CN115715802A - MyD88抑制剂在制备治疗乳腺癌和逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物中的应用 - Google Patents
MyD88抑制剂在制备治疗乳腺癌和逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了MyD88抑制剂在制备治疗乳腺癌和逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物中的应用。本发明验证了抑制MyD88基因的表达可以增加乳腺癌患者对紫杉醇的敏感性进而提高治疗乳腺癌的效果，而熊果酸可以有效抑制MyD88基因的表达，并通过调节MyD88以逆转乳腺癌PTX耐药性，因此，本发明为开发乳腺癌治疗方案提供了有效的策略。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及MyD88抑制剂在制备治疗乳腺癌和逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是临床上最常见的癌症之一，也是全球女性癌症死亡的主要原因。化疗是目前晚期乳腺癌患者的基础疗法。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是乳腺癌患者最常用的化疗药物，其是一种针对多种肿瘤细胞的有效抗肿瘤药物，通过促进微管聚合和稳定的微管聚合导致细胞内微管的积聚，阻止有丝分裂中的细胞分裂并阻断正常细胞的分裂，从而对抗多种肿瘤细胞。然而，对紫杉醇的耐药性是导致乳腺癌患者化疗失败的主要因素，多达50％～70％的患者会出现明显的耐药性。
MyD88的异常表达先前已在各种类型的癌症中被报道，这与肿瘤的发展有关，并且与肿瘤的存活和化疗耐药有关。在结直肠癌(CRC)中，MyD88的高表达与癌症患者的不良预后显著相关。与肿瘤细胞表达MyD88的卵巢癌患者相比，肿瘤细胞不表达MyD88的卵巢癌患者的无进展生存期有统计学意义的改善。报告显示，MyD88的高表达赋予卵巢癌细胞对化疗的耐药性。肿瘤细胞MyD88为阳性的患者对紫杉醇化疗的反应较差，这表明MyD88可能是癌细胞中的紫杉醇耐药性标志物。
然而，关于MyD88在人乳腺癌中的表达及其与肿瘤发展的相关性，以及MyD88的表达与人乳腺癌细胞对紫杉醇化疗耐药的关系知之甚少。如果在乳腺癌细胞中，同样验证了MyD88的高表达赋予癌细胞对化疗的耐药性，那么寻找能够有效抑制MyD88表达的分子或药物有助于逆转PTX耐药。
熊果酸(UA)是一种五环三萜酸，广泛存在于药材和食用植物中，如苹果和其他水果的蜡状涂层。最近的研究和本发明人之前的研究都表明，UA对许多人类癌细胞系表现出生长抑制特性，包括乳腺癌、胃癌、白血病、前列腺癌、肝癌、结肠癌和皮肤癌，UA被认为是一种适用于癌症治疗的潜在化学治疗剂。此外，研究表明，UA可以通过多种途径克服PTX耐药性，但未在乳腺癌中有所报道。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了MyD88抑制剂在制备治疗乳腺癌和逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供MyD88抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
进一步地，上述MyD88抑制剂包括下述至少一种：
特异性抑制MyD88表达的化合物；
特异性干扰MyD88表达的干扰分子；
特异性与MyD88蛋白结合的抗体或配体；
MyD88基因敲除载体。
进一步地，上述MyD88抑制剂为熊果酸或其药学上可接受的盐。
本发明的第二方面是提供MyD88抑制剂在制备逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物中的应用。
进一步地，上述MyD88抑制剂包括下述至少一种：
特异性抑制MyD88表达的化合物；
特异性干扰MyD88表达的干扰分子；
特异性与MyD88蛋白结合的抗体或配体；
MyD88基因敲除载体。
进一步地，上述MyD88抑制剂为熊果酸或其药学上可接受的盐。
本发明的第三方面是提供一种治疗乳腺癌或逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物，该药物包括MyD88抑制剂。
