、乙醇；粘合剂如淀粉浆、纤维素衍生物、聚维酮、明胶、聚乙二醇、海藻酸钠溶液等；崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羌丙基纤维素、泡腾崩解剂等；润滑剂如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、十二烷基硫酸钠等；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括颗粒剂、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂或纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
下面将结合实施例及说明书附图详细说明本发明。
附图说明
图1查尔酮类似物的合成路径和条件；化合物2-9和中间体11的合成：将化合物1或10(1mmol)，酰氯(2mmol)和无水四氢呋喃(10mL)的混合物以三乙胺作为催化剂的条件下，在0℃下搅拌30min。然后将所得混合物缓慢升温至室温。当TLC监测显示原料完全消耗时，减压蒸发所得的混合液。然后，用二氯甲烷和水萃取混合物。随后，将所得混合物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并真空浓缩得到残余物。最后，将残余物用硅胶柱纯化，得到所需产物。
化合物12-29的合成：将化合物11(1mmol)与各种取代苯甲醛用乙醇(10mL)作溶剂，40％NaOH水溶液作催化剂，在室温下搅拌12-24h。当TLC监测显示原料完全消耗时，将反应混合物真空浓缩得到残余物。最后，将残余物用硅胶柱纯化，得到所需产物。
图2化合物体外抗肿瘤活性评估；使用MTT法测定合成的系列查尔酮类似物对三种人肺癌细胞系即NCI-H460、A549和H1975的体外抗生长活性。以3000个细胞/孔的密度将NCI-H460、A549和H1975细胞接种于96孔板中，培养24h。将肿瘤细胞与合成的化合物(10μM)一起孵育72h。之后，每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS配置)20μL，在培养箱内继续培养4h。然后吸取MTT溶液，每孔加入150μL DMSO，用酶标仪(SpectraMax M2/M2e，Molecular Devices，Sunnyvale，USA)在490nm波长测定各孔光吸收值(A)。抑制率＝(1-A实验组/A对照组)×100％。使用BMS-345541(BMS)和Xn(黄腐酚)作为阳性对照。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。
表1化合物对肺癌细胞系的IC50(μM)；活性化合物IC50的测定方法：NCI-H460、A549和H1975细胞接种于96孔板中培养24h。将肿瘤细胞与化合物一起孵育72h。之后，每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS配置)20μL，在培养箱内继续培养4h。然后吸取MTT溶液，每孔加入150μLDMSO，用酶标仪(SpectraMax M2/M2e，Molecular Devices，Sunnyvale，USA)在490nm波长测定各孔光吸收值(A)。通过GraphPad Pro 5.0(San Diego，CA)计算每种化合物的IC50值。每个化合物的IC50重复测试3次，计算平均值和偏差。
图3活性化合物抑制肺癌细胞的生长；活性化合物时间依赖性抑制曲线的测定方法：以每孔3000个细胞的密度将NCI-H460细胞接种到96孔板中24h，并用5μM化合物8，22，26和Xn孵育细胞，在37℃、5％CO2培养箱下孵育12，24，48和72h，MTT法测定细胞活性。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。
活性化合物对集落形成抑制实验：以每孔1000个细胞的密度将NCI-H460细胞接种到6孔板中24h，并用浓度为1.25，2.5和5μM的化合物8，22和26或5μM的Xn孵育NCI-H460细胞12h。改变培养基，用正常培养基培养细胞大约8天。最后，将细胞与结晶紫混合，并用相机获得图像。所有实验均进行三次重复。
图4活性化合物8通过诱导ROS的产生起到抗肿瘤作用；(A)用10μM的8孵育指定时间后，采用流式细胞术测量NCI-H460细胞内ROS水平。(B)用5mM的NAC预处理1h，然后将细胞与10μM的8孵育3h。通过流式细胞术评估NCI-H460细胞内ROS产生。(C-D)将NCI-H460细胞与5mM NAC预处理1h，然后用化合物8(5μM)处理。(C)用8处理48h后，MTT法测定细胞死亡率(具体操作同上所述)。与仅有化合物8处理组相比，***P<0.001。与NAC治疗组相比，#P<0.05。(D)集落形成实验：用化合物8处理12h后更换培养基，细胞在新鲜培养基中生长大约8天。
图5活性化合物8诱导凋亡蛋白pro-caspase3表达的降低；采用western blot检测caspase-3蛋白的表达水平。实验方法步骤：取对数期NCI-H460细胞，以3×105个细胞/孔接种在6孔板上并生长24h，用8(5μM)孵育3、6、9、12、24h。裂解液裂解细胞后收集蛋白，用western blot法检测pro-caspase3的表达。。
图6活性化合物8的体内毒性试验；方法：将18只野生型BALB/c小鼠(雄性)(26-33g)随机分为3组(n＝6)，包括溶剂，EF24组和化合物8组。仅在第一天通过腹膜内(ip)注射化合物(500mg/Kg)进行毒性实验。所有的小鼠在25℃明暗循环下饲养，并记录14天内动物的死亡率，14天后所有老鼠安乐处死。
具体实施方式
本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明本发明的目的，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1化合物的合成
化合物2-9和中间体11的合成：将化合物1或10(1mmol)，酰氯(2mmol)和无水四氢呋喃(10mL)的混合物以三乙胺作为催化剂的条件下，在0℃下搅拌30min。然后将所得混合物缓慢升温至室温。当TLC监测显示原料完全消耗时，减压蒸发所得的混合液。然后，用二氯甲烷和水萃取混合物。随后，将所得混合物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并真空浓缩得到残余物。最后，将残余物用硅胶柱纯化，得到所需产物。
