CN101444515A - 乌索酸在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物化学技术领域。本发明公开了乌索酸在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的用途，通过实验表明乌索酸可以诱导肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌细胞凋亡，显著抑制肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌细胞的细胞增殖。乌索酸可以制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物。

Description

乌索酸在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的用途

技术领域

本发明属于药物化学技术领域。本发明公开了乌索酸在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的的用途，通过实验表明乌索酸可以改变肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌细胞的分裂周期，诱导肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌细胞的凋亡。乌索酸可以制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物。

背景技术

乌索酸(Ursolic acid，UA)，又名熊果酸、乌苏酸，属五环三萜类化合物，据不完全统计，自然界已有34科108种植物中发现乌索酸，如玄参植物毛泡桐的叶，杜鹃花科植物熊果的叶、果实等。乌索酸为脂溶性物质，可以透过细胞膜发挥作用，并且具有广泛的生物学效应，其突出作用为抗肿瘤，保肝护肝、降血脂、抗菌、抗病毒、抗微生物、抗寄生虫和促进造血系统功能恢复等药理等作用。

抗肝损伤

在实验研究中发现，UA对CCl₄引起的大、小鼠急、慢性肝损伤具有明显的保护和治疗作用。能使动物血清SGPT1SB及肝甘油三酯显著降低，血清甘油三酯、β-脂蛋白、α1、α2球蛋白、肝糖原、及肝脏羟脯氨酸含量明显增加，A/G比值倒置有改善作用，肝细胞变性、坏死明显减轻。证实UA对实验性肝损伤有显著的保护和治疗作用。实验研究还表明UA有明显抗慢肝和抗纤维化等作用。说明UA可以使肝脏合成较多的载脂蛋白，使TG从肝脏运输入血，从而减轻肝脂变。Liu报道UA可以降低由CCl₄(15ul/kg.ip)、乙酰氨基酚(500mg/kg.iv)、氯化镉所至CF-1小鼠肝损伤的程度，使肝金属硫蛋白水平提高了48倍。UA比它的同分异构体OA在降低化学试剂诱发的小鼠肝损伤方面更具优势。SaraSwat B，Miura N等人的实验研究均证实UA具有明显抗肝损伤作用。

利胆退黄

实验研究表明UA能增加正常大鼠和胆汁瘀积性肝炎大鼠胆汁流量，使APIT模型动物的血清SB含量明显降低，肝组织病理损伤显著减轻，具有保肝、利胆、退黄的作用。

抗肝炎

临床预试采用病例随机分组，双盲给药，以齐墩果酸(OA)为对照的方法，用UA治疗甲、乙型急性病毒性肝炎102例，剂量为120mg/日，60mg/次，平均治疗时间21天，治愈率89.3％，优于同期100例OA对照组的效果(68％)(P<0.01)。临床试验表明UA有显著而迅速降低谷丙转氨酶，消退黄疸，增进食欲和恢复肝功能的作用。服药60天后，对21例HBeAg阳性患者的转阴率为61.4％，对21例HBsAg阳性患者的转阴率为23.8％，对乙肝病毒具有一定的治疗作用。UA治疗的102例患者，停药1年后随访了90例，结果89例肝功能复查正常，仅1例谷丙转氨酶反跳为110u，后经服用UA治疗又恢复正常，表明UA疗效稳定。UA在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用，不论将UA单独使用，还是与其它药物配合使用，只要制备成药品或保健药品均具有显著治疗病毒性肝炎的作用。

毒性实验

动物实验证明，UA剂量下未发现明显毒副作用。小鼠皮下注射3.5g/kg UA一次，观察72小时，未见动物死亡或明显毒副作用，体重、食欲、活动均未受到影响。小鼠口服UA的LD50为8.33g/kg。小鼠腹腔注射UA的LD50为637mg/kg。家兔急性毒性实验表明，以2.4g/kg十二肠给药，观察24小时，对兔呼吸、血压、心电图无明显影响；亚急性毒性实验表明：大鼠口服UA500mg/kg/日×30天，对大鼠的生长、血象、心电图、肝肾功能都无明显影响，其心、肝、脾、肺、肾组织病检也未发现明显异常改变。该剂量是临床成人每日用量(2.4mg/kg/日)的208倍。实验结果表明，UA毒性低，服用安全。102例甲、乙型病毒性肝炎患者服用UA未见明显毒性反应。用药期间进行心电图、肝功能、血、尿常规检查，未发现异常改变。认为目前口服剂量(2.4mg/kg/日)是安全有效的。个别患者在服药初期或空腹服用时上腹部稍感不适，未经处理而自行消失。

