CN101444517A - 乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物化学技术领域。本发明公开了乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的用途，通过实验表明乌索酸能改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的黏附力，显著抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的迁移能力。

Description

乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的用途

技术领域

本发明属于药物化学技术领域。本发明公开了乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的用途，即乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。无论将乌索酸单独使用，还是与其他药物配合使用，只要制备成抗肿瘤药物均具有抑制肿瘤转移作用。

背景技术

乌索酸(Ursolic acid，UA)，又名熊果酸、乌苏酸，属五环三萜类化合物，存在于多种植物中，据不完全统计，在自然界已有34科108种植物中分离得到乌索酸，如杜鹃花科植物熊果的叶、果实，玄参植物毛泡桐的叶等。乌索酸为脂溶性物质，可以透过细胞膜发挥作用，并且具有广泛的生物学效应，其突出作用为抗肿瘤，保肝护肝、降血脂、抗菌、抗病毒、抗微生物、抗寄生虫和促进造血系统功能恢复等药理等作用。

抗肝炎

临床预试采用病例随机分组，双盲给药，以齐墩果酸(OA)为对照的方法，用UA治疗甲、乙型急性病毒性肝炎102例，剂量为120mg/日，60mg/次，平均治疗时间21天，治愈率89.3％，优于同期100例OA对照组的效果(68％)(P<0.01)。临床试验表明UA有显著而迅速降低谷丙转氨酶，消退黄疸，增进食欲和恢复肝功能的作用。服药60天后，对21例HBeAg阳性患者的转阴率为61.4％，对21例HBsAg阳性患者的转阴率为23.8％，对乙肝病毒具有一定的治疗作用。UA治疗的102例患者，停药1年后随访了90例，结果89例肝功能复查正常，仅1例谷丙转氨酶反跳为110u，后经服用UA治疗又恢复正常，表明UA疗效稳定。UA在制备治疗病毒性肝炎药物中的应用，不论将UA单独使用，还是与其它药物配合使用，只要制备成药品或保健药品均具有显著治疗病毒性肝炎的作用。

抗肝损伤

在实验研究中发现，UA对CCl₄引起的大、小鼠急、慢性肝损伤具有明显的保护和治疗作用。能使动物血清SGPT1SB及肝甘油三酯显著降低，血清甘油三酯、β-脂蛋白、α1、α2球蛋白、肝糖原、及肝脏羟脯氨酸含量明显增加，A/G比值倒置有改善作用，肝细胞变性、坏死明显减轻。证实UA对实验性肝损伤有显著的保护和治疗作用。实验研究还表明UA有明显抗慢肝和抗纤维化等作用。说明UA可以使肝脏合成较多的载脂蛋白，使TG从肝脏运输入血，从而减轻肝脂变。Liu报道UA可以降低由CCl₄(15ul/kg.ip)、乙酰氨基酚(500mg/kg.iv)、氯化镉所至CF-1小鼠肝损伤的程度，使肝金属硫蛋白水平提高了48倍。UA比它的同分异构体OA在降低化学试剂诱发的小鼠肝损伤方面更具优势。SaraSwat B，Miura N等人的实验研究均证实UA具有明显抗肝损伤作用。

利胆退黄

实验研究表明UA能增加正常大鼠和胆汁瘀积性肝炎大鼠胆汁流量，使APIT模型动物的血清SB含量明显降低，肝组织病理损伤显著减轻，具有保肝、利胆、退黄的作用。

毒性实验

动物实验证明，UA剂量下未发现明显毒副作用。小鼠皮下注射3.5g/kg UA一次，观察72小时，未见动物死亡或明显毒副作用，体重、食欲、活动均未受到影响。小鼠口服UA的LD50为8.33g/kg。小鼠腹腔注射UA的LD50为637mg/kg。家兔急性毒性实验表明，以2.4g/kg十二肠给药，观察24小时，对兔呼吸、血压、心电图无明显影响；亚急性毒性实验表明：大鼠口服UA500mg/kg/日×30天，对大鼠的生长、血象、心电图、肝肾功能都无明显影响，其心、肝、脾、肺、肾组织病检也未发现明显异常改变。该剂量是临床成人每日用量(2.4mg/kg/日)的208倍。实验结果表明，UA毒性低，服用安全。102例甲、乙型病毒性肝炎患者服用UA未见明显毒性反应。用药期间进行心电图、肝功能、血、尿常规检查，未发现异常改变。认为目前口服剂量(2.4mg/kg/日)是安全有效的。个别患者在服药初期或空腹服用时上腹部稍感不适，未经处理而自行消失。

