CN112300191B - 一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用 - Google Patents

一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112300191B
CN112300191B CN202011181060.XA CN202011181060A CN112300191B CN 112300191 B CN112300191 B CN 112300191B CN 202011181060 A CN202011181060 A CN 202011181060A CN 112300191 B CN112300191 B CN 112300191B
Authority
CN
China
Prior art keywords
isorhamnetin
reaction
solution
stirring
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011181060.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112300191A (zh
Inventor
杨卓进
朱明彦
郑艺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN202011181060.XA priority Critical patent/CN112300191B/zh
Publication of CN112300191A publication Critical patent/CN112300191A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112300191B publication Critical patent/CN112300191B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

本发明涉及一种异鼠李素生物素探针及其合成方法与应用，所述的探针以异鼠李素为反应基团，生物素为亲和标签，具有如下所示结构：
Figure DDA0002750185220000011
其中，X为O、C、NH、O＝CNH或哌嗪基中的一种，当X为哌嗪基时，n＝1，当X为O、C、NH、O＝CNH中的一种时，n为2～4中的整数。与现有技术相比，本发明保留了异鼠李素的抗癌活性，利用异鼠李素自身的光活性作为光亲和基团，具有标记异鼠李素靶蛋白的能力，可用于异鼠李素抗癌作用靶点的发现。

Description

一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及化学生物学技术领域，具体涉及一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用。
背景技术
异鼠李素是一种黄酮类化合物，存在于苹果，黑莓，梨和沙棘等多种蔬菜和水果中(J Periodont Res 2013；48:687–695)。异鼠李素具有抗炎、抗氧化、神经保护、抗癌等多种生物学特性。已有文章报道，异鼠李素在结肠癌细胞，乳腺癌细胞，肺癌细胞、肝癌等多种癌细胞系中表现出了微摩尔级的生长抑制作用(Molecular Medicine Reports,2014,9(3):935---940；Scientific Reports,2018,8(1):11255；APJCP,2015,16(7):3035-3042；Gen.Physiol.Biophys.(2019),38,473–484)。在体内实验中，肺癌异种移植小鼠经异鼠李素治疗后，肿瘤生长显着抑制并增加了肿瘤细胞凋亡(Cancer letters,2008,270(2):342-353.)。异鼠李素通过多种机制发挥抗癌活性，包括诱导细胞凋亡，DNA裂解和染色体凝缩，诱导细胞周期阻滞以及抑制癌细胞的侵袭和迁移，抑制PI3K-Akt-mTOR和MAPK信号通路等等(Biol.Pharm.Bull,2016,39(11):1830-1838.)。但对于异鼠李素的作用靶点知之甚少，确定异鼠李素的作用靶点，有利于更好地解释异鼠李素的生物活性以及将其作为先导化合物进行结构改造，促进新型药物的研发。
基于亲和力的探针(AfBP)为大规模的药物靶点相互作用研究提供了强大的工具。目前已经报道了多种黄酮类化合物的生物活性探针。在黄芩苷降脂作用研究中，利用包含二苯甲酮光交联基团和炔基报告基团的光亲和性黄芩苷探针，确定了CPT1A为黄芩苷的主要靶点之一(PNAS，2018，115,E5896–E5905)。黄芩苷直接激活CPT1A，以加速长链酰基辅酶A流入线粒体进行脂肪酸β氧化。在另一项关于槲皮素癌症治疗靶点的研究中，合成了槲皮素C7-生物素衍生物7-BioQ，该化合物以具有光交联反应活性的槲皮素为反应基团和光亲和基团，生物素为亲和标签，用作捕获槲皮素结合蛋白的光亲和探针(Bioorg.Med.Chem.2011,19(16):4710-4720.)，成功在Jurkat细胞中找到了槲皮素已证明的靶点——线粒体ATPase，以及槲皮素可能的靶点：热休克蛋白HSP70和HSP90，泛素激活酶，剪接蛋白，RuvB样2ATPase，真核生物翻译起始因子3。这些靶点都可能在槲皮素的凋亡和抗肿瘤活性中起作用。目前还没有报道一种异鼠李素的生物活性探针，用于发现异鼠李素发挥生物活性的作用靶点。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用，探针具有抗癌活性，且具有标记异鼠李素靶蛋白的能力。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种异鼠李素生物素探针，所述的探针以异鼠李素为反应基团，生物素为亲和标签，具有如下所示结构：