抗肿瘤作用

近年发现UA具有明显的抗肿瘤作用，其抗肿瘤谱广，不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细胞有明显细胞毒作用、诱导分化作用及抗血管形成作用。

对肿瘤的细胞毒作用

UA能直接杀伤肿瘤细胞。Lee等用UA进行了多种细胞系的细胞毒试验，结果表明UA对P-388和L1210白血病细胞、A549人肺癌细胞有显著的细胞毒作用，ED50均小于4mg/L；对KB肿瘤细胞、人结肠癌细胞HCT-8、乳腺癌细胞MCF-7显示边缘细胞毒作用。Young等从枇杷叶提取UA，腹腔注射能明显延长荷S180小鼠生存期，当UA的浓度为5、10umol/L时，S180细胞数明显减少，表明瘤重的减轻是由于UA对S180的细胞毒作用所致。Kim从白花蛇舌草中提取UA进行实验，结果显示UA对所测的肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。Simon、黄镜等实验证明：UA能抑制HL-60细胞增殖、生长及合成DNA，诱导HL-60细胞凋亡。Beek等实验表明胞内Ca++信号增强与HL-60细胞凋亡是密切相关的。Kim等深入研究UA诱导肿瘤细胞凋亡的机制，实验结果表明UA能促进人肝癌(HepG2)细胞凋亡，降低HepG2细胞活力，并有时间依赖性和浓度依赖性，30umol/L的UA能引起DNA的断裂，产生亚二倍体细胞，增加细胞色素C的释放，增强细胞色素C依赖的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)的激活。细胞周期分析结果显示，细胞主要被阻滞在G0期和G1期，并伴S期细胞数的下降，而且UA增加了p21WAF！的表达，在体外试验中，UA显著抑制SV40DNA复制的启始，并大大减少拓扑异构酶-1的DNA断裂，显著降低复制蛋白A的单链DNA的结合活性。这提示UA通过阻断起始阶段复制叉的建立，从而抑制DNA的复制，诱导细胞周期终止。因此认为，UA使p21^WAF！表达增加，导致细胞色素C释放和caspase-3激活，抑制DNA复制，从而导致HepG2细胞凋亡和细胞周期终止。

抗肿瘤血管形成作用

新生血管形成是肿瘤生长和转移的至关重要的病理过程，而在肿瘤新生血管形成过程中，血管内皮细胞(VEC)的活化、增殖、迁移及小管形成是其关键步骤。事实证明，血管再生是实体瘤的增长和转移灶的形成的重要因素。因此，抑制血管生成可以达到控制肿瘤生长和转移的目的。已经发现了许多血管再生抑制剂，如鱼精蛋白、干扰素、血小板因子-4等。这类抑制剂毒性很大，限制了其在临床上的应用。Soho K H等以鸡胚胎绒毛试验模型研究UA的抗血管作用，结果表明UA是很强的血管生成抑制剂，有效浓度为4nmol/egg，ID50为10nmol/egg。该浓度下无细胞毒作用，UA抑制血管内皮细胞增殖的ID50为5umol/L。王杰军等用20％胎牛血清的培养液使VEC呈指数生长状态。而增殖期VEC具有增殖、迁移及小血管形成功能。137.06umol/L-1096.5umol/L的UA对VEC增殖具有抑制作用，并有剂量依赖性。

抑制肿瘤形成生长

UA对肿瘤形成生长各阶段具有预防和抑制作用。UA能抗DNA突变、抑制癌变的启动。Ames试验研究发现UA能对抗致癌物如苯并芘[B(a)P]，黄曲霉毒素B1诱发基因突变。UA还具有抗诱变和抗促癌作用。Ohigashi等以抗TPA诱导的Raji细胞Epstein Bar病毒早期抗体(EBV-EA)活化试验模型来筛选皮肤癌促癌物的抑制剂，发现UA对TPA诱导Raji细胞EBV-EA活化具有几乎同维甲酸相同的抑制作用，并使Raji细胞的存活率更高；利用同位素标记的佛酯化合物³H-PDB₂证明UA不影响TPA与受体的结合，即UA不是通过竞争TPA位点，而是有效地阻断促癌物与受体结合后的环节发挥作用。在二阶段致癌实验中，Huang等发现UA明显抑制TPA对二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的小鼠皮肤癌的促癌作用。实验证明UA对TPA诱导的表皮ODC活性增强有抑制作用。这些作用可能是由于UA阻断ODC，引起多胺枯竭，导致生长抑制，使细胞积累在G1期并出现分化。实验表明，UA可能通过抗氧化作用起到抗始发突变与抗促癌作用。活性氧自由基与肿瘤的发生发展密切相关，Balanehru和Nagarajan研究表明UA有较强的抗氧化作用和捕获O₂-自由基的能力，在肝微粒体和P450单胺氧化酶系中对脂质过氧化均有较强的抑制作用。另有实验表明UA能抑制花生四烯酸代谢过程中5-脂氧合酶、环氧合酶活性，阻止前列腺素与白三烯生成。Subbaramaiah等研究表明乌索酸能抑制人乳腺上皮细胞中的环氧合酶2的转录，也由此抑制前列腺素2生成。

