CN115974782B - 一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针及其制备方法和应用，这种对异贝壳杉烯酸（KA）光亲和探针的制备方法包括：将三苯基膦的四氯化碳液在惰性气体中加热回流，冷却至室温，加入对异贝壳杉烯酸，加热回流，旋蒸，得到中间产物；将3‑胺乙基‑3‑(丁‑3‑炔基)双吖丙啶溶于有机溶剂，和中间产物混合，搅拌反应；旋蒸得到固体产物，加入有机溶剂溶解所述固体产物，洗涤有机相，除水，再次旋蒸，通过制备型高效液相色谱提纯得到对异贝壳杉烯酸光亲和探针。本申请运用化学蛋白质组学方法，揭示了天然产物KA抑制乳腺癌细胞MCF7生长的分子机制，确定了一系列重要靶点，为乳腺癌的治疗提供了新的方法。

Description

一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及化学蛋白质组学技术领域，特别涉及一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针及其制备方法和应用。

背景技术

一直以来，癌症都是影响人类健康的重要敌人。据数据统计，全世界每年约有1000万人因癌症丧生，其中作为十大癌症之一的乳腺癌，约占其中的15%左右，可见乳腺癌已成为危及女性健康的主要问题之一。现阶段针对乳腺癌的主要治疗方式是切除和化疗，但乳腺肿瘤的高度遗传异质性和化疗耐药性限制了治疗期间药物的使用。因此不断地寻找合适的化合物来制备新的有效药物来扩大治疗过程中药物的选择范围是十分必要的。

在新药开发的来源中，天然产物一直占据不可替代的地位，许多治疗癌症的药物都是来源于自然界中的天然产物及其衍生物。对异贝壳杉烯酸(The ent-kaurane-typediterpene kaurenoic acid, 简称KA)，是一种存在于许多巴西植物中的天然产物。KA对许多疾病表现出生物学特性，包括抗微生物和血管松弛(Pharmacol.2004.200425.233-241)。有文献报道，KA是一种对胃腺癌和宫颈癌细胞具有细胞毒性和遗传毒性的内酯类化合物(T. C. Okoye et.al 2014)，并发现KA主要调节c-FLIP、caspase-3和caspase-8，参与了化疗耐药U87细胞的凋亡反应(Biol.Res.2013.45.71-78)。同时在乳腺癌细胞MCF-7中的实验发现，KA对MCF-7细胞有明显的抑制增殖作用，并且在一定的浓度下KA增加了细胞DNA损伤的延伸，导致了G1期细胞周期的积聚和诱导细胞的凋亡(ChemistrySelect 2020.5.11850-11853)。然而，尽管越来越多的研究关注到了KA的细胞活性，但其具体的分子机制仍然不甚明确。

如何探究KA的分子机制，进而对KA的靶点蛋白质进行充分发掘，是目前需要解决的技术问题。

发明内容

为了揭示KA的分子机制，本申请提供了一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针及其制备方法和应用，利用化学蛋白质组学技术对KA的靶点进行发掘。

首先，本申请提供一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针，具有如下所示结构：

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其次，本申请还提供一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的制备方法，用于制备上述对异贝壳杉烯酸光亲和探针，包括如下步骤：

1）将三苯基膦的四氯化碳液在惰性气体中加热回流，冷却至室温，加入对异贝壳杉烯酸，加热回流，旋蒸，得到中间产物；

2）将3-胺乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶溶于有机溶剂，和中间产物混合，搅拌反应；

3）旋蒸得到固体产物，加入有机溶剂溶解所述固体产物，洗涤有机相，除水，再次旋蒸，通过制备型高效液相色谱提纯得到对异贝壳杉烯酸光亲和探针。

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进一步地，所述对异贝壳杉烯酸和3-胺乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶的摩尔比为1：2。