Figure BDA0002750185200000021
其中，X为O、C、NH、O＝CNH或哌嗪基中的一种，当X为哌嗪基时，n＝1，当X为O、C、NH、O＝CNH中的一种时，n为2～4中的整数。
优选的，所述的X为O，n＝3，探针具有如下所示结构：
Figure BDA0002750185200000022
所述的探针具有抗癌活性，保留了异鼠李素对癌细胞的生物活性，对癌细胞的增殖具有抑制活性。
一种上述异鼠李素生物素探针的合成方法，包括以下步骤：
(1)将槲皮素和K2CO3加入DMF溶液中搅拌溶解，在冰浴下逐滴加入苄溴的DMF溶液，搅拌1.5～2.5h，然后恢复至室温反应16～18h，反应完成后，洗涤、萃取、干燥、柱层析纯化得到化合物1，化合物1的结构式如下所示：
Figure BDA0002750185200000031
(2)将生物素加入无水DMF溶液中溶解，向反应液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和EDCI，并在室温搅拌22～26h至溶液澄清，旋干溶剂，洗涤、干燥，得到化合物2，化合物2的结构式如下所示：
Figure BDA0002750185200000032
(3)将四聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，降温至-2～2℃，向溶液中加入4-甲苯磺酰氯、新制氧化银和碘化钾，-2～2℃搅拌8～12min，反应结束后，过滤，旋干溶剂，柱层析纯化得到中间体3，中间体3的结构式如下所示：
Figure BDA0002750185200000033
(4)将步骤(3)所得中间体3加入DMF溶液中搅拌溶解，向溶液中加入NaN3和四丁基溴化铵，并在45～55℃搅拌反应16～18h，反应结束后加入水，萃取、洗涤、干燥，旋干溶剂，柱层析纯化得到中间体4，中间体4的结构式如下所示：
Figure BDA0002750185200000034
(5)将步骤(4)所得中间体4加入二氯甲烷中搅拌溶解，向溶液中加入4-甲苯磺酰氯和三乙胺，室温搅拌反应10～14h，反应结束后，旋干溶剂，柱层析纯化得到中间体5，中间体5的结构式如下所示：
Figure BDA0002750185200000035
(6)将步骤(1)所得化合物1和K2CO3加入DMF溶液中搅拌溶解，向溶液中加入步骤(5)所得中间体5的DMF溶液，并在75～85℃搅拌38～42h，反应结束后，向反应液中加入水，萃取、洗涤、干燥，旋干溶剂，柱层析纯化得到中间体6，中间体6的结构式如下所示：
Figure BDA0002750185200000041
(7)将步骤(6)所得中间体6加入甲醇和四氢呋喃溶液中搅拌溶解，并向反应液中加入4～6％钯碳，滴加2.8～3.2N HCl，开始反应，反应结束后，用硅藻土过滤，得到中间体7，中间体7的结构式如下所示：
Figure BDA0002750185200000042
(8)将步骤(7)所得中间体7和步骤(2)所得化合物2加入无水DMF溶液中搅拌溶解，再向反应液中加入三乙胺，并在室温反应16～18h，反应完全后，旋干溶剂，甲醇溶解，高效液相色谱纯化得到化合物8，化合物8的结构式如下所示：
Figure BDA0002750185200000043
所述的化合物8为一种异鼠李素生物素探针。
进一步地，步骤(7)中，所述的甲醇与四氢呋喃混合溶剂的体积之比为0.25～1:1，反应在高压反应釜中进行，调节氢气压力为5.8～6.2个大气压，室温反应15～17h。
优选的，步骤(1)中，在0℃下搅拌2h；步骤(2)中，在室温搅拌24h至溶液澄清；步骤(3)中，降温至0℃，在0℃搅拌10min；步骤(4)中，在50℃搅拌反应；步骤(5)中，室温搅拌反应12h；步骤(6)中，80℃搅拌40h；步骤(7)中，向反应液中加入5％钯碳，滴加3N HCl，调节氢气压力为6个大气压，室温反应16h。
所述的中间体7的末端氨基基团通过形成酰胺键或脲结构连接多种基团或标签，包括生物素；
所述的中间体7的末端氨基基团连接荧光基团或固相载体，荧光基团包括染料Cy3、染料Cy5，固相载体包括C60、纳米载体或金属复合物。
一种上述异鼠李素生物素探针的应用，将所述的探针用于在癌细胞中成像，显示探针在细胞中的定位与分布。
一种上述异鼠李素生物素探针的应用，将所述的探针用于鉴定癌细胞中与异鼠李素直接作用的蛋白质靶点，完成异鼠李素抗癌机制的研究。
进一步地，所述的蛋白质靶点与探针共价结合，通过紫外照射，实现探针中的异鼠李素与蛋白质靶点的光交联。
所述的癌细胞包括乳腺癌细胞MDA-MB-231、卵巢癌细胞SKOV-3，前列腺癌细胞PC-3。
与现有技术相比，本发明保留了异鼠李素的抗癌活性，利用异鼠李素自身的光活性作为光亲和基团，具有标记异鼠李素靶蛋白的能力，可用于异鼠李素抗癌作用靶点的发现，有利于更好地阐述异鼠李素的抗癌活性，根据靶点蛋白的结合模式对异鼠李素进行结构优化。
附图说明
图1为使用MTT比色法测定评估异鼠李素生物素探针对乳腺癌MDA-MB-231细胞系的存活率的影响的IC50曲线，用异鼠李素生物素探针(0-300μM)处理MDA-MB-231细胞48h，数据表示为平均值±SD，n＝3；
图2为使用MTT比色法测定评估异鼠李素生物素探针对卵巢癌SKOV-3细胞系的存活率的影响的IC50曲线，用异鼠李素生物素探针(0-300μM)处理SKOV-3细胞72h，数据表示为平均值±SD，n＝3；