诱导癌细胞分化作用

癌是一类生长失控，分化差或未分化的疾病。治疗癌的新途径是诱导癌细胞分化为良性或正常细胞。Lee等报道7.5umol/L的UA可以诱导F9畸胎瘤细胞成为内胚层细胞，并且引起与其分化有关的IV型胶原及维甲酸受体表达增加，且能导致M1细胞分化为巨噬细胞。UA诱导癌细胞分化成正常细胞可能因UA结构上类似于糖皮质激素通过与GS-R受体或类似的核受体结合发挥作用有关。Cha等对侵袭性最强的人HT1080纤维瘤细胞进行研究，实验表明UA能降低基质金属酶9(MMP-9)基因的表达从而对抗人HT1080纤维瘤细胞的侵袭性。

抗艾滋病病毒作用

实验研究表明，从桑毛路边青，山楂等植物提取的UA是抗HIV活性成分，具有抑制HIV蛋白酶的作用。

增强免疫功能作用

UA能使小鼠的巨噬细胞吞噬功能显著提高，体内试验表明可明显增强机体免疫功能。You等研究发现UA能诱导小鼠休止巨噬细胞释放NO、TNF-α增多，并呈剂量依赖性，这是通过核因子-KB(NF-KB)复合物介导，使一氧化氮合成酶(iNOS)的mRNA及TNF-α的mRNA水平提高，从而上调iNOS和TNF-α的表达，增加NO、TNF-α的产生，增强抗肿瘤活性。Hsu等试验先给小鼠腹腔内注射UA，30分钟后再以亚致死量全身照射4Gy，结果显示UA能通过植物血凝素的介导，加强照射后脾母细胞化的反应，使效应T淋巴细胞、效应B淋巴细胞大量增多，加强外周血细胞的作用，从而减轻放射后造血组织的损伤。

抗炎抑菌作用

Maria等实验结果UA能抑制由TPA、苯丙炔酸乙酯(EPP)诱发的耳水肿，剂量为015mg/耳，抑制率分别为73.4％、30.3％；抑制角叉菜胶诱发的水肿，口服剂量为100mg/kg，抑制率为35.5％；抑制由血清素诱发的水肿，剂量为50mg/kg，抑制率为48.6％；抑制由放射菌素D和放射菌素酮诱发的鼠爪水肿，剂量为50mg/kg，抑制率分别为47.5％、47.4％。另有报道大鼠每天腹腔注射12.5mg/kg×7d，有延缓植入羊毛球的发热过程，增加肝糖原，降低心、横纹肌及肌糖原，有糖皮质激素样作用，临床用作胶原抑制剂。

UA能抑制金色葡萄糖球菌、C+和C-菌及酵母的生长，其最低抑菌浓度为300ug/ml、50-400ug/ml、200-800ug/ml、100-700ug/ml；能抑制羊毛小孢子菌的生长；降低暴露在Hepes单病毒中的Verd细胞的细胞病变程度。

降血脂抗动脉粥样硬化作用

苏联学者Parfentena等发现UA可以降低家兔和大鼠血胆固醇(44％)和β-脂蛋白水平(50％)，具有降血脂、抗动脉粥样硬化作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种乌索酸在制备乌索酸在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的新用途，即乌索酸在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的应用。无论将乌索酸单独使用，还是与其他药物配合使用，只要制备成药品或保健品均具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

本发明所述的乌索酸在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的用途，其特征在于所述的乌索酸可以改变肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的分裂周期，显著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、白血病细胞的细胞分裂。

