CN107266466A - 灯盏乙素生物素标记探针的应用及相关pkm2激酶抑制剂 - Google Patents

灯盏乙素生物素标记探针的应用及相关pkm2激酶抑制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了灯盏乙素生物素标记探针的应用及相关PKM2激酶抑制剂，该PKM2激酶抑制剂是由灯盏乙素苷元生物素标记探针寻找活性基团的靶点，并根据寻找到的靶点蛋白制备得到的灯盏乙素苷元衍生物，用于在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

Description

灯盏乙素生物素标记探针的应用及相关PKM2激酶抑制剂
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及灯盏乙素苷元生物素标记探针的制备、用途和可用作PKM2激酶抑制剂的灯盏乙素苷元及其衍生物，包含此化合物的药物组合物，涉及所述化合物的制备方法及所述化合物在制备M2型丙酮酸激酶抑制剂中的应用，涉及所述化合物在疾病，例如PKM2过表达的癌症治疗中的用途。
背景技术
靶向治疗是利用肿瘤细胞可以表达，而正常细胞很少或不表达的特定基因或基因的表达产物，形成相对或绝对靶向，最大限度地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞损伤很小的治疗方法。目前越来越多的研究者把注意力转向了来源丰富、价廉易得、毒副作用小、分子结构多样的天然产物，并且对天然产物维护人类健康或预防疾病充满了期望。相继也发现了一些具有药理活性的有效成分，如发现黄酮类、萜类、生物碱类具有抗肿瘤的作用。近年来从药用植物提取物的黄酮类化合物的抗癌活性已报道(Liweber M.New therapeuticaspects of flavones:the anticancer properties of Scutellaria and its mainactive constituents Wogonin,Baicalein and Baicalin[J].Cancer TreatmentReviews,2009,35(1):57.)，灯盏乙素(Scutellarin)是从菊科植物灯盏细辛中提取的黄酮类化合物。人体药动学药效学研究(Gao C,Zhang H,Guo Z,et al.Mechanistic studieson the absorption and disposition of scutellarin in humans:selective OATP2B1-mediated hepatic uptake is a likely key determinant for its uniquepharmacokinetic characteristics[J].Drug Metabolism&Disposition,2012,40(10):2009.)表明了灯盏乙素7位的葡萄糖在体内代谢发生水解成灯盏乙素苷元(Scutellarein，SC)而被吸收，并且灯盏乙素苷元的药效同灯盏乙素相似，灯盏乙素苷元是灯盏乙素发挥药理作用的主要形式。
近期研究表明灯盏乙素苷元具有广泛的抗肿瘤活性(Feng Y,Zhang S,Tu J,etal.Novel function of scutellarin in inhibiting cell proliferation andinducing cell apoptosis of human Burkitt lymphoma Namalwa cells[J].Leukemia&Lymphoma,2012,53(12):2456.)，然而，其直接作用靶点蛋白和抗肿瘤作用机制尚不明确。因此设计合成灯盏乙素生物素苷元标记探针，以探针为工具，运用蛋白质组学，以期发现灯盏乙素苷元发挥抗肿瘤活性的直接靶点蛋白，一旦可能的靶标被发现后，再通过一系列的分子生物学实验来确证这些靶点蛋白及其生物学作用。
本发明以探针为工具和手段，利用蛋白质组学发现灯盏乙素苷元抗肿瘤作用的靶点为PKM2。M2型丙酮酸激酶(PKM2)是糖酵解中的一个关键限速酶，在能量代谢中起着关键的作用(Mazurek S.Pyruvate kinase type M2:A key regulator of the metabolicbudget system in tumor cells[J].International Journal of Biochemistry&CellBiology,2011,43(7):969.)。因此，以PKM2为靶点的药物代表针对特定分子靶点的新一代靶向治疗，且因此与常规化学治疗相比能在治疗各种癌症方面提供更大功效且同时具有更小副作用，为后续靶向药物开发提供重要理论依据，从而开发出药效更好，特异性更强的靶向药物。