图3为使用MTT比色法测定评估异鼠李素生物素探针对前列腺癌PC-3细胞系的存活率的影响的IC50曲线，用异鼠李素生物素探针(0-300μM)处理PC-3细胞72h，数据表示为平均值±SD，n＝3。
图4为20μM异鼠李素生物素探针在乳腺癌MDA-MB-231细胞系中的荧光定位。图4A为明亮视野下的细胞；图4B为异鼠李素生物素探针在488nm激发波长下,500～560nm的发射波长下显示的细胞荧光。图4C为明亮视野通道和荧光通道合并的细胞成像。
图5为40μM异鼠李素生物素探针在乳腺癌MDA-MB-231细胞系中的荧光定位。图5A为明亮视野下的细胞；图5B为异鼠李素生物素探针在488nm激发波长下,500～560nm的发射波长下显示的细胞荧光。图5C为明亮视野通道和荧光通道合并的细胞成像。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义，以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
一种异鼠李素生物素探针，其合成方法包括以下步骤：
第一步：合成化合物1[3,7-双(苄氧基)-2-(4-(苄氧基)-3-羟基苯基)-5-羟基-4H-苯并吡喃-4-酮]
反应式1
Figure BDA0002750185200000061
将槲皮素2g(6.6mmol)，碳酸钾2.76g(3eq,19.8mmol)加入30mL DMF溶液中，搅拌溶解。在冰浴下逐滴加入苄溴3.39g(2.36mL,3eq,19.8mmol)的DMF溶液(10mL)，并在0℃下搅拌2h，然后恢复至室温反应过夜。反应完成后，向反应体系中加入50mL饱和食盐水，再加入60mL乙酸乙酯萃取两遍，所得有机层用无水硫酸钠干燥，经柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到黄色固体化合物1(1.336g)，产率为35.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.67(s,1H),9.45(s,1H),7.56(d,J＝2.2Hz,1H),7.52(s,1H),7.50-7.30(m,15H),7.14(d,J＝8.7Hz,1H),6.81(d,J＝2.1Hz,1H),6.48(d,J＝2.2Hz,1H),5.24(s,2H),5.23(s,2H),5.02(s,2H)ppm；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ178.94,164.57,162.11,156.84,156.44,147.97,145.68,137.71,136.55，135.90,135.77,128.96,128.92,128.86,128.79,128.47,128.40,128.31,128.00,127.59,124.02,122.00,114.99,111.65,106.31,98.77,93.09,74.34,71.21,70.52ppm。
第二步：合成化合物2[生物素-N-羟基琥珀酰亚胺]
反应式2
Figure BDA0002750185200000071
将500mg生物素(2.046mmol)加入20mL无水DMF溶液中溶解，向反应液中加入370mgN-羟基琥珀酰亚胺(3.27mmol，1.6eq)与510mg EDCI，并在室温搅拌24h，溶液从浑浊变澄清。旋蒸除去DMF，所得固体用甲醇洗涤3-5次，干燥，得到白色固体粉末化合物2(325mg)，产率为45.8％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ6.44(s,1H),6.37(s,1H),4.32-4.30(m,1H),4.16-4.13(m,1H),3.12-3.09(m,1H),2.85-2.81(m,5H),2.67(t,J＝4.9Hz,2H),2.58(d,J＝8.3Hz,1H),1.67-1.61(m,3H),1.53-1.39(m,3H)ppm。
第三步：合成异鼠李素生物素探针
Figure BDA0002750185200000081
具体来说，包括以下步骤：
(1)合成中间体3[2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)对甲苯磺酸乙酯]，结构式如下：
Figure BDA0002750185200000082
将670mg四聚乙二醇(3.45mmol，4eq)加入50mL DCM溶液中溶解，并用冰浴降温至0℃左右，向溶液中加入725mg TsCl(3,8mmol,1.1eq)，1.2g新制Ag2O(5.18mmol,1.5eq)，115mg KI(0.69mmol,0.2eq)。并在0℃搅拌10min。反应结束后，将溶液过滤，旋干所得粗品经柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝2/1至1/1)，得到无色油状液体中间体3(830mg)，产率为69％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.79(d,J＝8.3Hz,2H),7.48(d,J＝8Hz,2H),4.57(t,J＝5.4Hz,1H),4.11(t,J＝4.4Hz,2H),3.57(t,J＝4.4Hz,2H),3.49-3.45(m,10H),3.40(t,J＝5.0Hz,2H),2.42(s,3H)ppm。
(2)合成中间体4[2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇]，结构式如下：
Figure BDA0002750185200000091