本发明用MTT法证明乌索酸明显抑制肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌细胞的增殖。MTT法是现代检测细胞存活率最经典的基本方法。该法利用活细胞具酶活性而死细胞无酶活性的原理设计。因为黄色的四氮唑[MTT]能接受脱氢酶给予的氢原子而转变为蓝紫色的甲次；活细胞因具脱氢酶，故能被染成蓝紫色。死细胞无活性脱氢酶，故不呈蓝紫色，培养液中活细胞越多，蓝紫色越深。

进一步在细胞培养液中加入二甲基亚砜(DMSO)，可使蓝紫色的蓝次溶出。培养液中活细胞越多，蓝紫色越深，在酶标仪上测各孔的吸光值(测定波长490nm)可测得其光密度值(A值)，根据其与对照组A值相比，可定量折算相对抑瘤率：

相对抑瘤率＝(处理孔的光密度值/空白对照孔的光密度值)×100％

结果发现：乌索酸即使在微量浓度下(5--60μg/ml)，对人肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌细胞都有显著的增殖抑制作用。且抑制强度与药物浓度和作用时间呈正相关。即乌索酸浓度越高，作用时间越长，抑制率越高。乌索酸在30μg/ml的浓度下，作用1天，它对人乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制率为21.3％；作用2天，它对人乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制率为41.2％；作用3天，它对人乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制率为76.8％。

结果还发现：乌索酸抑制肿瘤细胞增殖是通过诱导肿瘤细胞的凋亡来实现的。通过流式细胞仪检测发现，乌索酸作用于人乳腺癌细胞(MCF-7)后，出现能明显的凋亡峰，能诱导肿瘤细胞的凋亡。

在临床使用中，可以将本发明乌索酸制成片剂、固体分散体、滴丸、纳米粒等口服制剂，建议临床成人每日用量(24mg/kg·d)，每日分3次服用，30天一个疗程。

本发明将通过实施例进一步阐述本发明。

具体实施方式

实施例1

乌索酸的提取分离

材料与方法

材料 枇杷叶药渣为水煎法生产枇杷糖浆的废弃物，外观小条形，色黑，由江西海尔思药业公司提供。

试剂 食用级95％乙醇(广西糖厂生产)；“YCXY21号”除杂剂(自制)，活性炭，分析纯(上海豪申化学试剂有限公司生产)；乌索酸对照品(中国药品生物制品检定所提供)。

仪器 FC2204分析天平(上海天平分析仪器厂)；Perkin Elmer傅立叶变换红外光谱仪(美国)。

方法

工艺流程。采用“醇提凝析法”新工艺提取分离。

枇杷叶药渣→加乙醇回流提取→回收乙醇→用除杂剂除杂→活性炭脱色→凝析分离→纯化精制→烘干→乌索酸。

具体操作。取干燥的枇杷叶药渣1kg，共3份，分别用7倍量90％乙醇分2次于80℃回流提取各1h，合并提取液，回收乙醇后，用“YCXY21号”除杂剂除杂，再用活性炭脱色，经凝析分离、纯化精制即得。

结果与分析

乌索酸的产率 将所得产品于105℃烘干24h，称重。

性状鉴别 产品为无色针状结晶，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，不溶于石油醚和水。

定性鉴别

L2B反应。取样品少许，以95％乙醇溶解，吸取乙醇溶液1滴，置试管中，加1ml醋酐试剂，摇匀，加1ml浓硫酸试剂，在醋酐与浓硫酸界面上呈紫红色圆环。

薄层鉴定。取活化后的硅胶G硬板，将样品的乙醇溶液点样，同时用乌索酸对照品作对照，以环己烷∶丙酮(3∶1)为展开剂，展距10cm，取出晾干，喷雾10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热5～10min，结果在与对照品相应的位置上显相同颜色的紫红色斑点，在365nm紫外光下显相同颜色的金黄色荧光斑点。

红外光谱鉴定。产品IRKBrmaxυ/cm：3434(-OH)、2968、2927、2871(C-H)、1694(C＝O)、1456、1384(CH3)、1031(C-O)。其特征吸收与乌索酸标准品的红外光谱完全一致。上述分析结果证明，所得产品为乌索酸。

实施例2

实验材料(以下细胞株均购自美国ATCC标准细胞库)

主要试剂

RPMI1640培养基干粉         GIBCO公司

小牛血清                   GIBCO公司/杭州四季青公司

Trypsin、DMSO、MTT         F1uka公司

青霉素、链霉素             Sigma公司

Ursolic acid标准品         宜春学院天然药物研究江西省重点实验室

Cisplatin                  江苏森豪药业股份有限公司

培养基及常用溶液

肿瘤细胞培养基：RPMI1640培养基加入10％的小牛血清。含2g/L NaHCO₃，青霉素100U/ml和链霉素100U/ml，过滤除菌，4℃保存。

PBS：800ml水中溶解0.2g KCl，0.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，HCl调节pH为7.4，加水定容至1L，高压灭菌。

