CN102379873B - 一种急性全身性猴帕金森病模型及其药物筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种急性全身性猴帕金森病模型的制备方法，将剂量为0.36mg/kg的MPTP施用于猴，每隔一天施用一次，连续施用5次。所述的施用方式是静脉注射。本发明提供了一种筛选治疗急性帕金森病的药物的方法。本发明经外周静脉连续注射MPTP可以建立症状表现类似中晚期帕金森病患者的急性全身性猴帕金森病模型，该模型建模后1-4个月症状较为稳定，其后快速恢复。

Description

一种急性全身性猴帕金森病模型及其药物筛选方法

技术领域

本发明涉及一种急性全身性猴帕金森病模型及其药物筛选方法。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的实验动物模型已有多种，包括小鼠、大鼠的外科损伤或6-羟多巴立体定向注射毁损的模型等。最有价值的模型动物应是和人类神经系统尤其是中脑基底节区有着相似结构、功能和复杂程度的物种。灵长类PD动物模型能够反映PD症状的基本特征，是目前最接近人类PD的动物模型，为PD的基础研究提供了良好的基础和平台。

MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)导致中枢神经系统黑质-纹状体区多巴胺能神经元损害。虽然偏侧猴帕金森病模型建模简单，建模成本低、模型成活率高，被广泛采用，但是，该模型症状仅局限于一侧，与疾病呈双侧发展不相符合，不能体现中晚期帕金森病的临床特征。因此，亟需建立全身性帕金森病猴模型以供实验研究需要。1984年，Jenner等[Jenner P.，Rupniak N.M.，Rose S.，et al.1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahyropyridineinduced parkinsonism in the common mramoset.Neurosci Lett，1984，50：85-90.1]首次报道了使用MPTP注射建立全身性猴帕金森病模型的方法。尽管当时建立的动物模型仅表现为运动减少和僵直，并没有见到肢体震颤，但是，组织生化研究显示纹状体内多巴胺分泌减少了63-100％。之后，有学者提出了连续注射MPTP建立全身性帕金森病模型的方法，该方法可造成黑质致密部多巴胺能神经元损失超过95％，与终末期帕金森病患者脑病理改变相类似[Kunikowska G.，Jenner P..Alteraion in m-RNA expression for Cu，Zn-superoxide dismutase and glutathione peroxidase in the basal ganglia ofMPTP-treated marmosets and patients with parkinson’s disease.BrainRes，2003，968：206-218.]。目前，建立急性全身性帕金森病猴模型的给药途径包括：肌肉注射、皮下注射和静脉注射三种。由于静脉注射更接近人类应用MPTP的方式，并且不受组织吸收率等因素的影响，药物可快速进入颅内，容易控制用药量。因此，国内外学者多采用静脉注射的方法建立急性全身性帕金森病模型。但是，值得注意的是，各个研究报道的静脉给药方式和给药剂量有很大的不同。Stanley等[Stanley B.R.，Chuang C.C.，Sanford D.M.，et al.Aprimate model of parkinsonism：selective destruction of dopaminergic neuronsin the pars compacta of the substantia nigra byN-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine.Proc Natl AcadSci，1983，80：4546-4550.]对四只猴分别通过分次静脉注射1.75-2.49mg/kgMPTP溶液，建立了急性重度全身模型。国内陈生弟等[陈生弟，徐德隆，余慧贞等.MTPT在恒河猴帕金森病模型上的应用及其作用机制的研究.中华神经精神科杂志，1990，23(1)：23-27.]分次为两只猴注射2.45mg/kg和3.5mg/kgMPTP后，出现严重的帕金森病症状。Hansard等[Hansard M.J.，Smith L.A.，Jckson M.J，et al.Dopamine，but not norepinephrineor serotonin，reuptake inhibition reserves motor deficits in1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine treatmented primates.J PharmacolExp Ther，2002，303：952-958，MJ Hansard，LA Smith，MJ Jackson，et al.Dopamine reuptake inhibition and failure to evoke dyskinesia in MPTP-treatedprimates，Eur.J.Pharmacol.451(2002)157-160.]报道在5天内连续注射总剂量为2mg/kg的MPTP建立急性全身模型的方法。由于该模型症状明显而典型，被认为特别适合于左旋多巴引起的运动不能的病理生理机制的研究[MP Hill，P Ravenscroft，E Bezard，et al.Levetiracetam potentiates the antidyskinetic actionof amantadine in the 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine(MPTP)-lesioned primate model of Parkinson’s disease.J Pharmacol ExpTher，2004，310：386-394.，P Jenner.The MPTP-treated primate as a model ofmotor complicationsin PD：primate model of motor complications.Neurology，2003，61：S4-S11.]；也可用于帕金森病神经保护药及多巴胺受体激动剂等药物治疗的研究[CJ Hille，SH Fox，YP Maneuf，et al.Antiparkinsonianaction of a delta opioid agonist in rodent and primate models of Parkinson’sdisease，Exp.Neurol.172(2001)189-198.；[10]MM Iravani，S Costa，MJJackson，et al.GDNF reverses priming for dyskinesia in MPTP-treated，1-DOPA-primed common marmosets.Eur J Neurosci，2001：13：597-608.；RKPearce，M Jackson，DR Britton，et al.Actions of the D1 agonists A-77636 andA-86929 on locomotion and dyskinesia in MPTP-treated 1-dopa-primed commonmarmosets.Psychopharmacology，1999，142：51-60.]，但是，该方法建立的猴帕金森病模型症状严重，模型猴活动能力受到严重影响，并出现饮水和进食困难，需要使用左旋多巴类药物治疗，因此饲养难度大，模型猴容易死亡。为解决这一问题，Iravani等[M Iravani，E Syed，MJ Jackson，et al.A modifiedMPTP treatment regime produces reproducible partial nigrostriatal lesions incommon marmosets.Eur J Neurosci，2005，21：841-854.]降低MPTP用量，使用1mg/kg MPTP建立的猴帕金森病模型，其多巴胺能神经元损失只有60％，模型猴症状轻微，容易存活，适合于疾病早期阶段的各项研究；但是，该模型由于症状轻微，在短期内出现症状消失。和占龙，等，恒河猴帕金森氏病模型的建立和重组人NTN对黑质多巴胺能神经元的保护作用的实验观察，《中国现代实用医学杂志》，2005年4卷5期，其中公开了恒河猴帕金森氏病模型的建立方法为：猴下肢隐静脉注射MPTP，用药剂量和时间为：首先按0.3mg/kg给药，1次/d，共4d，然后按0.38mg/kg，1次/d，共3d，总共给MPTP7d。虽然降低了剂量，但制备的动物模型稳定性差。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种急性全身性猴帕金森病模型及其药物筛选方法。