将3g中间体3(8.61mmol)加入25mL DMF溶液中搅拌溶解。向溶液中加入1.12gNaN3(17.22mmol,2eq)，159mg TBAB(0.43mmol,0.05eq)，并在50℃搅拌反应过夜。反应结束后，向反应液中加入50mL水，用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干溶剂。所得粗品经柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)，得到无色油状液体中间体4(1.6g)，产率为84.8％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ4.57(t,J＝3.6Hz,1H),3.60(t,J＝3.3Hz,2H),3.57-3.51(m,8H),3.48(t,J＝3.6Hz,2H),3.42-3.38(m,4H)ppm。
(3)合成中间体5[2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)对甲苯磺酸乙酯]，结构式如下：
Figure BDA0002750185200000092
将300mg中间体4(1.37mmol)加入10mL DCM溶剂中搅拌溶解。向溶液中加入391mgTsCl(2.05mmol,1.5eq),284μL TEA(2.054mmol,1.5eq),室温搅拌反应12h。反应结束后，旋干溶剂，所得粗品经柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝2/1至1/1)，得到无色油状液体中间体5(321mg)，产率为73.8％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.80(d,J＝5.4Hz,2H),7.34(d,J＝5.4Hz,2H),4.16(t,J＝3.2Hz,2H),3.70-3.60(m,12H),3.38(t,J＝3.2Hz,2H),2.45(s,3H)ppm。
(4)合成中间体6[2-(3-(2-(2-(2-(2-叠氮氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-(苄氧基)苯基)-3,7-双(苄氧基)-5-羟基-4H-苯并吡喃-4-酮]，结构式如下：
Figure BDA0002750185200000093
将900mg化合物1(1.57mmol)，284mg K2CO3(2.04mmol,1.3eq)加入20mL DMF溶液中搅拌溶解。向溶液中加入500mg中间体5(1.57mmol,1eq)的DMF溶液5mL，并在80℃搅拌40h。反应结束后，向反应液中加入50mL水，并用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相并用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。旋干溶剂，所得粗品经柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到黄色半固体中间体6(790mg)，产率为64.57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.64(s,1H),7.65-7.63(m,2H),7.48-7.31(m,15H),7.20(d,J＝8.7Hz,1H),6.88(d,J＝1.8Hz,1H),6.48(d,J＝2Hz,1H),5.23(s,2H),5.22(s,2H),5.08(s,2H),3.94(t,J＝4.5Hz,2H),3.69(t,J＝4.5Hz,2H),3.59-3.51(m,10H),3.34(t,J＝5Hz,2H)ppm；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ178.96,164.63,162.21,156.86,156.50,151.09,148.64,137.70,136.78,136.64,135.92,128.89,128.73,128.52,128.47,128.39,128.19,127.64,127.42,123.60,122.82,114.70,113.80,106.33,98.76,93.21,74.55,71.05,71.01,70.89,70.81,70.77,70.60,70.15,69.71,69.06,50.79ppm。
(5)合成中间体7[22-(3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基苯基)-3,5,7-三羟基-4H-苯并吡喃-4-酮盐酸盐]，结构式如下：
Figure BDA0002750185200000101
将100mg中间体6(1.286mmol)加入1.5mL甲醇与1.5mL THF溶液中搅拌溶解，并向反应液中加入34mg 5％钯碳(0.032mmol，0.25eq)，滴加2滴3N HCl。并将反应管放在高压反应釜中，调节氢气压力为6个大气压，室温反应16h。反应结束后，用硅藻土过滤，得到黄色固体中间体7(60mg)，产率为100％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.45(s,1H),10.90(s,1H),9.87(s,1H),9.44(s,1H),7.76(d,J＝1.3Hz,1H),7.69(dd,J＝5.6Hz,J＝1.3Hz,1H),6.99(d,J＝5.6Hz,1H),6.50(d,J＝1.4Hz,1H),6.22(d,J＝1.4Hz,1H),4.26(t,J＝4.7Hz,2H),4.15(t,J＝3.1Hz,2H),3.79(t,J＝3.1Hz,2H),3.64-3.56(m,10H),3.44(t,J＝4.3Hz,2H)ppm。