发明内容
本发明通过设计合成灯盏乙素苷元生物素标记探针并考察探针和灯盏乙素苷元抗肿瘤活性，以探针为工具，运用蛋白质组学，发现灯盏乙素苷元发挥抗肿瘤活性的直接靶点蛋白，一旦可能的靶标被发现后，再通过一系列的分子生物学实验来确证这些靶点蛋白及其生物学作用。
本发明利用灯盏乙素苷元生物素标记探针寻找到灯盏乙素苷元用于治疗癌症的靶点PKM2蛋白，重组了PKM2蛋白，检测了化合物对重组PKM2活性影响，针对靶点PKM2蛋白对灯盏乙素苷元结构改造来寻找新型高效低毒的选择性PKM2调节剂。
因此，本发明的目的是提供用灯盏乙素苷元为先导化合物与WR试剂和劳森试剂反应成灯盏乙素苷元衍生物的制备方法和应用，可以解决现有技术存在的抑制PKM2活性不高的问题，而且本发明制得的灯盏乙素苷元衍生物水溶性、对人成骨肉瘤Saos-2细胞等多种肿瘤细胞生长抑制均较好，可应用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
本发明是这样实现的：
本发明提出了具有通式(Ⅰ)的灯盏乙素苷元生物素标记探针的结构模块：
该类结构模块包括活性基团、链接基团、报告集团，R可以是长烷烃链、聚乙二醇链、多肽链。本发明主要以常见的2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)为例，其中R为无时，得到探针P4；R为2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)，得到探针P10。
因此，由该结构模块制备得到的灯盏乙素苷元生物素标记探针结构是下列任一化合物：
该灯盏乙素苷元生物素标记探针的制备方法是：灯盏乙素苷元5、6、7、4'的羟基上的氢原子被二苯羧酮保护后，灯盏乙素苷元直接或间接与生物素相连，最后在TFA的作用下脱去保护基团，得到两个不同的灯盏乙素生物素标记探针。
该灯盏乙素苷元生物素标记探针的用途时：该探针用于寻找灯盏乙素苷元治疗癌症的靶点PKM2蛋白，从而合成作为PKM2激酶抑制剂的灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐。
该灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐，具有通式(Ⅱ)所示的结构：
其中R1为Me时，X为O；R1为H时，X为O；R1为Me时，X为S；R1为H时，X为S；R1为Me时，X为Se；R1为H时，X为Se。
具体的，该灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐，其结构选自：
该灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法是：灯盏乙素苷元5、6、7、4'的羟基上的氢原子被甲基取代后，3位上的氧分别被劳森试剂和WR试剂取代为含硫和硒的中间体，最后在BBr3的作用下脱去保护基团甲基，得到两个与灯盏乙素苷元不同的衍生物。
本发明还提出了该灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤的药物中的应用。其中，所述药物为PKM2激酶抑制剂类抗肿瘤药物。
与现有技术相比，本发明突出的实质性特点和显著的进步在于：本发明提供了一种M2型丙酮酸激酶(PKM2)抑制剂灯盏乙素苷元生物素标记探针及其衍生物的制法和探针在靶点蛋白寻找的应用、验证，该衍生物是从灯盏细辛中提取分离得到的灯盏乙素苷元为先导化合物与WR试剂和劳森试剂反应制得的。成药性初步研究表明本发明的灯盏乙素苷元生物素标记探针及其衍生物对PKM2抑制强度与紫草素类似，比灯盏乙素苷元提高约20或40多倍，能选择性抑制肿瘤细胞增殖，而对正常细胞(HEK293)几乎没有影响，属于新型PKM2抑制剂类抗肿瘤药物，尤其是当O被Se取代后，所以药理作用最为明显。本发明原料来源丰富，工艺简捷，纯度高，成本低，高效低毒，有望成为新型高效低毒的PKM2抑制剂类抗癌药物。
附图说明
图1是本发明的探针P4制备路线；
图2是本发明的探针P10制备路线；
图3是本发明的灯盏乙素苷元衍生物的制备路线；
图4是本发明的通过质谱鉴定PKM2为灯盏乙素的潜在靶点蛋白(A)；