本发明提供了一种急性全身性猴帕金森病模型的制备方法，将剂量为0.36mg/kg的MPTP施用于猴，每隔一天施用一次，连续施用5次。所述的施用方式是静脉注射。

本发明还提供了该方法制备的动物模型在筛选治疗急性帕金森病的药物中的用途。

本发明还提供了一种筛选治疗急性帕金森病的药物的方法，它包括如下步骤：

a、将剂量为0.36mg/kg的MPTP经外周静脉穿刺施用于猴，每隔一天注射一次，连续注射5次，建立急性全身性猴帕金森病模型；

b、将候选药物施用于动物模型；

c、观察候选药物对急性帕金森病的量化指标的影响情况，并进行评分，评价潜在治疗急性帕金森病的药物。

本发明制备动物模型的方法与“和占龙，等，恒河猴帕金森氏病模型的建立和重组人NTN对黑质多巴胺能神经元的保护作用的实验观察，《中国现代实用医学杂志》，2005年4卷5期”报道的方法相比，给药方式不相同：本方法为隔日给药，每次给药剂量相同，连续给药5次后停止给药；单次给药剂量也不同。本发明经外周静脉连续注射MPTP可以建立症状表现类似中晚期帕金森病患者的急性全身性猴帕金森病模型。该模型建模后1-4个月症状较为稳定，其后快速恢复。

