CN111150848B - Plagl2及其在肝癌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PLAGL2基因及其在肝癌中的应用。包括提供PLAGL2抑制剂在制备抗肝癌药物中的应用，提供一种靶向PLAGL2基因的干扰RNA，包含所述干扰RNA序列的基因运载系统，包含所述PLAG2抑制剂的药物组合物等，同时还将PLAGL2用作检测肝癌疾病的蛋白质分子标记以及制备用于诊断和/或预后评估肝癌疾病的试剂盒等。本发明基于首次发现PLAGL2在肝癌组织中表达异常上调的研究成果，阐明了PLAGL2在肝癌发病机制中的临床意义，为开发PLAGL2作为肝癌治疗、检测、诊断、药物筛选靶点提供了广阔的应用前景。

Description

PLAGL2及其在肝癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种PLAGL2基因及其在肝癌中的应用。
背景技术
肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的诊断癌症类型之一，并且已被列为癌症相关死亡中第二大死亡原因。 肝癌治疗可选择方案主要取决于手术切除，肝移植或化学疗法，患者复发率高，且总体5年的生存率不尽如人意。由于术后复发以及肿瘤的远处转移，HCC患者的预后仍然不佳，然而导致HCC进展和转移的详细分子机制目前尚未完全阐明。
EGFR在40%-70%的人类肝癌样本中高表达，然而EGFR 在HCC中的确切作用机制尚不明确。EGFR抑制剂在晚期肝癌患者中作用有限，在二期临床试验中效果并不显著。EGFR抑制剂可引起肝细胞损伤并分泌促炎细胞因子，在炎症刺激下，EGFR阳性的Kupffer细胞生成IL-6以触发肝细胞增殖和肝癌的发生发展。胆碱激酶α（CHKA）的过表达通过促进EGFR/mTORC2复合物的形成，增强肝癌细胞对抗EGFR药物吉非替尼和厄洛替尼的耐药性。因此，抗EGFR药物在肝癌治疗过程中产生的耐药性问题亟待研究和解决，揭开肝癌化疗耐药的分子机制，寻找和发现参与肝癌化疗耐药的关键靶点，降低其毒副作用，就成为提高化疗敏感性的重要手段。
多形性腺瘤基因(Pleomorphic adenoma gene，PLAGL) 锌指蛋白家族成员包括PLAG1、PLAGL1、PLAGL2。PLAGL1是从染色体易位的多形性腺瘤组织中克隆得到的高表达基因，在70%的多形性腺瘤中异常激活并高表达，Kas等（Kas K,et al., Promoter swappingbetween the genes for a novel zinc finger protein and β-catenin inpleiomorphic adenomas with t (3; 8)(p21; q12) translocations,Nat Genet,1997,15(2)）通过分离鉴定得到两种与PLAG1序列高度同源的编码C2H2锌指蛋白，即其家族成员PLAGL1和PLAGL2。PLAG1、PLAGL1和PLAGL2组成多形性腺瘤基因家族，以核蛋白转录调节因子的形式在调节细胞正常生理功能和多种疾病的发生发展方面发挥重要的调控作用。一些证据表明，PLAGL2与多种癌症的发展高度相关，例如PLAGL2在肺腺癌的发展中具有病理作用。研究还表明，PLAGL2与胃肠道癌的发生，发展和预后相关。此外，最近的研究结果表明，PLAGL2可以通过诱导G1向S的转变来调节肌动蛋白的细胞骨架结构，细胞迁移以及增加细胞增殖，并与白血病融合蛋白Cbfb-SMMHC协同作用促进急性髓细胞白血病（AML）的发展。但是，PLAGL2参与细胞周期调控的分子机制尚不清楚。PLAGL2在肿瘤的发生发展过程中的作用及其潜在的致癌机制目前研究还很少，PLAGL2基因及其表达产物与肿瘤的关系在学术界尚存在争议，尚未有研究发现PLAGL2基因在肝癌中的作用并基于此开发PLAGL2作为肝癌治疗、检测、诊断、药物筛选靶点的相关应用。
