CN101991579A - 熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用。熊果酸具有抑制结肠癌肿瘤细胞增殖作用及诱导凋亡作用。在裸鼠体内实验中,熊果酸能有效抑制结肠癌移植瘤的增殖,抑制瘤体血管生成,而且对小鼠本身无明显毒副作用。熊果酸具有抑制结肠癌细胞EGFR/MAPK信号通路磷酸化的作用,其中抑制ERK1/2蛋白磷酸化是其作用的关键靶点。熊果酸与结肠癌临床一线化疗药奥沙利铂协同作用,疗效更好。熊果酸对K-RAS基因突变的结肠癌细胞有更好的增殖抑制作用。本发明提出的熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用,为治疗结肠肿瘤提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及熊果酸的应用,尤其是作为抗结肠肿瘤药物的应用。
背景技术
结肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,在我国随着生活水平的提高发病率逐年上升。结肠癌的治疗目前采取的是一种包括手术、放疗、化疗,靶向治疗以及生物、免疫治疗等在内的综合治疗,但不管采用哪种手段,肠道癌的总体治愈率仍徘徊在50%左右,长期生存率和生活质量仍不理想。
EGFR/MAPK信号通路已证明与结肠癌的增殖,分化,血管形成等密切相关。通过阻断EGFR信号通路治疗结肠癌的单克隆抗体西妥昔单抗已经在临床上广为应用并取得了很大的进展,但西妥昔单抗只适用于K-RAS基因野生型的患者,还有约30-40%K-RAS基因突变型的患者需要有更好的治疗药物;而且临床结肠癌标准的一线化疗方案中的奥沙利铂有剂量限制性外周感觉神经毒性从而影响了继续使用。
熊果酸广泛存在于自然界中,熊果酸(Ursolic acid)又名乌索酸、乌苏酸,分子式:C30H48O3,分子量:456.68;文献报道它们具有抗炎,保护肝功能,免疫增强等作用,但其确切的作用机制仍未阐明。在本发明被公布之前,尚未有任何专利公开或报道过本专利申请中提及的熊果酸通过EGFR/MAPK信号通路发挥抗结肠癌肿瘤的作用及与奥沙利铂的协同作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,提供熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用。
1.熊果酸在抗结肠癌中的作用:熊果酸具有抑制结肠癌肿瘤细胞增殖作用及诱导凋亡作用。熊果酸性能非常稳定。
2.在裸鼠体内实验中,熊果酸能有效抑制结肠癌移植瘤的增殖,抑制瘤体血管生成,而且对小鼠本身无明显毒副作用。
3.熊果酸具有抑制结肠癌细胞EGFR/MAPK信号通路磷酸化的作用,其中抑制ERK1/2蛋白磷酸化是其作用的关键靶点。
4.熊果酸与结肠癌临床一线化疗药奥沙利铂协同作用,疗效更好。
5.熊果酸对K-RAS基因突变的结肠癌细胞有更好的增殖抑制作用。
本发明的有益效果是:基于熊果酸抗结肠癌的作用机制,其能有效阻断EGFR信号通路,可作为抗结肠癌的药物,对于治疗结肠肿瘤提供了新的思路,有助于寻找有效的作用靶点和治疗药物的开发。
附图说明
图1是熊果酸抑制四种大肠癌细胞株的增殖呈时间和剂量依赖性;
图2是熊果酸对四种大肠癌细胞株的IC50值;
图3是AV+PI检测显示熊果酸诱导四种大肠癌细胞株凋亡;
图4是Western blot显示熊果酸促进Caspase家族激活从而促进凋亡;
图5是Western blot显示熊果酸抑制BcL酶的表达;
图6是熊果酸对SW620细胞相关信号通路的基因表达谱改变;
图7是熊果酸对SW620细胞RAS/RAF/MEK/ERK1/2信号通路蛋白磷酸化的改变;
图8是熊果酸对SW620细胞MAPK信号通路蛋白磷酸化的改变;
图9是熊果酸下调SW620结肠癌细胞NF-κB蛋白水平的表达;
图10是熊果酸抑制ERK1/2和IKKα的磷酸化水平;
图11是熊果酸和奥沙利铂联用诱导凋亡亚二倍体峰增加;
图12是熊果酸和奥沙利铂合用后引起线粒体膜电位改变;
图13是熊果酸和奥沙利铂合用后下调ERK1/2,AKT,IKKα蛋白磷酸化表达;
图14是各组裸鼠实验结束时移植瘤重量比较;
图15是各组裸鼠肝功能的改变;
图16是各组移植瘤蛋白提取物的相关蛋白表达的改变;
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人编著的《分子克隆:实验手册》中所述的实验条件,或按照试剂或试剂盒制造商提供的实验条件。
实施例1
熊果酸对结肠癌细胞增殖抑制作用
