CN103382195B - 苯并吡喃查尔酮类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及有机化学和药物化学领域，具体地说，就是具有抗炎活性的苯并吡喃查尔酮类化合物及其制备方法和用途。所述苯并吡喃查尔酮类化合物具有如下结构：本发明通过实验表明，该化合物对炎症因子iNOS、TNF-α或IL-4具有抑制作用，可用于治疗骨关节炎、风湿性关节炎或哮喘等炎症。
Description
技术领域
本发明涉及有机化学和药物化学领域，具体地说，就是具有抗炎活性的苯并吡喃查尔酮类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
查尔酮类化合物是一类存在于甘草、红花等药用植物中的天然有机化合物，由于其分子结构具有较大的柔性，能与不同的受体结合，因此具有广泛的生物活性，如:抗肿瘤、抑制和清除氧自由基、抗菌、抗病毒、抗溃疡和解痉挛等生物活性。
查尔酮类化合物对肿瘤和炎症的治疗作用，可能是通过其对NF-κB信号传递系统的抑制作用实现的。NF-κB能调节多种参与炎症反应的细胞因子、粘附分子和蛋白酶类的基因转录过程，与炎症的发生密切相关。NF-κB的活化能够促进炎症因子的表达，反过来炎症因子使NF-κB的活性又进一步增强，从而使炎症的发生加重。目前，人们正试图通过阻断NF-κB的激活来达到治疗炎症的目的，临床上常用糖皮质激素、阿斯匹林及水杨酸盐等均为NF-κB抑制剂。
异戊烯基化的查尔酮，由于其分子的基本骨架中存在一个异戊烯基化的侧链(如异戊烯基、香叶基、2,2-二甲基吡喃等)，表现出更多、更强的令人感兴趣的生理活性。
苯并吡喃类查尔酮是异戊烯基化查尔酮类化合物中的一类，其是自二十世纪六十年代以来在植物中所发现的。该类化合物结构特点为在查尔酮的母核的A环或B环上至少有一个苯并吡喃取代基，其主要存在于植物的根，皮，根茎，树干，心木，种子和叶子之中。由于近年来不断发现该类化合物丰富的生物活性作用，目前苯并吡喃类查尔酮类天然产物成为药物化学领域研究的热点之一。苯并吡喃环的存在大大增加了这类化合物相应的生物活性，其对炎症因子iNOS,TNF-α和IL-4都具有较强的抑制作用，在制备治疗骨关节炎、风湿性关节炎和哮喘药物方面具有较大的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型结构的抗炎药物，苯并吡喃查尔酮类化合物或其可药用盐。
本发明的苯并吡喃查尔酮类化合物具有如下结构：
其中，
R1为氢原子、羟基、卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、C1～C6酰氧基；
R2、R3独立地为氢原子、羟基、卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷基氧基、C1～C6酰氧基或环氧；
R4、R5独立地为氢原子、卤素或C1～C6烷基；
R6、R7独立地为氢原子、卤素、C1～C6烷基或C1～C6烷氧基；
R8为带有或不带取代基的芳环基、带有或不带取代基的芳杂环基；其中取代基独立的分别为：-H、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-CF3、C1～C6烷基、卤素取代的C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、羟基或-N(R’)2（其中R’为氢原子、C1～C6烷基、卤素取代的C1～C6烷基）。
作为本发明优选的方案：上述苯并吡喃查尔酮类化合物中，R1为氢原子、羟基、卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基；优选的是R1为氢原子、羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基；进一步优选的是R1为羟基、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基；最优的是R1为羟基。
作为本发明优选的方案：上述苯并吡喃查尔酮类化合物中，R2、R3、R6、R7独立地为氢原子、卤素、C1～C6烷基；进一步优选的是R2、R3、R6、R7独立地为氢原子。
作为本发明优选的方案：上述苯并吡喃查尔酮类化合物中，R4、R5独立地为氢原子或C1～C6烷基；优选的是C1～C6烷基；进一步优选的是甲基或乙基。
作为本发明优选的方案：上述苯并吡喃查尔酮类化合物中，R8为带有或不带取代基的芳基；优选的是R8为带有或不带取代基的苯基。
作为本发明优选的方案：上述苯并吡喃查尔酮类化合物中，R8为带有取代基的苯基，其中取代基独立的分别为：-CN、-OH、卤素、-CF3、C1～C6烷基、卤素取代的C1～C6烷基、C1～C6烷基氧基、苯基、含有1～2个杂原子的5-7元杂环或-N(R’)2，其中所述杂原子为N、O、S；R’为氢原子、苯基、C1～C6烷基或卤素取代的C1～C6烷基。