(6)合成化合物8[N-(2-(2-(2-(2-(2-羟基-5-(3,5,7-三羟基-4-氧代-4H-苯并吡喃-2-基)苯氧基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((3aS，4S，6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺]，结构式如下：
Figure BDA0002750185200000102
将60mg中间体7(0.117mmol)，48mg化合物2(0.14mmol，1.2eq)加入10mL干燥DMF溶液中搅拌溶解，再向反应液中加入33μL三乙胺，并在室温反应过夜。反应完全后，旋干溶剂，并溶解在甲醇中。所得粗品经制备HPLC(流动相比例：30％MeOH-100％MeOH 30min，100％MeOH 10min)纯化，得到黄色固体化合物8(20mg)，产率为24.4％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(s,1H),7.82-7.77(m,2H),7.70(d,J＝8.4Hz,1H),6.97(d,J＝8.5Hz,1H),6.48(s,1H),6.40(s,1H),6.34(s,1H),6.20(s,1H),4.29(t,J＝5.7Hz,1H),4.15-4.12(m,3H),3.79(t,J＝4.7Hz,2H),3.62(t,J＝4.7Hz,2H),3.57-3.50(m,6H),3.38(t,J＝5.7Hz,2H),3.18(t,J＝5.8Hz,2H),3.09-3.05(m,1H),2.81(dd,J＝12.4Hz,J＝5.1Hz,1H),2.57(d,J＝12.4Hz,1H),2.05(t,J＝7.2Hz,2H),1.99(s,1H),1.54-1.40(m,3H),1.33-1.23(m,3H)ppm；13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ 175.84,172.08,163.94,162.64,160.63,156.13,149.23,146.53,146.45,135.78,129.59,122.06,121.94,115.75,113.93,102.97,98.18,93.55,69.91,69.78,69.69,69.51,69.11,68.96,68.47,60.99,59.16,55.33,38.40,35.04,28.10,27.97,25.17,20.68,14.02ppm；HRMS:[M+HCOOH-H]+C32H38N3O13S calcd 704.2489；found704.2496。
化合物8即为一种异鼠李素生物素探针。
实施例2
一种异鼠李素生物素探针的应用，将其应用于肿瘤细胞系增殖抑制，具体过程如下：
(1)细胞培养。所有肿瘤细胞系(MDA-MB-231，SKOV-3，PC-3)均购于ATCC(美国菌种保藏中心)。肿瘤细胞系在DMEM完全培养基(高糖DMEM培养基，加入10％胎牛血清，100units/mL青霉素，100mg/mL链霉素)中培养。细胞在CO2细胞培养箱中37℃培养。当细胞复苏后传代三次以上，长至80％满时且状态良好时可用于活性测试。
(2)具体操作。用四氮唑(MTT)法测试实施例1所合成的异鼠李素生物素探针对细胞的增殖抑制活性。简言之，细胞种于96孔板中，加入不同浓度的异鼠李素生物素探针孵育相应的时间。然后在每孔中加入20μL MTT(5mg/mL)并孵育4h。吸去上清，每孔加入150μLDMSO并震摇20min。酶标仪(Thermo Varioskan Flash)读取490nm下各孔的光密度值(OD)。每个化合物在每个浓度下设三个复孔。
(3)按下式计算药物对细胞系的增殖抑制率：细胞增殖抑制率＝(OD阴性对照试-OD试验)/(OD阴性对照-OD空白)×100％。以同一样品的不同浓度对细胞增殖抑制率作图可得到剂量反应曲线，用软件GraphPad Prism 5分析，从中求出样品的半数抑制浓度IC50。
图1为使用MTT比色法测定评估异鼠李素生物素探针对乳腺癌MDA-MB-231细胞系的存活率的影响的IC50曲线，用异鼠李素生物素探针(0-300μM)处理MDA-MB-231细胞48h，数据表示为平均值±SD，n＝3；
图2为使用MTT比色法测定评估异鼠李素生物素探针对卵巢癌SKOV-3细胞系的存活率的影响的IC50曲线，用异鼠李素生物素探针(0-300μM)处理SKOV-3细胞72h，数据表示为平均值±SD，n＝3；
图3为使用MTT比色法测定评估异鼠李素生物素探针对前列腺癌PC-3细胞系的存活率的影响的IC50曲线，用异鼠李素生物素探针(0-300μM)处理PC-3细胞72h，数据表示为平均值±SD，n＝3。
由图1～图3可知，本发明异鼠李素生物素探针对乳腺癌MDA-MB-231细胞系、卵巢癌SKOV-3细胞系和前列腺癌PC-3细胞系的增殖均具有抑制的作用，在300μM范围内，异鼠李素生物素探针的浓度越高，对癌症细胞系增殖的抑制作用越显著。
实施例3
一种异鼠李素生物素探针的应用，将其应用于细胞定位，具体过程如下：
将MDA-MB-231细胞接种到24孔板的细胞爬片上，并在DMEM培养基中生长约一天。加入40μM或20μM实施例1所合成的异鼠李素生物素探针，孵育4小时后，吸去培养基，用PBS洗涤，并用2μM环孢霉素A(CsA)覆盖细胞爬片，用4％的多聚甲醛于室温下固定细胞5min，PBS洗涤2次，使用封片液封片。并置于显微镜平台上。使用具有63×油浸物镜的Leica SP8显微镜。激发波长为488nm，并且在500-560nm的间隔内收集荧光。分辨率为1024×1024，行扫描频率为600Hz。