进一步地，步骤1）中所述将三苯基膦的四氯化碳液在惰性气体中加热回流的加热温度为80℃，回流时间为4~6h。

进一步地，步骤1）中所述加入对异贝壳杉烯酸，加热回流的加热温度80℃，回流时间为30~60min。

进一步地，步骤2）中所述搅拌反应的反应温度为15~25℃，反应时间为12~20h。

进一步地，所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯。

进一步地，步骤3）中所述洗涤有机相的溶剂为盐酸和碳酸氢钠溶液。

最后，本申请还提供一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的应用，使用上述对异贝壳杉烯酸光亲和探针，用于发掘乳腺癌细胞中对异贝壳杉烯酸的靶点蛋白质。

进一步地，所述靶点蛋白质为VDAC1/2、AT2A2和CATD。

本申请成功的运用化学蛋白质组学方法，揭示了天然产物KA抑制乳腺癌细胞MCF7生长的分子机制。在本申请相关的实验中，申请人首次设计并合成了KA相应的光亲和探针，利用该探针在乳腺癌细胞中定量鉴定到了656个潜在KA结合蛋白质，并通过对蛋白质信号比值和PSMs进行分析，确定了Voltage-dependent anion-selective channel protein1/2，Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2，Cathepsin D等高置信度靶点蛋白质，相关文献研究进一步证实该类靶点与乳腺癌密切相关，是临床重要靶点。因此，本申请第一次从分子水平揭示了KA的作用机制，确定了一系列重要靶点，为乳腺癌的治疗提供了新的方法。而蛋白靶点的确认，有助于进一步优化KA的结构，提高其特异性和选择性，成为临床前候选药物分子。

本申请所提供的技术方案优势在于，能够在表型相关的细胞模型或组织中进行实验，通过设计合成KA的光亲和活性化学探针，可以将该探针应用于KA抑制乳腺癌细胞生长的机制研究中，从而为新靶点的发现和癌症的“精准治疗”提供新的研究思路。

附图说明

下面对说明书附图所表达的内容做简要说明：

图1是本申请中实施例1制备的KA-1的质谱图；

图2是本申请中实施例1制备的KA-1的¹H NMR谱图；

图3是本申请中实施例1制备的KA-1的¹³C NMR谱图。

图4是本申请中KA-1探针在MCF-1细胞中的标记结果图；

图5是本申请中对KA-1结合蛋白质进行质谱结果分析的定量蛋白质散点图；

图6是本申请中对KA-1结合蛋白质进行质谱结果分析的定量蛋白质比值分布与PSMs关系图；

图7是本申请中对靶点蛋白进行注释的差异蛋白数目统计图；

图8是本申请中差异蛋白GO富集分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

对异贝壳杉烯酸光亲和探针（KA-1）的合成：

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在反应瓶中将三苯基膦（1.76 g，6.7 mmol）溶于四氯化碳（10 mL）中，将其在惰性气体环境中加热回流5小时，加热温度为80℃。待溶液冷却至室温后，用上述反应液溶解KA（200 mg，0.661 mmol），接上回流管加热至80℃，回流30分钟。另取3-胺乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶（181 mg，1.322 mmol）溶于二氯甲烷（5 mL）中，加入上述反应瓶室温下搅拌16小时。反应结束后旋蒸除去溶剂，用乙酸乙酯溶解反应瓶中固体，先后用盐酸、碳酸氢钠溶液洗涤有机相，经过无水硫酸镁除水后，旋蒸除去溶剂。最后经过制备型高效液相色谱提纯得到淡黄色油状产物KA-1，即对异贝壳杉烯酸光亲和探针（60 mg，21.52%）。