化合物12-29的合成：将化合物11(1mmol)与各种取代苯甲醛用乙醇(10mL)作溶剂，40％NaOH水溶液作催化剂，在室温下搅拌12-24h。当TLC监测显示原料完全消耗时，将反应混合物真空浓缩得到残余物。最后，将残余物用硅胶柱纯化，得到所需产物。合成路线如图1所示。化合物的理化性质如下所述：
对比化合物2:(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)benzamid(2):Pale yellow powder,50.32％yield,mp 214.1-216.1℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.613(s,1H,NH),8.233(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H3’),8.224(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),8.057(d,J＝15.6Hz,1H,β-H),8.021(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),8.024(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2’,Ar-H6’),7.991(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.628(t,J＝8.4Hz,1H,Ar-H4’),7.580(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H3’,Ar-H5’),7.499-7.462(m,2H,Ar-H4’,Ar-H5’),7.069(d,J＝7.8Hz,1H,Ar-H6’).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.439,166.014,143.925,137.957,134.556,134.264,132.441,132.334,131.876,131.815,129.983,129.827×2,128.544,128.420×2,127.782×2,127.639,124.853,119.589×2.HPLC:purity 95.5％.LC-MS m/z:362.28[M+1]+,calcd for C22H16ClNO2:361.09.
对比化合物3:(E)-4-chloro-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)benzamide(3):Pale yellow powder,58.85％yield,mp 182.2-182.5℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.668(s,1H,NH),8.010(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2”,Ar-H6”),7.992(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H3”,Ar-H5”),7.902(d,J＝16.2Hz,1H,β-H),7.887(d,J＝16.2Hz,1H,α-H),7.581-7.555(m,1H,Ar-H6’),7.497-7.439(m,2H,Ar-H4’,Ar-H5’),7.214(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.189(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.031(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H3’).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.439,166.014,143.925,137.957,134.556,134.264,132.441,132.334,131.876,131.815,129.983,129.827×2,128.544,128.420×2,127.782×2,127.639,124.853,119.589×2.HPLC:purity 96.4％.LC-MS m/z:396.16[M+1]+,calcdfor C22H15Cl2NO2:395.05.
对比化合物4:(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)-2-phenylacetamide(4):Pale yellow powder,65.54％yield,mp 171.1-171.9℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:8.182(d,J＝15.6Hz,1H,β-H),8.005(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.765(dd,J＝1.8,5.4Hz,1H,Ar-H3’),7.607(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.459(dd,J＝3.6,7.2Hz,2H,Ar-H5’,Ar-H6’),7.435(s,1H,α-H),7.399(s,1H,Ar-H4’),7.384(d,J＝4.2Hz,2H,Ar-H2’,Ar-H6’),7.361-7.358(m,2H,Ar-H3’,Ar-H5’),7.340(d,J＝6.0Hz,1H,Ar-H4’),3.809(s,2H,CH2).13C-NMR(400MHz,DMS O),δ:187.737,170.281,144.337,138.454,136.086,134.717,132.855,132.441,132.257,130.565×2,130.422,129.118,129.665×2,128.817,128.216,127.115×2,125.143,118.962×2,43.889.HPLC:purity 96.4％.LC-MS m/z:376.14[M+1]+,calcd for C23H18ClNO2:375.10.