发明内容
为改善现有技术中存在的问题，本发明的第一方面，提供PLAGL2抑制剂在制备抗肝癌药物中的应用，所述PLAGL2抑制剂为降低肝癌细胞中PLAGL2表达水平或者阻断肝癌细胞中PLAGL2作用通路的分子或制剂。
根据本发明的实施方案，所述降低肝癌细胞中PLAGL2表达水平的分子或制剂包括HIF1/2α抑制剂，例如BAY872243、 PT2385。
根据本发明的实施方案，所述PLAGL2抑制剂为PLAGL2转录因子抑制剂。所述PLAGL2转录因子抑制剂包括基因干扰体系，例如敲低PLAGL2的慢病毒、假病毒、腺相关病毒、腺病毒或PLAGL2基因非病毒沉默体系。所述PLAGL2转录因子抑制剂包括一系列能够抑制PLAGL2表达的干扰RNA, 所述干扰RNA可以为shRNA；
根据本发明的实施方案，所述shRNA可以选自如下PLAGL2干扰序列：
正义链： 5’-3’ GUAAGAAUUACAAUACGAATT（SEQ ID NO.1），
反义链： 5’-3’ UUCGUAUUGUAAUUCUUACCG（SEQ ID NO.2）；
其中正义链的3’末端TT为两个悬挂碱基。
本发明还提供了一种靶向PLAGL2基因的干扰RNA，其正义链序列如SEQ ID NO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示。
本发明进一步提供一种基因运载系统，其包括所述干扰RNA序列和载体，载体可以是病毒载体或非病毒载体。
根据本发明的实施方案，所述病毒载体包括慢病毒、假病毒、腺病毒、腺相关病毒（AAV）、泡沫病毒、单纯疱疹病毒，抗逆转录病毒、巨细胞病毒载体，在一些实施方案中，所述载体是慢病毒载体。在一些实施方案中，所述基因运载系统包括重组载体，重组载体的构建方法包括如下步骤：合成双链带粘性末端的干扰RNA表达小片段，与载体连接，得到所述重组载体。
所述非病毒载体包括能与质粒DNA或基因编辑片段形成复合物并促进细胞内基因转移的人工合成或天然化合物。所述载体材料可以选自例如脂类、聚合物、蛋白质和多肽，在一些实施方案中，可以采用外泌体运载所述干扰RNA序列或含有干扰RNA序列的重组基因片段。
本发明进一步提供所述的靶向PLAGL2基因干扰RNA在特异性地敲低/沉默PLAGL2基因中的应用。
根据本发明的实施方案，所述干扰RNA序列在制备抗肝癌药物的应用中，还可以采用包括针注射（例如瘤内注射、脾内注射、动脉内注射、静脉内注射、门静脉内注射、肌内注射、皮下注射、口服注射、肝切缘注射等），基因枪，电穿孔，超声波处理和流体动力学（例如导管插入技术）等形式进行基因传递。
根据本发明的实施方案，所述PLAGL2抑制剂为抑制PLAGL2进入细胞核和抑制PLAGL2同下游靶基因启动子序列结合的化合物，在一些实施方式中，所述PLAGL抑制剂可以阻断PLAGL2同EGFR启动子的结合；例如，所述抑制剂为可以与EGFR启动子序列第-355—123位点结合的化合物。
根据本发明的实施方案，所述阻断肝癌细胞中PLAGL2作用通路的分子或制剂选自PI3K抑制剂LY294002、PDK-1抑制剂OSU-03012、mTORC2抑制剂KU0063794中的至少一种。
本发明的又一方面，提供一种药物组合物，包括所述PLAGL2抑制剂。根据本发明的实施方案，所述药物组合物包括所述干扰RNA，或者所述基因运载系统。
根据本发明的实施方案，所述药物组合物进一步包括EGFR抑制剂。所述EGFR抑制剂包括阿法替尼、奥希替尼、厄洛替尼、吉非替尼。优选的，所述药物组合物包含HIF1/2α抑制剂与EGFR抑制剂的组合。