对制备得到的KA-1进行质谱分析和核磁分析，图1、图2和图3依次分别为KA-1的质谱图、¹H NMR谱图和¹³C NMR谱图。¹H NMR(400MHz, DMSO)δ 5.73-5.66(m,2H), 5.16(s,1H), 4.96-4.88(m,2H), 3.09-3.05(m,2H), 2.39-2.35(s,1H), 2.10-1.93(m,5H),1.85-1.63(m,7H), 1.58-1.55(m,2H), 1.53-1.52(m,2H), 1.36-1.24(m,4H), 1.19(s,3H), 1.17-1.05(m,2H), 1.0(s,3H), 0.63(s,3H).¹³C NMR(101MHz, DMSO)δ176.88,147.15, 137.81, 128.09, 112.95, 82.61, 69.31, 56.30, 50.47, 43.92, 39.58,39.41, 38.53, 38.31, 36.63, 35.78, 34.37, 32.18, 32.14, 30.17, 29.35, 24.82,19.90, 19.22, 13.93, 13.23.

KA-1的靶点选择性评估

基于荧光胶分析实验对KA-1探针的靶点选择性进行评估。MCF-7细胞在2 cm培养皿中培养至密度85%以上（铺板数目1.2×106, 24小时，数目~2×106），吸去培养基，用5 mLPBS清洗细胞两次。将2mL含有不同浓度KA-1探针的无血清培养基加入到细胞中（探针浓度为0-200μM）。将细胞置于细胞培养箱中继续孵育1小时，之后将细胞培养皿置于冰上，移去培养皿盖，在紫外光交联仪下以365 nm紫外光进行照射，细胞表面距灯管距离5-10 cm，光照15分钟。照射完毕后，用细胞刮刀将细胞轻轻刮下，收集至1.5ml 离心管中，并用冷PBS清洗两次。4℃下，以3000 rpm离心3分钟。去除上层PBS，所得细胞加入细胞裂解液[PBS（ThermoFisher Scientific），1%IGEPAL-CA-630(Sigma-Aldrich)，0.2% SDS (Sigma-Aldrich)，1% EDTA-free protease inhibitor mixture（Sigma-Aldrich），0.1%Benzonase(Beyotime)]，经超声破碎后在4℃台式离心机高速离心(20000 g，30 分钟 )。取上清液，使用BCA蛋白质测定法（Beyotime）在酶标仪上测定蛋白质浓度，并用细胞裂解液将浓度调至2mg/mL。在室温下加入终浓度为200 mM荧光素叠氮化合物、2.5 mM抗坏血酸钠(Sigma-Aldrich)、25mM BTTAA(CONFLUORE)和12.5 mM CuSO4(Innochem)，反应1小时。上述反应结束后，将样品通过SDS-PAGE分离，在150v电压下电泳约1小时。使用ChemiDoc成像扫描显示凝胶荧光条带，然后用考马斯蓝进行染色。结果如图1所示。

从图4可以看到，随着KA-1浓度的增加，条带的标记信号相应升高且在探针浓度为10 μM时即可产生显著标记，信号逐渐趋于饱和。荧光信号反映了KA-1标记的蛋白质种类和强度，在100 kDa和35 kDa附近分别由两条显著性标记条带，其它地方标记相对较弱，显示了KA-1的靶点选择性。

基于高分辨质谱的KA靶点鉴定

基于上述的实验结果，运用基于高分辨质谱的化学蛋白质组学技术对KA-1结合蛋白质进行定量鉴定。其核心主要是在活细胞中利用活性分子探针对与KA直接结合的蛋白质进行标记，然后使用生物素磁珠对标记蛋白进行富集获取，借助于二甲基化标记的方式对获得的富集蛋白肽段样品进行定量，最后进行质谱分析得到富集后的靶标蛋白结果。在实验过程中，设置DMSO处理细胞作为空白对照来减少假阳性的结果。