抗肿瘤作用

近年发现UA具有明显的抗肿瘤作用，其抗肿瘤谱广，不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用，而且对多种肿瘤细胞有明显细胞毒作用、诱导分化作用及抗血管形成作用。

抑制肿瘤形成生长

UA对肿瘤形成生长各阶段具有预防和抑制作用。UA能抗DNA突变、抑制癌变的启动。Ames试验研究发现UA能对抗致癌物如苯并芘[B(a)P]，黄曲霉毒素B1诱发基因突变。UA还具有抗诱变和抗促癌作用。Ohigashi等以抗TPA诱导的Raji细胞Epstein Bar病毒早期抗体(EBV-EA)活化试验模型来筛选皮肤癌促癌物的抑制剂，发现UA对TPA诱导Raji细胞EBV-EA活化具有几乎同维甲酸相同的抑制作用，并使Raji细胞的存活率更高；利用同位素标记的佛酯化合物³H-PDB₂证明UA不影响TPA与受体的结合，即UA不是通过竞争TPA位点，而是有效地阻断促癌物与受体结合后的环节发挥作用。在二阶段致癌实验中，Huang等发现UA明显抑制TPA对二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的小鼠皮肤癌的促癌作用。实验证明UA对TPA诱导的表皮ODC活性增强有抑制作用。这些作用可能是由于UA阻断ODC，引起多胺枯竭，导致生长抑制，使细胞积累在G1期并出现分化。实验表明，UA可能通过抗氧化作用起到抗始发突变与抗促癌作用。活性氧自由基与肿瘤的发生发展密切相关，Balanehru和Nagarajan研究表明UA有较强的抗氧化作用和捕获O₂-自由基的能力，在肝微粒体和P450单胺氧化酶系中对脂质过氧化均有较强的抑制作用。另有实验表明UA能抑制花生四烯酸代谢过程中5-脂氧合酶、环氧合酶活性，阻止前列腺素与白三烯生成。Subbaramaiah等研究表明乌索酸能抑制人乳腺上皮细胞中的环氧合酶2的转录，也由此抑制前列腺素2生成。

诱导癌细胞分化作用

癌是一类生长失控，分化差或未分化的疾病。治疗癌的新途径是诱导癌细胞分化为良性或正常细胞。Lee等报道7.5umol/L的UA可以诱导F9畸胎瘤细胞成为内胚层细胞，并且引起与其分化有关的IV型胶原及维甲酸受体表达增加，且能导致M1细胞分化为巨噬细胞。UA诱导癌细胞分化成正常细胞可能因UA结构上类似于糖皮质激素通过与GS-R受体或类似的核受体结合发挥作用有关。Cha等对侵袭性最强的人HT1080纤维瘤细胞进行研究，实验表明UA能降低基质金属酶9(MMP-9)基因的表达从而对抗人HT1080纤维瘤细胞的侵袭性。

抗肿瘤血管形成作用

新生血管形成是肿瘤生长和转移的至关重要的病理过程，而在肿瘤新生血管形成过程中，血管内皮细胞(VEC)的活化、增殖、迁移及小管形成是其关键步骤。事实证明，血管再生是实体瘤的增长和转移灶的形成的重要因素。因此，抑制血管生成可以达到控制肿瘤生长和转移的目的。已经发现了许多血管再生抑制剂，如鱼精蛋白、干扰素、血小板因子-4等。这类抑制剂毒性很大，限制了其在临床上的应用。Soho K H等以鸡胚胎绒毛试验模型研究UA的抗血管作用，结果表明UA是很强的血管生成抑制剂，有效浓度为4nmol/egg，ID50为10nmol/egg。该浓度下无细胞毒作用，UA抑制血管内皮细胞增殖的ID50为5umol/L。王杰军等用20％胎牛血清的培养液使VEC呈指数生长状态。而增殖期VEC具有增殖、迁移及小血管形成功能。137.06umol/L-1096.5umol/L的UA对VEC增殖具有抑制作用，并有剂量依赖性。