作为本发明优选的方案：上述苯并吡喃查尔酮类化合物中，R8取代基独立的分别为：-OH、卤素、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、苯基、含有1～2个杂原子的5-7元杂环；优选的是-OH、-F、-Cl、-Br、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、苯基、含有1个N原子的5-7元杂环或-N(R’)2；进一步优选的是-OH、卤素、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、苯基、N-吡咯烷基或-N(R’)2。
进一步优选的是R’为氢原子、苯基、甲基或乙基。
作为本发明优选的方案：R8为带有或不带取代基的芳杂环基，芳杂环基的骨架为含有1～2个杂原子的5-7元杂环，所述杂原子为N、O或S；优选的是所述芳杂环基的骨架为含有1个N原子的5-7元杂环。作为优选的方案：取代基独立的分别为：-CN、-OH、卤素、-CF3、C1～C6烷基、卤素取代的C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、苯基；优选的是-OH、-F、-Cl、-Br、C1～C6烷基、C1～C6烷氧基、苯基；进一步优选的是-OH、卤素、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、苯基。
本发明还提供了上述苯并吡喃查尔酮类化合物的可药用盐：盐酸盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐或磺酸盐。
本发明还提供了上述苯并吡喃查尔酮类化合物或其可药用盐在制备对炎症因子iNOS、TNF-α或IL-4的抑制剂中的用途。
本发明还提供了上述苯并吡喃查尔酮类化合物或其可药用盐在制备治疗骨关节炎、风湿性关节炎或哮喘的用途。
本发明还提供了一种抗炎的药用组合物，含有上述任一种或多种苯并吡喃查尔酮类化合物或其可药用盐。
上述苯并吡喃查尔酮类化合物的合成方法如下：
方法一合成路线：
2,4-二羟基苯乙酮与3-甲基-2-烯-丁醛反应生成化合物A，A与苯环上羟基已被氯甲基甲醚保护的苯甲醛通过微波反应生成目标化合物；
方法二合成路线：
2,4-二羟基苯乙酮与3-甲基-2-烯-丁醛反应生成化合物A，化合物A经由氯甲基甲醚保护后生成的化合物B进一步与不含羟基的苯甲醛反应生成化合物C，用浓盐酸脱去其上的保护基得到目标产物；然后可将其转化为盐酸盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐或磺酸盐。
本发明通过体外抑制实验表明，苯并吡喃查尔酮类化合物I对由脂多糖诱导的一氧化氮和一氧化氮合酶具有抑制作用。
本发明通过卡拉胶诱导的爪肿胀模型实验表明，苯并吡喃查尔酮类化合物I具有抗炎作用。
本发明通过小鼠关节炎模型实验表明，苯并吡喃查尔酮类化合物I具有优良的抗炎活性。
本发明通过Elisa实验表明，苯并吡喃查尔酮类化合物I对TNF-α具有较强抑制作用。
本发明通过绿色荧光蛋白标记实验表明，苯并吡喃查尔酮类化合物I能够抑制炎症因子IL-4。
本发明通过动物药效实验，确定查尔酮衍生物I或其药学组合的小鼠使用剂量范围是1-100mg/kg/day。本领域技术人员容易根据现有技术换算出人用剂量范围。
根据本发明，上述所示化合物及其药学组合以药学上可接受的制剂形式存在：片剂、口服剂、栓剂、滴丸剂、大输液、小针、冻干粉针、胶囊剂、气雾剂、分散片、软膏，包括各种缓释、控释剂型或纳米制剂；以单位剂量形式给药，注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和穴位注射。
附图说明
图1化合物I-2、I-4、I-6、I-8对角叉菜胶诱导的爪肿胀的影响图。
图2化合物I-2对佐剂性关节炎的治疗作用。图A为关节炎评分图；图B为给药期间小鼠体重波动图。
图3为HE染色病理切片观察图。3A为模型组；3B和3C为给药组，化合物I-2浓度分别为10mg/kg和25mg/kg；3D为阳性对照组；3E为正常组。
图4流式细胞仪分析化合物I（10μM）对炎症因子IL-4的抑制率。
图5流式细胞仪分析化合物I（10μM）对肿瘤坏死因子TNF-α的抑制率。
图6ELISA分析化合物I（10μM）对肿瘤坏死因子TNF-α的抑制率。
实施例12，2-二甲基-5-羟基-6-乙酰基-2H-1-苯并吡喃(A)的合成
将6.08g(40mmol)2，4-二羟基苯乙酮加入到100mL圆底烧瓶中，以4mL干燥吡啶溶解，滴加4.20mL(44mmol)3-甲基-2-烯-丁醛后于115°C回流12h。后处理：减压蒸去吡啶，剩余物以150mL水洗，乙酸乙酯(200mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=30：1)得黄色固体4.70g，收率54.3%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.45(s,6H),2.54(s,3H),5.57(d,1H,J=10.0Hz),6.33(d,1H,J=8.8Hz),6.70(d,1H,J=10.0Hz),7.51(d,1H,J=8.8Hz),12.98(s,1H).MS(ES),m/z:217(ES-).
