CN102166211A - 一种含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学药物领域，具体涉及一类含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。本发明发现含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。因而可以用于糖尿病治疗，有广阔的应用前景。

Description

一种含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用

技术领域

本发明属于化学药物领域，具体涉及一种含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

背景技术

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)化学名为(2R, 3R, 4R, 5S)-2-(羟甲基-3,4,5一三羟基)吡啶，是一种不能在人体代谢的氮杂糖[1]。1976年，Yagid等从桑树根中首次分离得到DNJ，DNJ也存在于其他植物、微生物及蚕体中，自然界以桑中含量最高。DNJ也可通过化学合成或半合成方法得到。由于DNJ的结构类似于葡萄糖，相当于吡喃糖环上的氧被氮取代，使DNJ在酶催化的糖代谢过程中与糖基中间体形成竞争，从而表现出很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性[2]。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制小肠α-葡萄糖苷酶，减缓碳水化合物的水解和葡萄糖的吸收，从而避免餐后血糖和血浆胰岛素的过度增高，由于其副作用小，仅限于肠道不良反应，已成为治疗I型和II型糖尿病的一线药物，临床常见品种有阿卡波糖 (Acarbose，拜糖平)，米格列醇(Miglitol)和桑枝颗粒剂[3]。DNJ及其衍生物作为高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有降血糖、抗病毒、抑制肿瘤转移等作用，且细胞毒性小，在药物开发中受到广泛重视[4]。

DNJ是目前糖尿病治疗市场上唯一国际公认的零伤害生物制剂，但至今DNJ仍未作为治疗糖尿病的药物上市[5]。一方面是由于天然产物中DNJ含量甚低且纯化困难，而人工合成难度又较大，成本高，目前DNJ商品大多为DNJ粗提物；另一方面是DNJ在体外实验中是糖苷酶有效的抑制剂，但体内单独作用，至少要经过质膜和内质网两个膜障碍，才能到达抑制位点，导致抑制剂在酶水平和细胞水平有所差异。因此人们为了增加DNJ的体内活性，在DNJ结构中引入疏水性基团以增加其亲脂性[6]，合成了大量的DNJ衍生物，其中N-羟乙基-1-脱氧野尻霉素已被成功开发为治疗糖尿病的新药--米格列醇，由于其高效低毒，因而使糖尿病在治疗方面有了一个质的飞跃[7]。因此近年来设计合成新型DNJ衍生物受到世界各国药物化学家的高度重视。

本发明发现一类含1,2,3-三氮唑的DNJ衍生物具有高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂，在糖尿病治疗方面有较好的前景。

参考文献

[1] Lillelund V H, et al.Chem Rev, 2002, 102(2), 515-553.

[2] Yoshimizu M, et al. Clinica Chimica Acta, 2008, 391(1-2), 68-73.

[3] 田金英，张天娇，叶菲. 临床和实验医学杂志. 2005, 4, 105 –106.

[4] Kong W H, et al. J Agric Food Chem, 2008, 56(8), 2613-2619.

[5] Kuriyama C, et al.Bioorg Med Chem, 2008, 16(15), 7330-7336.

[6] Andersson U, et a1. Biochem Pharmacol,2004, 67(4), 697-705.

[7] Minami Y, et a1. Bioorg Med Chem, 2008, 16(6), 2734-2740。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用。

本发明提出的含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用，所述含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物的结构通式具体如下：

1

其中：R为甲基、氟、甲氧基、氯等中任一种，具体结构如下：

化合物1a

化合物1b

化合物1c

化合物1d

本发明中，所述含1,2，3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物的合成方法为：以芳基叠氮为原料，在CuI存在下与丙炔醇进行环加成反应生成含羟甲基的芳烃三氮唑衍生物2a-d，再与环氧氯丙烷反应生成含三氮唑的环氧化合物3a-d，最后与1-脱氧野尻霉素反应生成含三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物1a-d。其合成路线如下：