将-80℃保存的经过探针处理MCF-7细胞置于冰上融化，加入细胞裂解液[PBS（ThermoFisher Scientific），1%IGEPAL-CA-630(Sigma-Aldrich)，0.2% SDS (Sigma-Aldrich)，1% EDTA-free protease inhibitor mixture（Sigma-Aldrich），0.1%Benzonase(Beyotime)]，超声破碎后在4℃台式离心机高速离心(20000 g，30 min )。取上清液，使用BCA蛋白质测定法（Beyotime）在酶标仪上测定蛋白质浓度，并用细胞裂解液将浓度调至2mg/mL。室温下加入200mM荧光素-生物素-叠氮（Biotin-PEG3-azide，TAB厂家）、2.5mM抗坏血酸钠(Sigma-Aldrich)、25mM BTTAA(CONFLUORE)和12.5 mM CuSO4(Innochem)，反应1小时。上述反应结束后，用氯仿(北京沃凯生物科技有限公司)-甲醇(Innochem)萃取蛋白质组以除去多余的试剂，再将蛋白质组用冷甲醇洗涤两次，重悬于待富集缓冲浓缩液中，超声辅助溶解，高速离心（20000g ， 2 min）去除可能的沉淀杂质，并用PBS稀释至富集缓冲液终浓度，此时取40 mL全蛋白质组溶液，作为富集前（Before）样品。随后将蛋白质溶液与链霉亲和素偶联磁珠(200μL，ThermoFisher)在室温下旋转孵育3小时，富集结束后，加入相应的酶对肽段进行过夜酶切。酶切结束后进行二甲基化的轻标重标标记，将样品旋干后进行质谱上样。

质谱采集条件为：正离子模式，Orbitrap质量分析器，一级谱扫描范围350到1800Da，分辨率为60000，profile format，二级谱数据采集方式为数据依赖型，centroidformat，取强度最高的20个离子峰进行二级HCD （high-energy collision induceddissociation）碎裂，二级谱分辨率为15000。其它需设置参数包括isolation window, 1.6m/z units; default charge, 2+; normalized collision energy, 28%; maximum IT,50 ms; dynamic exclusion, 30.0 s。

MS数据使用Thermo proteomo Discoverer2.5进行搜库定量分析，通用参数如表1所示。

表1 质谱采集通用参数

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申请人使用基于活性的蛋白质组分析，在乳腺癌细胞细胞系(MCF-7)中进行了一系列的化学蛋白质组学实验，通过Thermo Proteome Discoverer2.5软件对质谱数据进行过滤分析，排除假阳性的结果，并使用探针处理组和DMSO对照组进行比较得到AbundanceRatio（log2），该比值代表蛋白质在两组样品中的鉴定强度之比，比值越大，即蛋白质在探针处理组中被富集程度越高，即为潜在靶点蛋白质，而背景蛋白质的比值则在1附近。如图5所示，通过上述的实验设置和数据分析，在该实验中，一共定量鉴定了894个蛋白质，其中656个蛋白质的比值在5之上，为潜在结合蛋白。对候选蛋白质靶点的PSMs（peptide-spectrum matches）进行分析，该值越高，则一定程度上反映了该蛋白在样品中绝对强度越高。如图6所示，其中Voltage-dependent anion-selective channel protein1/2 (VDAC1/2), Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2 (AT2A2), Cathepsin D(CATD)的比值和PSMs均很高，且蛋白分子量分别为31.5，30.8，114.7和44.5 kDa，与图4中罗丹明信号条带相吻合，为高置信度潜在蛋白靶点。综合文献已报道数据，VDAC1/2， AT2A2和CATD均是临床上备受关注的癌症药物靶点（Front Oncol. 2017, 7:154 ；J. Med.Chem. 2020, 63, 5, 1937–1963; FASEB J. 2016, 30, 768.4; Ther Adv Med Oncol.2020, 12:1758835920927838），尤其是AT2A2 和CATD，在乳腺癌中高度表达，是乳腺癌治疗的潜在靶点。