实施例22，2-二甲基-5-甲氧基甲醚-6-乙酰基-2H-1-苯并吡喃(B)的合成
将10.9g(50mmol)化合物A溶于100mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入纯度为60%的NaH4.00g(100mmol)，滴加7.50mL(100mmol)氯甲基甲醚后于室温下反应2h。后处理：将反应物倾入500mL水中，乙酸乙酯(300mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩得黄色液体8.89g，收率67.8%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.44(s,6H),2.57(s,3H),3.52(s,3H),5.01(s,2H),5.67(d,1H,J=10.0Hz),6.61(d,1H,J=8.8Hz),6.66(d,1H,J=10.0Hz),7.51(d,1H,J=8.4Hz).MS(ES),m/z:261.3(ES-).
实施例33’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-4-甲氧基查尔酮(I-1)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，136.1mg(1mmol)对甲氧基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65°C下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=50：1)得橙色固体262.3mg，收率78%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),3,86(s,3H),5.58(d,1H,J=10.0Hz),6.37(d,1H,J=8,8Hz),6.74(d,1H,J=10.0Hz),6.93(d,2H,J=8.4Hz),7.43(d,1H,J=15.6Hz),7.60(d,2H,J=8.8Hz),7.71(d,1H,J=8.8Hz),7.84(d,1H,J=15.2Hz),13.80(s,1H).MS(ES),m/z:335(ES-).
实施例43’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-3，4-二甲氧基查尔酮(I-2)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，166.2mg(1mmol)对3，4-二甲氧基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得橙色固体302.3mg，收率83%.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),3,94(s,3H),3.97(s,3H),5.57(d,1H,J=10.0Hz),6.38(d,1H,J=8,8Hz),6.75(d,1H,J=10.0Hz),6.90(d,1H,J=8.4Hz),7.16(d,1H,J=2.0Hz),7.24(d,1H,J=2.0Hz),7.41(d,1H,J=15.2Hz),7.72(d,1H,J=8.8Hz),7.82(d,1H,J=15.2Hz),13.79(s,1H).MS(ES),m/z:365(ES-).
实施例53’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-2，4，5-三甲氧基查尔酮(I-3)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，196.2mg(1mmol)对2，4，5-二甲氧基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得浅黄色固体321.6mg，收率81%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),3,92(s,3H),3.93(s,3H),3.96(s,3H),5.58(d,1H,J=10.0Hz),6.36(d,1H,J=8,8Hz),6.53(s,1H),6.75(d,1H,J=10.0Hz),7.11(s,1H),7.50(d,1H,J=15.2Hz),7.71(d,1H,J=8.8Hz),8.15(d,1H,J=15.2Hz),13.94(s,1H).MS(ES),m/z:395(ES-).
实施例63’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-3，4，5-三甲氧基查尔酮(I-4)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，196.2mg(1mmol)对3，4，5-二甲氧基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得橙色固体309.2mg，收率78%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),3,90(s,3H),3.93(s,6H),5.59(d,1H,J=10.0Hz),6.38(d,1H,J=8,8Hz),6.75(d,1H,J=10.0Hz),6.87(s,1H),7.42(d,1H,J=15.2Hz),7.72(d,1H,J=8.8Hz),7.78(d,1H,J=15.6Hz),13.71(s,1H).MS(ES),m/z:395(ES-).
实施例73’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-4-苯基查尔酮(I-5)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，196.2mg(1mmol)对4-苯基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65°C下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=50：1)得橙色固体309.8mg，收率81%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),5.60(d,1H,J=10.0Hz),6.39(d,1H,J=8.8Hz),6.76(d,1H,J=10.0Hz),7.39(d,1H,J=7.6Hz),7.46-7.49(2H,m),7.59–7.68(5H,m),7.72-7.77(3H,m),7.90(d,1H,J=15.2Hz),13.72(s,1H).MS(ES),m/z:381(ES-).
实施例83’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-3-氟查尔酮(I-6)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，124.1mg(1mmol)对3-氟苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65°C下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得黄色固体240.4mg，收率74%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),5.60(d,1H,J=10.0Hz),6.39(d,1H,J=8.8Hz),6.76(d,1H,J=10.0Hz),7.10-7.14(1H,m),7.33-7.41(3H,m),7.53(d,1H,J=15.6Hz),7.70(d,1H,J=8.8Hz),7.80(d,1H,J=15.2Hz),13.58(s,1H).MS(ES),m/z:323(ES-)
实施例93’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-4-氯查尔酮(I-7)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，140.6mg(1mmol)对4-氯苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=50：1)得橙色固体279.6mg，收率82%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),5.59(d,1H,J=10.0Hz),6.38(d,1H,J=8.8Hz),6.74(d,1H,J=10.0Hz),7.39(d,1H,J=8.4Hz),7.52(d,1H,J=15.2Hz),7.57(d,2H,J=8.8Hz),7.70(d,1H,J=8.8Hz),7.80(d,1H,J=15.6Hz),13.68(s,1H).MS(ES),m/z:339(ES-).