对比化合物6:(E)-2-((4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)carbamoyl)benzoic acid(6):Pale yellow powder,58.32％yield,mp 165.1-166.5℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:8.224(d,J＝15.6Hz,1H,β-H),8.170(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.989(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2’,Ar-H6’),7.825(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H3’,Ar-H5’),7.770(dd,J＝1.8,7.2Hz,1H,Ar-H3’),7.687(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.514(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),7.459(dd,J＝1.8,7.2Hz,1H,Ar-H6),7.320-7.368(m,2H,Ar-H4,Ar-H5).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.330,168.620,163.609,143.543,143.434,141.000,132.812,132.355,132.218,131.532,129.944×2,127.762,126.642,126.600,123.325,118.766×2,118.475,117.969,117.831,116.971,116.831.HPLC:purity 97.0％.LC-MS m/z:404.15[M-1]+,calcd for C23H16ClNO4:405.08.
对比化合物7:(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)-2-fluorobenzamide(7):Pale yellow powder,50.32％yield,mp 163.6-164.3℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:8.200(d,J＝15.6Hz,1H,β-H),8.088(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.841(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.769(d,J＝7.2Hz,1H,Ar-H3’),7.546-7.582(m,1H,Ar-H6’),7.516(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),7.451(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H6’),7.360-7.315(m,4H,Ar-H4’,Ar-H5’,Ar-H4’,Ar-H5’),7.261-7.198(m,1H,Ar-H3’).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.439,166.014,143.925,137.957,134.556,134.264,132.441,132.334,131.876,131.815,129.983,129.827×2,128.544,128.420×2,127.782×2,127.639,124.853,119.589×2.HPLC:purity95.1％.LC-MS m/z:380.13[M+1]+,calcd for C22H15ClFNO2:379.08.
有效化合物8:(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(8):Pale yellow powder,54.6％yield,mp 176.3-177.3℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.548(s,1H,NH),8.236(dd,J＝1.8,9.0Hz,1H,β-H),8.204(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2,Ar-H5),8.027(d,J＝3.6Hz,2H,Ar-H3,Ar-H6),7.878(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H3’,α-H),7.583(dd,J＝1.8,6.0Hz,1H,Ar-H6’),7.503-7.464(m,2H,Ar-H5’,Ar-H4’),6.509-6.464(m,1H,CO-CH),6.333(dd,J＝1.8,15.6Hz,1H,CH),5.841(dd,J＝1.2,8.4Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.346,163.757,163.630,140.676,134.107,133.255,132.232,132.005,131.526,130.029×2,128.704,128.191,127.814,125.232,124.965,118.809×2.HPLC:purity 96.7％.LC-MS m/z:312.10[M+1]+,calcd for C18H14ClNO2:311.07.
对比化合物9:(E)-N-(4-(3-(2-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)propionamide(9):Pale yellow powder,62.78％yield,mp 164.6-167.7℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:8.135(d,J＝15.6Hz,1H,β-H),7.864(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.756(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H3’),7.582(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.441(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),7.361-7.333(m,2H,Ar-H5’,Ar-H6’),7.329-7.308(m,1H,Ar-H4’),3.781(s,3H,CH3),1.216-1.497(m,2H,CH2).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.696,173.141,144.527,138.284,134.735,132.829,132.396,132.143,130.535×2,130.487,129.107,128.135,125.130,118.779×2,30.179,9.864.HPLC:purity 99.2％.LC-MS m/z:314.12[M+1]+,calcd for C18H16ClNO2:313.09.
对比化合物11:N-(4-acetylphenyl)acrylamide(11):Pale yellow powder,61.32％yield,mp 142.1-144.9℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.456(s,1H,NH),7.952(d,J＝9.6Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.841(d,J＝9.6Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),6.497-6.443(m,1H,CO-CH),6.315(d,J＝20.4Hz,1H,CH),5.821(d,J＝12.0Hz,1H,CH),2.537(s,3H,CH3).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:197.723,164.274,142.743,132.792,131.038,129.795×2,128.935,119.405,113.753.HPLC:purity 98.2％.LC-MS m/z:189.96[M+1]+,calcd forC11H11NO2:189.08.