2a-d      

3a-d                              1a-d  

其中R为甲基、氟、甲氧基、氯等中任一种。

本发明中，所述含1,2，3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物1a-d的制备方法，具体步骤如下：

（1）含羟甲基的芳烃三氮唑衍生物2a-d的合成

将叠氮基芳烃衍生物、丙炔醇、抗坏血酸钠、碘化亚铜加入到烧瓶中，氮气保护下，室温反应15-24h，TLC检测显示反应完成后，向反应体系内加入水，用乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，硅胶柱分离，即得所需产品。其中，芳烃衍生物与丙炔醇的摩尔比为1：1—1：1.2，丙炔醇与碘化亚铜的摩尔比为1：0.1—1：0.2，丙炔醇与抗坏血酸钠的摩尔比为1：0.1—1：0.2。

（2）含三氮唑的环氧化合物3a-d的合成

将环氧氯丙烷和TBAB加入反应瓶中，以氢氧化钠水溶液为溶剂，常温剧烈搅拌至完全溶解，之后放入冰浴，冷却至0℃，缓慢加入含羟甲基的芳烃三氮唑衍生物A。在0℃下反应8-20h，TLC检测显示反应完成后，将反应液倒入冷水中，用乙醚萃取，饱和食盐水洗至中性，有机相无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙醚，硅胶柱分离，即得所需产品。其中三氮唑的芳烃衍生物与环氧氯丙烷的摩尔比为1：5，三氮唑的芳烃衍生物与TBAB的摩尔比为20：1,氢氧化钠水溶液浓度是50％。

（3）含三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物1a-d的合成

将步骤（2）所得的含三氮唑的环氧化合物2a-d和1-脱氧野尻霉素加入反应瓶中，以甲醇作溶剂，室温下搅拌反应12-24h, TLC检测显示反应完成后, 真空旋转蒸发除去甲醇，硅胶柱分离，即得所需产品。其中三氮唑的环氧化合物与1-脱氧野尻霉素的摩尔比为1：1—1：1.2。

本发明中，所述的芳烃衍生物为带甲基，氟等含供电子或吸电子的取代芳基，如对甲苯，对氟苯等。本发明合成的新型含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物，具有潜在的a-葡萄糖苷酶抑制活性，同时也可以作为进一步修饰的药物中间体，具有开发成新的治疗糖尿病药物的潜在应用价值。该合成路线具有操作简便、反应条件温和、节省溶剂、减少污染等优点，便于工业化生产。

本发明中，所述含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物1a-1d具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。化合物1a (R为甲基) 是竞争性抑制剂，Ki=917 μM，IC50=2.6 mM；化合物1b (R为卤素F) 是竞争性抑制剂，Ki=208 μM，IC50=331 μM；化合物1c (R为甲氧基) 是竞争性抑制剂，Ki=418 μM，IC50=2.2 mM；化合物1d (R为为卤素Cl)是竞争性抑制剂，Ki=885 μM，IC50=2.2 mM。

本发明中，含1,2，3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)衍生物具有α-葡萄糖苷酶抑制剂，可用于治疗糖尿病，肥胖症，病毒感染等疾病，有广阔的应用前景。

具体实施方式

下述通过实例进一步说明本发明，但不能限制本发明的内容。

实施例1：

（1）含羟甲基的芳烃三氮唑衍生物2a的合成

2a

将对甲基叠氮苯（119 mg, 1 mmol）、丙炔醇(96 μL, 1.2 mmol)、抗坏血酸钠（20 mg, 0.1 mmol）、碘化亚铜（19 mg, 0.1 mmol）加入到反应瓶中，氮气保护下，室温反应24h，TLC检测显示反应完成后，向反应体系内加入水，用乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，硅胶柱分离，即得淡黄色固体114 mg，收率60%。

（2）含三氮唑的环氧化合物3a的合成

3a

将环氧氯丙烷（390 μL , 5 mmol），TBAB(16 mg)和50％氢氧化钠水溶液（0.6 mL）加入反应瓶中，常温剧烈搅拌至完全溶解，之后放入冰浴，冷却至0℃，缓慢加入步骤（1）所得的对甲基三氮唑的芳烃衍生物（189 mg, 1 mmol）。在0℃下反应18h，TLC检测显示反应完成后，将反应液倒入冷水中，用乙醚萃取，饱和食盐水洗至中性，有机相无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙醚，硅胶柱分离，即得白色固体200 mg，收率82%。

（3）含三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物1a的合成

1a

将步骤（2）所得的三氮唑的环氧化合物(17 mg, 0.07 mmol)和1-脱氧野尻霉素(10 mg, 0.06 mmol)加入反应瓶中，以甲醇作溶剂，室温下搅拌反应16h，TLC检测显示反应完成后, 真空旋转蒸发除去甲醇，硅胶柱分离，即得白色固体18 mg，收率74%。

表征数据如下：¹HNMR (500 MHz, D₂O) : δ = 8.30 (s, 1H), 7.47 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.29 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.01-4.11 (m, 2H), 3.90 (m, 1H), 3.20-3.83 (m, 7H), 3.04(m, 1H), 2.80 (m, 1H), 2.54 (m, 1H), 2.21-2.37(m, 5H)。

实施例2：

（1）含羟甲基的芳烃三氮唑衍生物2b的合成

2b

将对氟叠氮苯（137 mg, 1 mmol）、丙炔醇(96 μL, 1.2 mmol)、抗坏血酸钠（20 mg, 0.1 mmol）、碘化亚铜（19 mg, 0.1 mmol）加入到反应瓶中，氮气保护下，室温反应24h，TLC检测显示反应完成后，向反应体系内加入水，用乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，硅胶柱分离，即得黄色固体172 mg，收率89%。

（2）含三氮唑的环氧化合物3b的合成

3b

将环氧氯丙烷（390 μL , 5 mmol），TBAB(16 mg)和50％氢氧化钠水溶液（0.6 mL）加入反应瓶中，常温剧烈搅拌至完全溶解，之后放入冰浴，冷却至0℃，缓慢加入步骤（1）所得的对氟苯基三氮唑的衍生物（193 mg, 1 mmol）。在0℃下反应20h，TLC检测显示反应完成后，将反应液倒入冷水中，用乙醚萃取，饱和食盐水洗至中性，有机相无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙醚，硅胶柱分离，即得淡黄色液体221 mg，收率89%。

（3）含三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物1b的合成

 1b

将步骤（2）所得的三氮唑的环氧化合物(17 mg, 0.07 mmol)和1-脱氧野尻霉素(10 mg, 0.06 mmol)加入反应瓶中，以甲醇作溶剂，室温下搅拌反应24h，TLC检测显示反应完成后, 真空旋转蒸发除去甲醇，硅胶柱分离，即得白色固体17 mg，收率71%。

表征数据如下：¹HNMR (500 MHz, D₂O) : δ = 8.41 (s, 1H), 7.70 (dd, 2H ,J = 4.2 Hz, J= 13.3 Hz), 7.30 (t, 2H), 4.09 (m, 1H),3.79-3.90 (m, 2H)，3.55-3.65 (m, 4H), 3.28-3.44 (m, 3H), 3.15 (m, H), 2.94 (m, 1H), 2.66 (m, 1H), 2.45 (m, 2H)

实施例3：

（1）含羟甲基的芳烃三氮唑衍生物2c的合成

2c

将对氯叠氮苯（154 mg, 1 mmol）、丙炔醇(96 μL, 1.2 mmol)、抗坏血酸钠（20 mg, 0.1 mmol）、碘化亚铜（19 mg, 0.1 mmol）加入到反应瓶中，氮气保护下，室温反应24h，TLC检测显示反应完成后，向反应体系内加入水，用乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，硅胶柱分离，即得红棕色固体189mg，收率90%。

（2）含三氮唑的环氧化合物3c的合成

3c

将环氧氯丙烷（390 μL , 5 mmol），TBAB(16 mg)和50％氢氧化钠水溶液（0.6 mL）加入反应瓶中，常温剧烈搅拌至完全溶解，之后放入冰浴，冷却至0℃，缓慢加入步骤（1）所得的对氯三氮唑的芳烃衍生物（210 mg, 1 mmol）。在0℃下反应18h，TLC检测显示反应完成后，将反应液倒入冷水中，用乙醚萃取，饱和食盐水洗至中性，有机相无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙醚，硅胶柱分离，即得白色固体215 mg，收率81%。

（3）含三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物1c的合成

1c

将步骤（2）所得的三氮唑的环氧化合物(19 mg, 0.07 mmol)和1-脱氧野尻霉素(10 mg, 0.06 mmol)加入反应瓶中，以甲醇作溶剂，室温下搅拌反应16h，TLC检测显示反应完成后, 真空旋转蒸发除去甲醇，硅胶柱分离，即得淡黄色固体21mg，收率82%。

表征数据如下：¹HNMR(500 MHz, D₂O) : δ = 8.34 (s, 1H), 7.56 (s, 2H), 7.44 (s, 2H), 4.66 (s, 2H), 3.99 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 3.78 (m, 2H), 3.38-3.57 (m, 4H), 3.19 (m, 1H), 3.01 (m, 1H), 2.77 (m, 1H), 2.46-2.56 (m, 1H), 2.31 (m, 2H)。

实施例4：

（1）含羟甲基的芳烃三氮唑衍生物2d的合成

2d

将对溴叠氮苯（198 mg, 1 mmol）、丙炔醇(96 μL, 1.2 mmol)、抗坏血酸钠（20 mg, 0.1 mmol）、碘化亚铜（19 mg, 0.1 mmol）加入到反应瓶中，氮气保护下，室温反应24h，TLC检测显示反应完成后，向反应体系内加入水，用乙酸乙酯萃取，有机相水洗，无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，硅胶柱分离，即得淡黄色固体178mg，收率70%。

（2）含三氮唑的环氧化合物3d的合成

 3d

将环氧氯丙烷（390 μL , 5 mmol），TBAB(16 mg)和50％氢氧化钠水溶液（0.6 mL）加入反应瓶中，常温剧烈搅拌至完全溶解，之后放入冰浴，冷却至0℃，缓慢加入步骤（1）所得的对溴苯基三氮唑的衍生物（254 mg, 1 mmol）。在0℃下反应20h，TLC检测显示反应完成后，将反应液倒入冷水中，用乙醚萃取，饱和食盐水洗至中性，有机相无水硫酸钠干燥，真空旋转蒸发除去乙醚，硅胶柱分离，即得淡黄色固体236mg，收率76%。

（3）含三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物1d的合成

                                            1d

将步骤（2）所得的三氮唑的环氧化合物(22 mg, 0.07 mmol)和1-脱氧野尻霉素(10 mg, 0.06 mmol)加入反应瓶中，以甲醇作溶剂，室温下搅拌反应24h，TLC检测显示反应完成后, 真空旋转蒸发除去甲醇，硅胶柱分离，即得黄白色固体23mg，收率81%。

表征数据如下：¹HNMR(500 MHz, CD₃OD) : δ = 8.60 (s, 1H), 7.83 (d, J= 9.0 Hz, 2H), 7.75 (d, J= 9.0 Hz, 2H), 4.73 (m, 2H), 3.87 (s, 1H), 3.82 (m, 2H), 3.61 (m, 4H), 3.10 (m, 1H), 2.46 (m, 1H), 2.39 (m, 1H), 2.29 (m, 1H), 2.16 (m, 2H) 。