实施例103’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-4-溴查尔酮(I-8)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，185.0mg(1mmol)对4-溴苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=30：1)得橙色固体304.3mg，收率79%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),5.59(d,1H,J=10.0Hz),6.38(d,1H,J=8.8Hz),6.74(d,1H,J=10.0Hz),7.49-7.57(5H,m),7.69(d,1H,J=8.8Hz),7.78(d,1H,J=15.2Hz),13.60(s,1H).MS(ES),m/z:383(ES-).
实施例113’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-2-氟-4-甲氧基查尔酮(I-9)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，154.1mg(1mmol)对2-氟-4-甲氧基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=40：1)得橙色固体283.5mg，收率80%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),3.85(s,3H),5.58(d,1H,J=10.0Hz),6.37(d,1H,J=8.8Hz),6.66(dd,1H,J=12.4Hz,2.4Hz),6.74(d,2H,J=9.6Hz),7.53(d,1H,J=8.4Hz),7.58(d,1H,J=5.2Hz),7.69(d,1H,J=9.2Hz),7.89(d,1H,J=15.6Hz),13.75(s,1H).MS(ES),m/z:353(ES-).
实施例123’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-4-吡咯查尔酮(I-10)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，175.2mg(1mmol)对4-吡咯苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=20：1)得橙色固体292.9mg，收率78%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),2.04(q,4H,J=6.0Hz),3.35(d,4H,J=6.0Hz),5.57(d,1H,J=10.0Hz),6.35(d,1H,J=8.8Hz),6.55(d,2H,J=8.0Hz),6.75(d,1H,J=10.0Hz),7.32(d,1H,J=15.2Hz),7.53(d,2H,J=8.4Hz),7.72(d,1H,J=8.8Hz),7.85(d,1H,J=15.2Hz),14.10(s,1H).MS(ES),m/z:374(ES-).
实施例133’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-4-二苯胺查尔酮(I-11)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，273.3mg(1mmol)4-二苯胺基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=50：1)得橙色固体359.9mg，收率76%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),2.54(s,1H),5.58(d,1H,J=10.0Hz),6.36(d,1H,J=9.2Hz),6.74(d,1H,J=10.0Hz),7.01(d,2H,J=8.4Hz),7.09–7.16(5H,m),7.29–7.33(4H,m),7.40(d,1H,J=15.2Hz),7.48(d,2H,J=8.4Hz),7.69(d,1H,J=8.8Hz),7.81(d,1H,J=15.6Hz),13.76(s,1H).MS(ES),m/z:474(ES+).
实施例143’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基查尔酮(I-12)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，106.1mg(1mmol)苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=60：1)得橙色固体245.1mg，收率80%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),5.59(d,1H,J=10.0Hz),6.38(d,1H,J=9.2Hz),6.75(d,1H,J=10.0Hz),7.42-7.43(3H,m),7.55(d,1H,J=15.6Hz),7.64-7.66(2H,m),7.12(d,1H,J=8.8Hz),7.86(d,1H,J=15.6Hz),13.68(s,1H).MS(ES),m/z:305(ES-).
实施例153’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’，4-二羟基-3-甲氧基查尔酮(I-13)
于25mL茄形瓶中加入218.3mg(1mmol)化合物A，196.2mg(1mmol)羟基经氯甲基甲醚保护后的4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，200mg(0.6mmol)相转移催化剂四丁基溴化铵，20%氢氧化钠水溶液6mL。将装有空气冷凝管的上述茄形瓶置于MCL-Ⅲ型微波合成仪中，于脉冲电流下反应5min。后处理：生成物以150mL乙酸乙酯溶解后，有机相用稀盐酸水溶液洗至中性，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体B的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65°C下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=6：1)得黄色固体126.9mg，收率36%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),3.98(s,3H),5.59(d,1H,J=10.0Hz),5.92(s,1H),6.37(d,1H,J=8.8Hz),6.75(d,1H,J=10.0Hz),6.95(d,1H,J=8.4Hz),7.12(d,1H,J=1.6Hz),7.22(dd,1H,J=8.0,1.6Hz),7.39(d,1H,J=15.6Hz),7.71(d,1H,J=8.8Hz),7.80(d,1H,J=15.2Hz),13.79(s,1H).MS(ES),m/z:353(ES+).
实施例163’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’，2，5-三羟基查尔酮(I-14)
于25mL茄形瓶中加入218.3mg(1mmol)化合物A，266.2mg(1mmol)羟基经氯甲基甲醚保护后的2，5-二羟基苯甲醛，200mg(0.6mmol)相转移催化剂四丁基溴化铵，20%氢氧化钠水溶液6mL。将装有空气冷凝管的上述茄形瓶置于MCL-Ⅲ型微波合成仪中，于脉冲电流下反应5min。后处理：生成物以150mL乙酸乙酯溶解后，有机相用稀盐酸水溶液洗至中性，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65°C下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=30：1)得黄色固体111.7mg，收率33%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),5.76(d,1H,J=10.0Hz),6.42(d,1H,J=9.2Hz),6.63(d,1H,J=10.0Hz),6.77(s,2H),7.79(d,1H,J=15.6Hz),8.09–8.13(2H,m),8.93(s,1H),9.67(s,1H),14.02(s,1H).MS(ES),m/z:337(ES-).
