CN112138014A - 熊果酸在逆转乳腺癌紫杉醇耐药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及熊果酸在逆转乳腺癌紫杉醇耐药中的应用。本发明证明熊果酸能逆转乳腺癌耐紫杉醇细胞株对紫杉醇的耐药作用，和在体内逆转乳腺癌对紫杉醇的耐药作用，以及熊果酸的安全用药浓度；也证明了熊果酸是通过调节细胞的凋亡水平来实现的，和通过调节凋亡基因来实现的；还证明了熊果酸是通过促进乳腺癌耐紫杉醇细胞株miR‑149‑5p的表达水平来逆转乳腺癌耐紫杉醇细胞株对紫杉醇的耐药作用。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物领域，尤其涉及熊果酸在逆转乳腺癌紫杉醇耐药中的应用。
背景技术
乳腺癌是世界上最常见的临床癌症之一，也是女性癌症死亡的主要原因。紫杉醇为单体双萜类化合物，来源于红豆杉属树皮，可以促进活细胞中的微管聚合和稳定，是乳腺癌临床化疗的一线用药。紫杉醇临床化疗能有效的降低乳腺癌死亡率，改善患者的总生存期及无病生存期。但是，随着临床应用时间的延长，紫杉醇耐药现象日益明显，严重制约了乳腺癌患者的临床疗效。熊果酸又名乌索酸，属五环三萜类化合物，广泛分于蔬菜、水果、及中草药山楂、熊果、白花蛇舌草等植物中。研究表明熊果酸也可用于治疗癌症。
我们研究发现熊果酸联合紫杉醇化疗能明显降低紫杉醇的用量，促进细胞凋亡。我们还分析了熊果酸对miR-149的影响，发现熊果酸能促进乳腺癌231耐紫杉醇细胞株miR-149的表达水平。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供熊果酸在逆转乳腺癌紫杉醇耐药中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明提供熊果酸在逆转乳腺癌紫杉醇耐药中的应用。
优选地，所述应用为熊果酸联合紫杉醇抑制乳腺癌耐紫杉醇细胞增殖和熊果酸联合紫杉醇促进乳腺癌耐紫杉醇细胞凋亡。
优选地，所述应用为熊果酸促进miR-149-5p的表达逆转乳腺癌紫杉醇耐药。
优选地，熊果酸的用药浓度为0-40μM。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明证明熊果酸能逆转乳腺癌耐紫杉醇细胞株对紫杉醇的耐药作用，和在体内逆转乳腺癌对紫杉醇的耐药作用，以及熊果酸的安全用药浓度；也证明了熊果酸是通过调节细胞的凋亡水平来实现的，和通过调节凋亡基因来实现的；还证明了熊果酸是通过促进乳腺癌耐紫杉醇细胞株miR-149-5p的表达水平来逆转乳腺癌耐紫杉醇细胞株对紫杉醇的耐药作用。
附图说明
图1为CCK-8法检测UA对231和231/PXT细胞增殖能力的影响；
图2为CCK-8法检测UA联合PTX对231/PTX细胞增殖能力的影响；
图3为流式细胞术检测UA联合PTX对231/PTX细胞凋亡水平的影响；其中图A为UA联合PTX与单用PTX对比凋亡图；图B为UA联合PTX与单用PTX对比凋亡统计图；
图4为qRT-PCR和Western blot检测UA联合PTX对231/PTX细胞凋亡基因Bax和Bcl-2m的RNA和蛋白表达水平的影响；其中图A为凋亡基因Bax和Bcl-2的mRNA表达水平；图B为凋亡基因Bax和Bcl-2的蛋白表达水平；
图5为PTX联合UA作用对裸鼠体内肿瘤的影响；其中图A为瘤体生长曲线；图B为瘤体照片；图C为瘤体剥离后体积；图D为瘤体剥离后重量；
图6为UA 20μM对231/PTX细胞miR-149-5p表达水平的影响；
图7为CCK-8法检测过表达miR-149-5p后PTX对231/PTX细胞增殖的影响；
图8为流式细胞术检测过表达miR-149-5p后PTX对231/PTX细胞凋亡的影响；其中图A为PTX不同浓度(30μM、60μM)作用过表达miR-149-5p的231/PTX细胞凋亡对比图；图B为PTX不同浓度(30μM、60μM)作用过表达miR-149-5p的231/PTX细胞凋亡统计图；
其中的附图标记为*P<0.05；**P<0.01。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1：CCK-8法检测熊果酸(UA)对人乳腺癌细胞(231)和人乳腺癌耐紫杉醇细胞株(231/PTX)细胞增殖能力的影响
镜下观察细胞，待细胞生长于对数期进行处理；将96孔细胞培养板、培养基、吸管、D-hanks液、胰酶、灭菌后的移液器枪头、废液缸等放入超净台内，紫外线灭菌30min备用；弃细胞内旧液，用D-hanks液清洗一次，加入1mL胰酶，消化后弃掉胰酶，用完全培养基将细胞调整为2×105个/mL；接种于96孔板，100μL/孔(20000个/孔)，次日细胞贴壁后，弃掉旧液，将药物稀释到合适的浓度加入96孔板内，孵箱内继续培养48小时；弃旧培养基，加入含有CCK-8的无血清1640培养基(RPMI 1640无血清培养基:CCK-8＝10:1)，100μL/孔，孵箱中避光放置4小时；将酶标仪设置为双波长(450nm 630nm)检测吸光度(OD值)，根据OD值计算细胞的增殖抑制率，计算公式为：抑制率＝(1-ODn/ODc)×100％(ODn为药物作用后的吸光值，ODc为对照组的吸光值)；数据处理：将OD值输入Excel表，根据公式计算细胞抑制率和IC50，用Graphpad 5.01软件绘制细胞增殖曲线图。