(1)在96孔细胞培养板内无菌接种人结肠癌细胞HT-29,SW620,SW480,LoVo,RKO每孔接种0.1ml含1×106细胞完全细胞培养液1640或L-15培养液。
(2)每孔加入0.1ml含不同浓度(10μM,20μM,30μM,40μM,60μM,80μM)熊果酸的完全细胞培养液,与细胞混匀后,将细胞放入37℃细胞培养箱内(含5%CO2)培养48小时。
(3)终止细胞培养,用MTT法测定培养细胞活力。
(4)结果发现:细胞增殖抑制有明显的量效关系,其中对K-RAS基因突变的细胞株有更好的增殖抑制作用。(见图1、图2)
实施例2
熊果酸促进人结肠癌细胞凋亡的作用
(1)在6孔细胞培养板内无菌接种人肠道癌细胞SW620,SW480,LoVo,RKO,每孔接种2ml含1×106细胞完全细胞培养液L-15。
(2)每孔加入不同浓度熊果酸(SW620细胞为15μM,30μM,60μM),与细胞混匀后,将细胞放入37℃细胞培养箱内(含5%CO2)培养48小时。
(3)终止细胞培养,收取细胞送流式细胞学检测,结果提示熊果酸作用后凋亡比率与细胞类型相关。(见图3、图4)。
(4)同时收取熊果酸处理后的细胞行免疫印迹检测,观察到细胞caspase蛋白表达增加与BcL-2蛋白家族表达下降与熊果酸呈显著的量效关系。(见图5)。
实施例3
熊果酸对人肠道癌细胞EGFR/MAPK信号通路的抑制作用
(1)在6孔细胞培养板内无菌接种人肠道癌细胞SW620,每孔接种2ml含1×106细胞完全细胞培养液L-15。
(2)每孔加入不同浓度熊果酸(15μM,30μM,60μM),与细胞混匀后,将细胞放入37℃细胞培养箱内(含5%CO2)培养48小时,收细胞提取蛋白。
(3)用real-time PCR,免疫印迹方法观察EGFR/MAPK信号通路蛋白磷酸化水平的变化。
(4)结果发现:经上述浓度熊果酸处理可见EGFR/MAPK信号通路基因水平和蛋白磷酸化水平明显下降,且具有剂量依赖关系,其中ERK1/2基因和蛋白磷酸化水平的下降是其关键作用靶点。(见图6、图7、图8、图9、图10)。
实施例4
熊果酸与结肠癌一线临床化疗药奥沙利铂的协同作用
(1)在6孔细胞培养板内无菌接种人肠道癌细胞SW620,每孔接种2ml含1×106细胞完全细胞培养液L-15。
(2)每孔加入不同浓度的熊果酸与奥沙利铂联用(10μM,15μM,30μM熊果酸或单用,联用0.64μM,1.02μM的奥沙利铂),与细胞混匀后,将细胞放入37℃细胞培养箱内(含5%CO2)培养48小时。
(3)终止细胞培养,采用MTT方法计算出联合应用指数,结果见表1,由表可见熊果酸与结肠癌临床化疗一线药物奥沙利铂有协同作用
(4)同时收集上述方法培养和熊果酸单用或联用奥沙利铂处理的细胞,用流式细胞术,线粒体膜电位,Western-blot方法观察细胞增殖,促进凋亡,EGFR/MAPK信号通路蛋白水平的变化。
(5)结果发现:低于IC50的熊果酸与结肠癌临床化疗一线药物奥沙利铂在体外显示有协同作用。(见图11、图12、图13)。
表1MTT方法计算出联合应用指数
CI:combination index;CI=1表示两药叠加效果,CI<1表示两药有协同作用,CI>1表示两药拮抗作用。
实施例5
熊果酸抑制结肠癌细胞SW620裸鼠移植瘤的作用及与奥沙利铂的协同作用
(1)分组:每只裸鼠右侧腋下接种0.2ml的SW620细胞悬液,细胞接种量均为1.2×107/ml。肿瘤接种当天记为第0天。肿瘤接种后第5天腋下能触及肿瘤小块时开始给药。根据预实验结果将裸鼠随机分为6组,每组6只,共36只。分别为:对照组,熊果酸低剂量组(10mg/Kg),熊果酸中剂量组(20mg/Kg),单用奥沙利铂组(10mg/Kg),熊果酸低剂量(10mg/Kg)+奥沙利铂组(10mg/Kg),中剂量熊果酸(20mg/Kg)+奥沙利铂组(10mg/Kg)。
(2)给药方式:均为每次腹腔注射0.2ml。给药剂量为:对照组为每次腹腔注射0.2ml的DMSO连续5天,熊果酸组按10mg/kg,20mg/kg的剂量分2组,每次0.2ml腹腔注射连续5天;奥沙利铂组单用10mg/kg的剂量腹腔注射,每次0.2ml,给药第一天腹腔注射一次;合用组分为三组:熊果酸10mg/kg d1-5+奥沙利铂10mg/kg d1,熊果酸20mg/kg d1-5+奥沙利铂10mg/kg d1。
(3)结果:SW620移植瘤动物模型显示较低剂量的熊果酸与奥沙利铂合用有更强的抑瘤效果和抑制血管形成作用,治疗后的移植瘤蛋白ERK1/2磷酸化水平也显著下调,并对奥沙利铂引起的肝损害有一定的保护作用。(见图14、图15、图16)。
Claims (1)
1.熊果酸作为抗结肠肿瘤药物的应用。
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