实施例173’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’，3，4-三羟基查尔酮(I-15)
于25mL茄形瓶中加入218.3mg(1mmol)化合物A，266.2mg(1mmol)羟基经氯甲基甲醚保护后的3，4-二羟基苯甲醛，200mg(0.6mmol)相转移催化剂四丁基溴化铵，20%氢氧化钠水溶液6mL。将装有空气冷凝管的上述茄形瓶置于MCL-Ⅲ型微波合成仪中，于脉冲电流下反应5min。后处理：生成物以150mL乙酸乙酯溶解后，有机相用稀盐酸水溶液洗至中性，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65°C下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=25：1)得黄色固体128.6mg，收率38%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),5.58(d,1H,J=10.0Hz),6.36(d,1H,J=7.6Hz),6.74(d,1H,J=9.6Hz),6.89(d,1H,J=7.2Hz),7.11(d,1H,J=6.4Hz),7.18(s,1H),7.37(d,1H,J=14.8Hz),7.69(d,1H,J=8.0Hz),7.73(d,1H,J=7.2Hz),13.78(s,1H).MS(ES),m/z:337(ES-).
实施例183’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’，4-二羟基-3-乙氧基查尔酮(I-16)
于25mL茄形瓶中加入218.3mg(1mmol)化合物A，210.2mg(1mmol)羟基经氯甲基甲醚保护后的4-羟基-3-乙氧基苯甲醛，200mg(0.6mmol)相转移催化剂四丁基溴化铵，20%氢氧化钠水溶液6mL。将装有空气冷凝管的上述茄形瓶置于MCL-Ⅲ型微波合成仪中，于脉冲电流下反应5min。后处理：生成物以150mL乙酸乙酯溶解后，有机相用稀盐酸水溶液洗至中性，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=25：1)得黄色固体124.6mg，收率34%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),4.17(q,2H,J=6.8Hz),5.59(d,1H,J=10.0Hz),6.00(s,1H),6.37(d,2H,J=9.2Hz),6.74(d,1H,J=10.0Hz),6.95(d,1H,J=8.4Hz),7.11(d,1H,J=1.6Hz),7.21(dd,1H,J=8.0,2.0Hz),7.38(d,1H,J=15.6Hz),7.71(d,1H,J=8.8Hz),7.80(d,1H,J=15.2Hz),13.80(s,1H).MS(ES),m/z:367(ES+).
实施例193’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’，3-二羟基-4-甲氧基查尔酮(I-17)
于25mL茄形瓶中加入218.3mg(1mmol)化合物A，196.2mg(1mmol)羟基经氯甲基甲醚保护后的3-羟基-4-甲氧基苯甲醛，200mg(0.6mmol)相转移催化剂四丁基溴化铵，20%氢氧化钠水溶液6mL。将装有空气冷凝管的上述茄形瓶置于MCL-Ⅲ型微波合成仪中，于脉冲电流下反应5min。后处理：生成物以150mL乙酸乙酯溶解后，有机相用稀盐酸水溶液洗至中性，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=9：1)得黄色固体125.8mg，收率37%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),3.95(s,3H),5.58(d,1H,J=10.0Hz),5.66(s,1H),6.37(d,1H,J=8.8Hz),6.74(d,1H,J=10.0Hz),6.87(d,1H,J=8.4Hz),7.13(dd,1H,J=8.4,1.6Hz),7.28(d,1H,J=1.2Hz),7.41(d,1H,J=15.2Hz),7.70(d,1H,J=8.8Hz),7.78(d,1H,J=15.6Hz),13.80(s,1H).MS(ES),m/z:351(ES-).
实施例203’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’，2-二羟基-5-氯查尔酮(I-18)
于25mL茄形瓶中加入218.3mg(1mmol)化合物A，220.6mg(1mmol)羟基经氯甲基甲醚保护后的5-氯-2-羟基苯甲醛，200mg(0.6mmol)相转移催化剂四丁基溴化铵，20%氢氧化钠水溶液6mL。将装有空气冷凝管的上述茄形瓶置于MCL-Ⅲ型微波合成仪中，于脉冲电流下反应5min。后处理：生成物以150mL乙酸乙酯溶解后，有机相用稀盐酸水溶液洗至中性，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得黄色固体103.5mg，收率29%。1H NMR(400MHz,DMSO)δ:1.22(s,6H),5.76(d,1H,J=10.0Hz),6.43(d,1H,J=8.8Hz),6.63(d,1H,J=10.0Hz),6.94(d,1H,J=8.4Hz),7.30(dd,1H,J=8.4,2.4Hz),7.98(d,1H,J=15.6Hz),8.08(d,1H,J=10.0Hz),8.11(s,1H),8.21(d,1H,J=9.2Hz),13.93(s,1H).MS(ES),m/z:355(ES-).