附图说明

图1：建模前实验猴活动及姿势正常

图2：MPTP注射后2周出现身体屈曲、运动迟缓、尾巴直立、肌张力增高和面具脸表现

图3：MPTP注射后1个月出现身体严重屈曲、肌张力增高、木僵表现

图4：MPTP注射后1个月模型猴双侧肢体肌张力显著增高，活动困难，影响进食

图5：MPTP注射后3个月(B)，猴全脑脑糖代谢较建模前(A)显著降低；且糖代谢水平较偏侧猴帕金森病模型(C)更低。

图6：急性全身性模型猴全脑代谢降低，在尾状核区域仍可见相对活跃糖代谢活动(B)

图7：猴动态行为学评分

图8：右侧丘脑 HE×400

图9：左侧丘脑 HE×400

图10：实验猴左右侧丘脑-纹状体区TH阳性细胞数均显著降低

图11：实验猴左右侧纹状体区TH染色 TH×100

图12：实验猴左右侧纹状体区TH染色 TH×400

图13：实验猴左右侧纹状体D₂受体染色；D₂×100

图14：实验猴左右侧纹状体D₂受体染色；D₂×400

具体实施方式

实施例1本发明急性全身性猴帕金森病模型的制备

1、实验目的

建立症状典型的全身性MPTP猴帕金森病模型模型并对模型进行综合评估，使其适用于新药评估等各类研究。

2、实验方法

2.1实验动物入选：

参照实验猴纳入标准(见后述)，由成都平安实验动物繁育中心购入3只健康成年猕猴。年龄5-7岁，体重5.0-6.1Kg，两雄一雌，分别以M1、M2、F1代表。经检验、检疫合格后，置于国家(成都)中药安全性评估中心(GLP)大动物饲养中心饲养。

实验猴纳入标准：

①、年龄4-7岁；

②、有血液常规、生化和传染病等检测报告，且检查结果正常，无传染病；

③、既往未接受其他实验研究；

④、体重4-7Kg；

⑤、躯干、肢体及头面部活动自如；

⑥、对外界环境及刺激反应正常。

2.2建模前实验猴饲养：

满足实验要求的猴在进行建模手术前3周移入GLP中心大动物饲养中心进行适应性训练，使其适应新的生活环境。所有实验猴采用专用猴笼，单笼饲养，参照动物福利要求和医学实验伦理委员会要求，为实验猴提供全价饲料和水果，并由专职饲养人员照顾实验猴日常生活和饮食。饲养环境提供12小时照明，供应充足的食物和饮用水，并保持猴房通风、清洁，维持室内温度15-25摄氏度。定期对饲养间进行消毒处理，并对实验猴进行隔离，禁止与实验无关人员进入饲养间。

2.3建模前实验猴行为评估：

实验猴在大动物饲养中心单笼饲养3周，饲养期间，固定猴笼及猴笼位置。3周后，待实验猴熟悉饲养环境、饲养人员及实验人员后，采用猴帕金森病行为评分表(详见表I)对实验猴进行行为学评分，记录基础评分值。使用摄像机记录实验猴活动情况并存档。

表1：帕金森病猴行为学评分表

2.4建模前猴脑¹⁸FDG-PET-CT检查

实验猴在大动物饲养中心饲养3周后，使用四川大学华西医院核医学科Philips PET-CT进行猴全脑¹⁸FDG-PET-CT糖代谢检测。

经肌肉注射氯胺酮(10mg/Kg)作全身麻醉。麻醉满意后，经外周静脉注射新鲜合成的经同位素标记的显影剂：¹⁸FDG(各实验猴显影剂放射剂量见表2)。猴放置于放射屏蔽环境安静休息30分钟后，将猴放置于检查床上，妥善固定头部，开始进行全脑PET-CT扫描。由华西医院核医学科专职医学技术人员操作PET-CT设备进行图像采集，将扫描结果存档。扫描结束后，将猴放回原猴笼继续按照原饲养条件饲养。