本发明的另一方面，提供了一种PLAGL2基因、PLAGL2 mRNA、或PLAGL2表达产物的至少一种的应用，其特征在于，所述PLAGL2用作检测肝癌疾病的蛋白质分子标记。
根据本发明的实施方案，所述检测为检测PLAGL2基因和/或PLAGL2 mRNA在肝癌细胞组织中的表达量。所述检测PLAGL2基因和/或PLAGL2 mRNA在肝癌细胞组织中的表达量是检测在肝癌细胞组织中是否存在上调表达。
本发明的又一方面，提供PLAGL2基因、PLAGL2 mRNA、或PLAGL2表达产物的至少一种在制备检测肝癌疾病的试剂中的应用；例如制备用于肝癌疾病诊断试剂中的应用，或者在制备用于肝癌疾病预后评估试剂中的应用，或者在制备用于肝癌疗效检测试剂中的应用。
本发明的又一方面，提供了PLAGL2在检测肝癌细胞对于抗癌药物敏感性中的应用。根据所述应用，其特征在于，检测该蛋白在肝癌细胞组织中的表达量。所述检测该蛋白在肝癌细胞组织中的表达量是检测该蛋白在肝癌细胞组织中是否存在上调表达。
根据本发明的实施方案，所述抗癌药物选自EFGR抑制剂。所述EGFR抑制剂包括阿法替尼、奥希替尼、厄洛替尼、吉非替尼。
本发明的又一方面，提供一种PLAGL2在制备用于诊断和/或预后评估肝癌疾病的试剂盒中的应用。
本发明的又一方面，提供一种试剂盒，其特征在于：包括用于特异性检测PLAGL2的引物和探针。
本发明的又一方面，提供一种试剂盒用于确定肝癌疾病患者对于抗EGFR药物敏感性的方法。
本发明的又一方面，提供PLAGL2在筛选抗肝癌疾病的药物中的应用。
根据本发明的实施方案，所述肝癌疾病包括原发性肝癌、继发性肝癌。所述原发性肝癌包括肝细胞癌，肝内胆管癌，胆囊癌，肝细胞癌-肝内胆管癌混合型、纤维板层癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤和其他间叶性肝癌等。所述继发性肝癌包括来自乳腺、肺、胰腺和结直肠癌等的转移性肿瘤等。
有益效果
1）本发明的研究首次证明PLAGL2在肝癌组织中表达异常上调，阐明了PLAGL2在肝癌发病机制中的临床意义。
2）本发明进一步证实PLAGL2在肿瘤发展过程中的作用之一是通过促进生长因子和生长因子受体的表达影响细胞增殖以及发现PLAGL2通过EGFR调节HIF1 /2α的表达并揭示HCC在缺氧信号通路中的新机制。
3）本发明进一步证实PLAGL2的过表达增强了肝癌中的EGFR信号，从而促进了肝癌对EGFR靶向治疗的耐药性。而抑制PLAGL2的消除了肝癌细胞对EGFR药物厄洛替尼的抵抗性。
4）本发明证实HIF1 /2α参与对PLAGL2转录调控，证实HIF1 /2α抑制剂同EGFR抑制剂Erlotinib联用能有效的抑制肝癌发展。
附图说明
图1.PLAGL2在临床肝癌样本中高表达。(A) TCGA数据库分析显示，与正常肝组织（50例）相比，肝癌患者（372）例肝脏组织中PLAGL2表达显著上调。(B) Kaplan-Meier生存期分析PLAGL2的表达同肝癌患者生存期呈负相关。(C) 肿瘤组织中PLAGL2 mRNA水平高于癌旁组织。(D) RT-PCR检测30例配对肝癌患者癌巢及癌旁组织中PLAGL2 mRNA的表达。(E) 免疫组化检测肝癌患者癌旁组织和癌巢组织中PLAGL2的表达和分布。(F) Western-blot检测10对肝癌的癌巢和癌旁组织中PLAGL2的表达水平，P为癌旁组织，T为肿瘤组织。*** p <0.001。