进一步地，上述MyD88抑制剂包括下述至少一种：
特异性抑制MyD88表达的化合物；
特异性干扰MyD88表达的干扰分子；
特异性与MyD88蛋白结合的抗体或配体；
MyD88基因敲除载体。
进一步地，上述MyD88抑制剂为熊果酸或其药学上可接受的盐。
本发明的第四方面是提供一种治疗乳腺癌的药物组合物，包括紫杉醇，以及熊果酸或其药学上可接受的盐。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明验证了抑制MyD88基因的表达可以增加乳腺癌患者对紫杉醇的敏感性进而提高治疗乳腺癌的效果，而熊果酸可以有效抑制MyD88基因的表达，并通过调节MyD88以逆转乳腺癌PTX耐药性，因此，本发明为开发乳腺癌治疗方案提供了有效的策略。
附图说明
图1显示了MyD88在人乳腺癌中表达升高，MyD88表达升高与预后不良有关；其中，图1A显示了MyD88在人乳腺癌组织中的表达情况，图a-d分别显示了癌旁正常组织中MyD88负表达，乳腺癌组织中MyD88低表达，乳腺癌组织中MyD88中度表达，乳腺癌组织中MyD88高表达；图1B为Kaplan-Meier生存曲线，其显示了MyD88高表达患者与MyD88正常表达患者相比，生存差异具有统计学意义；
图2显示了MyD88的表达量下降会抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移；其中，图2A显示了使用实时荧光定量PCR测量在不同组中MyD88的表达水平结果；图2B显示了使用Western blot测定不同组中MyD88蛋白表达的结果；图2C显示了采用WST-1法检测细胞增殖的结果；图2D显示了用肿瘤体积检测肿瘤生长的结果；图2E显示了对MyD88下调的MCF-7细胞和对照细胞进行细胞迁移实验的结果；图2F显示了用结晶紫染色观察迁移的细胞，并用细胞计数器定量的结果，“*”表示p＜0.05；
图3显示了MyD88下调后231/PTX细胞对PTX的耐药性逆转；其中，图3a显示了MyD88mRNA和蛋白在231和231/PTX细胞中的表达水平；图3b显示了转染含有shRNA的慢病毒载体的231/PTX细胞中MyD88 mRNA和蛋白表达水平的变化；图3c显示了MyD88的下调增加了231/PTX细胞对PTX治疗的敏感性；图3d显示了MyD88表达下调后经PTX处理的231/PTX细胞凋亡率增加；图3e显示了Bax、Bcl2、PI3K、Akt、P-Akt和NF-κB蛋白水平的Western blot结果；
图4显示了UA可逆转乳腺癌细胞对PTX的耐药性；其中，图4a显示了PTX对231和231/PTX细胞生长的抑制作用；图4b显示了PTX处理后的231和231/PTX细胞的凋亡情况；图4c显示了UA对231和231/PTX细胞生长的抑制作用；图4d显示了UA预处理后，PTX对231/PTX细胞生长的抑制作用；图4e显示了UA预处理后经PTX处理的231/PTX细胞的凋亡情况；图4f显示了实时荧光定量PCR和Western blot分析Bax和Bcl2 mRNA和蛋白质水平的结果；
图5显示了UA通过调节MyD88以逆转PTX耐药性；其中，图5a显示了UA处理后231/PTX细胞中MyD88 mRNA和蛋白水平的变化；图5b显示了过表达的231/PTX细胞中MyD88 mRNA和蛋白水平的变化；图5c显示了药物处理后，过表达的231/PTX细胞的生长活性的变化；图5d显示了药物处理后，过表达的231/PTX细胞的凋亡水平的变化，“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01。
具体实施方式
本发明提供了MyD88抑制剂在制备治疗乳腺癌和逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物中的应用。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例验证MyD88在人乳腺癌中表达升高，MyD88表达升高与预后不良有关，具体的实验步骤和结果如下：
1.免疫组织化学
MyD88的免疫组化检测如下进行。福尔马林固定、石蜡包埋的癌组织切片被连续切割成4μm，并脱蜡。使用柠檬酸盐缓冲液(0.01mmol/L，pH 6.0)进行抗原修复。首先用一抗处理组织切片。在4℃孵育过夜后，用PBS缓冲液洗涤组织切片并用过氧化物酶标记的二抗处理30分钟。使用二氨基联苯胺显色。切片用苏木精复染、脱水并固定在树脂中。MYD88表达的染色强度被半定量地分为阴性和弱阳性、中阳性和强阳性(分别为0、+、++和+++)。
如图1A所示，癌组织中MyD88水平显着高于癌旁正常组织(p＜0.01)。
2.Kaplan-Meier生存曲线
Kaplan-Meier生存曲线用于比较MyD88正常和高表达患者的存活率，如图1B所示。Kaplan-Meier生存曲线显示，MyD88高表达患者与MyD88正常表达患者相比，生存差异具有统计学意义(P＜0.018)。
实施例2
本实施例验证了MyD88表达下降，抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移，具体的实验步骤和结果如下：
1.MyD88慢病毒载体的构建
使用含有shRNA的慢病毒载体特异性靶向并稳定敲低MyD88在乳腺癌MCF-7细胞中的表达。根据制造商的说明，使用Trizol试剂盒分离总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒(Takara Bio，Inc.)进行逆转录。使用标准SYBR-Green PCR试剂盒在Real-Time PCR仪器(7300；Applied Biosystems，美国)上进行基于定量实时PCR的基因表达分析，反应程序为95℃，2min；95℃15sec，60℃30sec，40个循环，使用2-ΔΔct方法计算用GAPDH归一化的每个靶基因的相对表达。
实时荧光定量PCR分析显示，MyD88缺陷型MCF-7细胞中MyD88的mRNA表达明显低于对照MCF-7细胞(图2A)。
2.Western blot
使用Western blot测定MyD88蛋白的表达。等量的蛋白样品在12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上连续上样和分离，然后转移到硝酸纤维素膜(AmershamPharmacia，UK)上。然后将膜在含有5％脱脂牛奶的TBST封闭溶液(包括0.1％Tween-20的Tris缓冲液)中在室温下孵育2小时，然后在4℃条件下过夜孵一抗。洗涤后，将膜与相应的二抗抗孵育2小时。几次洗涤后，上机检测。。
由图2B可知，在MyD88缺陷型MCF-7细胞中，MyD88蛋白的表达降低。
3.细胞增殖
将细胞(每孔0.5×104)接种到96孔板中。孵育24小时后，加入10μM、20μM、30μM、40μM和50μM紫杉醇(Sigma)并孵育48小时。48小时后，根据制造商的说明使用细胞增殖试剂WST-1(罗氏)分析活细胞群。使用WST-1在不同时间点评估细胞增殖。
由图2C可知，细胞在MyD88基因沉默后24小时、48小时和96小时，生长活性均未改变，但在7天后，生长活性有所下降。
4.动物研究
雄性无胸腺BALB/c裸鼠购自中国科学院上海实验动物中心(中国上海)，并在特定的无病原体条件下饲养。动物护理和实验方案按照上海市医学实验动物护理委员会的指导方针进行。对于体内治疗，将感染编码shMyD88的慢病毒(感染复数(MOI)为100)的MCF-7细胞(5×106)皮下植入裸鼠的侧腹(每组6个，雄性BALB/c nu/nu，4-6周)和用编码shNC的慢病毒处理的MCF-7细胞用作模拟对照。用肿瘤体积监测肿瘤生长。
由图2D可知，MCF-7细胞中MyD88的抑制显著抑制了裸鼠肿瘤的生长，MyD88缺陷型MCF-7细胞形成的肿瘤体积约为对照细胞的一半。
5.细胞迁移测定
采用Cell Transwell Permeable Support(Coming)并根据说明书对细胞侵袭和迁移进行评估。随机选取5个200倍显微镜视野计算侵袭或迁移细胞的总数。所有测定进行3次。
由图2E和图2F可知，当MyD88基因被敲除时，MCF-7细胞迁移较慢。
实施例3
本实施例采用PTX抗性细胞231/PTX(由上海基科生物化学有限公司构建)，验证了MyD88下调后231/PTX细胞对PTX的耐药性逆转，具体的实验步骤和结果如下：
1.检测231/PTX细胞中MyD88的表达水平
为了阐明MyD88是否介导231/PTX细胞中的PTX耐药性，我们采用了实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测了231/PTX细胞中MyD88的表达水平，结果表明与231细胞相比，231/PTX细胞中MyD88的水平增加(见图3a)。
2.构建MyD88缺陷型231/PTX细胞，测定MyD88的表达
针对人MyD88基因的MyD88 cDNA和shRNA序列由GenePharma(中国上海)设计和合成，使用含有shRNA的慢病毒载体特异性靶向并稳定敲低MyD88在乳腺癌231/PTX细胞中的表达；MyD88的敲低组和对照组分别被命名为MyD88-KD和MyD88-NC。经实时荧光定量PCR和蛋白质印迹分析显示，转染MyD88的shRNA的231/PTX细胞中MyD88的表达明显低于对照231/PTX细胞(图3b)。
3.MyD88表达量的下调增加了231/PTX细胞对PTX治疗的敏感性
将MyD88-KD或MyD88-NC细胞以0.3×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在L-15培养基中孵育过夜，再用各种浓度(0、20、40、60和80μM，溶于DMSO中)的PTX处理48小时，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8，Dojindo，Japan)测量细胞活力，将CCK-8溶液(10μl)添加到每个孔中2小时，并在450nm处测量光密度。
由图3c可知，存在PTX的情况下，MyD88-KD细胞的增殖受到显着抑制，表明MyD88表达量的下调增加了231/PTX细胞对PTX治疗的敏感性。
4.分析MyD88表达的变化是否改变231/PTX细胞在PTX处理下的凋亡率
0、30和60μM的PTX处理48小时后，收获细胞并用PBS缓冲液洗涤两次并重悬于结合缓冲液中，然后用膜联蛋白V-藻红蛋白(PE)和7-氨基放线菌素(7-AAD)(BD Biosciences)对细胞进行双重染色。室温避光15分钟。随后，在1小时内使用Calibur(BD Biosciences)流式细胞仪对细胞进行分析。
由图3d可知，MyD8表达下降增加了PTX处理的细胞凋亡数目，表明MyD88在231/PTX细胞中的表达水平与PTX诱导的细胞凋亡有关。
5.Bax、Bcl2、PI3K、Akt、P-Akt和NF-κB蛋白水平的测定
为了研究MyD88在改变231/PTX细胞中NF-κd3激活中的作用，采用Western blot测定MyD88-KD或MyD88-NC细胞中Bax、Bcl2、PI3K、Akt、P-Akt和NF-κB蛋白的表达水平。
由图3e可知，MyD88的敲低极大地抑制了乳腺癌细胞中通过PI3K/Akt激活NF-κd3的通路，且在231/PTX细胞中，MyD88下调表达，bax凋亡基因增加，Bcl-2显著降低。
实施例4
本实施例验证了UA逆转乳腺癌231/PTX细胞对PTX的耐药性，具体的实验步骤和结果如下：
1.231/PTX细胞对PTX具有显著的耐药性
采用不同浓度的PTX处理231和231/PTX细胞48小时后，采用CCK-8测量细胞活力。由4a可知，与231细胞相比，231/PTX细胞对PTX具有显著的耐药性，231和231/PTX细胞的半数抑制浓度(IC50)值分别为74.05μM和348.96μM。
2.PTX处理对231和231/PTX细胞凋亡的影响
0、30和60μM的PTX处理48小时后，收获细胞并用PBS缓冲液洗涤两次并重悬于结合缓冲液中，然后用膜联蛋白V-藻红蛋白(PE)和7-氨基放线菌素(7-AAD)(BD Biosciences)对细胞进行双重染色。室温避光15分钟。随后，在1小时内使用Calibur(BD Biosciences)流式细胞仪对细胞进行分析。
由图4b可知，与231细胞相比，231/PTX细胞的细胞凋亡率经PTX处理后显著降低。
3.测定UA处理的无毒浓度
采用DMSO稀释的不同浓度的UA(Selleck，Houston，United States)处理231和231/PTX细胞48小时后，采用CCK-8试剂盒测定对于这些细胞，UA的无毒浓度。由4c可知，逆转试验的最大UA浓度可选择35μM。
4.UA增强PTX对乳腺癌细胞的作用