对肿瘤的细胞毒作用

UA能直接杀伤肿瘤细胞。Lee等用UA进行了多种细胞系的细胞毒试验，结果表明UA对P-388和L1210白血病细胞、A549人肺癌细胞有显著的细胞毒作用，ED50均小于4mg/L；对KB肿瘤细胞、人结肠癌细胞HCT-8、乳腺癌细胞MCF-7显示边缘细胞毒作用。Young等从枇杷叶提取UA，腹腔注射能明显延长荷S180小鼠生存期，当UA的浓度为5、10umol/L时，S180细胞数明显减少，表明瘤重的减轻是由于UA对S180的细胞毒作用所致。Kim从白花蛇舌草中提取UA进行实验，结果显示UA对所测的肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。Simon、黄镜等实验证明：UA能抑制HL-60细胞增殖、生长及合成DNA，诱导HL-60细胞凋亡。Beek等实验表明胞内Ca++信号增强与HL-60细胞凋亡是密切相关的。Kim等深入研究UA诱导肿瘤细胞凋亡的机制，实验结果表明UA能促进人肝癌(HepG2)细胞凋亡，降低HepG2细胞活力，并有时间依赖性和浓度依赖性，30umol/L的UA能引起DNA的断裂，产生亚二倍体细胞，增加细胞色素C的释放，增强细胞色素C依赖的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)的激活。细胞周期分析结果显示，细胞主要被阻滞在G0期和G1期，并伴S期细胞数的下降，而且UA增加了p21WAF！的表达，在体外试验中，UA显著抑制SV40DNA复制的启始，并大大减少拓扑异构酶-1的DNA断裂，显著降低复制蛋白A的单链DNA的结合活性。这提示UA通过阻断起始阶段复制叉的建立，从而抑制DNA的复制，诱导细胞周期终止。因此认为，UA使p21^WAF！表达增加，导致细胞色素C释放和caspase-3激活，抑制DNA复制，从而导致HepG2细胞凋亡和细胞周期终止。

增强免疫功能作用

UA能使小鼠的巨噬细胞吞噬功能显著提高，体内试验表明可明显增强机体免疫功能。You等研究发现UA能诱导小鼠休止巨噬细胞释放NO、TNF-α增多，并呈剂量依赖性，这是通过核因子-KB(NF-KB)复合物介导，使一氧化氮合成酶(iNOS)的mRNA及TNF-α的mRNA水平提高，从而上调iNOS和TNF-α的表达，增加NO、TNF-α的产生，增强抗肿瘤活性。Hsu等试验先给小鼠腹腔内注射UA，30分钟后再以亚致死量全身照射4Gy，结果显示UA能通过植物血凝素的介导，加强照射后脾母细胞化的反应，使效应T淋巴细胞、效应B淋巴细胞大量增多，加强外周血细胞的作用，从而减轻放射后造血组织的损伤。

抗艾滋病病毒作用

实验研究表明，从桑毛路边青，山楂等植物提取的UA是抗HIV活性成分，具有抑制HIV蛋白酶的作用。

抗炎抑菌作用

Maria等实验结果UA能抑制由TPA、苯丙炔酸乙酯(EPP)诱发的耳水肿，剂量为015mg/耳，抑制率分别为73.4％、30.3％；抑制角叉菜胶诱发的水肿，口服剂量为100mg/kg，抑制率为35.5％；抑制由血清素诱发的水肿，剂量为50mg/kg，抑制率为48.6％；抑制由放射菌素D和放射菌素酮诱发的鼠爪水肿，剂量为50mg/kg，抑制率分别为47.5％、47.4％。另有报道大鼠每天腹腔注射12.5mg/kg×7d，有延缓植入羊毛球的发热过程，增加肝糖原，降低心、横纹肌及肌糖原，有糖皮质激素样作用，临床用作胶原抑制剂。

UA能抑制金色葡萄糖球菌、C+和C-菌及酵母的生长，其最低抑菌浓度为300ug/ml、50-400ug/ml、200-800ug/ml、100-700ug/ml；能抑制羊毛小孢子菌的生长；降低暴露在Hepes单病毒中的Verd细胞的细胞病变程度。

降血脂抗动脉粥样硬化作用

苏联学者Parfentena等发现UA可以降低家兔和大鼠血胆固醇(44％)和β-脂蛋白水平(50％)，具有降血脂、抗动脉粥样硬化作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的新用途，即乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。无论将乌索酸单独使用，还是与其他药物配合使用，只要制备成药品或保健品均具有抑制肿瘤转移的作用。

本发明乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的用途，其特征在于通过用MTT法实验表明乌索酸可以改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞对IV型胶原蛋白的黏附力，乌索酸能改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的黏附力。

本发明乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的用途，其特征在于通过用划痕损伤模型实验表明乌索酸可以抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞在二维水平的迁移能力。

$\mathrm{Migration\; rate}(\%)=\frac{S_{\mathrm{time\; zero}}-S_{\mathrm{time\; point}}}{S_{\mathrm{time\; zero}}}$

本发明乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的用途，其特征在于通过用侵袭小室模型实验表明乌索酸可以抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞在三维水平的迁移能力。

结果发现，表明乌索酸可以改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的黏附力，乌索酸能改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的迁移能力。

在临床使用中，可以将本发明乌索酸制成片剂、固体分散体、滴丸、纳米粒等口服制剂，建议临床成人每日用量(24mg/kg·d)，每日分3次服用，30天一个疗程。

具体实施方式

实施例1

枇杷叶药渣中乌索酸的提取分离

材料与方法

材料枇杷叶药渣为水煎法生产枇杷糖浆的废弃物，外观小条形，色黑，由江西海尔思药业公司提供。

试剂食用级95％乙醇(广西糖厂生产)；“YCXY21号”除杂剂(自制)，活性炭，分析纯(上海豪申化学试剂有限公司生产)；乌索酸对照品(中国药品生物制品检定所提供)。

仪器 FC2204分析天平(上海天平分析仪器厂)；Perkin Elmer傅立叶变换红外光谱仪(美国)。

方法

工艺流程。采用“醇提凝析法”新工艺提取分离。

枇杷叶药渣→加乙醇回流提取→回收乙醇→用除杂剂除杂→活性炭脱色→凝析分离→纯化精制→烘干→乌索酸。

具体操作。取干燥的枇杷叶药渣1kg，共3份，分别用7倍量90％乙醇分2次于80℃回流提取各1h，合并提取液，回收乙醇后，用“YCXY21号”除杂剂除杂，再用活性炭脱色，经凝析分离、纯化精制即得。

结果与分析

乌索酸的产率 将所得产品于105℃烘干24h，称重。

性状鉴别 产品为无色针状结晶，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，不溶于石油醚和水。

定性鉴别

L2B反应。取样品少许，以95％乙醇溶解，吸取乙醇溶液1滴，置试管中，加1ml醋酐试剂，摇匀，加1ml浓硫酸试剂，在醋酐与浓硫酸界面上呈紫红色圆环。

薄层鉴定。取活化后的硅胶G硬板，将样品的乙醇溶液点样，同时用乌索酸对照品作对照，以环己烷∶丙酮(3∶1)为展开剂，展距10cm，取出晾干，喷雾10％硫酸乙醇溶液，于105℃加热5～10min，结果在与对照品相应的位置上显相同颜色的紫红色斑点，在365nm紫外光下显相同颜色的金黄色荧光斑点。

红外光谱鉴定。产品IRKBrmaxυ/cm：3434(-OH)、2 968、2 927、2 871(C-H)、1 694(C＝O)、1 456、1 384(CH3)、1031(C-O)。其特征吸收与乌索酸标准品的红外光谱完全一致。上述分析结果证明，所得产品为乌索酸。

实施例2

UA改变肿瘤细胞与IV型胶原蛋白间黏附能力

实验材料

人胃癌细胞MGC-803               中国药科大学肿瘤药理实验室

人乳腺癌细胞株MDA-MB-435        中国药科大学肿瘤药理实验室

人肝癌细胞株Bel-7402            中国药科大学新药筛选中心

24孔培养板                      Coming公司

Thincert侵袭小室(孔径8μm)       Greiner公司

主要试剂

RPMI1640培养基干粉            Gibco公司

胰蛋白酶                      Amersco公司

MTT                           Sigma公司

主要仪器

水平电泳槽                    南京大学仪器厂

恒温振荡器                    上海智诚分析仪器制造公司

荧光倒置显微镜                Leica公司

实验方法

肿瘤细胞与IV型胶原蛋白间黏附能力的检测

参照Herren等的方法，采用MTT法测定癌细胞与IV型胶原蛋白间的黏附能力。具体操作如下：

IV型胶原蛋白包被96孔培养板：将IV型胶原蛋白储液用PBS稀释成0.1mg/mL，按50μL/孔加入到96孔培养板中，4℃过夜后再于37℃下孵育2h，然后吸去上情。

用0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1.5×10⁴个/孔接种到已包被IV型胶原蛋白的96孔培养板中；于37℃，5％CO2条件下培养0.5h后，将细胞分为两组：(1)黏附细胞组，用PBS小心洗涤2～3遍除去未黏附的细胞，然后采用MTT法测定黏附细胞的吸光度值；(2)总细胞组，不用PBS洗涤，直接采用MTT法测定吸光度值(A)。每组设6个平行孔。同时，测定IV型胶原蛋白包被但未接种细胞的孔作为空白对照(control)。按照如下公式计算黏附率(Adhesion rate)：

实验结果

表1 乌索酸改变肿瘤细胞对IV型胶原蛋白间黏附能力

注：n＝8，mean±SD，重复3次，*为P<0.05(有显著差异)；**为P<0.01(有极显著差异)

实验结果表明：乌索酸能明显改变乳腺癌细胞MDA-MB-435、胃癌细胞MGC-803和肝癌细胞Bel-7402对IV型胶原蛋白间黏附能力。

实施例3

UA抑制肿瘤细胞二维水平细胞迁移能力

实验材料与主要试剂实施例2

二维水平细胞迁移实验

参照Nakayama等的方法，采用划痕损伤模型分析乌索酸在二维水平上对肿瘤细胞的迁移能力的影响，操作步骤如下：

(1)用0.25％胰蛋白酶消化细胞，按6×10⁴个/孔接种到24孔培养板中，于37℃，5％CO₂条件下培养；

(2)次日，待细胞长成均匀单层后，用无菌的1000μL移液器吸头延孔的中轴线轻轻划过。用37℃预热的PBS轻轻洗涤2～3遍除去漂起的细胞残骸后，加入37℃预热的培养基，放入培养箱中继续培养；

(3)培养0.5～1h后(待细胞恢复)，以这一时间作为零时间点，分别在0、12、24h时通过倒置显微镜下(50×)观察细胞迁移情况并利用目镜刻度尺测量划痕宽度(S)，每孔测量5处(即两端、中点、左1/4处和右1/4处)求平均值，直至细胞完全汇合。每组细胞均设三个平行孔。按照如下公式计算细胞迁移率(Migration rate)：

$\mathrm{Migration\; rate}(\%)=\frac{S_{\mathrm{time\; zero}}-S_{\mathrm{time\; point}}}{S_{\mathrm{time\; zero}}}\&times;100\%$

表1 UA抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞二维水平细胞迁移能力

      乳腺癌MDA-MB-435      胃癌细胞MGC-803       肝癌细胞Bel-7402

      负对照 15μg/ml        负对照 15μg/ml        负对照 15μg/ml

0h    0.00％     0.00％     0.00％     0.00％     0.00％    0.08％

12h   14.81％    1.90％     28.24％    12.59％    6.30％    0.76％

24h   19.27％    6.38％     47.95％    20.91％    12.40％   1.10％

36h   54.50％    9.42％     69.55％    47.19％    28.80％   5.62％

48h              10.10％                          29.40％   7.00％

实验结果表明：乌索酸能明显改变乳腺癌细胞MDA-MB-435、胃癌细胞MGC-803和肝癌细胞Bel-7402二维水平细胞迁移能力。

实施例4

UA抑制肿瘤细胞三维水平细胞迁移能力

实验材料与主要试剂实施例2

采用侵袭小室模型分析乌索酸在三维水平上对肿瘤细胞的迁移能力的影响，具体操作如下：

(1)将细胞用无血清DMEM培养基培养12h后，用0.25％胰蛋白酶消化、无血清RPMI-1640培养基制备单细胞悬液，调整浓度为2.5×10⁵个/mL；

(2)向24孔培养板中加入600μL含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，然后将Thincert侵袭小室浸入，再向小室中加入200μL无血清单细胞悬液(即5.0×10⁴个细胞)；

(3)37℃，5％ CO2培养20h后，取出Thincert小室，用棉签小心将膜上表面的细胞擦拭去除；

(4)用手术刀片小心沿小室边缘将膜切下，把膜下表面向上放在一个洁净的24孔培养板的孔中；

(5)将膜用甲醇:冰醋酸(3:1)固定10min，然后用10％姬姆萨染液染色15～30min；

将膜用蒸馏水漂洗干净后在倒置显微镜下(200×)随机选取6个视野(上、下、左、右各一，中央两个)计数细胞(呈紫红色)。

表1 UA抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞三维水平细胞迁移能力

      乳腺癌MDA-MB-435   胃癌细胞MGC-803      肝癌细胞Bel-7402

      负对照 UA15μg/ml   负对照 UA15μg/ml     负对照UA15μg/ml

mean  134.83   78.99     201.00     166.00    104.00  96.40

SD    34.07    8.19      15.55      7.99      13.93   5.07

实验结果表明：乌索酸能明显改变乳腺癌细胞MDA-MB-435、胃癌细胞MGC-803和肝癌细胞Bel-7402三维水平细胞迁移能力。

Claims (4)

1、乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的乌索酸在制备抑制肿瘤转移药物中的用途，其特征在于所述的乌索酸可以改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的黏附力，显著抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞的迁移能力。

3、根据权利要求1或要求2所述的特征在于乌索酸可以改变乳腺癌、胃癌、肝癌细胞对IV型胶原蛋白的黏附力，抑制乳腺癌、胃癌、肝癌细胞二维、三维水平上的迁移能力。

4、如权利要求1-3任一项要求的用途，其特征在于可以制备抑制肿瘤转移药物。