表2：各实验猴注射¹⁸FDG放射剂量

2.5建模前准备

建模前3天将实验猴移入隔离饲养间饲养，按照原饲养环境给予照明、食物和饮水。于建模手术前1晚开始禁食水，直至手术，并称量实验猴体重。

2.6建模操作：

2.6.1该建模手术在隔离手术间进行，并装备大风量换气系统。

2.6.2建模手术过程的防护：在隔离手术间进行手术操作，整个手术过程均保持换气系统正常运行。参与手术人员进入手术室前，均按照个人防护要求，正确穿戴连体带帽式生化防护衣、防护镜、防护面罩、防毒呼吸面罩并戴双层腈纶手套，换专用手术拖鞋(见图1)。禁止与手术无关人员进入手术室，手术过程中，须保持个人防护用品穿戴正确、无破损。在手术台及操作台边放置预先配置的漂白粉液筒，随时对沾染MPTP的器具进行无毒化处理。

2.6.3手术材料：

MPTP(Sigma公司，10mg/支)：

英文全称：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine

中文全称：1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶

无菌生理盐水(四川青山利康药业)

氯胺酮(100mg/支)

22G穿刺针(成都市新津事丰医疗器械有限公司)

10ml，20ml注射器(BD公司)

微量注射泵(德国博朗，BRAUN)

2.6.4MPTP溶液的配制：

MPTP溶液在隔离饲养间内现场配制。严格按照第一部分个人防护要求进行。按照0.36mg/kg计算药物使用量，将所需药物用生理盐水稀释至10ml，并置于20ml注射器中。将注射器置于微量注射泵上备用。

2.6.5建模手术操作：

使用氯胺酮肌肉注射作猴全身麻醉(5mg/kg)。剪去小腿后毛发，显露皮下静脉，以碘复消毒穿刺区皮肤。压迫静脉近心端，以22G穿刺针作静脉穿刺，见回血后，固定穿刺针，连接已预先使用生理盐水灌注的延长管，并将其连接到微量注射泵，以3ml/min速度注入新鲜配置的MPTP溶液。注射完毕后，用含1％漂白粉液的纱布压迫穿刺点，并将接触MPTP药液的器械立即丢入漂白粉溶液中行无害化处理。用1％漂白粉液喷洒猴笼、饲养间地面。按上述步骤，自首次注射日起，每间隔1日为实验猴注射相同剂量MPTP溶液，连续注射5次。

2.7建模后饲养：

模型饲养环境保持和条件与建模前一致，自首次给药起，增加对实验猴的水果供应，并加强对实验猴的观察监护，及时发现不良反应。最后一次注射完成后，每日定时为实验猴提供含有左旋多巴的橙汁2次。记录模型猴进食情况，必要时进行血液生化检测，及时发现可能存在的危险。

2.8建模后行为学观察：

实验猴隔离至建模术后第6天，转入原大动物饲养间，继续定时给予药物治疗，直至猴行为学评分低于25分，并加强监护。由专人管理饲养间，禁止与实验无关人员进入饲养间，影响实验猴行为。

每日定时由同一实验人员按照猴帕金森病行为学评分表，对实验猴进行行为学评分并录像。如出现行为学评分分数变化，由评分人员与另一位实验人员根据录像情况对评分进行再评估，重新评分。

2.9模后脑¹⁸FDG-PET-CT扫描：

建模手术后3个月，使用华西医院核医学科Philips PET-CT进行脑¹⁸FDG-PET-CT糖代谢检测。经肌肉注射氯胺酮(10mg/Kg)作全身麻醉。麻醉满意后，经外周静脉注射新鲜合成的同位素标记的显影剂：¹⁸FDG(各试验后放射性显影剂放射剂量见表3。将猴放置于放射屏蔽环境安静休息30分钟后，开始进行全脑PET-CT扫描。扫描结束后，将猴放回原猴笼饲养。

表3：各实验猴注射¹⁸FDG放射剂量

2.10后脑组织病理学检查：建模手术后12个月，对实验猴进行脑组织病理学分析。

2.10.1灌注取材：

依据AAALAC和实验动物医学伦理委员会要求，对实验猴进行深度全身麻醉后再进行灌注取脑操作。对手术后动物尸体按照实验动物管理规范，交动物饲养中心统一处理。

2.10.2实验材料：

多聚甲醛、PBS液、生理盐水、解剖器械、水浴恒温箱等。

2.10.3灌注取脑：

实验猴肌肉注射氯胺酮(10mg/kg)麻醉后，固定于手术台，以(3mg/kg)戊巴比妥进行静脉注射强化麻醉。剪除胸前毛发，沿胸骨作垂直正中皮肤切口，上至胸骨头，下至各膈肌下。骨剪沿胸骨正中线剪开胸骨，用撑开器撑开手术切口，显露纵隔。剪开心包，暴露心脏及胸主动脉，在左心室作一小切口，以灌注针穿刺心室壁，针头直接插入升主动脉。固定灌注针，并夹闭心室切口，开放灌注输液泵，灌注37摄氏度PBS液。剪开右心耳，释放血液和灌注液。观察右心耳流出液体变清亮，猴面部及肝脏变白后，换用4摄氏度4％多聚甲醛液500ml继续灌注固定。灌注完成后，打开猴颅盖，小心剪开硬脑膜、小脑幕和硬脊膜，剪断颅神经，于颈2水平切断脊髓，小心取出整个端脑、小脑和脑干。

2.10.4组织固定：

将取出的脑组织立即放于4摄氏度20％蔗糖水中脱水8小时，待脑组织沉底后，小心取出脑组织，置于4摄氏度4％多聚甲醛液固定。

2.10.5切片：

2.10.6染色、分析

3、模型行为学变化分析：

对实验猴的行为学评分进行汇总，绘制模型猴行为学变化曲线图。

4、试验结果

4.1实验猴行为学变化评估

对3只实验猴的行为学评分均顺利完成。实验猴在完成适应性饲养后，基础行为学评分均为“0”分，实验猴对周围环境感知良好，对刺激行为警惕性强，进食正常(见图1)。前两次静脉注射后实验猴无明显症状。第3次静脉注射后，M1和F1开始出现轻度活动减少。第4次注射后，所有实验猴均表现出活动减少。第5次注射后，实验猴出现明显的活动减少和反应迟缓。MPTP注射后2周，实验猴出现身体屈曲、运动迟缓、竖尾等症状，尚能自行进食(见图2)。至完成MPTP注射后3周，实验猴症状达到高峰，出现严重身体屈曲、运动迟缓、肌张力增高、木僵和姿势性震颤症状，并影响实验猴日常进食活动(见图3，4)。给予口服美多芭(125mg)果汁后30-40分钟，实验猴身体屈曲缓解，出现活动增多，猴兴奋性增强，注意力难以集中。上述情况维持1小时左右后消失。术后5个月，模型猴症状出现缓慢缓解趋势。至术后9个月，实验猴症状基本消失。(各模型猴帕金森病行为学评分情况见图7)。

模型猴在行为学评分超过18分后可出现进食活动减少，少动和阵发性木僵行为。当评分超过20分，模型猴出现进食困难，尤其在完成MPTP注射后3-5周，实验猴对急剧的症状进展难以适应，需要人工帮助和药物治疗。经密切观察和积极处理，所有模型猴均存活至建模后12个月。

4.2建模前后¹⁸FDG-PET-CT扫描结果

3只实验猴经适应性饲养后，接受脑¹⁸FDG-PET-CT扫描脑糖代谢活跃，左右对称。经外周静脉注射MPTP建立全身帕金森病模型后3个月再次¹⁸FDG-PET-CT扫描提示：模型猴脑双侧基底节区及额、颞叶糖代谢较建模前降低，且双侧无明显差别。脑糖代谢水平较偏侧帕金森病猴模型更低(见图5，6)。