有效化合物12:(E)-N-(4-(3-(2,4-dichlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(12):Pale yellow powder,50.32％yield,mp 214.1-216.1℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.717(s,1H,NH),8.279(d,J＝8.5Hz,1H,β-H),8.200(d,J＝8.6Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.892(t,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.817-7.772(m,2H,Ar-H3’,Ar-H6’),7.644-7.564(m,2H,Ar-H5’,α-H),6.512(t,J＝16.8Hz,1H,CO-CH),6.328(t,J＝16.8Hz,1H,CH),5.825(t,J＝20.4Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.564,164.095,144.211,137.143,135.972,135.565,132.547×2,131.900×2,130.614,130.322,130.005,128.437,128.392,125.780,119.216×2.HPLC:purity 98.6％.LC-MS m/z:346.09[M+1]+,calcd for C18H13Cl2NO2:345.03.
有效化合物14:(E)-N-(4-(3-(4-methoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(14):Pale yellow powder,52.5％yield,mp 155.1-157.9℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:8.051(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H5),7.823(s,1H,β-H),7.773(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3,Ar-H6),7.623(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2’,Ar-H6’),7.446(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),6.960(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H5’,Ar-H4’),6.510(d,J＝16.8Hz,1H,CO-CH),6.356-6.311(m,1H,CH),5.845(d,J＝10.2Hz,1H,CH),3.879(s,3H,CH3).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:189.076,163.634,161.725,144.505,141.800,134.377,130.894,130.210×2,129.839×2,128.571,127.706,119.542,119.303,114.460×2,55.400.HPLC:purity 99.4％.LC-MS m/z:308.14[M+1]+,calcd for C19H17NO3:307.12.
有效化合物15:(E)-N-(4-(3-(2-fluorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(15):Pale yellow powder,57.9％yield,mp 177.9-179.2℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.545(s,1H,NH),8.178(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),8.133(t,J＝15.0Hz,1H,β-H),8.005(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),7.878(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.833(d,J＝12.0Hz,1H,Ar-H6’),7.526(d,J＝7.2Hz,1H,Ar-H3’),7.350-7.318(m,2H,Ar-H5’,Ar-H4’),6.509-6.404(m,1H,CO-CH),6.333(d,J＝15.6Hz,1H,CH),5.838(d,J＝11.4Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:188.994,163.686,162.775,160.749,142.146,137.278,131.806,131.736,130.863,130.031×2,129.761,128.642,124.478,124.413,119.350,116.371,116.196.HPLC:purity 99.5％.LC-MS m/z:296.10[M+1]+,calcd for C18H14FNO2:295.10.
有效化合物16:(E)-N-(4-(3-(2,6-difluorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(16):Pale yellow powder,58.2％yield,mp 203.9-205.1℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.535(s,1H,NH),8.067(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.876(t,J＝15.3Hz,3H,Ar-H3,Ar-H5,β-H),7.682(d,J＝16.2Hz,1H,α-H),7.582-7.533(m,1H,Ar-H4’),7.258(t,J＝17.4Hz,2H,Ar-H1’,Ar-H5’),6.498-6.453(m,1H,CO-CH),6.321(dd,J＝1.8,15.0Hz,1H,CH),5.826(dd,J＝1.8,8.4Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:184.750,164.376,144.183,132.985,132.763,132.709×2,132.423,130.195×2,129.142,128.933,127.744,119.842×2,112.890×2,112.732.HPLC:purity 95.8％.LC-MS m/z:314.06[M+1]+,calcd for C18H13F2NO2:313.09.
有效化合物17:(E)-N-(4-(3-(3-fluorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(17):Pale yellow powder,61.4％yield,mp 143.3-145.1℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.540(s,1H,NH),8.206(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2,Ar-H5),8.030(d,J＝15.6Hz,1H,β-H),7.880(s,2H,Ar-H3,Ar-H4),7.861(d,J＝5.4Hz,1H,α-H),7.715(t,J＝8.4Hz,2H,Ar-H6’,Ar-H5’),7.526-7.490(m,1H,Ar-H4’),7.294(td,J＝1.8,6.0Hz,1H,Ar-H2’),6.509-6.464(m,1H,CO-CH),6.333(dd,J＝1.8,15.0Hz,1H,CH),5.840(dd,J＝1.2,8.4Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:188.737,163.616,142.887,142.266,131.257,130.491,130.440,129.949×2,127.918,124.310,123.748,119.654×2,117.190,117.051,114.614,114.464.HPLC:purity 95.1％.LC-MS m/z:296.16[M+1]+,calcd for C18H14FNO2:295.10.