实施例213’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’，3-二羟基查尔酮(I-19)
于25mL茄形瓶中加入218.3mg(1mmol)化合物A，166.2mg(1mmol)羟基经氯甲基甲醚保护后的3-羟基苯甲醛，200mg(0.6mmol)相转移催化剂四丁基溴化铵，20%氢氧化钠水溶液6mL。将装有空气冷凝管的上述茄形瓶置于MCL-Ⅲ型微波合成仪中，于脉冲电流下反应5min。后处理：生成物以150mL乙酸乙酯溶解后，有机相用稀盐酸水溶液洗至中性，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得黄色固体106.4mg，收率33%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),5.76(d,1H,J=10.0Hz),6.38(d,1H,J=8.8Hz),6.74(d,1H,J=10.0Hz),6.89(d,1H,J=8.0Hz),7.11(s,1H),7.21(d,1H,J=7.6Hz),7.27(t,1H,J=8.0Hz),7.51(d,1H,J=15.6Hz),7.70(d,1H,J=9.2Hz),7.78(d,1H,J=15.6Hz),13.65(s,1H).MS(ES),m/z:321(ES-).
实施例223’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’，4-二羟基-3，5-二甲氧基查尔酮(I-20)
于25mL茄形瓶中加入218.3mg(1mmol)化合物A，166.2mg(1mmol)羟基经氯甲基甲醚保护后的4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲醛，200mg(0.6mmol)相转移催化剂四丁基溴化铵，20%氢氧化钠水溶液6mL。将装有空气冷凝管的上述茄形瓶置于MCL-Ⅲ型微波合成仪中，于脉冲电流下反应5min。后处理：生成物以150mL乙酸乙酯溶解后，有机相用稀盐酸水溶液洗至中性，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得黄色固体137.7mg，收率36%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),3.97(s,6H),5.59(d,1H,J=10.0Hz),5.86(s,1H),6.38(d,1H,J=9.2Hz),6.75(d,1H,J=10.0Hz),6.89(s,2H),7.39(d,1H,J=15.2Hz),7.72(d,1H,J=8.8Hz),7.79(d,1H,J=15.2Hz),13.79(s,1H).MS(ES),m/z:383(ES+).
实施例233’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-4-氟查尔酮(I-21)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，124.1mg(1mmol)对4-氟苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得黄色固体249.7mg，收率77%。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),5.59(d,1H,J=10.0Hz),6.38(d,1H,J=8.8Hz),6.74(d,1H,J=10.0Hz),7.10(t,2H,J=8.8Hz),7.47(d,1H,J=15.6Hz),7.62-7.65(2H,m),7.70(d,1H,J=8.8Hz),7.82(d,1H,J=15.6Hz),13.65(s,1H).MS(ES),m/z:323(ES-).
实施例243’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-3-甲氧基查尔酮(I-22)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，136.1mg(1mmol)对3-甲氧基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得黄色固体272.5mg，收率81%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.47(s,6H),3.86(s,3H),5.59(d,1H,J=10.0Hz),6.38(d,1H,J=9.2Hz),6.74(d,1H,J=10.0Hz),6.95(dd,1H,J=8.4,2.4Hz),7.15(s,1H),7.23(d,1H,J=9.2Hz),7.32(t,1H,J=8.0Hz),7.52(d,1H,J=15.6Hz),7.71(d,1H,J=8.8Hz),7.82(d,1H,J=15.6Hz),13.65(s,1H).MS(ES),m/z:335(ES-).
实施例253’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-4-二乙胺基查尔酮(I-23)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，177.2mg(1mmol)对4-二乙胺基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65℃下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得黄色固体286.9mg，收率76%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.23(6H,m)1.47(s,6H),3.40(q,4H,J=7.2Hz),5.57(d,1H,J=10.0Hz),6.35(d,1H,J=9.2Hz),6.65(d,2H,J=8.8Hz),6.75(d,1H,J=10.0Hz),7.31(d,1H,J=15.6Hz),7.52(d,1H,J=8.8Hz),7.71(d,1H,J=9.2Hz),7.83(d,1H,J=15.2Hz),14.10(s,1H).MS(ES),m/z:378(ES+).
