KR101039750B1

KR101039750B1 - 신규 쿠마린계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101039750B1
Application number: KR1020080120497A
Authority: KR
Inventors: 이경; 민경훈; 이기호; 최용석; 김영란; 하연
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-12-01
Filing date: 2008-12-01
Publication date: 2011-06-09
Also published as: WO2010064817A2; WO2010064817A3; KR20100062072A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 쿠마린계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 쿠마린계 화합물은 다약제내성의 주요 원인인 P-당단백질(P-glycoprotein, Pgp)의 과발현에 대한 억제활성 및 항암제와의 병용투여시 항암활성의 증가를 나타내어 항암제에 대한 다약제내성 극복제제, 치료제 또는 조절제로 이용될 수 있으며, 항암제의 효과를 증진시켜 암환자의 생존률을 높일 수 있고, 병용투여하는 항암제의 용량을 줄여 정상세포에 대한 부작용을 감소시킬 수 있으므로 항암치료에 유용하게 사용될 수 있다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, R은 본 명세서에 정의된 바와 같다.)

쿠마린계 화합물, 다약제내성, P-당단백질, 암

Description

신규 쿠마린계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물{Novel coumarin based compound or pharmaceutically acceptable salt thereof, preparation method thereof and pharmaceutical composition for inhibition of multidrug resistance containing the same as an active ingredient}

본 발명은 쿠마린계 화합물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

현재까지 암을 치료하기 위한 외과적 요법, 방사선 요법, 화학적 요법 등과 같은 다양한 치료방법이 연구되고 있으나, 아직까지 암의 완전 치료에는 이르지 못하고 있는 실정이다.

이중, 외과적 요법과 방사선 요법은 암 발생의 초기 단계에서 유용한 방법이기 때문에 초기에 감지하기가 힘든 암의 경우에는 화학적 요법에 대한 의존도가 점차 증가되고 있으며, 상기 화학적 요법은 50년 이상의 역사를 가지고 있고, 현재까 지 수백여 종의 함암제가 개발되어 임상에서 사용되어 왔으나, 임상적으로 만족할만한 효과를 얻는 경우는 아직 많지 않다.

이와 같이, 암이 난치성 질환으로 남아 있는 주요한 이유 중의 하나는 암세포의 다약제내성(multidrug resistance, MDR) 발현에 기인한 것으로 알려져 있다. 한 가지 약제에 대한 내성을 갖게 된 암세포는 구조적으로 전혀 다른 항암 화합물에 대한 내성을 갖게 되는데 이를 다약제내성이라고 한다. 이러한 다약제내성의 발생은 화학요법제를 이용한 전이성 암의 치료에 있어 가장 큰 장애가 되고 있다. 한편, 다약제내성을 일으키는 여러 가지 생물학적 기전이 보고되었지만 P-당단백질(P-glycoprotein, Pgp)의 과발현이 가장 큰 원인이며 이러한 사실은 생화화적, 임상적으로 증명되었다. P-당단백질은 일종의 ATP 의존적 트랜스포터(ABC 트랜스포터) 단백질로서 친유성 생체이물들을 세포안에서 밖으로 배출하는 기능을 가지고 있다. 친유성을 갖는 많은 항암약물들이 P-당단백질의 기질이 되어 대부분 약효를 발현하지 못하고 P-당단백질에 의해 세포 밖으로 배출된다. 따라서 P-당단백질의 발현 억제는 다약제내성을 갖는 암세포를 다시 항암제에 반응하게 만들어 세포사멸을 유도하고 이는 다약제내성 암을 극복할 수 있는 가장 효율적인 방법으로 생각되고 있다. P-당단백질의 과발현이 유도된 세포를 이용하여 항암제와의 병용투여를 통해 세포사멸이 유도되는 화합물을 검색하여 P-당단백질의 억제제를 탐색하거나 P-당단백질에 결합하는 형광물질을 이용하여 P-당단백질 억제제를 탐색 및 발굴 할 수 있다.

상기 P-당단백질에 대해서 좀 더 살펴보면, P-당단백질은 사람의 ABCB-1(MDR1) 유전자에 의해 170kDa이 암호화되어 있는 세포막 단백질(membrane protein)로써, 6개의 막으로 구분되는 부분과 하나의 ATP-결합부위를 가지는 상동의 소수성 부위가 두개로 형성된 1,280개의 아미노산으로 구성된 ATP 결합 카세트(ATP binding cassette; ABC) 수송단백질(transporter proteins)의 상족(superfamily)에 속하는 데, P-당단백질에 의한 다약제내성의 발현은 P-당단백질이 약물과 직접 결합하여 ATP를 소모하는 에너지 의존적 기작에 의해 약물을 세포 밖으로 방출시킴으로써 세포내의 약물 농도를 낮추는 기작을 통해 다약제 내성을 나타내는 것이다. 또한, 대부분의 결장이나 신장암과 같은 인간의 종양에는 P-당단백질이 발현되고 발현속도가 증가하여, 종양의 악화를 가중시킨다.

P-당단백질에 의해 영향을 받는 항암제로는 빈카 알카로이드(vinca alkaloids) 계열의 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 나벨빈(navelbine); 탁산스(taxanes) 계열의 파클리탁셀(paclitaxel;TAX), 탁소테르(taxotere); 안트라사이클린(anthracyclines) 계열의 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin); 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins) 계열 약물인 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide) 등과; 기타약물들로 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉스산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신 C(mitomycin C) 등의 다양한 약물들이 알려져 있다.

따라서, 항암제의 사용에 있어서 이러한 다약제내성이 중요한 제한요소로 작용되고 있으며, 임상적으로도 P-당단백질을 발현하는 암을 갖는 환자의 치료율이 이를 발현하지 않는 암 환자에 비해 현저히 저하되는 결과를 보이고 있다.

이러한 다약제 내성을 극복하기 위한 연구들이 다양하게 진행되고 있으며, 지금까지 많은 P-당단백질 억제제가 개발 되어 왔다.

먼저 1세대 약물로서 칼슘채널 억제제인 베라파밀(verapamil), 칼모듈린(calmodulin) 길항제들, 스테로이드계 약물들, 면역억제제(사이클로스포린), 항말라리아 치료체(퀴닌)등 기존에 다른 치료목적으로 사용되고 있는 약물들 중 P-당단백질을 억제하는 약물들이다. 하지만 1세대 약물들은 억제정도가 충분히 뛰어나지 못하며 약물 원래의 약물학적 작용이 부작용으로 나타나 임상에 쓰이는데 실패하였다.