有效化合物18:N-(4-cinnamoylphenyl)acrylamide(18):Pale yellow powder,51.3％yield,mp 191.8-192.4℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.516(s,1H,NH),8.178(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.949(d,J＝15.6Hz,1H,β-H),7.893-7.855(m,4H,Ar-H3,Ar-H5,Ar-H2’,Ar-H6’),7.729(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),7.461(t,J＝6.6Hz,3H,Ar-H3’,Ar-H4’,Ar-H5’),6.502-6.457(m,1H,CO-CH),6.323(dd,J＝1.8,15.0Hz,1H,CH),5.828(dd,J＝1.8,8.4Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:188.995,163.584,144.629,141.931,134.979,134.114,130.831,130.491,129.969×2,128.954×2,128.685,128.432×2,121.865,119.302.HPLC:purity 97.8％.LC-MS m/z:278.06[M+1]+,calcd for C18H15NO2:277.11.
有效化合物19:(E)-N-(4-(3-(2,3-dimethoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(19):Pale yellow powder,62.4％yield,mp 166.1-167.7℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.517(s,1H,NH),8.156(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.972(d,J＝7.8Hz,1H,β-H),7.910-7.852(m,3H,Ar-H3,Ar-H5,α-H),7.618(t,J＝9.0Hz,1H,Ar-H5),7.156(d,J＝4.8Hz,2H,Ar-H4’,Ar-H6’),6.502-6.456(m,1H,CO-CH),6.323(d,J＝17.4Hz,1H,CH),5.828(d,J＝10.2Hz,1H,CH),3.843(s,3H,OCH3),3.800(s,3H,OCH3).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:189.352,163.587,153.268,146.049,141.888,139.484,134.216,130.866,129.995×2,129.194,128.608,127.508,124.171,123.435,119.751,119.271,114.318.HPLC:purity 98.3％.LC-MS m/z:338.16[M+1]+,calcd for C20H19NO4:337.13.
有效化合物20:(E)-N-(4-(3-(2-(trifluoromethyl)phenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(20):Pale yellow powder,65.1％yield,mp 180.9-184.0℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.717(s,1H,NH),8.280(d,J＝9.0Hz,1H,β-H),8.200(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),8.059(d,J＝15.6Hz,1H,Ar-H3)7.959(d,J＝15.6Hz,1H,Ar-H5),7.907-7.886(m,3H,α-H,Ar-H2’,Ar-H6’),7.817(t,J＝16.2Hz,1H,Ar-H6’),7.573(d,J＝6.6Hz,1H,Ar-H4’),6.526-6.490(m,1H,CO-CH),6.328(t,J＝16.8Hz,1H,CH),5.834(d,J＝10.2Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.210,163.639,143.747,137.240,133.000,132.894,132.044,130.330,130.085×2,128.717,127.802,126.260,126.140,126.094,125.265,118.812×2.HPLC:purity 97.7％.LC-MS m/z:346.09[M+1]+,calcd for C19H14F3NO2:345.10.
有效化合物21:(E)-N-(4-(3-(2,5-dimethoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(21):Pale yellow powder,60.32％yield,mp 173.3-176.5℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.527(s,1H,NH),8.178(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),8.028(d,J＝15.6Hz,1H,β-H),7.924(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),7.868(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.561(d,J＝2.4Hz,1H,Ar-H4’),7.050(t,J＝4.2Hz,2H,Ar-H3’,Ar-H6’),6.508-6.463(m,1H,CO-CH),6.330(dd,J＝1.8,15.0Hz,1H,CH),5.836(dd,J＝1.8,16.8Hz,1H,CH),3.852(s,3H,OCH3),3.811(s,3H,OCH3).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:189.698,163.841,154.277,153.773,141.875,139.936,139.911,131.358,129.938×2,127.711,123.721,119.551×2,117.472,114.435,113.296,56.482,56.053.HPLC:purity 96.7％.LC-MSm/z:338.16[M+1]+,calcd for C20H19NO4:337.13.
有效化合物22:(E)-N-(4-(3-(2-bromophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(22):Pale yellow powder,67.56％yield,mp 191.8-192.4℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.537(s,1H,NH),8.190(d,J＝8.4Hz,3H,Ar-H2,Ar-H6,β-H),7.974(d,J＝4.8Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.870(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3’,α-H),7.743(d,J＝7.8Hz,1H,Ar-H6’),7.496(t,J＝15.0Hz,1H,Ar-H5),7.401-7.376(m,1H,Ar-H4’),6.503-6.457(m,1H,CO-CH),6.325(dd,J＝1.8,15.0Hz,1H,CH),5.831(dd,J＝1.2,9.0Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.346,163.757,163.630,140.676,134.107,133.255,132.232,132.005,131.526,130.029×2,128.704,128.191,127.814,125.232,124.965,118.809×2.HPLC:purity96.2％.LC-MS m/z:355.93[M+1]+,calcd for C18H14BrNO2:355.02.