实施例263’,4’-(2,2-二甲基吡喃)-2’-羟基-2，3，4-三甲氧基查尔酮(I-24)
于25mL茄形瓶中加入262.3mg(1mmol)化合物B，196.2mg(1mmol)对2，3，4-三甲氧基苯甲醛，以15mL甲醇溶解。滴加浓度为50%氢氧化钾水溶液4mL，N2保护下室温反应24h。后处理：将反应物倾入100mL水中，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥。过滤，浓缩，于浓缩后含有中间体C的物质中加入3mL甲醇，20%的稀盐酸溶液2mL，65°C下回流1h。该反应物以30mL水洗，乙酸乙酯(20mL×3)萃取，饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯=15：1)得黄色固体305.2mg，收率77%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.44(s,6H),3.90(d,6H,J=9.2Hz),3.97(s,3H),5.58(d,1H,J=10.0Hz),6.37(d,1H,J=8.8Hz),6.72(d,1H,J=8.8Hz),6.75(d,1H,J=10.0Hz),7.37(d,1H,J=8.8Hz),7.60(d,1H,J=15.2Hz),7.70(d,1H,J=9.2Hz),8.03(d，1H,J=15.6Hz),13.84(s,1H).MS(ES),m/z:397(ES+).
实施例27化合物I对LPS诱导的RAW264.7细胞释放的NO的抑制作用
1、方法：细胞按5×103/孔接种于96孔板中，每孔100μl，贴壁4h后，加入10μM浓度的化合物I-1至I-24（正常对照孔或模型对照孔加入等体积的培养基）孵育2h，再加入LPS使终浓度为1μg/mL孵育22h，正常组加入生理盐水。Griess法测定上清中NO2 -的含量，用以反应NO水平。吲哚美辛作为阳性对照。
2、结论
表1是化合物I（10μM）对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞释放的NO的抑制率。结果表明化合物I-2、I-4、I-6、I-8对LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞释放的NO的有很好的抑制作用。
表1
| 样品编号 | 一氧化氮抑制率(%)±SD | 样品编号 | 一氧化氮抑制率(%)±SD |
| 吲哚美辛 | 59.2+2.1 | ||
| I-1 | 26.6+13.6 | I-13 | 52.8+5.8 |
| I-2 | 78.4+4.6 | I-14 | 72.5+6.7 |
| I-3 | 40.5+11.3 | I-15 | 69.5+4.8 |
| I-4 | 80.2+5.9 | I-16 | 70.2+5.3 |
| I-5 | 41.6+12.5 | I-17 | 63.7+6.3 |
| I-6 | 71.9+8.4 | I-18 | 61.2+5.4 |
| I-7 | 66.2+6.1 | I-19 | 46.4+5.9 |
| I-8 | 81.4+8.0 | I-20 | 51.2+7.1 |
| I-9 | 51.3+5.4 | I-21 | 61.5+2.4 |
| I-10 | 62.8+5.1 | I-22 | 66.5+5.6 |
| I-11 | 36.2+1.9 | I-23 | 56.7+7.7 |
| I-12 | 62.9+5.1 | I-24 | 63.7+3.5 |
实施例28化合物I-2、I-4、I-6、I-8对iNOS活性影响
1、方法：RAW264.7细胞培养在25cm2细胞瓶中，待长至50%左右时，更换含5μg/L LPS的培养基培养24h，用D-Hanks漂洗3次，刮取细胞、离心、重悬。将细胞5×103/孔接种于96孔板中，贴壁4h后，给药组加入不同浓度的I-2、I-4、I-6、I-8药液，空白对照组加入等体积培养基，孵育8h后直接取该96孔板用荧光酶标仪检测。
2、结论
表2是化合物I-2、I-4、I-6、I-8对一氧化氮氧合酶活性影响。结果表明四个化合物对一氧化氮氧合酶的活性的抑制作用均好于阳性对照物吲哚美辛。
表2
| 化合物 | 吲哚美辛 | I-2 | I-4 | I-6 | I-8 |
| iNOS/IC50(μM) | 20.0 | 7.9 | 6.2 | 5.4 | 17.8 |
实施例29化合物I-2、I-4、I-6、I-8对卡拉胶诱导的小鼠足肿胀的抑制作用
1、方法：雄性ICR小鼠(体重18-22g)，于温度22℃，相对湿度55.5%的树脂笼子中以12h制昼夜交替饲养2周，并任意给以食物和水。实验组和对照组小鼠均给以0.5%羧甲基纤维素钠和蒸馏水的混合溶液。吲哚美辛（10mg/kg）溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中作为阳性对照。
实验组小鼠分别于腹腔注射I-2、I-4、I-6、I-8（10mg/kg），对照组小鼠注射吲哚美辛。30min后，实验组和对照组均于小鼠皮下注射1%的卡拉胶致炎。致炎后1h以千分尺测量致炎足爪的厚度，然后每隔1h测量一次，共测量5次。最后，以致炎前后足足厚度的差值计算肿胀度，并计算各组用药对肿胀的抑制率。
2、结论
图1是化合物I-2、I-4、I-6、I-8对角叉莱胶诱导的爪肿胀的影响图。结果表明给药4h后，足肿胀达到最大值时，以I-2（10mg/kg）为治疗药物的实验组足肿胀程度最小，说明该化合物能很好抑制足肿胀。
实施例30化合物I-2对佐剂性关节炎的治疗作用
1、方法：将12周雌性lewis大鼠随机分为6组，于大鼠尾巴基部皮内注射完全弗氏佐剂（CFA）,每天测量关节的肿胀度，每三天测量一次体重。于佐剂免疫14天后，大鼠随机分为4组，其中，一组继续注射甲基纤维素溶液，一组注射10mg/kg吲哚美辛，另外两组分别按照10mg/kg和25mg/kg给药。正常对照组小鼠每天注射甲基纤维素溶液，为期21天。
小鼠断颈处死后，取其肢腕关节及后肢踝关节，经10%中性福尔马林固定，5%硝酸溶液脱钙后，石蜡包埋，切片，H&E染色。
2、结论
图2为化合物I-2不同浓度（10mg/kg和25mg/kg）对佐剂性关节炎的治疗作用。图2A为关节炎评分图；图2B为给药期间小鼠体重波动图。结果表明，化合物I-2对关节炎的治疗作用与药物浓度有关，25mg/kg较10mg/kg治疗效果好。当其浓度为25mg/kg时，小鼠关节炎评分较小，与治疗组相当；经治疗后小鼠体重增长最多。
图3为HE染色病理切片观察图。3A为模型组；3B和3C为给药组，化合物I-2浓度分别为10mg/kg和25mg/kg；3D为阳性对照组；3E为正常组。与正常组对照，两个浓度的化合物I-2均有清除炎症细胞的作用，并且在给药组中，浓度为25mg/kg的实验组效果最好。
实施例31化合物I对炎症因子IL-4的抑制作用
1、方法：取转IL-4-GFP基因报告小鼠脾脏细胞，加到PBS溶液中，冰浴。培养皿中研碎脾脏，加入PBS离心。去上清，加2-3mL红细胞裂解液，吹打，静置。加10ml预先配置的FBS的1640培养液，过滤，离心。去上清，加配好的培养液混匀得到悬液。在总样体积中加入稀释后细胞因子IL-2、IL-4和抗体ConA。将细胞4×106/孔接种于96孔板中，同时加入预先用FBS稀释的化合物I，于37℃，CO2浓度5%的环境中培养48h。
48h后，收集所培养的细胞进行CD-4染色，然后进行流式细胞仪检测。
2、图4为流式细胞仪分析化合物I（10μM）对炎症因子IL-4的抑制率。结果表明化合物I对炎症因子IL-4均有较强抑制作用，其中以化合物I-14、I-15抑制效果最好，说明该类化合物在由炎症因子IL-4引起的疾病方面具有重要治疗作用。
IL-4-GFP抑制率（%）=100×（加化合物后IL-4-GFP比率－负对照IL-4-GFP比率）/负对照IL-4-GFP比率
实施例32化合物I对炎症因子TNF-α的抑制作用
1、方法：取转TNF-α-GFP基因报告小鼠加到PBS溶液中，冰浴。培养皿中研碎脾脏，加入PBS离心。去上清，加红细胞裂解液，吹打，静置。加预先配置的FBS的1640培养液，过滤，离心。去上清，加配好的培养液混匀得到悬液。在总样体积中加入稀释后细胞因子TNF-α和抗体ConA。将细胞4×106/孔接种于96孔板中，同时加入预先用FBS稀释的化合物I，于37℃，CO2浓度5%的环境中培养48h。
48h后，收集所培养的细胞进行CD-4染色，然后进行流式细胞仪检测。
2、结论
图5流式细胞仪分析化合物I（10μM）对肿瘤坏死因子TNF-α的抑制率。结果化合物I大部分对TNF-α有较强抑制作用。
TNF-α抑制率（%）=100×（加化合物后TNF-α比率－负对照TNF-α比率）/负对照TNF-α比率
实施例33化合物I对炎症因子TNF-α的抑制作用
1、方法：按照人肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒说明书上操作，最后在酶标仪上测定吸光度并分析数据。
图6ELISA分析化合物I（10μM）对肿瘤坏死因子TNF-α的抑制率。结果表明化合物I大部分对TNF-α有较强抑制作用。
TNF-α抑制率（%）=100×（加化合物后TNF-α比率－负对照TNF-α比率）/负对照TNF-α比率。
Claims (5)
1.苯并吡喃查尔酮类化合物，其特征在于具有如下结构：
2.权利要求1所述的苯并吡喃查尔酮类化合物的可药用盐。
3.权利要求1所述的苯并吡喃查尔酮类化合物或其可药用盐在制备对炎症因子iNOS的抑制剂中的用途。
4.权利要求1所述的苯并吡喃查尔酮类化合物或其可药用盐在制备治疗骨关节炎、风湿性关节炎或哮喘药物中的用途。
5.一种抗炎的药用组合物，含有权利要求1所述的苯并吡喃查尔酮类化合物或其可药用盐。
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