2세대 약물들은 1세대의 단점을 보완하였으나 많은 2세대 약물들은 다른 종류의 트랜스포터를 억제할 뿐만 아니라 대사에 관련된 효소등을 함께 억제하여 항암제의 혈중농도를 오랫동안 증가시켜 병용투여된 항암제로 인한 부작용을 증가시키는 문제점을 보였다.

3세대 약물은 다른 트랜스포터들에 대한 선택성이 뛰어나고 P-당단백질에 대한 억제효과가 매우 높으며 CYP450 3A4에 의해 대사되지 않아 병용투여되는 항암제의 약물동력학적 특징을 변화시키지 않아 항암제로부터의 부작용을 초래하지 않는 다. 그러한 특성에도 불구하고 지금까지 개발된 많은 3세대 약물들(Tariquidar, Zosuquidar, VX-710, Laniquidar, ONT-093 등), 임상 실험 중에 있는 수종을 제외한 약물들은 P-당단백질 억제제 자체에 기인하는 세포독성에 의한 예기치 못한 부작용이 문제가 되고 있다.

따라서 자체 세포독성이 없는 P-당단백질 억제제의 개발이 필요로 하고 있다.

이에 본 발명자들은 다약제내성의 주요 원인인 P-당단백질의 과발현을 억제하여 기존 항암제의 치료 효율을 증가 시킬 수 있으면서 자체 세포독성이 없는 화합물을 탐색하기 위하여 연구한 결과, 신규한 쿠마린계 화합물을 합성하게 되었고, 이들 화합물 및 공지의 쿠마린계 화합물 중 일부가 P-당단백질 발현에 우수한 억제활성을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규 쿠마린계 화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 쿠마린계 화합물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 쿠마린계 화합물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 쿠마린계 화합물의 제조방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 신규 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 쿠마린계 화합물은 다약제내성의 주요 원인인 P-당단백질의 과발현에 대한 억제활성 및 항암제와의 병용투여시 항암활성의 증가를 나타내어 항암제에 대한 다약제내성 극복제제, 치료제 또는 조절제로 이용될 수 있으며, 항암제의 효과를 증진시켜 암환자의 생존률을 높일 수 있고, 병용투여하는 항암제의 용량을 줄여 정상세포에 대한 부작용을 감소시킬 수 있으며 경제적으로도 이득을 제공할 수 있으므로 항암치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 쿠마린계 화합물을 제공한다.

상기 화학식 1에서,

R은 -X-Y이고,

상기 X는 C₁-C₆의 알킬렌 또는 카보닐이고;

상기 Y는 페닐 또는 피리딜로서, 상기 페닐 또는 피리딜은 비치환되거나 또는 하나 이상의 나이트로, 트리플루오로메틸, 할로겐, C₁-C₆ 알콕시 또는 페닐로 치환될 수 있으며,

바람직하게는,

상기 X는 C₁-C₂의 알킬렌 또는 카보닐이며,

상기 Y는 상기 Y는 페닐 또는 피리딜로서, 상기 페닐 또는 피리딜은 비치환되거나 또는 하나 이상의 나이트로, 트리플루오로메틸, 할로겐, C₁-C₆ 알콕시 또는 페닐로 치환될 수 있으며,

더욱 바람직하게는,

상기 X는 C₁-C₂의 알킬렌이며,

상기 Y는 페닐 또는 피리딜로서, 상기 페닐 또는 피리딜은 비치환 또는 하나 이상의 나이트로 또는 페닐로 치환될 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물의 구체적인 예는 아래와 같다.

(1) 3-나이트로-벤조산 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스터;

(2) 3,5-다이메톡시-벤조산 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스터;

(3) 4-브로모-벤조산 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스터;

(4) 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-페네틸옥시-크로멘-2-온;

(5) 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(4-나이트로-벤질옥시)-크로멘-2-온;

(6) 7-(바이페닐-4-일메톡시)-6-(3-메틸-부트-2-에닐)-크로멘-2-온;

(7) 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(3-트라이플루오로메틸-벤질옥시)-크로멘-2-온;

(8) 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(피리딘-2-일메톡시)-크로멘-2-온.

상기 화합물 중에서 바람직한 예로는,

6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(4-나이트로-벤질옥시)-크로멘-2-온; 또는

6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(피리딘-2-일메톡시)-크로멘-2-온이 있다.

하기 표 1에는 본 발명에 따른 화학식 1의 쿠마린계 화합물의 구체적인 예에 대한 구조가 제시되어 있다.

화합물	구조 (화학식 1에서 R의 구조)
1
2
3
4
5
6
7
8

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 신규 쿠마린계 화합물뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 약학적으로 허용가능한 염, 가능한 용매화물 또는 수화물 및 프로드러그를 모두 포함한다.

본 발명은 또한 공지의 쿠마린계 화합물인 마메신(marmesin), 데커시놀(decursinol), 데커신(decursin), 데커시놀 앤젤레이트(decursinol angelate) 및 마메신 앤젤레이트(marmesin angelate)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 마메신(marmesin), 데커시놀(decursinol), 데커신(decursin), 데커시놀 앤젤레이트(decursinol angelate) 및 마메신 앤젤레이트(marmesin angelate)는 각각 하기의 화학식 2 내지 6과 같으며, 상기 화합물들은 이미 알려진 제조방법에 따라 제조하거나 구입하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 화학식 1의 신규 쿠마린계 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 화학식 1에 있어서, R이 -X-Y이고 X가 카보닐인 경우에 해당하는 본 발 명 화합물의 제조방법은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,

출발물질인 화학식 7의 디메틸수버로신(demethylsuberosin)의 에스테르화 반응을 통해 화학식 1a의 쿠마린계 화합물을 제조하는 단계를 포함한다.

(상기 반응식 1에서, Y는 화학식 1에서 정의한 바와 같으며, Z는 OH, 할라이드 또는 OC(O)Y이다.)

상기 반응식 1의 에스테르화 반응은 통상의 에스테르화 반응을 위한 시약을 사용하여 완결할 수 있다.