4.3模型组织学检查结果

分别对实验猴左右侧脑免疫组织化学进行比较。

4.3.1HE染色

实验猴基底节区神经元胞体缩小，左右侧神经元数量无显著差异。如图8，9)。

4.3.2TH染色

实验猴左右侧基底节区仅可见少数神经元胞浆内存在TH阳性染色颗粒，较动脉模型中未毁损侧TH阳性细胞明显减少(见图10，11，12)。

4.3.3D₂染色

D₂受体染色阳性细胞显示为棕色。实验猴双侧基底节区D₂受体染色阳性细胞数无显著差异(见图13，14)。

5、讨论

上述研究结果提示，控制给药剂量，改变给药方式可以获得多巴胺能神经元不同程度的损伤。结合文献资料和预实验结果，对MPTP的注射剂量和给药方式作了相应调整。首先，使用1.8mg/kg MPTP溶液的总剂量进行静脉注射，此剂量低于陈生弟等[陈生弟，徐德隆，余慧贞等.MTPT在恒河猴帕金森病模型上的应用及其作用机制的研究.中华神经精神科杂志，1990，23(1)：23-27.]的总剂量，对多巴胺能神经元的损伤相对降低。另外，由于MPTP注射建立的帕金森病猴模型在停止给药后会出现帕金森病样症状逐渐消失，而连续较高剂量注射又可能导致黑质多巴胺神经元损伤过重；因此，与Hansard等[Hansard M.J.，Smith L.A.，Jckson M.J，et al.Dopamine，but notnorepinephrine or serotonin，reuptake inhibition reserves motor deficits in1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine treatmented primates.J PharmacolExp Ther，2002，303：952-958；MJ Hansard，LA Smith，MJ Jackson，et al.Dopamine reuptake inhibition and failure to evoke dyskinesia in MPTP-treatedprimates，Eur.J.Pharmacol.451(2002)157-160.]连续注射不同的是，采用了隔日注射的方式。在对实验猴的连续行为学评估中发现，采用该方法建立的全身性猴帕金森病模型症状典型，并能在相当一段时间内保持症状稳定；症状高峰期行为学评分介于24-32分之间，略低于极重度模型的标准，饲养相对比较容易。该全身模型症状稳定区间为建模后1-5个月，至5个月以后，症状开始逐渐减轻，至实验结束(12个月)，模型猴的帕金森病样症状基本消失。

帕金森病患者神经代谢变化的研究也是当前研究的热点之一。本发明动物模型的制备方法中，对全身性猴帕金森病模型也进行了¹⁸FDG-PET-CT扫描，以了解模型猴脑代谢情况。结果发现，模型猴双侧脑基底节区、额叶、颞叶均出现糖代谢降低，而且左右比较无明显差别。3只模型猴在建模后除表现出典型的肌张力增高、运动减少、面具脸和活动迟缓等帕金森病样症状外，还可观察到明显的反应迟钝、木僵、发声障碍等表现。可能与神经系统的广泛性损伤有关。对实验猴脑组织的免疫组化研究显示，双侧丘脑-纹状体区域TH阳性细胞少见，但左右侧D₂受体无明显差别，与偏侧怕金色病猴模型未毁损侧比较也无明显差别。

综上所述，采用本方法建立的急性全身猴帕金森病模型具有症状明显而典型，建模后1-4个月稳定性较好。

实施例2用治疗急性帕金森病的药物验证急性全身性猴帕金森病模型并初步建立相关药物筛选平台

a、取实施例1方法建立的急性全身性猴帕金森病模型；

b、采用目前公认的治疗急性帕金森病的药物(美多芭，息宁)施用于本发明急性全身性猴帕金森病模型动物；

c、观察候选药物对急性帕金森病的量化指标的影响情况，并进行评分(同实施例1表1动物行为学评分表)，评价潜在治疗急性帕金森病的药物，同时也验证了本发明急性全身性猴帕金森病模型动物用于药物筛选的可行性。

Claims (1)

1.一种急性全身性猴帕金森病模型的制备方法，其特征在于：将剂量为0.36mg/kg的MPTP施用于猴，每隔一天施用一次，连续施用5次；所述的施用方式是静脉注射；所述猴为健康成年猕猴。

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