KA抗癌机制的关键靶点分析

1）GO功能注释分类

考虑到天然产物的多靶点效应，同时为了充分了解靶蛋白的活性、功能定位以及参与的生物进程，申请人对候选蛋白进行靶点利用Gene Ontology(GO)进而对蛋白质进行注释。GO，也可称为GO term，是以阐述生物大分子的生物学功能而建立的分类系统。GO注释分为以下3类：生物过程（Biological Process, BP）、细胞组分（Cellular Component, CC）和分子功能（Molecular Function, MF）（Kanehisa, M.et al.2012）。在 GO二级功能注释水平上对差异蛋白数目进行统计如图7所示。

2）GO富集分析

为了展现差异蛋白在GO注释通路中的富集趋势，对差异蛋白进行Fisher's exacttest得到差异蛋白涉及GO term的富集情况，通过评判GO term富集程度的显著性水平（pvalue）找到差异蛋白显著富集的功能分类和通路。挑选显著富集（pvalue<=0.05）的GOterm前10个绘制富集气泡图，如图8所示。

图8横坐标为Log2（Fold enrichment），表示差异蛋白在GO term中的富集程度，Fold enrichment=（GO term中差异蛋白数/总差异蛋白数）/（GO term蛋白数/所有GO term蛋白数）纵坐标为富集到的GO term，图中颜色为富集显著性（pvalue），圆圈大小表示GOterm中差异蛋白数目。可以看到，Biological Process富集结果显示在cytoplasmictranslation、endoplasmic retlculum to Golgi veslcle mediated transport、cellular respiration，mitochondrial transport, aerobic respiration, cellularrespiration等通路显著富集，Cellular Component富集结果显示在inner mitochondrialmembrane protein complex, integral component of endoplasmic reticulummembrane, intrinsic component of endoplasmic reticulum membrane等通路显著富集，Molecular Function富集结果显示在structural constituent of ribosome,electron transfer activity, proton transmembrane transporter activity 等通路显著富集，因此，上述分析结果均指向线粒体及相关功能通路，即靶点蛋白质VDAC1/2和AT2A2等参与信号通路，说明KA分子在进入细胞后，很可能特异性靶向线粒体并抑制了相关蛋白的活性，从引起了细胞的死亡。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针，其特征在于，具有如下所示结构：

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2.一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的制备方法，用于制备权利要求1所述的对异贝壳杉烯酸光亲和探针，其特征在于，包括如下步骤：

1）将三苯基膦的四氯化碳液在惰性气体中加热回流，冷却至室温，加入对异贝壳杉烯酸，加热回流，旋蒸，得到中间产物；

2）将3-胺乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶溶于有机溶剂，和中间产物混合，搅拌反应；

3）旋蒸得到固体产物，加入有机溶剂溶解所述固体产物，洗涤有机相，除水，再次旋蒸，通过制备型高效液相色谱提纯得到对异贝壳杉烯酸光亲和探针；

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3.根据权利要求2所述的一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的制备方法，其特征在于，所述对异贝壳杉烯酸和3-胺乙基-3-(丁-3-炔基)双吖丙啶的摩尔比为1：2。

4.根据权利要求2所述的一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述将三苯基膦的四氯化碳液在惰性气体中加热回流的加热温度为80℃，回流时间为4~6h。

5.根据权利要求2所述的一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述加入对异贝壳杉烯酸，加热回流的加热温度80℃，回流时间为30~60min。

6.根据权利要求2所述的一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述搅拌反应的反应温度为15~25℃，反应时间为12~20h。

7.根据权利要求2所述的一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的制备方法，其特征在于，步骤2）中和步骤3）中，所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯。

8.根据权利要求2所述的一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述洗涤有机相的溶剂为盐酸和碳酸氢钠溶液。

9.一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的应用，使用权利要求1所述的对异贝壳杉烯酸光亲和探针，其特征在于，用于发掘乳腺癌细胞中对异贝壳杉烯酸的靶点蛋白质。

10.根据权利要求9所述的一种对异贝壳杉烯酸光亲和探针的应用，其特征在于，所述靶点蛋白质为VDAC1/2、AT2A2和CATD。

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