图5是本发明的通过质谱鉴定PKM2为灯盏乙素的潜在靶点蛋白(B)；
图6是本发明的探针10与PKM2蛋白相互作用；
图7是本发明的丙酮酸激酶活性测定的示意图。
具体实施方式
本发明的灯盏乙素苷元生物素标记探针的结构模块具有以下结构式：
式(Ⅰ)中母核结构为灯盏乙素苷元，其中无R＝0时，为探针P4，R＝2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)时，为探针P10。
本发明的灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐具有以下结构式：
式(Ⅱ)中母核结构为5灯盏乙素苷元化合物，其中，R1为Me，X为O、S、Se的杂原子；R1为H，X为O、S、Se的杂原子。
灯盏乙素生物素标记探针的制备原理：灯盏乙素苷元5、6、7、4'的羟基上的氢原子被二苯羧酮保护后，灯盏乙素苷元直接或间接与生物素相连，最后在TFA的作用下脱去保护基团，得到两个不同的灯盏乙素生物素标记探针。如图1和图2所示。
灯盏乙素苷元衍生物的制备原理：灯盏乙素苷元5、6、7、4'的羟基上的氢原子被甲基取代后，3位上的氧分别被劳森试剂和WR试剂取代为含硫和硒的中间体，最后在BBr3的作用下脱去保护基团甲基，得到两个与灯盏乙素苷元不同的衍生物。如图3所示。
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
缩酮保护灯盏乙素苷元(2)的制备：
取干燥的灯盏乙素苷元(1)(0.5g,1.75mmol)置于干燥的100mL二颈瓶中，加入10mL DME溶解，加入DMAP(0.25g,1.75mmol)，室温搅拌下加入二氯二苯甲烷(0.5mL,1.75mmol)，180℃条件下，回流反应2h，TLC监测反应完全，减压旋蒸除去溶剂，硅胶分离残余物，得浅棕黄色粉末状固体(2)，0.34g，收率为62％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.92(d,J＝8.8Hz,2H),7.56-7.53(m,4H),7.46-7.44(m,6H),7.04(s,1H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H),6.83(s,1H).EI-MS(m/z)[M+H]+451.11。
灯盏乙素苷元-4'-生物素(3)的制备：
取缩酮保护灯盏乙素苷元(2)(0.4g,0.89mmol)于100mL的茄型瓶中，分别依次加入DMAP(0.054g,0.44mmol)，生物素(0.433g,1.78mmol)，室温搅拌至完全溶解后，再缓慢滴加用DMF溶解的DCC(0.366g,1.78mmol)，滴加完毕，室温反应12h，TLC监测反应完全，用乙酸乙酯(150mL×2)萃取，有机层用水(100mL×2)洗涤，无水MgSO4干燥，减压回收乙酸乙酯至干，硅胶柱层析得到淡黄色粉末状固体(3)0.2g，收率为30％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.13(d,J＝8.0Hz,2H),7.56-7.43(m,10H),7.34(d,J＝8.0Hz,2H),7.12(s,1H),7.06(s,1H),6.47(s,1H),6.38(s,1H),2-4.29m,1H),4.16-4.13(m,1H),3.50-3.44(m,1H),3.42-3.37(m,1H),3.15-3.11(m,1H),2.87-2.81(m,1H),2.71-2.49(m,3H),1.67-1.63(m,3H),1.56-1.37(m,2H).EI-MS(m/z)[M+H]+677.73。
脱缩酮保护灯盏乙素苷元-4'-生物素(4)的制备：
取化合物(3)10mg于50mL的茄型瓶中，加入5mL干燥的CH2Cl2，冰浴条件下加入2mLTFA，加毕，室温反应17h,减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯沉降3次，得到黄色固体(4)8mg.