图2. 体内外实验证明PLAGL2促进肝癌细胞增殖。(A) 在HCCLM3和Hep3B细胞中敲低PLAGL2后，细胞生长和集落生成数量均受到抑制。(B) 在Huh7和PLC/PRF/5细胞中过表达PLAGL2后，细胞生长和集落生成数量均出现上调。(C) 每隔三天测定HCCLM3-shNC细胞和HCCLM3-shPLAGL2细胞接种裸鼠皮下瘤生长情况，接瘤20天取瘤组织拍照，并称取肿瘤重量，Ki67和PCNA免疫组化染色结果显示，HCCLM3-shPLAGL2组接瘤小鼠肿瘤细胞增殖能力显著降低。(D) 每隔三天测定HCCLM3-zsGreen细胞和HCCLM3-PLAGL2细胞接种裸鼠皮下瘤生长情况，接瘤20天取瘤组织拍照，并称取肿瘤重量，Ki67和PCNA免疫组化染色结果显示，HCCLM3-PLAGL2组接瘤小鼠肿瘤细胞增殖能力显著上调。**p < 0.01，***p < 0.001。
图3. PLAGL2在体外和体内均可促进肝癌的转移。 (A) HCCLM3和Hep3B细胞中敲低PLAGL2显著的抑制了细胞的迁移和侵袭。(B) 在Huh-7和PLC/PRF/5细胞中过表达PLAGL2显著促进了细胞迁移和侵袭。 (C) RT-PCR检测在HCCLM3-shCtrl，HCCLM3-shPLAGL2细胞和Huh-7-zsGreen，Huh-7-PLAGL2细胞中E-Cadherin，N-Cadherin和Vimentin的mRNA水平的变化。(D) Western-blot检测在HCCLM3-shCtrl，HCCLM3-shPLAGL2细胞，Hep3B-shCtrl，Hep3B-shPLAGL2细胞，Huh-7-zsGreen，Huh-7-PLAGL2细胞和PLC/PRF/5-zsGreen, PLC/PRF/5-PLAGL2细胞中的E-Cadherin，N-Cadherin和Vimentin的蛋白水平变化。 (E)活体成像分析通过尾静脉接种HCCLM3-shCtrl和HCCLM3-shPLAGL2细胞的BALB/C裸鼠6周后肺转移情况，肺组织切片H＆E染色（比例尺为100μm），同时计算了每组中的肺转移灶数量（n = 6）。p * <0.05，**** p <0.0001。
图4. PLAGL2作为EGFR的转录调节因子。(A) GSEA富集分析HCCLM3-shPLAGL2和shCtrl RNA-seq数据的结果。(B) 通过qRT-PCR检测临床肝癌样本中PLAGL2与EGFR表达的相关性，通过Western-blot检测HCC细胞系中PLAGL2与EGFR表达的相关性。 (C) 通过qRT-PCR检测两个PLAGL2敲低HCC细胞系(HCCLM3，Hep3B-shCtrl和HCCLM3，Hep3B-shPLAGL2)和两个PLAGL2过表达HCC细胞系(Huh-7，PLC/PRF/5 zsGreen和Huh-7，PLC/PRF/5-PLAGL2)中EGFR mRNA表达水平。(D)通过Western-blot检测两个PLAGL2敲低HCC细胞系(HCCLM3，Hep3B-shCtrl和HCCLM3，Hep3B-shPLAGL2)和两个PLAGL2过表达HCC细胞系(Huh-7，PLC/PRF/5 zsGreen和Huh-7，PLC/PRF/5-PLAGL2)中EGFR蛋白表达水平。(E) 通过免疫荧光观察敲低在HCCLM3细胞中敲低PLAGL2抑制了EGFR的表达，在Huh-7细胞中过表达PLAGL2促进了EGFR的表达。(F) 分析EGFR启动子区域，分析PLAGL2同EGFR启动子区域结合位点，针对不同位点设计不同ChIP q-PCR引物， PLAGL2结合序列为GRGGC（NNNNNN）RGGK，GRGGC（NNNNNNN）RGGK和GRGGC（NNNNNNNN）RGGK，在293T和HCCLM3细胞通过荧光素酶报告基因检测PLAGL2能够激活EGFR启动子，在HCCLM3细胞中通过qChIP证明PLAGL2与EGFR启动子直接结合，免疫沉淀中分离的DNA用于PCR扩增，正常兔IgG用作阴性对照。 *** p ＜0.001。