由图4～图5可知，本发明异鼠李素探针可进入细胞，通过与细胞中的蛋白结合显示荧光，因此具有在细胞中荧光成像的能力，显示探针在细胞中的定位与分布。荧光强度与化合物浓度成依赖关系，化合物浓度越高，荧光越强。由图4可知，化合物浓度为20μM时，化合物进入细胞并显示荧光，细胞形态正常。由图5可知，化合物浓度达到40μM时，化合物进入细胞且荧光增强，但显微镜观察部分细胞形态有变化，由梭形变为圆球形，细胞皱缩，细胞数目减少。推荐使用的异鼠李素探针的细胞定位浓度为20～40μM范围以内。
实施例4
一种异鼠李素生物素探针的应用，将其应用于基于亲和力的蛋白质组学分析，鉴别被标记的蛋白质，具体过程如下：
(1)蛋白质组标记和亲和纯化实验
MDA-MB-231细胞在DMEM完全培养基(高糖DMEM培养基，加入10％胎牛血清，100units/mL青霉素，100mg/mL链霉素)中指数生长，直至约15×106个细胞，之后收获细胞，并用3％DMSO溶液或在3％DMSO溶液中的150μM异鼠李素生物素探针处理2小时。对于竞争实验，在添加光探针之前，首先将细胞与异鼠李素(500μM)孵育2小时。将MDA-MB-231细胞冷却至0℃，然后将玻璃管中的MDA-MB-231细胞在裂解前后分别用UV灯于4℃照射30分钟，该玻璃管浸入冰中，与紫外线中压汞弧灯相距10厘米。
在2mL细胞裂解缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.2、100mM NaCl，0.2％Triton X-100和蛋白酶抑制剂)的冷室中进行超声处理裂解细胞，并以5000rpm离心10分钟后，将上清液与链霉亲和素珠一起温育，然后以14000rpm离心5分钟，并除去上清液。然后用变性缓冲液(20mM Tris HCl，2％SDS，pH 7.4)洗涤珠子，每次离心前震荡3分钟。洗涤程序至少重复三遍。然后将珠粒重悬于20μL2×SDS-PAGE凝胶上样缓冲液(50mM Tris HCl，100mM二硫苏糖醇，8M尿素，2％SDS，10％甘油)煮沸10分钟以使链霉亲和素变性并释放生物素结合物。将样品加到SDS聚丙烯酰胺凝胶上，并在125V电压下电泳约1个小时。然后将SDS聚丙烯酰胺凝胶在100mL乙醇/冰醋酸/水(30:10:60)溶液中温育过夜，以固定蛋白质。用去离子水洗涤后，对凝胶进行银染。
(2)凝胶内胰蛋白酶消化
用凝胶切割器或手术刀刀片将银染的条带切下。将探针组泳道标记而对照组泳道未标记的相应部分条带切下，并切成1mm×1mm大小的小块，放入微量离心管中，向其中加入脱色缓冲液。脱色后，将胶块用50mM碳酸氢钠洗涤至少3次，直到溶液没有明显黄色。将乙腈(200μL)加入每个试管中振荡5分钟以使胶块脱水，干燥。在离心管中加入50μL 10mM DTT/25～50mM碳酸氢铵。去掉DTT溶液后，将胶块与在50mM碳酸氢铵中的25～50mM新鲜配制的碘乙酰胺溶液在室温下于黑暗中孵育20分钟。然后将胶块用50mM碳酸氢铵洗涤1次，用500μL乙腈脱水10分钟。除去乙腈后，将样品在离心蒸发仪中完全干燥，并进行胰蛋白酶消化。
将测序级胰蛋白酶用50mM碳酸氢铵配制成2ng/μL，每个样品中添加10～100μLTrypsin酶液，4℃放置30min，观察胶是否充分吸胀，如果没有充分吸胀，补加一定量的酶液(酶液体积根据胶块大小确定，稍多于胶水溶状态体积)，37℃酶解过夜。
10～100μL乙腈：水：甲酸(60：35：5)，超声粉碎5min，37℃孵育30min。将液体吸净转移至新的离心管。再加10～100μL乙腈，超声粉碎5min，37℃孵育30min，将液体吸净转移至以上步骤离心管，合并提取液。离心浓缩仪中干燥，50～55℃，1～2小时。将干燥的多肽混合物重悬于0.1％FA中，然后用C18微量层析柱脱盐干燥，用适量上样缓冲液(0.1％FA)重悬，上机。
(3)LC-MS/MS分析
纳升液相色谱分析柱为C18反相分析柱(75μm×20cm，3μm)；流动相A为99.9％水和0.1％甲酸混合液，流动相B为80％乙腈和0.1％甲酸混合液。液相梯度一般为：0-1min，2％B；1-3min，2-6％B；3-43min，6％-20％B；43-48min，20-35％B；48-49min，35-100％B；49-60min，100％B。流动相流速为300nL/min。流出物直接喷入四极杆轨道阱质谱仪中(ThermFisher,Exactive plus)，ESI+模式，采用数据依赖性扫描模式，在分辨率为70000(AGC 3e6)的轨道阱中进行全扫描采集(m/z 350-1800)。将分离出的前20个肽信号(电荷态≥+2)母离子通过高能碰撞(HCD)破碎，标准化碰撞能(NCE)为28.0。毛细管的温度是275℃，喷雾电压是2100V。子离子在分辨率为17500(AGC 1e5)的轨道上测量。全扫描和MS-MS扫描的最大填充时间分别设置为50ms和45ms，动态排除时间设置为30s。
(4)MS数据分析
利用Peaks studio 10.0软件搜索引擎对原始数据进行搜库分析，数据库下载自UniProt，条目数20376。分析参数为：母离子质量容差：10ppm，二级谱图质量容差：0.020u，固定修饰为Carbamidomethyl(C)，可变修饰(+659.2149、663.2098、691.2047)为Deamidation(NQ)，Oxidation(M)，胰酶酶切，最大漏切位点设置为2个。多肽和蛋白的FDR≤1％。