상기 에스테르화 반응의 일 실시 태양으로는, 상기 반응식 1의 에스테르화 반응을 아실할라이드 및 염기, 또는 카르복시산 안하이드라이드를 사용하여 달성한다.

한편, 상기 반응식 1의 에스테르화 반응의 또 다른 실시태양으로는 축합제와 아민 촉매의 존재하에서 카복시산을 화학식 7의 디메틸수버로신과 반응시키는 것을 통해서도 달성할 수 있다.

상기 축합제로는 다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 1,1-카보닐다이이미다졸 등을 사용할 수 있고, 아민 촉매로는 피리딘, 다이메틸아미노피리딘(DMAP), 트리에틸아민을 포함하는 트라이알킬아민 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 축합제로는 다이사이클로헥실카보다이이미드, 아민 촉매로는 다이메틸아미노피리딘을 사용할 수 있다.

상기 반응식 1의 에스테르화 반응의 반응용매는 디클로로메탄, 클로로포름, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 디클로로메탄을 사용할 수 있다.

상기 반응식 1의 에스테르화 반응은 실온에서 12시간 내지 24시간 교반시킴으로써 이루어질 수 있다.

상기 화학식 1에 있어서, R이 -X-Y이고 X가 C₁-C₆의 알킬렌인 본 발명 화합물의 제조방법은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이,

출발물질인 화학식 7의 디메틸수버로신(demethylsuberosin)을 염기 존재하에서 Y-X-Hal로 표시되는 할라이드 화합물과 반응시켜 화학식 1b의 쿠마린계 화합물을 제조하는 단계를 포함한다.

(상기 반응식 2에서, Hal은 할로겐 원소 중의 하나이며, X는 C₁-C₆의 알킬렌이고, Y는 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)

이때, 반응용매로는 DMF 또는 DMSO 등과 같은 비양성자성 극성 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMF를 사용할 수 있다.

상기 반응식 2에서 염기로는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 등을 사용할 수 있다.

상기 반응은 실온에서 12시간 내지 24시간 교반시킴으로써 이루어질 수 있다.

한편, 상기 반응식 1 또는 2의 출발물질인 디메틸수버로신은 하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이 제조될 수 있다.

(상기 반응식 3에서, Hal은 할로겐 원소 중의 하나이고, Bn은 벤질, Boc는 t-부틸록시카보닐을 나타낸다.)

디메틸수버로신의 제조방법은 상기 반응식 3에 나타낸 바와 같이,

출발물질인 화학식 8의 벤즈알데하이드에 염기의 존재하에서 다이-t-부틸 다아카보네이트를 반응시켜 화학식 9의 보호된 벤즈알데하이드를 제조하는 단계(단계 1);

단계 1에서 얻은 화학식 9의 보호된 벤즈알데하이드를 환원제로 환원시켜 화학식 10의 보호된 벤질 알코올을 제조하는 단계(단계 2);

단계 2에서 얻은 화학식 10의 보호된 벤질 할라이드에 2-메틸-1-프로페닐의 그리냐드 시약을 반응시켜 화학식 11의 화합물을 제조하는 단계(단계 3);

단계 3에서 얻은 화학식 11의 화합물에 염기의 존재하에서 벤질 할라이드 시약을 반응시켜 화학식 12의 화합물을 제조하는 단계(단계 4);

단계 4에서 얻은 화학식 12의 화합물을 산성조건에서 처리하여 보호기인 Boc기를 제거하여 화학식 13의 화합물을 제조하는 단계(단계 5);

단계 5에서 얻은 화학식 13의 화합물을 AlCl₃ 촉매 존재하에서 트라이에틸오로토포르메이트(triehtylorthoformate; CH(OEt)₃)와 반응시켜 화학식 14의 화합물을 얻는 단계(단계 6);

단계 6에서 얻은 화학식 14의 화합물에 (카베톡시메틸렌)트라이페닐포스포레인((carbethoxymethylene)triphenylphosphorane)을 반응시켜 화학식 15의 화합물을 얻는 단계(단계 7); 및

단계 7에서 얻은 화학식 15의 화합물을 벤질기를 제거할 수 있는 환원제를 사용하여 화학식 7의 디메틸수버로신을 제조하는 단계(단계 8)를 포함한다.

이하, 상기 반응식 3에 따르는 디메틸수버로신의 제조방법에 대해서 상세히 설명한다.

단계 1은 출발물질인 화학식 8의 벤즈알데하이드에 염기의 존재하에서 다이-t-부틸 다아카보네이트(Boc₂O)를 반응시켜 화학식 9의 보호된 벤즈알데하이드를 제조하는 단계이다. 염기로는 무기염기를 바람직하게 사용할 수 있다. 무기염기는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼슘, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등을 포함한다.

이때 반응용매로는 다이에틸에터, 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄, 클로로포름 등을 사용할 수 있다.

단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 화학식 9의 보호된 벤즈알데하이드를 환원제로 환원시켜 화학식 10의 보호된 벤질 알코올을 제조하는 단계이다. 환원제는 알데하이드를 알코올로 환원시킬 수 있는 모든 종류의 환원제가 사용될 수 있으며, PCC, LAH, NaBH₄, 수소 존재하의 금속촉매, 알코올 존재하의 나트륨 등이 바람직하다.

환원제의 바람직한 예로는 NaBH₄를 사용하며, 이때의 반응용매로는 테트라하이드로퓨란, 다이에틸에터, 테트라하이드로퓨란과 물의 혼합을 사용할 수 있다.

단계 3은 상기 단계 2에서 얻은 화학식 10의 보호된 벤질 할라이드에 2-메틸-1-프로페닐의 그리냐드 시약을 반응시켜 화학식 11의 화합물을 제조하는 단계이다. 2-메틸-1-프로페닐의 그리냐드 시약으로는 바람직하게 2-메틸-1-프로페닐 마그네슘브로마이드 또는 2-메틸-1-프로페닐 마그네슘클로라이드를 사용하며, 반응용매로는 다이에틸에터 또는 테트라하이드로퓨란을 바람직하게 사용할 수 있다.

단계 4는 상기 단계 3에서 얻은 화학식 11의 화합물에 염기의 존재하에서 벤질할라이드 시약을 반응시켜 화학식 12의 화합물을 제조하는 단계이다. 벤질할라이드 시약으로는 벤질브로마이드, 벤질클로라이드가 바람직하며, 염기로는 무기염기를 사용할 수 있으며, 무기염기는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼슘, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등을 포함한다.