收率为85％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.12(d,J＝12Hz,2H),7.32(d,J＝12Hz,2H),6.93(s,1H),6.61(s,1H),6.48(s,1H),6.38(s,1H),4.32-4.29(m,1H),4.16-4.13(m,1H),3.17-3.11(m,2H),2.85-2.81(m,1H),2.64-2.48(m,2H),1.69-1.64(m,2H),1.53-1.40(m,2H).13CNMR(DMSO-d6,400MHz):182.11,171.53,162.73,162.22,153.64,153.10,149.80,146.95,128.51,127.89,122.65,104.49,104.22,94.03,61.02,59.20,55.34,48.61,33.32,28.00,27.93,24.30.EI-MS(m/z)[M+H]+513.13.HRMS calcd for C25H23N2O8S-[M-H]-511.1223,found:511.1228。
长链生物素(6)的制备：
取生物素(600mg,2.5mmol)和三乙胺(0.38mL,3mmol)置于100mL茄型瓶中，用无水DMF将其溶解，然后在冰浴下搅拌半个小时，然后缓慢滴加氯甲酸异丁酯(0.44mL,3mmol)加毕，体系在冰浴下反应3小时，然后将反应液缓慢滴加到2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)(655.14mg,4.4mmol)的DMF溶液中，加毕，室温反应4个小时。反应完后用旋蒸仪蒸出DMF，过柱得到产物(6)10mg,收率50％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.909(m,1H),6.35(m,2H),4.27-4.24(m,1H),4.10-4.09(m,1H),3.58-3.33(m,9H),3.24-3.03(m,5H),2.92-2.89(m,2H),2.17-2.14(m,2H),1.56-1.26(m,7H).EI-MS(m/z)[M+H]+375.50。
缩酮保护灯盏乙素苷元-4'-氯乙酸甲酯(7)的制备：
取缩酮保护灯盏乙素苷元(2)(0.50g,1.11mmol)与无水K2CO3(0.31g,2.22mmol)和ClCH2COOCH3(0.14g,1.33mmol)混合于反应瓶中，氮气保护下注入无水DMF 15mL，室温搅拌反应过夜。经萃取、洗涤、干燥后，减压回收溶剂至干得(7)0.37g，收率为64％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.03(d,J＝8Hz,2H),7.55-7.46(m,10H)7.12(d,J＝8Hz,2H),6.98(s,1H),6.72(s,1H),5.75(s,1H),4.98-4.92(m,2H),3.70(s,3H).EI-MS(m/z)[M+H]+523.50。
缩酮保护灯盏乙素苷元-4'-氯乙酸甲酯水解(8)的制备：
取上述所得的化合物(7)溶解于甲醇和水(甲醇：水＝9:1)，室温下缓慢加入用甲醇溶解的氢氧化锂(20.35mg,0.8mmol)，室温反应3h，反应完毕，经萃取、洗涤、干燥后，减压回收溶剂至干得(8)0.30g，收率为90％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.02(d,J＝8Hz,2H),7.56-7.40(m,10H),7.03(d,J＝8Hz,2H),6.98(s,1H),6.72(s,1H),4.59(s,2H).EI-MS(m/z)[M+H]+509.48。
缩酮保护灯盏乙素苷元-4'-长链生物素(9)的制备：
取缩酮保护灯盏乙素苷元-4'-氯乙酸甲酯水解产物(8)0.30g和NMM(137.26mg,1.36mmol)于干燥的反应瓶中，用10mL无水DMF溶解，并在冰浴下反应半个小时，再缓慢加入含有IBCF(96.7mg,0.7mmol)的二氯甲烷，继续在冰浴下反应3h，然后缓慢加入上述产物长链生物素(265.14mg,0.59mmol)，加毕，体系在室温反应20h，反应完毕，经萃取、洗涤、干燥后，减压回收溶剂至干得黄色固体(9)100mg，收率20％。1H-NMR(400MHz,CD3Cl)δ(ppm):7.80(d,J＝8Hz,2H),7.60-7.54(m,3H),7.38-7.35(m,7H),7.02(d,J＝8Hz,2H),7.15(s,1H),6.62-6.53(m,3H),6.46(s,1H),5.63(s,1H),4.56(s,2H),4.44(s,1H),4.25(s,1H),3.55(m,11H),3.38(m,2H),2.84(m,1H),2.79(m,1H),2,79-2,16(m,2H),1.65-1,54(m,5H)。