通过亲和纯化得到的被标记蛋白质经消化后，按照上述方法进行蛋白质身份鉴定，确定异鼠李素生物素探针的作用靶点。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种异鼠李素生物素探针，其特征在于，所述的探针以异鼠李素为反应基团，生物素为亲和标签，具有如下所示结构：
Figure FDA0003364002380000011
2.一种如权利要求1所述的异鼠李素生物素探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将槲皮素和K2CO3加入DMF溶液中搅拌溶解，在冰浴下逐滴加入苄溴的DMF溶液，搅拌1.5～2.5h，然后恢复至室温反应16～18h，反应完成后，洗涤、萃取、干燥、柱层析纯化得到化合物1，化合物1的结构式如下所示：
Figure FDA0003364002380000012
(2)将生物素加入无水DMF溶液中溶解，向反应液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和EDCI，并在室温搅拌22～26h至溶液澄清，旋干溶剂，洗涤、干燥，得到化合物2，化合物2的结构式如下所示：
Figure FDA0003364002380000013
(3)将四聚乙二醇加入二氯甲烷中溶解，降温至-2～2℃，向溶液中加入4-甲苯磺酰氯、新制氧化银和碘化钾，-2～2℃搅拌8～12min，反应结束后，过滤，旋干溶剂，柱层析纯化得到中间体3，中间体3的结构式如下所示：
Figure FDA0003364002380000014
(4)将步骤(3)所得中间体3加入DMF溶液中搅拌溶解，向溶液中加入NaN3和四丁基溴化铵，并在45～55℃搅拌反应16～18h，反应结束后加入水，萃取、洗涤、干燥，旋干溶剂，柱层析纯化得到中间体4，中间体4的结构式如下所示：
Figure FDA0003364002380000021
(5)将步骤(4)所得中间体4加入二氯甲烷中搅拌溶解，向溶液中加入4-甲苯磺酰氯和三乙胺，室温搅拌反应10～14h，反应结束后，旋干溶剂，柱层析纯化得到中间体5，中间体5的结构式如下所示：
Figure FDA0003364002380000022
(6)将步骤(1)所得化合物1和K2CO3加入DMF溶液中搅拌溶解，向溶液中加入步骤(5)所得中间体5的DMF溶液，并在75～85℃搅拌38～42h，反应结束后，向反应液中加入水，萃取、洗涤、干燥，旋干溶剂，柱层析纯化得到中间体6，中间体6的结构式如下所示：
Figure FDA0003364002380000023
(7)将步骤(6)所得中间体6加入甲醇和四氢呋喃溶液中搅拌溶解，并向反应液中加入4～6％钯碳，滴加2.8～3.2N HCl，开始反应，反应结束后，用硅藻土过滤，得到中间体7，中间体7的结构式如下所示：
Figure FDA0003364002380000024
(8)将步骤(7)所得中间体7和步骤(2)所得化合物2加入无水DMF溶液中搅拌溶解，再向反应液中加入三乙胺，并在室温反应16～18h，反应完全后，旋干溶剂，甲醇溶解，高效液相色谱纯化得到化合物8，化合物8的结构式如下所示：
Figure FDA0003364002380000031
所述的化合物8为异鼠李素生物素探针。
3.根据权利要求2所述的异鼠李素生物素探针的合成方法，其特征在于，步骤(7)中，所述的甲醇与四氢呋喃混合溶剂的体积之比为0.25～1:1，反应在高压反应釜中进行，调节氢气压力为5.8～6.2个大气压，室温反应15～17h。
4.一种如权利要求1所述的异鼠李素生物素探针的应用，其特征在于，所述的探针在制备癌细胞成像药物中的应用。
5.一种如权利要求1所述的异鼠李素生物素探针的应用，其特征在于，将所述的探针在制备鉴定癌细胞中与异鼠李素直接作用的蛋白质靶点的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的异鼠李素生物素探针的应用，其特征在于，所述的蛋白质靶点与探针共价结合，通过紫外照射，实现探针中的异鼠李素与蛋白质靶点的光交联。
7.根据权利要求4～6中任一项所述的异鼠李素生物素探针的应用，其特征在于，所述的癌细胞为乳腺癌细胞MDA-MB-231、卵巢癌细胞SKOV-3或前列腺癌细胞PC-3。
CN202011181060.XA 2020-10-29 2020-10-29 一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用 Active CN112300191B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011181060.XA CN112300191B (zh) 2020-10-29 2020-10-29 一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011181060.XA CN112300191B (zh) 2020-10-29 2020-10-29 一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112300191A CN112300191A (zh) 2021-02-02
CN112300191B true CN112300191B (zh) 2022-03-15

Family

ID=74331679