단계 5는 상기 단계 4에서 얻은 화학식 12의 화합물을 산성조건에서 처리하여 보호기인 Boc기를 제거하여 화학식 13의 화합물을 제조하는 단계이다. Boc기를 제거할 수 있는 산성조건이면 모두 가능하며, 바람직하게는 염산을 포함하는 산성조건을 사용한다.

단계 6은 상기 단계 5에서 얻은 화학식 13의 화합물을 AlCl₃ 촉매 존재하에 서 트라이에틸오르토포르메이트(triethylorthoformate; CH(OEt)₃)와 반응시켜 화학식 14의 화합물을 얻는 단계이다. 반응용매로는 바람직하게 벤젠, 톨루엔, 자일렌 등을 사용할 수 있다.

단계 7은 상기 단계 6에서 얻은 화학식 14의 화합물에 (카베톡시메틸렌)트라이페닐포스포레인((carbethoxymethylene)triphenylphosphorane)을 반응시켜 화학식 15의 화합물을 얻는 단계이다. 반응용매로는 바람직하게 N,N-다이에틸아닐린을 사용할 수 있다.

단계 8은 상기 단계 7에서 얻은 화학식 15의 화합물을 벤질기를 제거할 수 있는 환원제를 사용하여 화학식 7의 디메틸수버로신을 제조하는 단계이다. 상기 환원제로는 수소 존재하에서 래니 니켈(Raney Ni) 등의 금속 촉매를 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 신규 쿠마린계 화합물은 상기 제조방법에 제한되지 않으며, 이외에 이미 공지된 방법 뿐만 아니라 미공지된 방법이라도 상기 신규 쿠마린계 화합물을 합성할 수 있는 방법이라면 사용할 수 있다.

상기와 같이 본 발명에 따라 제조된 신규 쿠마린계 화합물은 제조 후, 고속 액체크로마토그래피로 분리 정제한 후 핵자기 공명에 의해 분자구조를 확인할 수 있다.

나아가, 본 발명은 화학식 1의 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 다약제내성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물들은 항암제에 대한 다약제내성을 유발하는 단백질의 과발현을 억제함으로써 다약제 내성을 조절 또는 치료할 수 있으며, 이때 다약제내성을 유발하는 단백질은 암세포에서 발현되는 P-당단백질을 그 대상으로 한다.

본 발명의 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 항암제와 병용투여함으로써 다약제 내성의 유발을 억제하여 항암제의 항암효과를 증진시키고, 또한 병용투여되는 항암제의 용량을 감소시켜 항암제 단독 투여시 유발되는 정상세포에 대한 부작용을 감소시킨다.

다약제내성은 주로 암세포의 세포막에 다약제내성 유전자(MDR1)에 의한 P-당단백질이 과다발현되어 항암 치료약물과 직접 결합하여 상기 약물을 세포 밖으로 배출시킬 뿐만 아니라 세포내 약물축적을 감소시켜 결과적으로 암세포 내부의 약제농도를 감소된다. 따라서, P-당단백질의 과다발현을 억제하는 화합물은 다약제내성을 억제하는 효과를 갖게 된다.

본 발명의 화합물은 파클리탁셀로 처리한 P-당단백질 발현 세포주인 MES-SA/DX5 암세포주에 대한 파클리탁셀의 세포독성을 강화시켜 P-당단백질의 발현을 억제하며(표 2 참조), 기존 항암제인 파클리탁셀(paclitaxel)과 병용투여시 항암제 단독처리시 측정된 IC₅₀ 값과 비교하여 볼 때, MES-SA/DX5 세포주에 대해서 IC₅₀값을 최고 36배 낮추는 것으로 나타났다. 이는 종래 다약제내성 억제제로 사용되는 베라파밀보다 우수한 다약제내성 억제 활성을 보인 것이다(표 2 참조). 따라서, 본 발명의 화합물들은 다약제내성을 유발하는 P-당단백질을 효과적으로 억제하므로, 다약제내성을 치료 또는 조절하는데 유용하게 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 화합물들은 결장암, 직장암, 방광암, 남소암, 유방암, 폐암 등과 같이 정상적으로도 P-당단백질이 많이 발현되는 암 뿐만 아니라 정상적으로도 P-당단백질의 발현이 높지 않은 급성골수성 백혈병(AML), 악성 림프종 등에서의 항암제에 의한 다약제내성을 치료 또는 조절하는데 사용될 수 있다.

특히, 본 발명의 화합물들은 빈카 알카로이드(vinca alkaloids) 계열의 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 나벨빈(navelbine)과; 탁산스(taxanes) 계열의 파클리탁셀(paclitaxel;TAX), 탁소테르(taxotere)와; 안트라사이클린(anthracyclines) 계열의 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin) 및 이다루비신(idarubicin)과; 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins) 계열 약물인 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide) 등과; 기타약물들로 콜히친(colchicine), 미톡산트론(mitoxantrone), 닥티노마이신(dactinomycin), 토포테칸(topotecan), 트리메트렉 스산(trimetrexate), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신 C(mitomycin C) 등의 항암제에 대한 다약제내성을 치료 또는 조절하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 하는 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 쿠마린계 화합물되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 30~120 ㎎/일이며, 바람직하게는 40~80 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 제조예 및 실시예에서 다른 특별한 언급이 없는한, 플래시 컬럼크로마토그래피에는 실리카 겔 60(230-400메시 Kieselgel 60)을 사용하였고, 프렙 TLC (preparative thin layer chromatography)에서는 유리 기판의 실리카 겔 플레이트 (1mm 두께)를 사용하였으며, 반응의 진행을 확인하기 위한 TLC에는 0.25mm 두께의 실리카 플레이트 (E. Merck, 실리카 겔 60 F254)를 사용하였다.