13CNMR(CD3Cl,400MHz):183.02,173.35,167.82,163.91,163.52,160.09,153.51,153.25,142.32,139.30,130.07,129.84,129.56,128.54,128.45,128.29,128.12,128.01,126.46,126.38,124.92,119.29,115.37,107.71,104.54,89.57,70.23,70.16,69.95,69.71,67.45,61.89,60.32,55.55,40.56,39.23,39.01,35.95,28.18,28.11,27.89,25.59.EI-MS(m/z)[M+H]+865.10.HRMS calcd for C46H47N4O11S-[M-H]-865.3155,found:865.3150。
脱缩酮保护灯盏乙素苷元-4′-长链生物素(10)的制备
10mg于10mL的茄型瓶中，加入0.5mL干燥的CH2Cl2，冰浴条件下加入0.2mL三氟乙酸(TFA)，加毕，室温反应10h，减压蒸除溶剂，用乙酸乙酯沉降3次，得到黄色固体(10)6mg，收率为60％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d)δ(ppm):8.04(d,J＝6Hz,2H),7.12(d,J＝6Hz,2H),6.86(s,1H),6.61(s,1H),4.62(m,2H),4.31-4.27(m,1H),4.12-4.09(m,1H),3.51-3.28(m,14H),3.20-3.17(m,1H),2.82-2.78(m,1H),2.07-2.03(m,2H),1.60-1.42(m,4H),1.32-1.23(m,2H).13C NMR(DMSO-d,400MHz):181.93,172.01,167.14,162.57,153.32,146.90,128.03,115.16,104.09,102.95,93.82,69.41,69.06,68.71,67.45,60.92,59.07,55.31,54.80,40.5,39.21,39.00,34.97,28.08,27.92,25.24.EI-MS(m/z)[M+H]+701.60.HRMScalcd for C33H39N4O11S-[M-H]-699.2410,found:699.2416。
实施例2：
灯盏乙素苷元衍生物本发明自行制备，制备方法如下：
化合物SC2的制备：
取灯盏乙素苷元(1g，3.49mml)和K2CO3(2.41g，17.47mml)在15mL丙酮溶液中，油浴至回流，缓慢滴加1.3mL，加毕，回流反应2h，TLC监测反应完全，用乙酸乙酯(300mL×2)萃取，有机层用水(300mL×2)洗涤，无水MgSO4干燥，减压回收乙酸乙酯至干，硅胶柱层析得到淡黄色粉末状固体SC2(0.96g)，收率为85％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.92(d,J＝8.8Hz,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H),6.83(s.1H),6.30(s.1H),3.95(s.12H).EI-MS(m/z)[M+H]+343.34。
化合物SC3的制备：
取化合物SC2(0.5g，1.46mml)和劳氏试剂(0.59g，1.46mml)在10mLTHF溶液中，加毕，室温反应3天，TLC监测反应完全，用乙酸乙酯(200mL×2)萃取，有机层用水(200mL×2)洗涤，无水MgSO4干燥，减压回收乙酸乙酯至干，硅胶柱层析得到粉末状固体SC3(0.25g)，收率为50％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.92(d,J＝8.8Hz,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H),5.63(s,1H),5.99(s,1H),3.95(s.12H).EI-MS(m/z)[M+H]+359.43。
化合物SC4的制备：
取化合物SC3(0.2g，0.558mml)在5mLCH2Cl2溶液中，在冰浴-20度下缓慢滴加BBr3(0.97mL，10.04mml)，加毕，室温反应6h，TLC监测反应完全，用乙酸乙酯(200mL×2)萃取，有机层用水(200mL×2)洗涤，无水MgSO4干燥，减压回收乙酸乙酯至干，硅胶柱层析得到粉末状固体SC4(0.13g)，收率为80％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.86(d,J＝8.8Hz,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,2H),5.63(s,1H),5.89(s,1H),5.53(s,4H).13CNMR(DMSO-d6,400MHz):202.8,157.7,154.8,154.3,152.4,129.6,129.9,122.9,120.1,115.8,111.6,94.3.EI-MS(m/z)[M+H]+303.02.HRMS calcd for C25H23N2O8S-[M-H]-301.0223,found:301.0228。
化合物SC5的制备：
取化合物SC2(0.5g，1.46mml)和WR试剂(0.78g，1.46mml)在10mL乙腈溶液中，加毕，置于完全密封的微管中，在油浴中150℃下反应1h，TLC监测反应完全，用乙酸乙酯(200mL×2)萃取，有机层用水(200mL×2)洗涤，无水MgSO4干燥，减压回收乙酸乙酯至干，硅胶柱层析得到粉末状固体SC5(0.4g)，收率为83％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.86(d,J＝8.8Hz,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,2H),5.63(s,1H),5.89(s,1H),3.83(s,12H).EI-MS(m/z)[M+H]+407.03。
化合物SC6的制备：
取化合物SC5(0.2g，0.493mml)在5mLCH2Cl2溶液中，置于冰浴-20度下缓慢滴加BBr3(0.86mL，8.88mml)，加毕，室温反应10h，TLC监测反应完全，用乙酸乙酯(200mL×2)萃取，有机层用水(200mL×2)洗涤，无水MgSO4干燥，减压回收乙酸乙酯至干，硅胶柱层析得到粉末状固体SC6(0.13g)，收率为80％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):7.86(d,J＝8.8Hz,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,2H),5.63(s,1H),5.89(s,1H),5.53(s,4H).13CNMR(DMSO-d6,400MHz):192.8,157.7,156.6,153.3,152.8,151.4,130.2,129.2,122.9,115.8,111.6,97.3,94.9,84.6.EI-MS(m/z)[M+H]+350.97.HRMS calcd for C25H23N2O8S-[M-H]-348.9223,found:348.9228。
探针P4、P10抗肿瘤活性：
探针P4、P10和SC1对人宫颈癌Hela细胞在48h体外抗肿瘤活性测定结果。将上述三种待测化合物用DMSO溶解成相应浓度，以培养液稀释成终浓度分别为10μM-400μM，加入到相应的板孔中，每孔体积100μL，同时设置调零孔(加入等量培养基)、细胞对照组(加入不含药物培养基)。置37℃，5％CO2培养箱内培养48h后，每孔加入5μL MTS，继续培养4h后，将96孔板置于酶标仪中，在490nm波长处测定吸光度值(OD)，计算细胞存活率(结果见表1)，每个浓度平行6孔，实验重复3次，计算公式如下：
表1灯盏乙素苷元及探针体外抗肿瘤活性
以上结果说明，探针P4、P10与灯盏乙素苷元抗肿瘤活性相当，探针P4、P10能用来确定灯盏乙素苷元的抗肿瘤作用靶点蛋白。
探针P4和P10的用途：
先将化学探针P4和P10与蛋白质提取液进行孵育，生物素-链亲和素层析分离技术的方法分离纯化蛋白，通过高灵敏度的质谱鉴定这些候选蛋白，通过对质谱鉴定到的蛋白的细胞定位、功能和参与的生物学过程查询，得到5个可能与探针P4和P10相互作用的靶点蛋白，详细信息见表2，分别为55kD的PKM2、105kD的NFKB1、90kD的HSP90、36kD的GAPDH、42kD的NDRG1。在所发现的靶点蛋白中，其中在55KDa处有明显的蛋白条带(见图4)，根据进一步的质谱二级谱图解析其唯一多肽片段表明该条带可能为M2型丙酮酸激PKM2(见图5)。
表2MASCOT分析LC–MS/MS鉴定P4和P10垂钓的蛋白
探针P10与PKM2蛋白相互作用验证：
Hela细胞经200μM探针P10处理6小时后，提取Hela细胞裂解液，利用生物素与链霉素亲和素之间高度的亲和力，免疫共沉淀P10上面的生物素，蛋白印迹检测PKM2蛋白，结果显示(见图6中A部分)，Hela、MCF-7、A549细胞均能IP出PKM2蛋白，证明P10和PKM2相互作用。生物素单体作为竞争性对照，通过竞争的方法抑制探针分子与靶点蛋白的结合，加入不同浓度的生物素可能会出现特征性条带逐渐变淡的现象。进一步的免疫共沉淀结果显示(见图6中B部分)，Streptavidin beads中PKM2随生物素浓度增大条带变浅，上清液中PKM2随生物素浓度增大条带变深，说明PKM2蛋白与P10相互作用为特异结合。
重组PKM1、PKM2方法如下：
Top10(购自Qiagen公司)中，经上海美吉生物公司测序，NCBI数据库比对，所克隆出的基因确PKM2基因，通过IPTG(购自Qiagen公司)诱导表达出PKM2蛋白，经纯化得到纯度为99％的PKM2蛋白。PKM1、PKM2活性的测定：根据Vander Heiden等[Heiden M G V,Christofk H R,Schuman E,et al.Identification of small molecule inhibitors ofpyruvate kinase M2[J].Biochemical Pharmacology,
2010,79(8):1118.]人报道的方法进行酶的活性和抑制试验。该法是由乳酸脱氢酶偶联法测定丙酮酸酶的活性(见图7)，根据乳酸脱氢酶的底物NADH在340nm有吸收，可以通过紫外分光光度检测NADH含量减少来判断反应进行的速度。丙酮酸反应液成分是：TrispH 7.5(50mM),KCl(100mM),MgCl2(5mM),ADP(0.6mM),PEP(0.5mM),β-NADH(180mM),FBP(10mM)and LDH(8units)。将上述制备的灯盏乙素苷元及其衍生物SC1,SC2,SC3,SC4,SC 5,SC6配成浓度0.25mM,0.5mM,1mM,2mM,4mM,8mM,16mM,32mM,64mM的母液。酶活检测的过程如下：先将20-100ng/μL的重组PKM2蛋白和相应浓度FBP预孵育30分钟，然后将重组PKM2蛋白与相应浓度的药物混合(反应体系中DMSO浓度不能超过1％体积比，避免DMSO影响酶活)，室温孵育30分钟，再将800μL的孵育液与200μL酶反应液在比色皿中迅速混合，插入紫外分光光度计检测槽，检测OD340nm在5-10分钟的降低变化，程序设定每0.1秒记录一次吸光值。根据一定时间内吸光值的变化，其吸光值和浓度呈线性正比关系，比较对照组和药物处理组酶活性，OD340nm变化越慢则表示酶活越低。
灯盏乙素苷元及其衍生物抗肿瘤活性筛选：
灯盏乙素苷元及其衍生物SC1、SC4、SC6对人成骨肉瘤Saos-2细胞、人宫颈癌Hela细胞等10种肿瘤细胞在48h体外抗肿瘤活性测定结果。将上述三种待测化合物用DMSO溶解成相应浓度，以培养液稀释成终浓度分别为10μM-400μM，加入到相应的板孔中，每孔体积100μL，同时设置调零孔(加入等量培养基)、细胞对照组(加入不含药物培养基)。置37℃，5％CO2培养箱内培养48h后，每孔加入5μL MTS，继续培养4h后，将96孔板置于酶标仪中，在490nm波长处测定吸光度值(OD)，计算细胞存活率，每个浓度平行6孔，实验重复3次，计算公式如下：
药理学数据：
表3灯盏乙素苷元及其衍生物对PKM2的抑制
表4灯盏乙素苷元及其衍生物体外抗肿瘤活性
以上数据表明，在SC1 3位上的O被S和Se取代后，表现出对PKM2具有更强的抑制效果，相对于PKM1的抑制率，化合物SC4和SC6对PKM2表现出明显的选择性抑制。同时也表现出更好的抗肿瘤活性，特别是当O被Se取代后，以上效果更为明显。
当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种具有通式(Ⅰ)的灯盏乙素苷元生物素标记探针的结构模块：
其中，R是长烷烃链、聚乙二醇链或多肽链。
2.由权利要求1的结构模块制备得到的灯盏乙素苷元生物素标记探针，其特征在于结构是下列任一化合物：
3.权利要求2所述的灯盏乙素苷元生物素标记探针的制备方法，其特征在于：灯盏乙素苷元5、6、7、4'的羟基上的氢原子被二苯羧酮保护后，灯盏乙素苷元直接或间接与生物素相连，最后在TFA的作用下脱去保护基团，得到两个不同的灯盏乙素生物素标记探针。