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011181060.XA Active CN112300191B (zh) 2020-10-29 2020-10-29 一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112300191B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114685463B (zh) * 2021-07-01 2024-05-28 上海交通大学 一种异鼠李素光亲和探针及其合成方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016073897A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Northwestern University Inhibition of cancer cell motility
CN107266466A (zh) * 2017-05-25 2017-10-20 贵州医科大学 灯盏乙素生物素标记探针的应用及相关pkm2激酶抑制剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016073897A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Northwestern University Inhibition of cancer cell motility
CN107266466A (zh) * 2017-05-25 2017-10-20 贵州医科大学 灯盏乙素生物素标记探针的应用及相关pkm2激酶抑制剂

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biotinylated quercetin as an intrinsic photoaffinity proteomics probe for the identification of quercetin target proteins;Rongsheng E. Wang等;《Bioorganic & Medicinal Chemistry》;20110713;第19卷(第16期);第4710-4720页 *
Scutellarin inhibits Hela cell growth and glycolysis by inhibiting the activity of pyruvate kinase M2;Lin You等;《Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters》;20171110;第27卷(第24期);54040-5408 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112300191A (zh) 2021-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11814396B2 (en) Sesquiterpenoid analogs
CN112300191B (zh) 一种异鼠李素生物素探针及其合成方法和应用
CN114957231B (zh) Gpx4蛋白靶向降解嵌合体及其制备方法与应用
CN114621310B (zh) 基于雷公藤红素的靶向Prdx2降解剂及其制备方法与医药用途
CN114685463B (zh) 一种异鼠李素光亲和探针及其合成方法和应用
CN112457297B (zh) 一种parp蛋白降解剂及其制备方法与应用
CN110615813B (zh) 一种小分子探针及其制备与应用
CN112250700B (zh) 氟硼二吡咯类蛋白质错误折叠探针Halo-BODIPY及其制备方法与应用
Zhou et al. Synthesis, biological evaluation and cellular localization study of fluorescent derivatives of Jiyuan Oridonin A
CN115746036B (zh) 一种靶向识别Aβ纤维的荧光探针SN-BODIPY化合物及其制备方法
CN113773283B (zh) 一种含疏水标签的氧桥双环庚烯磺酰胺类化合物及其应用
CN113072534B (zh) 一种rna荧光探针及其制备方法和应用
CN110483547B (zh) 二氢青蒿素的简单酚类偶联物、合成方法及应用
CN114685504A (zh) 一种Fascaplysin衍生物及其制备方法与应用
CN115974782B (zh) 一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针及其制备方法和应用
CN112321489A (zh) 一种基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针及其制备方法和应用
CN111808006A (zh) 氮杂环丙烯类化合物及其制备方法和应用
CN113754603B (zh) 一种异恶唑类化合物作为粘度荧光探针的应用
CN114685457B (zh) 一种恩扎鲁胺光亲和探针及其制备方法
JP2014137307A (ja) 蛍光性質量標識プローブ
CN116199728B (zh) 一种半乳糖二硒醚荧光探针及其制备方法与应用
CN116836142B (zh) 一种3-色酮基-2-磺酰基丙烯腈衍生物及其制备方法与应用
CN118439981A (zh) 一种氟磺酸类化合物及其应用
CN118852114A (zh) 一种靶向周期蛋白依赖性激酶9的光亲和探针及其制备方法和应用
CN117362383A (zh) 双重靶向降解雌激素受体和人组蛋白脱乙酰基酶6的PROTACs化合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant