CN106619586B - L6h3制备帕金森病药物等的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了L6H3在制备用于改善帕金森病症状和修复神经元损伤的药物中的应用，具备用于治疗帕金森病的前景。

Description

L6H3制备帕金森病药物等的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，本发明提供了一种化合物(L6H3)在制备用于治疗帕金森病等的药物中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，简称为PD)是一种常见的神经系统变性疾病，又称震颤麻痹，常见于中老年人。PD的病理特征主要是中脑黑质多巴胺(Dopamine，简称为DA)系统神经元丧失、多巴胺含量显著下降，神经元细胞有路易小体(Lewy body)出现。临床上的症状表现为静止性震颤、运动徐缓、肌肉强直、姿势步态障碍等不自主的异常运动行为。

PD病变复杂，发病机制尚未完全阐明，可能的致病机理包括：PD患者纹状体中DA含量减少，纹状体的抑制性作用降低，而乙酰胆碱(Aacetylcholine，Ach)含量却无改变，则Ach的兴奋性作用相对增强，纹状体DA含量降低而使胆碱(Ach)能系统的功能相对亢进；Glu的异常增高对神经细胞有毒性作用，不仅PD病人在运动环路中存在继发的Glu能传导障碍，而且Glu作为兴奋性氨基酸可造成神经元的损伤；纹状体的GABA水平的增高，输出到苍白球外侧部的GABA增加，使得基底节核团活性紊乱，抑制运动功能发挥。

外科治疗PD主要采用苍白球和丘脑的射频毁损术，这在10年前比较推崇，但由于其为破坏性手术，且复发率较高、并发症多，目前已较少采用。目前临床上治疗PD的方法包括多巴胺替代治疗、单胺氧化酶抑制剂、金刚烷胺、抗胆碱能药物及多巴胺受体激动剂等，但是这些药物只能暂时减轻或缓解症状，而不能阻止PD的进程，而且长期应用抗PD药物会相继出现多种并发症。现有技术已经逐渐将注意力转移到纹状体内干细胞移植上，以修复神经元来对PD治本。

本发明人没有受现有技术的启示去采用流行的干细胞移植，而是通过自身的长期研究和实验，尤其是凭了些运气，令人意外地从天文数字般多的现有化合物中发现了一种化合物(L6H3)，其不仅能改善PD症状，而且对神经元有修护作用，既治标又治本，效果远优于其类似物，具备作为新一代PD药物的前景。另外，该化合物合成步骤简单，适合大规模制备，从而方便推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的L6H3的用途，用于治疗帕金森病等，尤其是其不但能改善帕金森病症状，而且能修复脑神经元损伤，从而从根本上治疗帕金森病。

具体而言，在第一方面，本发明提供了L6H3在制备用于改善帕金森病症状的药物中的应用。在本文中，改善具有其常规含义，尤其指的是将帕金森病症状往症状消失的方向修正或调整，包括症状的严重程度降低。在本发明的具体实施方式中，帕金森病症状是APO诱导的旋转。

本发明人发现，L6H3对帕金森病症状的改善具有持续性，即停药后(至少停药后约一周的时间)仍旧在改善帕金森病症状，不仅仅是维持已有的症状，更远远优于现有药物停药后帕金森病症状出现的恶化反弹(加重)。因此优选在本发明第一方面的应用中，改善包括用药时改善和停药后改善。更优选其中，停药是停药3-10天，优选是5-7天。这样无需连续不断用药的特性对于患者的顺应性是非常有利的。

在第二方面，本发明提供了L6H3在制备用于修复脑神经元损伤的药物中的应用。在本文中，修复具有其常规含义，尤其指的是脑神经元损伤后进行的修补恢复。脑神经元通常被认为是不可再生的，即使有少量再生，但是其再生量极少。而本发明人发现，L6H3能对6-OHDA引起的多巴胺能神经元损伤起到恢复功能，使得该神经元的数量得以恢复。

优选在本发明第二方面的应用中，神经元是多巴胺能神经元。

也优选在本发明第一方面的应用中，损伤是由6-OHDA引起的。

在第三方面，本发明提供了L6H3在制备用于治疗帕金森病的药物中的应用。本发明人发现，对于帕金森病的治疗，L6H3不但能治标，而且有治本的作用。

L6H3可以单独作为有效成分来改善帕金森病症状和修复脑神经元损伤，用于治疗帕金森病。因此优选本发明第一、二和/或三方面的应用是L6H3单独作为有效成分的应用，即L6H3单独作为有效成分在制备用于改善帕金森病症状、修复脑神经元损伤和/或治疗帕金森病的药物中的应用。

L6H3通常与药学上可接受的辅料配置为药物制剂来给药。在本文中，药学上可接受的辅料指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、载体、溶剂或其他制剂辅料。例如，稀释剂、赋形剂，如微晶纤维素、甘露醇等；表面活性剂，如十六烷醇；溶剂，如水、缓冲液、生理盐水等。另外，优选在本发明第一、二和/或三方面的应用中，药物是脑输注制剂。

本发明取得的有益效果在于：L6H3不但能改善帕金森病症状，而且能从根本上修复脑神经元损伤，效果优于其类似物，具有治疗帕金森病的前景，另外它制备简便，方便推广应用。

以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明

图1显示了APO诱发的大鼠旋转次数，其中，^**表示与假手术组(Sham)相比，P<0.01；^##表示与PD组相比，P<0.01；^#表示与PD组相比，P<0.05；^&表示与给药后第2周(图中第6周)的PD+Madopar组相比，P<0.05。

图2显示了多巴胺能阳性神经元的免疫组化染色结果。

具体实施方式

以下通过具体实验进一步说明本发明的内容。如未详尽之处，可以参见《现代药学实验教程》、《中国药典》以及药物监管部门(如，CFDA)的相关规定和指引等。

实施例1 L6H3的合成

将1mmol相应的取代香草醛和4-乙基苯乙酮溶于30mL无水乙醇中，加入5滴浓硫酸，60℃反应10h后，用TLC检测反应的进行。反应完后，加入3倍反应液体积的水析出沉淀，干燥后得淡黄色粉末状产物，再经硅胶柱色谱纯化得到纯度98％的化合物(orangecrystal,20.1％yield)，其理化参数如下：mp 156.4～158.7℃.¹H-NMR(CDCl₃),δ:8.014(d,J＝8.4Hz,2H,H-2’,H-6’),7.772(d,J＝15.6Hz,1H,H-β),7.537(d,J＝9Hz,2H,H-2,H-6),7.342(d,J＝15.6Hz,1H,H-α),6.960(d,J＝9Hz,2H,H-3,H-5),6.686(d,J＝8.4Hz,2H,H-3’,H-5’),3.052(s,6H,N(CH₃)₂-4’).ESI-MS m/z:285.3(M+1)⁺。

实施例2大鼠帕金森病模型的构建

将大鼠用10％水合氯醛腹腔注射(0.3mL/l00g)麻醉后，应用耳杆将其头部固定在立体定位仪上，剪毛消毒，在头背中部纵向切口，暴露前囟和人字点。选右侧纹状体为注射区，定位坐标：前囟0.7mm，中线右旁3.0mm，硬膜下5.5mm。微量注射器吸取含有2.0g/L维生素C的生理盐水配制而成的1.5μg/μL 6-羟多巴胺(6-OHDA)溶液10μL，使用微量注射泵以10nL/sec的速度进行注射，且为能使药物充分弥散，每注射5μL留针5min，注射完毕再留针10min，最后缓慢退出注射针，缝合伤口，待其清醒。另取15只假手术组大鼠，按上述同样方法和坐标操作，注射等体积含有2.0g/L维生素C的生理盐水。操作过程按无菌手术规程进行，留针后肌肉注射青霉素20万单位/只，缝合，清醒后正常饲养。

术后第1周开始对大鼠进行行为学检测，每周1次，连续4周，每次用0.1g/L的阿朴吗啡(APO)溶液腹腔注射(0.5mg/kg)诱发大鼠旋转行为，观察记录每分钟向健侧旋转次数及40min旋转的总次数。旋转360度为一转(r)，以大鼠旋转圈数≥7r/min且旋转圈数稳定在该水平时认定PD大鼠模型建立成功。

本次造模共成功45只。另取大鼠施行以上手术，但是不注射6-OHDA，作为假手术组(SHAM)，即正常对照。

实施例3 L6H3对PD模型大鼠的药效实验

将造模成功的大鼠随机分成PD组、PD+L6H3组和PD+Madopar组，每组15只。其中，PD+L6H3组大鼠用10％水合氯醛(0.3mL/l00g)腹腔注射麻醉后，将其头部固定在大鼠脑立体定位仪上，剪毛消毒，在头背中部纵向切口，暴露颅骨，去除骨膜后，将其钻孔并将引导管插入原造模位点5mm深处。并在引导管周围固定3个螺丝，与引导管呈三角形排列，最后用牙科水泥固定。将大鼠头部的引导管与给药管芯相连，每天给予配置好的L6H3溶液(1.5μg/μL)10μL，设定1uL/100sec的给药速率进行给药，此时大鼠可在一定范围内自由活动，连续给药14天。

另外，作为模型对照的PD组实施与以上基本相同的步骤，但是给药的溶液中不含L6H3；作为阳性对照的PD+Madopar组，连续灌胃给药美多巴(Madopar，50mg/Kg)14天。

分别于造模后第1-4周、给药后第1、2周和停药后1周，大鼠用APO溶液诱导进行大鼠行为学实验。结果如图1(其中依次为造模后第1-4周、给药后第1-2周(图中第5-6周)及停药后第1周(图中第7周))所示，假手术组无旋转行为，而PD组、PD+L6H3组和PD+Madopar组大鼠都表现出以健侧前肢或后肢为支点、身体环曲、首尾相接地原地旋转，伴觅食样动作，在造模后3周内旋转圈数有上升趋势，第3周至第4周旋转圈数基本稳定，且转圈数≥7r/min，部分动物尾僵直、震颤、好斗、对外界刺激敏感、易于激惹及步态不稳现象，旋转行为在给药后15-30min内最为迅速，30min后旋转明显变慢；给药后的第1周，与PD组相比，PD+L6H3组和PD+Madopar组大鼠的旋转圈数有下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)；给药后的第2周，PD+L6H3组和PD+Madopar组与阳性对照PD+Madopar组相似，与PD组相比，均显示出对阿扑吗啡诱导的旋转行为的明显抑制作用(P<0.05)；而停药后1周，PD+L6H3组大鼠的旋转圈数仍旧有下降趋势，明显比PD+Madopar组降低(P<0.05)；而PD+Madopar组大鼠的旋转圈数与给药后的第2周同组比呈明显上升趋势(P<0.05)。所以，用L6H3和美多芭治疗2周后均明显改善PD症状(大鼠的旋转行为)，尤其是停药1周后，PD+L6H3组大鼠的PD症状继续得到改善，而PD+Madopar组大鼠的疗效没有持续性。

然后，假手术组、PD组、PD+L6H3组和PD+Madopar组每组随机各取5只大鼠，用水合氯醛腹腔注射麻醉后，开胸腔充分暴露心脏，同时剪开右心耳，由左心室心尖处插入输液管，先快速滴注温生理盐水，使组织内的血液被冲洗干净，至肝、肺等组织完全泛白为止。接着以4％多聚甲醛(250mL-500mL)左右，灌注固定30min-60min，直至大鼠肝脏变硬、肢体僵硬即完成固定。接着断头，取整个脑组织，置于4％多聚甲醛溶液中，4℃固定3天。再冠状切取中脑黑质部约5mm组织，梯度脱水，透明，石蜡包埋。最后，进行连续冠状切片(6μm)，进行免疫组化染色，于显微镜下观察大鼠黑质中多巴胺能阳性神经元(即酪氨酸羟化酶，TH)神经纤维。结果如图2所示，假手术组大鼠黑质中的TH免疫阳性神经元清晰可见，DA能神经元的胞体和纤维染色较深，有明显可见的免疫阳性突起；对于PD模型大鼠，TH免疫阳性神经元损伤严重，仅剩少量残余的神经纤维，损伤程度高达90％左右，经过L6H3处理后，黑质区的TH含量增多，表明L6H3对PD模型大鼠的多巴胺能神经元严重损害有明显的修复作用，减少了受损的神经元；而美多巴对PD模型大鼠的多巴胺能神经元严重损害并无改善作用。

Claims (4)

1.L6H3在制备用于改善帕金森病症状的药物中的应用，其中改善包括用药时改善和停药3-10天后改善，而且其中药物是脑输注制剂

2.权利要求1所述的应用，其中帕金森病症状是APO诱导的旋转。

3.权利要求1所述的应用，其中停药3-10天是停药5-7天。

4.权利要求1-3之任一所述的应用，其是L6H3单独作为有效成分的应用。