<제조예> 디메틸수버로신의 제조

(단계 1) : 2,4-다이-t-부틸 1-포르밀페닐 카보네이트의 제조

출발물질인 2,4-다이하이드록시벤즈알데하이드(2.0 g, 14.5 mmol), 다이-tert-부틸 다이카보네이트(Boc₂O; 12.6 g, 57.9 mmol) 및 탄산칼륨(4.0 g, 28.9 mmol)을 다이에틸에터(60 ml)에 넣고 실온에서 교반하여 완전히 녹인다. 반응 혼합물을 여과한 후 다이에틸에터로 침전물을 씻어서 얻은 혼합 여과액을 감압증류하였다. 얻어진 잔유물에 물을 부어 반응을 종결시키고 에틸아세테이트로 분액하였다. 에틸아세테이트층을 분리한 후 식염수 및 물로 씻은 후 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축하였다. 얻어진 잔유물은 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 2:1)로 정제하여 표제화합물 4.4 g(수율 90%)을 얻었다 .

¹H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 10.12 (s, 1H), 7.88 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.23 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 1.55 (d, J = 3 Hz, 18H).

(단계 2) : 2,4-다이-t-부틸 1-하이드록시메틸페닐 카보네이트의 제조

THF:물(19:1, 1 ml)에 녹인 상기 단계 1에서 얻은 화합물(130 mg, 384 mmol)의 용액에 NaBH₄(15.3 mg, 403 mmol, 물 0.27 ml에 포함된)를 0 ℃에서 점적하여 15분 동안 교반한다. 반응 혼합물을 얼음으로 온도를 낮춘 물에 붓고, 이어서 다이에틸에터로 3번 추출한다. 합쳐진 다이에틸에터층을 식염수 및 물로 씻은 후 무수 황 산마그네슘으로 건조 후, 감압농축하였다. 얻어진 잔유물은 프렙 TLC(에틸아세테이트:n-헥산 = 3:7)로 정제하여 표제화합물 93.7 mg(수율 70%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.42 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.07 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 2.1, 3.9 Hz, 1H), 4.56 (s, 2H), 2.37 (brs, 1H), 1.52 (s, 18H).

(단계 3) : t-부틸 3-하이드록시-4-(3-메틸부트-2-에닐)페닐 카보네이트의 제조

상기 단계 2에서 얻은 화합물(1.29 g, 3.81 mmol)의 THF(21 ml) 용액에 0 ℃에서 2-메틸-1-프로페닐 마그네슘브로마이드(11.44 mmol, 0.5 M in THF 22.89 ml)를 가하고 1시간 교반한다. 반응 혼합물을 실온으로 가온한 후 추가로 10시간 교반한다. 반응 혼합물을 0.5 N HCl 수용액을 부어 반응을 종결시킨 후 다이에틸에터로 추출하였다. 추출한 다이에틸에터층을 식염수 및 물로 씻은 후 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축하였다. 얻어진 잔유물은 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 3:7)로 정제하여 표제화합물 760 mg(수율 70%)을 얻었다 .

¹H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 7.04 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.64 (dd, J = 2.1, 8.4 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.84 (s, 1H), 5.26 (m, 1H), 3.26 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.74 (s, 3H), 1.72 (s, 3H), 1.55 (s, 9H);

MS (ESI) m/z 301 (M+Na)+.

(단계 4) : t-부틸 3-벤질옥시-4-(3-메틸부트-2-에닐)페닐 카보네이트의 제조

상기 단계 3에서 얻은 화합물(0.60 g, 2.16 mmol), 벤질브로마이드(0.44 g, 2.59 mmol) 및 탄산칼륨의 DMF(10 ml) 현탁액 을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음으로 온도를 낮춘 물을 붓고 에틸아세테이트로 추출하였다. 합쳐진 추출물을 식염수 및 물로 씻었다. 에틸아세테이트층을 식염수 및 물로 씻은 후 무수 황산마그네슘으로 건조하여, 감압농축하였다. 얻어진 잔유물은 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 1:9)로 정제하여 표제화합물을 650 mg(수율 81.4%) 얻었다 .

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.38 (m, 5H), 7.14 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.73 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 5.31 (m, 1H), 5.06 (s, 2H), 3.35 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 1.74 (s, 3H), 1.65 (s, 3H), 1.57 (s, 9H);

¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 156.80, 152.01, 149.88, 136.90, 132.59, 129.49, 128.49, 127.94, 127.86, 127.31, 122.27, 113.06, 105.28, 83.38, 70.07, 28.25, 27.72, 25.75, 17.72;

MS (ESI) m/z 391 (M+Na)⁺.

(단계 5) : 3-벤질옥시-4-(3-메틸부트-2-에닐)페놀의 제조

상기 단계 4에서 얻은 화합물(2.00 g, 5.43 mmol)의 n-부탄올(200 ml) 용액을 4 M HCl 다이옥산 용액(70 ml)에 실온에서 가한 후 TLC로 확인하여 반응이 완결될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음으로 온도를 낮춘 물로 반응을 종결시킨 후 포화된 탄산수소나트륨 수용액으로 중화하고, 메탄올:디클로메탄(1:9) 혼합액으로 추출하였다. 추출된 유기층을 식염수 및 물로 씻은 후 무수 황산마그네슘으로 건조하여, 감압농축하였다. 얻어진 잔유물은 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 1.5:8.5)로 정제하여 표제화합물을 1.32 g(수율 90.6%) 얻었다 .

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz,) δ 7.36 (m, 5H), 6.99 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.35 (dd, J = 2.4, 8.1 Hz, 1H), 5.29 (m, 1H), 5.04 (s, 2H), 4.55 (brs, 1H), 3.29 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 1.72 (s, 3H), 1.65 (s, 3H);

¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 157.29, 154.65, 137.17, 132.06, 129.82, 128.48, 127.76, 127.22, 127.14, 122.94, 122.75, 106.85, 100.09, 69.90, 28.01, 25.77, 17.70;

MS (ESI) m/z 269 (M+H)⁺.

(단계 6) : 4-벤질옥시-2-하이드록시-5-(3-메틸부트-2-에닐)벤즈알데하이드 의 제조

상기 단계 5에서 얻은 화합물(523 mg, 1.95 mmol) 및 트라이에틸오르토포르메이트(triethylorthoformate(CH(OEt)₃); 1.45 g, 9.75 mmol)의 벤젠(25 ml) 용액에 AlCl₃(391 mg, 2.93 mmol)를 실온에서 나누어서 가한 후 30분간 교반하였다. 반응 혼합물을 0 ℃로 낮추고 3 M HCl 수용액(28 ml)을 점적하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온한 후, 다이에틸에터 및 에틸아세테이트로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 식염수 및 물로 씻은 후 무수 황산마그네슘으로 건조하여, 감압농축하였다. 얻어진 잔유물은 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 1:9)로 정제하여 표제화합물을 280 mg(수율 48.4%) 얻었다 .

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 11.45 (s, 1H), 9.72 (s, 1H), 7.42 (m, 5H), 7.27 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.30 (m, 1H), 5.14 (s, 2H), 3.31 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.78 (s, 3H), 1.66 (s, 3H);

¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 194.54, 163.67, 163.08, 135.88, 133.46, 133.41, 128.66, 128.21, 127.27, 123.06, 121.62, 114.50, 99.71, 70.32, 27.71, 25.79, 17.74;

MS (ESI) 297 (M+H)⁺, 319 (M+Na)⁺.

(단계 7) : 7-벤질옥시-6-(3-메틸부트-2-에닐)-2H-크로멘-2-온의 제조

상기 단계 6에서 얻은 화합물과 (카베톡시메틸렌)트라이페닐포스포레인((carbethoxymethylene)triphenylphosphorane); 0.44 g, 1.27 mmol)의 N,N-다이에틸아닐린(21 ml) 용액을 아르곤 분위기에서 5시간 동안 190 ℃로 가열하였다. 반응액을 냉온하고 1.5 M HCl 수용액 1 리터에 붓고, 에틸아세테이트로 3번 추출하였다. 합쳐진 에틸아세테이트 추출액을 1.5 M HCl 수용액 및 식염수로 씻고, 무수 황산마그네슘으로 건조하여, 감압 농축하였다. 얻어진 고체물을 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 3:7)로 정제하여 표제화합물을 290 mg(수율 88.8%) 얻었다 .

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.66 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.50-7.38 (m, 5H), 7.31 (s, 1H), 6.88 (s, 1H), 6.28 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.35 (m, 1H), 5.2 (s, 2H), 3.43 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.82 (s, 3H), 1.71 (s, 3H);

¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 161.48, 159.57, 154.31, 143.57, 135.98, 133.63, 128.69, 128.22, 127.81, 127.60, 127.26, 121.42, 112.91, 112.10, 99.79, 70.39, 28.12, 25.80, 17.77;

MS (ESI) m/z 321 (M+H)⁺, 343 (M+Na)⁺.

(단계 8) : 디메틸수버로신의 제조

상기 단계 7에서 얻은 화합물의 에탄올(6ml) 용액을 래니 니켈(0.88 g)의 수 용성 슬러리에 가하고, 혼합물을 아르곤 분위기의 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 재빨리 셀라이트의 플러그를 통해 여과한 후, 감압 농축하였다. 잔유물을 플래시 컬럼클로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 3:7)로 정제하여 디메틸수버로신 화합물 160 mg(수율 89.6%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.65 (d, J = 9 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.05 (s, 1H) 6.23 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 5.32 (m, 1H), 3.37 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.78 (s, 3H), 1.74 (s, 3H);

¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz) δ 162.20, 158.42, 154.15, 144.12, 135.16, 128.31, 125.56, 120.96, 112.39, 112.31, 103.22, 28.52, 25.81, 17.87;

MS (ESI) m/z 231 (M+H)⁺, 253 (M+Na)⁺.

<실시예> 신규 쿠마린계 화합물의 제조

<실시예 1> 3-나이트로-벤조 산 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스터의 제조

상기 제조예에서 얻어진 디메틸수버로신(30 mg, 0.13 mmol)의 디클로메탄(3 ml) 용액을 얼음으로 온도를 낮춘 3-나이트로벤조일클로라이드(27 mg, 0.14 mmol) 와 트라이에틸아민(0.04 ml, 0.26 mmol)의 혼합액에 점적하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하고, 포화된 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 디클로메탄으로 추출하여, 디클로로메탄 용액을 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축하였다. 얻어진 잔유물은 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트: n-헥산 = 1:5)로 정제하여 표제화합물 18.6 mg(수율 62%)을 얻었다 .

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 9.04-9.03 (m, 1H), 8.55-8.51 (m, 1H), 7.79-7.69 (m, 3H), 7.39 (s , 1H), 7.19 (s, 1H), 6.42 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.21 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.32 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 1.69 (s, 3H), 1.57 (s, 3H);

MS (ESI) m/z 380 (M+H)⁺.

<실시예 2> 3,5-다이메톡시-벤조산 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스터의 제조

상기 제조예에서 얻어진 디메틸수버로신(30 mg, 0.13 mmol), 3,5-다이메톡시 벤조산(28 mg, 0.16 mmol), DCC(34 mg, 0.16 mmol) 및 DMAP(130 mg, 1.06 mmol)를 무수 디클로로메탄 5 ml에 녹이고 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시킨 후 얻은 잔유물을 플래시 컬럼크로마토그래피(MeOH:디클로로메탄 = 1:50)로 정제하여 표제 화합물 15.9 mg(수율 53%)을 얻었다 .

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.69 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.36-7.33 (m, 3H), 7.17 (s, 1H), 6.75-6.74 (m, 1H), 6.39 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.22 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 3.87 (s, 6H), 3.31 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.71 (s, 3H), 1.59 (s, 3H);

MS (ESI) m/z 395 (M+H)⁺.

<실시예 3> 4-브로모-벤조산 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스터의 제조

상기 제조예에서 얻어진 디메틸수버로신(31.7 mg, 0.14 mmol)의 디클로메탄 용액을 얼음으로 온도를 낮춘 4-브로모벤조일클로라이드(33.26 mg, 0.15 mmol)와 트라이에틸아민(0.04 ml, 0.28 mmol)의 혼합액에 점적하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하고, 포화된 탄산수소나트륨 수용액으로 반응을 종결시킨 후, 디클로메탄으로 추출하여, 디클로로메탄 용액을 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축하였다. 얻어진 잔유물은 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 1:5)로 정제하여 표제화합물 23.4 mg(수율 74%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 8.08-8.04 (m, 1H), 7.68 (m, 4H), 7.36 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 6.40 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.21 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 3.30 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 1.69 (s, 6H);

MS (ESI) m/z 413 (M+H)⁺.

<실시예 4> 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-페네틸옥시-크로멘-2-온의 제조

상기 제조예에서 얻어진 디메틸수버로신(40 mg, 0.18 mmol)과 탄산칼륨(73 mg, 0.53 mmol)의 DMF(3 ml) 용액을 실온에서 교반하면서 2-브로모에틸벤젠(0.26 mmol)을 가하였다. 반응 혼합액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면, 물을 가하고 혼합액을 에틸아세테이트로 2번 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 물과 식염수로 씻고, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 여과하였다. 여과액을 감압농축하고 잔유물을 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 1:10)로 정제하여 표제화합물 48 mg(수율 83%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.59 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.35-7.28 (m, 5H), 7.16 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.21J = 9.6 Hz, 1H), 5.24 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.24 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.28 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 3.15 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.75 (s, 3H), 1.68 (s, 3H);

MS (ESI) m/z 357 (M+Na)⁺, 335 (M+H)⁺.

<실시예 5> 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(4-나이트로-벤질옥시)-크로멘-2-온의 제조

상기 제조예에서 얻어진 디메틸수버로신(30 mg, 0.19 mmol)과 탄산칼륨(55 mg, 0.39 mmol)의 DMF(2 ml) 용액을 실온에서 교반하면서 4-나이트로벤질브로마이드(0.13 mmol) 을 가하였다. 반응 혼합액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면, 물을 가하고 혼합액을 에틸아세테이트로 2번 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 물과 식염수로 씻고, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 여과하였 다. 여과액을 감압농축하고 잔유물을 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 1:5)로 정제하여 표제화합물 39.5 mg(수율 82%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 8.26 (d, J = 8.27 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.80-6.45 (m, 4H), 5.82 (s, 2H), 5.20 (t, J = 9.6 Hz, 1H), 3.22 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.75 (s, 3H), 1.68 (s, 3H);

MS (ESI) m/z 366 (M+H)⁺.

<실시예 6> 7-(바이페닐-4-일메톡시)-6-(3-메틸-부트-2-에닐)-크로멘-2-온의 제조

상기 제조예에서 얻어진 디메틸수버로신(30 mg, 0.19 mmol)과 탄산칼륨(55 mg, 0.39 mmol)의 DMF(2 ml) 용액을 실온에서 교반하면서 4-브로로에틸바이페닐(0.19 mmol) 을 가하였다. 반응 혼합액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면, 물을 가하고 혼합액을 에틸아세테이트로 2번 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 물과 식염수로 씻고, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 여과하였다. 여과액을 감압농축하고 잔유물을 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 1:5)로 정제하여 표제화합물 40.3 mg(수율 78%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.80 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.40-7.28 (m, 9H), 7.14 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 6.45 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.80 (s, 2H), 5.20 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.22 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.75 (s, 3H), 1.68 (s, 3H);

MS (ESI) m/z 367 (M+H)⁺, 419 (M+Na)⁺.

<실시예 7> 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(3-트라이플루오로메틸-벤질옥시)-크로멘-2-온의 제조

상기 제조예에서 얻어진 디메틸수버로신(30 mg, 0.19 mmol)와 탄산칼륨(55 mg, 0.39 mmol)의 DMF(2 ml) 용액을 실온에서 교반하면서 4-(트라이플루오로메틸)벤질브로마이드(0.19 mmol)를 가하였다. 반응 혼합액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면, 물을 가하고 혼합액을 에틸아세테이트로 2번 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 물과 식염수로 씻고, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 여과하였다. 여과액을 감압농축하고 잔유물을 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 1:5)로 정제하여 표제화합물 47 mg(수율 92%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 7.80 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.38-7.12 (m, 4H), 6.59 (s, 1H), 6.45 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.80 (s, 2H), 5.20 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 3.22 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.75 (s, 3H), 1.68 (s, 3H);

MS (ESI) m/z 389 (M+H)⁺.

<실시예 8> 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(피리딘-2-일메톡시)-크로멘-2-온의 제조

상기 제조예에서 얻어진 디메틸수버로신(30 mg, 0.19 mmol)와 탄산칼륨(55 mg, 0.39 mmol)의 DMF(3 ml) 용액을 실온에서 교반하면서 2-브로모에틸-피리딘(0.20 mmol) 을 가하였다. 반응 혼합액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응이 완결되면, 물을 가하고 혼합액을 에틸아세테이트로 2번 추출하였다. 에틸아세테이트 추출액을 물과 식염수로 씻고, 무수 황산마그네슘으로 건조 후, 여과하였다. 여과액을 감압농축하고 잔유물을 플래시 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:n-헥산 = 1:2)로 정제하여 표제화합물 24 mg(수율 79%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 8.65 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.63-7.56 (m, 2H), 7.36 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 6.24 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.36-5.29 (m, 3H), 3.42 (d, J = 3.43 Hz, 2H), 1.78 (s, 3H), 1.70 (s, 3H);

MS (ESI) m/z 344 (M+Na)⁺, 322 (M+H)⁺.

<실험예> 다약제내성 억제 효과 측정

(1) 세포배양

ATCC로부터 MES-SA/DX5 (ATCC Number: CRL-1977) 세포주를 구입하여 사용하 고 ATCC에서 기술한 배양법을 기초로 하여 배양하였다. MES-SA/DX5세포주는 10% FBS를 포함하는 DMEM (혹은 RPMI-1640)에서 배양하였으며 매 2-3일을 주기로 1:6에서 1:10으로 계대 배양하였다.

(2) 다약제내성 억제 효과 측정

본 발명에 따른 화합물의 다약제내성 억제 활성을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

MES-SA/DX5 세포주를 96-웰 플레이트에 분주하고, 세포가 플레이트 바닥 면에 부착되도록 24시간동안 전배양을 하였다. 부착된 세포는 항암제 파클리탁셀(Taxol)의 연속 희석 농도에 따라 대조군(다약제내성 억제제 무첨가)과 상기 실시예 4, 5 및 8에서 제조된 화합물 (5.0 μM), 공지의 화학식 6으로 표시되는 마메신 안젤레이트 화합물 및 비교군으로서 베라파밀(5.0 μM)을 각각 첨가하여 72시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 다음, 각 웰에서 Cell Counting Kit-8 (Dojindo Corporate) 용액 0.01 mL을 각 웰에 넣고 1시간에서 3시간 동안 세포 배양기에서 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 측정기(microplate reader, Tecan)로 측정하였고, 50%의 암세포가 성장이 억제되는 파클라탁셀의 유효한 농도(IC₅₀) 값을 측정하여 표 2에 나타내었다.