数据统计及处理均通过软件SPSS 21.0版(Chicago，IIIionis，USA)进行，计量资料组间比较采用Student's t-检验，多组之间比较采用one-way ANOVA进行，p<0.05表示具有统计学差异，p<0.01表示具有显著的统计学差异。
结果显示：UA不同浓度(5μM、10μM、20μM、40μM、160μM、320μM)作用后，231和231/PTX细胞的增殖抑制率无统计学差异；UA 80μM作用后，231/PTX细胞的增殖抑制率低于231细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。选择抑制率在20％以下的药物浓度，使联合作用能对肿瘤细胞起到杀伤作用而对正常细胞不起到细胞毒作用，UA 0-40μM范围对231/PTX细胞的增殖抑制率都在20％以下，均符合药物的安全用药浓度(如图1)。
实施例2：熊果酸逆转231/PTX细胞对紫杉醇耐药的作用
1.CCK-8法检测UA联合紫杉醇(PTX)促进PTX对231/PTX细胞的增殖抑制
实验方法同实施例1。结果显示：UA 20μM联合PTX 30μM与单用PTX 30μM相比，231/PTX细胞的增殖抑制率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)；UA 20μM联合PTX60μM与单用PTX 60μM相比，231/PTX细胞的增殖抑制率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。表明UA联合PTX能明显的促进PTX对231/PTX细胞的增殖抑制作用(如图2)。
2.流式细胞术检测UA联合PTX促进231/PTX细胞的凋亡
将231与231/PTX细胞分为6组：对照组、UA 20μM用药组、PTX 30μM用药组、PTX 60μM用药组、PTX 30μM联合UA 20μM用药组、PTX 60μM联合UA 20μM用药组。取生长于对数期的细胞，按需将细胞调至合适的数量，接种于培养板进行培养，次日观察细胞并将药物调至合适的浓度，作用48小时后用于后续实验；将细胞调整为2.5×105个/ml，接种于六孔板内，即5×105个/孔；次日细胞贴壁后弃掉旧培养基，用L-15完全培养基将UA和PTX稀释到需要的浓度加入六孔板内，孵箱继续培养48小时；准备好PBS磷酸盐缓冲液、吸管、不含EDTA的胰酶、流式管、BD凋亡试剂盒等备用；标记好流式管，将六孔板内旧培养基分别吸入相应的流式管内，用PBS磷酸盐缓冲液清洗3次，加入0.5mL的不含EDTA的胰酶，消化充分后用旧培养基中和，将细胞放入相应标记的流式管内；离心，1000rmp，5min，弃上清，每管加入1mL PBS缓冲液，旋涡震荡器上轻微震荡后离心，2000rmp，10min，重复3次，弃掉上清；将10倍的Annexin V Binding Buffer稀释为1倍，每管内加入100μL，继续加入7-AAD和PE AnnexinV，每管各2.5μL，避光30min，加入1倍的Annexin V Binding Buffer，200μL/孔；上机分析，实验本记录各组细胞凋亡率。
结果表明：UA 20μM联合PTX 30μM与单用PTX 30μM相比，231/PTX细胞的凋亡率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)；UA 20μM联合PTX 60μM作用与单用PTX 60μM相比，231/PTX细胞的凋亡率明显上升，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。表明UA联合PTX能明显促进231/PTX细胞的凋亡水平(如图3)。
3.qRT-PCR和Western blot检测UA联合PTX对凋亡基因Bax和Bcl-2表达水平的影响
实验方法为本领域常规技术手段。结果表明：UA 20μM联合PTX 30μM与单用PTX 30μM相比，231/PTX细胞Bax基因和蛋白的表达水平上升，差异具有统计学意义(P<0.05)，Bcl-2基因和蛋白的表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；UA 20μM联合PTX 60μM作用与单用PTX 60μM作用相比，231/PTX细胞Bax基因和蛋白的表达水平上升，差异具有统计学意义(P<0.05)，Bcl-2基因和蛋白的表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明UA联合PTX能明显的促进Bax基因和蛋白的表达水平，抑制Bcl-2基因和蛋白的表达水平(如图4)。
实施例3：熊果酸逆转裸鼠皮下移植瘤对紫杉醇耐药的作用
取生长于对数期的231/PTX细胞，用PBS重悬，将细胞调整为3×107个/mL，每只老鼠自腋下注射3×106个细胞，100μL/只。细胞注射10天后，将裸鼠随机分组，分别进行给药，动物分为5组：对照组(每3天注射PBS 100μL)、UA单独用药组(每3天注射UA 10mg/kg)、PTX低浓度用药组(每3天注射PTX 10mg/kg)、PTX高浓度用药组(每3天注射PTX 20mg/kg)、PTX联合UA用药组(每3天注射UA 10mg/kg和PTX 10mg/kg)，用药3周，剥离瘤体。动物实验经普陀区中心医院(中国上海)机构动物护理和使用委员会批准。