有效化合物23:(E)-N-(4-(3-(4-chlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(23):Pale yellow powder,62.54％yield,mp 168.0-173.8℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:8.057(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.790-7.765(m,3H,β-H,Ar-H3,Ar-H5),7.560(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H2’,Ar-H6’),7.534(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),7.417(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H3’,Ar-H5’),6.515(d,J＝16.8Hz,1H,CO-CH),6.349-6.304(m,1H,CH),5.858(d,J＝10.2Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:188.995,163.584,144.629,141.931,134.979,134.114,130.837,130.491,129.969×2,128.954×2,128.685,128.432×2,121.865,119.302.HPLC:purity 98.9％.LC-MS m/z:312.10[M+1]+,calcd for C18H14ClNO2:311.07.
有效化合物24:(E)-N-(4-(3-(3,4-dichlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(24):Pale yellow powder,65.79％yield,mp 168.9-171.3℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:8.057(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.966(t,J＝7.8Hz,1H,β-H),7.786(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.735(d,J＝12.6Hz,3H,α-H,Ar-H2’,Ar-H3’),7.284(s,1H,Ar-H6’),6.517(d,J＝16.8Hz,1H,CO-CH),6.348-6.303(m,1H,CH),5.864(d,J＝10.2Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.239,163.641,143.742,137.815,135.059,131.812,131.506,130.087×2,129.830,128.394,127.840,127.165,123.211,118.815×2,118.725.HPLC:purity 95.4％.LC-MS m/z:346.03[M+1]+,calcd for C18H13Cl2NO2:345.03.
有效化合物25:(E)-N-(4-(3-(3,4-difluorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(25):Pale yellow powder,62.54％yield,mp 180.1-182.5℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:8.057(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.966(t,J＝7.8Hz,1H,β-H),7.786(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.735(d,J＝12.6Hz,4H,α-H,Ar-H2’,Ar-H2’,Ar-H3’),7.284(s,1H,Ar-H6’),6.517(d,J＝16.8Hz,1H,CO-CH),6.348-6.303(m,1H,CH),5.864(d,J＝10.2Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.564,164.095,144.211,137.143,135.972,135.565,132.547×2,131.900×2,130.614,130.322,130.005,128.437,128.392,125.780,119.216×2.HPLC:purity 95.5％.LC-MS m/z:314.02[M+1]+,calcdfor C18H13F2NO2:313.09.
有效化合物26:(E)-N-(4-(3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(26):Pale yellow powder,67.19％yield,mp 186.5-188.1℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.515(s,1H,NH),8.188(d,J＝9.0Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.910-7.865(m,3H,Ar-H3,Ar-H5,β-H),7.683(d,J＝15.6Hz,1H,α-H),7.229(s,2H,Ar-H2’,Ar-H6’),6.502-6.456(m,1H,CO-CH),6.323(dd,J＝1.8,15.0Hz,1H,CH),5.829(dd,J＝1.2,7.8Hz,1H,CH),3.868(s,6H,OCH3×2),3.716(s,3H,OCH3).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:189.050,163.629,153.543×2,144.827×2,141.922,134.150,130.842,130.416,129.931×2,128.651,121.243,119.326×2,105.588×2,60.973,56.297×2.HPLC:purity96.9％.LC-MS m/z:368.11[M+1]+,calcd for C21H21NO5:367.14.
有效化合物28:(E)-N-(4-(3-(2,3-dichlorophenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(28):Pale yellow powder,67.88％yield,mp 205.3-208.1℃.1H-NMR(600MHz,DMSO-d6),δ:10.565(s,1H,NH),8.200(dd,J＝1.2,8.4Hz,3H,β-H,Ar-H2,Ar-H6),8.024(d,J＝3.6Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.879(d,J＝9.0Hz,2H,α-H,Ar-H3’),7.749(t,J＝7.8Hz,1H,Ar-H5’),7.490(t,J＝15.6Hz,1H,Ar-H6’),6.510-6.465(m,1H,CO-CH),6.332(dd,J＝1.8,8.4Hz,1H,CH),5.841(dd,J＝1.8,8.4Hz,1H,CH).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:187.239,163.641,143.742,137.815,135.059,131.812,131.506,130.087×2,129.830,128.394,127.821,127.165,126.211,118.815×2,118.725.HPLC:purity 98.6％.LC-MSm/z:346.03[M+1]+,calcd for C18H13Cl2NO2:345.03.