在上述结果的基础上进一步探讨UA是否可以增强PTX对乳腺癌细胞的作用，将231/PTX细胞以0.3×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在L-15培养基中孵育过夜，将不同浓度(30、60μM)的PTX单独或浓度为20μM的UA联合处理细胞48小时后，使用CCK-8试剂盒测量细胞活力并采用Annexin-PE与7-AAD双染法进行细胞凋亡分析。
由图4d和4e可知，20μM的UA可显著增强PTX处理后的231/PTX细胞的生长抑制和细胞凋亡率。
此外，采用实时荧光定量PCR和Western blot分析UA是否对PTX处理后的231/PTX细胞中Bax、Bcl2基因的表达有影响。
结果如图4f可知，与单独使用PTX相比，用PTX+UA处理的231/PTX细胞中，凋亡基因Bax显著增加，而Bcl-2的表达降低。
因此，UA可以逆转乳腺癌细胞对PTX的耐药性。
实施例5
本实施例验证UA调节MyD88以逆转PTX耐药性，具体的实验步骤和结果如下：
1.UA促使MyD88的表达降低
为了探讨UA是否通过靶向MyD88在乳腺癌中逆转PTX耐药性，我们评估了UA对MyD88表达的影响。采用浓度为20μM的UA处理231/PTX细胞48小时后，使用实时荧光定量PCR和Western blot分析UA是否对231/PTX细胞中的MyD8基因的表达有影响。
由图5a可知，经UA处理后的231/PTX细胞中MyD88的表达显著降低。
2.UA靶向MyD88逆转PTX耐药性
为了验证UA通过靶向MyD88逆转PTX耐药性的功效，我们使用含有MyD88的慢病毒载体在231/PTX细胞中稳定过表达MyD88，MyD88的过表达细胞组和对照组被分别命名为MyD88-OE和MyD88-NC。Real-time PCR和Western blot分析显示，MyD88慢病毒载体转染的231/PTX细胞中MyD88的表达明显高于对照细胞(图5b)。
采用不同浓度(30、60μM)的PTX单独或浓度为20μM的UA联合处理MyD88-OE和MyD88-NC组细胞48小时后，使用CCK-8试剂盒测量细胞活力并采用Annexin-PE与7-AAD双染法进行细胞凋亡分析。
由图5c和图5d可知，过表达MyD88的231/PTX细胞在UA和PTX联合处理后的增殖抑制作用较对照细胞降低，且凋亡率也降低。
以上结果表明UA不能有效逆转过表达MyD88的231/PTX细胞中的PTX耐药性，UA是通过调节MyD88在乳腺癌细胞中的表达水平逆转PTX耐药性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.MyD88抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MyD88抑制剂包括下述至少一种：
特异性抑制MyD88表达的化合物；
特异性干扰MyD88表达的干扰分子；
特异性与MyD88蛋白结合的抗体或配体；
MyD88基因敲除载体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MyD88抑制剂为熊果酸或其药学上可接受的盐。
4.MyD88抑制剂在制备逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述MyD88抑制剂包括下述至少一种：
特异性抑制MyD88表达的化合物；
特异性干扰MyD88表达的干扰分子；
特异性与MyD88蛋白结合的抗体或配体；
MyD88基因敲除载体。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述MyD88抑制剂为熊果酸或其药学上可接受的盐。
7.一种治疗乳腺癌或逆转乳腺癌紫杉醇耐药的药物，其特征在于，包括MyD88抑制剂。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述MyD88抑制剂包括下述至少一种：
特异性抑制MyD88表达的化合物；
特异性干扰MyD88表达的干扰分子；
特异性与MyD88蛋白结合的抗体或配体；
MyD88基因敲除载体。
9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述MyD88抑制剂为熊果酸或其药学上可接受的盐。
10.一种治疗乳腺癌的药物组合物，其特征在于，包括紫杉醇，以及熊果酸或其药学上可接受的盐。
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