每3天通过游标卡尺测量肿瘤的长和宽，计算瘤体体积(V＝L×W2×0.5，L表示肿瘤的长度；W表示肿瘤的宽度)，记录数据，绘制成瘤体在裸鼠体内的增长曲线。在最终药物施用3天后，取出肿瘤，天平称取剥离后瘤体重量，游标卡尺测量瘤体剥落后长和宽，记录数据，绘制成图，拍照记录。
结果表明：PTX低浓度联合UA用药组相对于PTX低浓度用药组和PTX高浓度用药组，裸鼠皮下的肿瘤生长较慢，差异具有统计学意义(P<0.05)；瘤体剥落后，PTX低浓度联合UA用药组相对于PTX低浓度用药组，瘤体体积较小，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)；PTX低浓度联合UA用药组相对于PTX高浓度用药组，瘤体体积下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；瘤体剥落后，PTX低浓度联合UA用药组相对于PTX低浓度用药组，瘤体重量较轻，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。表明UA联合PTX作用相对于单用PTX作用能明显抑制肿瘤在裸鼠体内的生长(如图5)。
实施例4：熊果酸促进231/PTX细胞miR-149-5p的表达及过表达miR-149-5p增强231/PTX细胞对紫杉醇的敏感性
1.qRT-PCR法检测UA 20μM对231/PTX细胞miR-149-5p表达水平的影响
实验方法同实施例2。结果显示：UA 20μM与Ctrl组相比，231/PTX细胞miR-149-5p的表达水平明显上升，差异具有统计学差异(P<0.05)。表明UA 20μM能促进231/PTX细胞内miR-149-5p的表达(如图6)。
2.CCK-8法检测过表达miR-149-5p后，PTX对231/PTX细胞增殖的影响
实验方法同实施例1。结果表明：过表达miR-149-5p后，PTX不同药物浓度(5μM、25μM、50μM、75μM)对231/PTX细胞的增殖抑制作用明显上升，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。表明过表达miR-149-5p能促进PTX对231/PTX细胞的增殖抑制作用(如图7)。
3.流式细胞术检测过表达miR-149-5p对PTX不同浓度(30μM、60μM)作用231/PTX细胞凋亡的影响
实验方法同实施例2。结果表明：过表达miR-149-5p后，231/PTX细胞基础凋亡率上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；过表达miR-149-5p后，PTX 30μM对231/PTX细胞的促凋亡作用明显上升，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)；过表达miR-149-5p后，PTX 60μM对231/PTX细胞的促凋亡作用明显上升，差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。表明过表达miR-149-5p能促进PTX对231/PTX细胞的凋亡诱导(如图8)。
综上所述，UA的安全用药浓度为0-40μM；UA联合PTX作用能促进PTX对231/PTX细胞的增殖抑制作用和促凋亡作用；UA逆转裸鼠体内乳腺癌紫杉醇耐药的作用；UA促进231/PTX细胞中miR-149-5p的表达，过表达miR-149-5p的231/PTX细胞对PTX的敏感性上升；即熊果酸能够逆转乳腺癌紫杉醇耐药。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.熊果酸在逆转乳腺癌紫杉醇耐药中的应用。
2.根据权利要求1所述的熊果酸在逆转乳腺癌紫杉醇耐药中的应用，其特征在于，所述应用为熊果酸联合紫杉醇抑制乳腺癌耐紫杉醇细胞增殖和熊果酸联合紫杉醇促进乳腺癌耐紫杉醇细胞凋亡。
3.根据权利要求1所述的熊果酸在逆转乳腺癌紫杉醇耐药中的应用，其特征在于，所述应用为熊果酸促进miR-149-5p的表达逆转乳腺癌紫杉醇耐药。
4.根据权利要求1所述的熊果酸在逆转乳腺癌紫杉醇耐药中的应用，其特征在于，熊果酸的用药浓度为0-40μM。
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|---|---|---|---|---|
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| CN102600175A (zh) * | 2010-06-22 | 2012-07-25 | 浙江大学 | 熊果酸在治疗肿瘤疾病药物中的用途 |
| US20130315983A1 (en) * | 2012-05-24 | 2013-11-28 | The Research Foundation Of The City University Of New York | Methods and compositions for the treatment of cancer |
-
2020
- 2020-09-29 CN CN202011052569.4A patent/CN112138014A/zh active Pending
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