有效化合物29:(E)-N-(4-(3-(2-fluoro-5-methoxyphenyl)acryloyl)phenyl)acrylamide(29):Pale yellow powder,67.88％yield,mp 151.2-154.7℃.1H-NMR(600MHz,CDCl3),δ:8.054(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H2,Ar-H6),7.884(s,1H,β-H),7.785(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H3,Ar-H5),7.634(d,J＝16.2Hz,1H,α-H),7.121(s,1H,Ar-H3’),7.070(t,J＝18.6Hz,1H,Ar-H4’),6.939-6.919(m,1H,Ar-H6’),6.510(d,J＝16.8Hz,1H,CO-CH),6.361-6.216(m,1H,CH),5.848(d,J＝10.2Hz,1H,CH),3.852(s,3H,OCH3).13C-NMR(400MHz,DMSO),δ:188.997,163.683,155.856,142.152,137.367,133.831,130.381×2,130.852,130.041,124.609,124.553,119.345,117.403,117.336,116.969,116.776,113.673,55.896.HPLC:purity 95.6％.LC-MS m/z:326.19[M+1]+,calcd for C19H16FNO3:325.11.
实施例2化合物抑制肺癌细胞生长活性的抑制率
使用MTT法测定合成的系列查尔酮类似物(10μM)对三种人肺癌细胞系即NCI-H460、A549和H1975的体外抗生长活性。以3000个细胞/孔的密度将NCI-H460、A549和H1975细胞接种于96孔板中培养24h。将肿瘤细胞与合成的化合物(10μM)一起孵育72h。之后，每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS配置)20μL，在培养箱内继续培养4h。然后吸取MTT溶液，每孔加入150μL DMSO，用酶标仪(SpectraMax M2/M2e，Molecular Devices，Sunnyvale，USA)在490nm波长测定各孔光吸收值(A)。抑制率＝(1-A实验组/A对照组)×100％。使用BMS-345541(BMS)和Xn(黄腐酚)作为阳性对照。实验数据见图2。
本发明的有效化合物都具有较好的抑制肺癌细胞H460、A549和H1975生长的活性，具体如下：它们对H460的抑制率均大于60％；绝大部分化合物对A549的抑制率均大于60％，化合物8、15、22和26均达到了80％左右的抑制率；除20的抑制率为55％外，其它化合物对H1975的抑制率均大于60％，尤其是化合物8、15、16、17、21、22、23、24、25、26和28均达到80％左右的抑制率。所有有效化合物的抑制率均大于阳性药物BMS和Xn。而对比化合物的抑制率较低，活性不佳，不具有药用前景。
实施例3活性化合物8、22和26的抗肺癌活性
活性化合物IC50的测定方法：NCI-H460、A549和H1975细胞接种于96孔板中培养24h。将肿瘤细胞与化合物一起孵育72h。之后，每孔加MTT溶液(5mg/mL用PBS配置)20μL，在培养箱内继续培养4h。然后吸取MTT溶液，每孔加入150μL DMSO，用酶标仪(SpectraMax M2/M2e，Molecular Devices，Sunnyvale，USA)在490nm波长测定各孔光吸收值(A)。通过GraphPad Pro 5.0(San Diego，CA)计算每种化合物的IC50值。实验数据见表1。
活性化合物时间依赖性抑制曲线的测定方法：以每孔3000个细胞的密度将NCI-H460细胞接种到96孔板中24h，并用一定浓度的化合物8，在37℃、5％CO2培养箱下孵育12，24，48和72h，MTT法测定细胞活性。实验数据见图3A。
活性化合物对集落形成抑制实验：以每孔1000个细胞的密度将NCI-H460细胞接种到6孔板中24h，并用一定浓度的化合物8，在37℃、5％CO2培养箱下孵育12h。改变培养基，用正常培养基培养细胞大约8天。最后，将细胞与结晶紫混合，并用相机获得图像。实验数据见图3B。
化合物8、22和26化合物对NCI-H460、A549和H1975三株肿瘤细胞的IC50值的范围分别为2.3±0.3-5.7±1.4μM，2.2±0.9-5.2±0.7μM，2.0±1.1-5.4±1.2μM，而且与Xn相比，化合物在不同细胞系中的抗肿瘤活性增加了3.2-3.8倍，2.7-3.8倍，2.2-2.5倍(表1)。同时，化合物8、22和26孵育NCI-H460细胞不同的时间(12、24、48和72h)后，均对癌细胞的生长抑制表现时间依赖性(图3A)。而且，集落实验也进一步表明，化合物8、22和26与对照组相比可以有效减少集落形成，并具有浓度依赖性，同时，所有化合物在2.5μM时即显示比Xn更强的集落形成抑制活性(图3B)。以上数据表明化合物8、22和26可以有效抑制肺癌细胞系的生长。
实施例4活性化合物8通过诱导ROS的产生起到抗肿瘤作用
化合物8对细胞内ROS产生的影响：采用流式细胞术检测ROS的累积。以3×105个细胞/孔将NCI-H460细胞接种到6孔板中24h，然后在存在或不存在NAC的情况下用化合物8处理一定时间。然后将培养基更换为无血清培养基，并将细胞与DCFH-DA(10μM)(BeyotimeInstitute of Biotechnology，China)在37℃在黑暗中孵育30min。最后，收集细胞并通过流式细胞术(BD，USA)分析样品。如图4A所示，与对照组相比，使用化合物8(3、6、12和24h)孵育NCI-H460细胞后，ROS水平明显升高。此外，我们发现细胞预孵育ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)时，ROS的增加被明显抑制(图4B)。这些数据表明化合物8可以调节细胞内ROS的产生。
进一步发现(图4C-D)，单独使用NAC孵育细胞后，基本没有细胞死亡，而单独使用化合物8时发现H460细胞大量死亡，但同时采用NAC和化合物8处理细胞后，发现化合物8的抗肿瘤活性被削弱，即NAC不仅可以抑制ROS的产生，也可以抑制8诱导的细胞死亡。以上数据表明，化合物8可以通过升高细胞内ROS达到抑制肺癌细胞生长的效果。
实施例5活性化合物8诱导凋亡蛋白pro-caspase3表达的降低
用western blot检测caspase-3蛋白的表达水平。实验方法步骤：取对数期NCI-H460细胞，以3×105个细胞/孔接种在6孔板上并生长24h，用8(5μM)孵育指定时间。肿瘤细胞被裂解后，所有样品的蛋白质浓度使用Bradford蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)测定。通过SDS-PAGE电泳分离裂解物，然后转移到PVDF膜上。用含5％脱脂牛奶将膜于室温下封闭1.5h后，TBST洗脱，再用一抗caspase-3在4℃摇床上孵育过夜。用TBST洗涤三次后，将膜与相应的二抗于室温下孵育1.5h，TBST洗脱三次，曝光仪内曝光。用ECL试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)检测条带的深度，最后通过Image J软件检测靶蛋白。
caspase-3是化疗药物诱导细胞凋亡的关键蛋白，采用WB的实验方法检测caspase-3蛋白的表达。结果如图5所示，随着药物作用时间的增加，pro-caspase-3总量降低，这进一步证明化合物8与细胞凋亡的相关性。
实施例6活性化合物8的体内毒性试验
进一步进行急性毒性实验以确定化合物8的毒性。将18只野生型BALB/c小鼠(雄性)(26-33g)随机分为3组(n＝6)，包括溶剂，EF24组和化合物8组。仅在第一天通过腹膜内(ip)注射用化合物(500mg/Kg)进行毒性实验。所有的小鼠在25℃下明暗循环下饲养，并记录14天内动物的死亡率，然后这些老鼠一起安乐死。由于EF24与本专利所示所有化合物一样含有2个迈克尔受体结构，且有优异的抗癌活性，故选择EF24作为阳性对照。结果显示在图6中，对于经化合物8处理的小鼠未观察到死亡，而用EF24处理的BALB/c小鼠，死亡率为33.3％。说明8的毒性低于EF24。以上数据表明，化合物8比EF24在动物体内毒性方面更具有优势。

Claims (7)

1.如下所示的化合物之任一在制备抗肺癌药物中的应用：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述的应用，其中化合物优选自如下化合物之任一：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
3.根据权利要求2所述的应用，其中化合物优选自如下化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
4.权利要求1、2或3所述的化合物或其可药用盐或其制剂。
5.用于治疗肺癌的药物组合物，其含有治疗有效量的活性成分和药用辅料，所述的活性成分包含权利要求1、2或3所述的化合物或其可药用盐。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中权利要求1、2或3所述的化合物或其可药用盐作为唯一的活性成分。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征是：所述药物组合物的制剂形式选自注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释或缓释剂和纳米制剂。
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