4.权利要求2或3所述的灯盏乙素苷元生物素标记探针的用途，其特征在于该探针用于寻找灯盏乙素苷元治疗癌症的靶点PKM2蛋白，从而合成作为PKM2激酶抑制剂的灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐。
5.权利要求4所述的灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于具有通式(Ⅱ)所示的结构：
其中R1为Me时，X为O；R1为H时，X为O；R1为Me时，X为S；R1为H时，X为S；R1为Me时，X为Se；R1为H时，X为Se。
6.根据权利要求5所述的灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于其结构选自：
7.权利要求5所述的灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：灯盏乙素苷元5、6、7、4'的羟基上的氢原子被甲基取代后，3位上的氧分别被劳森试剂和WR试剂取代为含硫和硒的中间体，最后在BBr3的作用下脱去保护基团甲基，得到两个与灯盏乙素苷元不同的衍生物。
8.权利要求5或6所述的灯盏乙素苷元衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于所述药物为PKM2激酶抑制剂类抗肿瘤药物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110627852A (zh) * 2019-10-12 2019-12-31 华中农业大学 一种生物素标记的柚皮苷、制备方法及其应用
CN112300191A (zh) * 2020-10-29 2021-02-02 上海交通大学 一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用
CN116059199A (zh) * 2023-03-03 2023-05-05 中国中医科学院医学实验中心 灯盏乙素化合物作为野生型idh1激动剂的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106214698A (zh) * 2016-09-28 2016-12-14 昆明医科大学 一种含有无机砷化合物的药物组合物及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106214698A (zh) * 2016-09-28 2016-12-14 昆明医科大学 一种含有无机砷化合物的药物组合物及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AIKI HIZA, YUTA TSUKAGUCHI,ET AL.,: "SYNTHETIC STUDIES OF FISETIN, MYRICETIN AND NOBILETIN ANALOGS AND RELATED PROBE MOLECULES", 《HETEROCYCLES》 *
HISAKAZU OHTANI，ET AL.: "Effects of Various Methoxyflavones on Vincristine Uptake and Multidrug Resistance to Vincristine in P-gp-Overexpressing K562/ADM Cells", 《PHARMACEUTICAL RESEARCH》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110627852A (zh) * 2019-10-12 2019-12-31 华中农业大学 一种生物素标记的柚皮苷、制备方法及其应用
CN112300191A (zh) * 2020-10-29 2021-02-02 上海交通大学 一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用
CN112300191B (zh) * 2020-10-29 2022-03-15 上海交通大学 一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用
CN116059199A (zh) * 2023-03-03 2023-05-05 中国中医科学院医学实验中心 灯盏乙素化合物作为野生型idh1激动剂的应用

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