消化液：EDTA/PBS(无Ca²⁺Mg²⁺)/胰蛋白酶缓冲液

主要仪器

CO₂培养箱                美国Thermo Forma公司

酶标仪                   Bio Rad公司

荧光倒置相差显微镜       德国Leica公司

高速冷冻离心机           日本HITACHI公司

超低温冰箱               日本SANYO公司

微量高速离心机TGF-16G    南京大学仪器厂

恒温水浴锅               常州国华电器有限公司

隔水式培养箱             上海福玛公司

高压灭菌锅               上海三申医疗器械有限公司

超净工作台                      苏州净化设备厂

电子天平                        上海民桥仪器有限公司

6孔、24孔及96孔细胞培养板       Coming Costar公司

实验方法

MTT法测定肿瘤细胞生长的抑制作用

将细胞(活细胞率≥95％)接种于96孔培养板，每孔含3-5×10³个细胞，空白孔不接种细胞，置于37℃，5％ CO₂饱和湿度的细胞培养箱内培养。待细胞培养24hr贴壁后去掉培养基，加入不同浓度的受试药物，阴性孔和空白孔均加入无血清培养基作为对照，每孔200μl，细胞培养44hr后吸去培养基，每孔加入5mg/ml MTT20μl，温育4hr。弃上清，每孔加入DMSO 150μl，酶标仪测定490nm值，按下式计算细胞生长抑制率并作图计算IC50。每个剂量浓度设3个平行孔，重复试验3次。

Inhibition Ratio(％)＝(阴性孔OD值-试验孔OD值)/(阴性孔OD值-空白孔OD值)×100％

实验结果

n＝6，mean±SD，重复3次，^*为P<0.05(有显著差异)；^**为P<0.01(有极显著差异)

实验结果表明：乌索酸能明显抑制肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌细胞的增殖。

实施例3

UA对肿瘤细胞分裂周期的调控

实验材料同实施例2

主要试剂

碘化丙啶                         Sigma公司

转染试剂Lipofectamin TM 2000     Invitrogen

Annexin V凋亡检测试剂盒          Beckman Coulter公司

RnaseA                           上海生工生物工程技术有限公司

RPMI1640培养基干粉               Gibco公司

胰蛋白酶                         Amersco公司

MTT                           Sigma公司

主要仪器

FACSCalibur流式细胞仪         Becton Dickinson公司

荧光倒置显微镜                Leica公司

主要溶液

PBST缓冲液       PBS缓冲液中加入0.1％Tween-20

其它同实施例2

实验方法

细胞的培养

肿瘤细胞在含10％新生牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

MTT检测法

将4-5×10³个细胞接种于96孔板的每孔，每孔180μL，每组平行8孔，并设立空白，阴性药对照，阳性药。44h后，弃上清，每孔加20μL新配制的5g/L MTT，孵育4h，弃上清，加150μL DMSO溶解，混匀后用Bio-Rad型号的酶标仪490nm波长测定。

流式细胞术检测

用药后48h，细胞胰蛋白酶消化30s，收集细胞，PBS洗两遍，加入1mL乙醇固定过夜，去乙醇，PBS洗两遍，加入100μL浓度为10μg/mL的PI，混匀后室温避光孵育30min，在反应管中加400μL PBS，上机检测细胞周期变化。

实验结果表明：在浓度为10μg/ml乌索酸作用48小时后，肝癌Bel-7402、胃癌MGC-803、肺癌A549和乳腺癌细胞MCF-7均出现明显的细胞凋亡的特征：细胞体积变小、形态不规则、细胞皱缩、核固缩、贴壁差等特点。10μg/ml乌索酸作用48小时，流式细胞仪检测发现：乌索酸作用后，肝癌Bel-7402、胃癌MGC-803、肺癌A549和乳腺癌细胞MCF-7均出现明显的凋亡峰。

Claims (3)

1、乌索酸在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的用途。

2、根据权利要求1所述的乌索酸在制备诱导肿瘤细胞凋亡药物中的用途，其特征在于所述的乌索酸可以诱导肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌细胞的凋亡，显著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌细胞增殖。

3、根据权利要求1或要求2所述的特征在于乌索酸可以制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物。