实施例5：

α-葡萄糖苷酶抑制活性检测采取如下方法：

15 μl对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG) (5 mM)于37℃预热10分钟。6 μl α-葡萄糖苷酶 (5 U／ml)，15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)，15 μl α-葡萄糖苷酶抑制剂（5 mM)以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至135 μl于37℃预热10分钟。将预热后的底物溶液与含抑制剂的酶溶液混合，于37℃反应二十分钟，用等体积的碳酸钠溶液（1M）终止反应，取200微升反应液使用酶标仪在405 nm测OD值。

是否为可逆抑制的判定方法：

取一定量的抑制剂(1a-d)与一定量的α-葡萄糖苷酶溶液混合在一起，保温一定时间，取混合溶液作不同程度的稀释，测定反应速度。用反应速度对测活系统中的酶浓度作图，根据曲线的特征可以判定是否是可逆抑制剂。

具体反应条件：实验分成含抑制剂与不含抑制剂两组，每组又根据抑制剂或酶浓度不同分别标注编号。第一组，取15 μl的待测α-葡萄糖苷酶抑制剂（浓度5 mM，2.5 mM，1.25 mM，625 μM，312.5 μM)与6 μl α-葡萄糖苷酶（5 U，2.5 U，1.25 U，0.625 U，0.3125 U）混合，加入15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)并以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至135 μl于37℃预热10分钟；第二组，取6 μl α-葡萄糖苷酶（5 U，2.5 U，1.25 U，0.625 U，0.3125 U），加入15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)并以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至135 μl于37℃预热10分钟。在上述两组十只管中，加入15 μl 于37℃预热的底物硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG) (5 mM)，混合后37℃反应二十分钟，用等体积的碳酸钠溶液（1M）终止反应，取200 μl反应液使用酶标仪在405 nm测OD值。

可逆抑制类型判断及Ki值测定：

实验以抑制剂 浓度不同分为三组，每组又按照加入底物量不同分别标注五个编号。第一组不含抑制剂，含15μl谷胱甘肽（1 mg／ml)与6 μl α-葡萄糖苷酶，以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至120 μl于37℃预热10分钟；第二组含终浓度为200 μM的抑制剂，组成如下：15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)，6 μl抑制剂（5 mM）与6 μl α-葡萄糖苷酶，以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至120 μl于37℃预热10分钟；第三组含终浓度为500 μM的抑制剂，组成如下：15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)，15 μl抑制剂（5 mM）与6 μl α-葡萄糖苷酶以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至120 μl于37℃预热10分钟。每组按编号加入在37℃下预热十分钟的底物，使其初始终浓度分别为1 mM，500 μM，250 μM，125 μM，62.5 μM，于37℃反应二十分钟，用等体积的碳酸钠溶液（1M）终止反应，取200 μl反应液使用酶标仪在405nm测OD值。以1/v~1/[S]作图，判定抑制剂类型，并获得抑制剂的Ki值。按此方法测定阿卡波糖的Ki值为165 μM。

IC50测定：15 μl谷胱甘肽（1 mg／ml)，6 μl α-葡萄糖苷酶和一定量的待测α-葡萄糖苷酶抑制剂混合，以磷酸缓冲液（pH 6.8）补至135 μl，抑制剂终浓度分别为50，100，200，400，500，800，1000 μM。混合液37℃保温10分钟，再向上述混合液内加入于37℃下预热十分钟的底物（5 mM）15 μl，反应在37℃下进行20分钟，用等体积的碳酸钠溶液（1M）终止反应，取200 μl反应液使用酶标仪在405 nm测OD值。所得结果利用IC50计算器计算。

1b

IC50=331μM

按此方法测定阿卡波糖的IC50=295μM。

Claims (2)

1.一种含1,2,3-三氮唑1-脱氧野尻霉素衍生物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用，其特征在于所述含1,2,3-三氮唑的1-脱氧野尻霉素衍生物的结构通式具体如下： 

                  1

其中：R为甲基、氟、甲氧基、氯中任一种，具体结构如下：

化合物1a

化合物1b

化合物1c

化合物1d

。

2.如权利要求1所述的应用用于治疗糖尿病、肥胖症及病毒感染。