실험군	파클리탁셀의 IC₅₀ (μM)	내성억제효과
대조군(파클리탁셀 단독)	5.99	1.0
실시예 4 화합물	1.93	3.1
실시예 5 화합물	0.551	10.9
실시예 8 화합물	0.166	36.0
마메신 앤젤레이트 (marmesin angelate)	1.03	5.8
비교군 (베라파밀 (Verapamil))	0.234	25.6

한편, 본 발명에 따른 쿠마린계 화합물 및 베라파밀은 P-당단백질 발현 세포주인 MES-SA/DX5 암세포주에 대한 파클리탁셀의 세포독성을 강화시키는 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 쿠마린계 화합물의 경우 5.0 μM을 파클리탁셀과 병용처리하였을 때, MES-SA/DX5 세포주에 대한 파클리탁셀 단독처리군에 비해 IC₅₀값을 낮추는 것으로 나타나고 있다. 특히, 실시예 8 화합물의 경우는 파클리탁셀 단독처리군에 비해 IC₅₀값을 36배까지 낮추고 있으며, 이는 종래 다약제내성 억제제로 사용되는 베라파밀보다 우수한 다약제내성 억제 활성을 보이는 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 쿠마린계 화합물은 다약제내성을 유발하는 P-당단백질을 효과적으로 억제하므로, 다약제내성을 치료 또는 조절하는데 유용하게 사용할 수 있다. 뿐만 아니라 실험농도에서 실시예 8 화합물의 자체 세포독성은 전혀 관찰되지 않아 P-당단백질 억제제들의 주요한 문제가 되는 자체 세포독성에 따른 부작용은 최소화 될 것으로 기대된다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 쿠마린계 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1> 정제의 제조

활성성분 100 ㎎

옥수수 전분 68 ㎎

락토오즈 90 ㎎

미세결정질 셀룰로즈 40 ㎎

마그네슘 스테아레이트 2 ㎎

통상적인 정제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합하고 교반한 후, 과립화하였다. 건조후 타정기를 사용하여 정제를 제조하였다.

<제제예 2> 캅셀제의 제조

활성성분 80 ㎎

옥수수 전분 68 ㎎

락토오즈 90 ㎎

미세결정질 셀룰로즈 60 ㎎

마그네슘 스테아레이트 2 ㎎

통상적인 캅셀제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합한 후 적절한 크기의 젤라틴 캅셀에 충진하여 목적하는 캅셀제를 제조하였다.

<제제예 2> 주사제의 제조

활성성분 50 ㎎

소듐 메타비설파이트 1.5 ㎎

메틸 파라벤 1.0 ㎎

프로필 파라벤 0.1 ㎎

주사용 정제수 적당량

통상적인 주사제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 비등수에 교반하면서 용해시킨 후, 냉각시켜 2 ㎖ 용량의 멸균 바이알에 충진하고, 적당량의 주사용 정제수를 2 ㎖가 되도록 보충하여 주사제를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물:

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

R은 -X-Y이고,

상기 X는 C₁-C₆의 알킬렌이거나 또는 카보닐이고;

상기 Y는 페닐 또는 피리딜로서, 상기 페닐 또는 피리딜은 비치환되거나 또는 하나 이상의 나이트로, 트리플루오로메틸, 할로겐, C₁-C₆ 알콕시 또는 페닐로 치환될 수 있다.).
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 정의에 있어 상기 X는 C₁-C₂의 알킬렌 또는 카보닐이며,

상기 Y는 페닐 또는 피리딜로서, 상기 페닐 또는 피리딜은 비치환되거나 또는 하나 이상의 나이트로, 트리플루오로메틸, 브로모, 메톡시 또는 페닐로 치환될 수 있는 쿠마린계 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 정의에 있어 상기 X는 C₁-C₂의 알킬렌이며, 상기 Y는 페닐 또는 피리딜로서, 상기 페닐 또는 피리딜은 비치환되거나 또는 하나 이상의 나이트로 또는 페닐로 치환될 수 있는 쿠마린계 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물은

(1) 3-나이트로-벤조산 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스터;

(2) 3,5-다이메톡시-벤조산 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스터;

(3) 4-브로모-벤조산 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스터;

(4) 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-페네틸옥시-크로멘-2-온;

(5) 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(4-나이트로-벤질옥시)-크로멘-2-온;

(6) 7-(바이페닐-4-일메톡시)-6-(3-메틸-부트-2-에닐)-크로멘-2-온;

(7) 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(3-트라이플루오로메틸-벤질옥시)-크로멘-2-온; 및

(8) 6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(피리딘-2-일메톡시)-크로멘-2-온으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 쿠마린계 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 쿠마린계 화합물은

6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(4-나이트로-벤질옥시)-크로멘-2-온; 또는

6-(3-메틸-부트-2-에닐)-7-(피리딘-2-일메톡시)-크로멘-2-온인 쿠마린계 화합물.
하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 출발물질인 화학식 7의 디메틸수버로신(demethylsuberosin)을 염기의 존재하에서 아실할라이드와 반응시키는 에스테르화 반응을 통해 화학식 1(a)의 쿠마린계 화합물을 제조하는 단계를 포 함하는 제1항의 쿠마린계 화합물의 제조방법:

[반응식 1]

(상기 반응식 1에서, Y는 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같으며, Z는 할라이드이다.).
하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 출발물질인 화학식 7의 디메틸수버로신(demethylsuberosin)을 염기 존재하에서 Y-X-Hal로 표시되는 할라이드 화합물과 반응시켜 화학식 1(b)의 쿠마린계 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 제1항의 쿠마린계 화합물의 제조방법:

[반응식 2]

(상기 반응식 2에서, Hal은 할로겐 원소 중의 하나이며, X는 C₁-C₆의 알킬렌이고, Y는 제1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다.).
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항의 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제내성 억제용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 쿠마린계 화합물은 항암제에 대한 다약제내성을 유발하는 P-당단백질의 과발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항암제내성 억제용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel;TAX)인 것을 특징으로 하는 항암제내성 억제용 약학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 항암제는 결장암, 직장암, 방광암, 남소암, 유방암 및 폐암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암을 대상으로 하는 항암제내성 억제용 약학적 조성물.