图5. PLAGL2通过EGFR-AKT信号通路促进肝细胞癌的增殖和转移。(A) GSEA富集分析 HCCLM3-shPLAGL2与HCCLM3-shCtrl差异基因后发现差异基因主要富集到PI3K-AKT-mTOR信号通路。 (B) 将Hep3B-shCtrl和Hep3B-shPLAGL2细胞系或Huh-7-zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞系用无血清DMEM饥饿16小时，然后EGF 刺激0、15和30分钟，然后用所示抗体进行蛋白质印迹。(C) 将Huh-7-zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞系用无血清DMEM饥饿16小时后，用厄洛替尼（10μM）预处理6小时，然后EGF 处理15分钟，并通过用所示抗体进行蛋白质印迹。(D) 将Huh-7zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞系种植在96孔板中，每孔3000个细胞，并用厄洛替尼（10μM）处理48h，CCK-8检测细胞增殖，与厄洛替尼处理24小时和48小时的Huh-7zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞进行迁移和侵袭检测。(E) Huh-7-zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞系用无血清DMEM饥饿16小时后，分别用PI3K抑制剂，LY294002（10μM），mTOR抑制剂KU-0063794（10μM）或PDK1抑制剂预处理OSU-03012（5μM）6小时，EGF处理15分钟，并用所示抗体进行免疫印迹分析。（F）将Huh-7-zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞系种植在96孔板中，每孔3000个细胞，并用LY294002（10μM），KU-0063794（10μM）或PDK1抑制剂OSU-03012（5μM）处理）48h，用CCK-8检测细胞增殖，与将Huh-7-zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞系用LY294002（10μM），KU-0063794（10μM）或PDK1抑制剂OSU-03012（5μM）处理，对迁移和侵袭进行检测。 ****p <0.0001。
图6.PLAGL2-HIF-1 /2α相互调控的信号环路。（A）对HCCLM3-shPLAGL2与HCCLM3-shCtrl中的RNA-seq数据进行GSEA分析，发现差异基因富集到缺氧信号通路。（B）将三株人源HCC细胞系在1% O2中处理24小时，qRT-PCR检测HIF-1α和PLAGL2的mRNA水平显著增加，将三株人源HCC细胞系在1% O2分别为处理2h，4h和6h，Western-blot检测HIF-1α和PLAGL2的蛋白水平以时间依赖性显著增加。 (C) 在1% O2 环境中，BAY-872234（10μM）和PT2385（10μM）处理三株人源HCC细胞24小时，Western-blot检测HIF1α，HIF2α和PLAGL2的蛋白表达。(D)Huh-7和HCCLM3细胞稳定敲低HIF1α或稳定敲低HIF2α在20%O2或1%O2中处理24h，Western-blot检测HIF1α，HIF2α和PLAGL2的蛋白表达。（E）PLAGL2启动子的片段。通过qRT-PCR检测到PLAGL2启动子不同区域的富集，与HIF1 /2α共有结合位点为ACGTG，GCGTG。将HCCLM3细胞通过1% O2或20% O2处理，qChIP分析HIF1α/2α与PLAGL2启动子的结合位点。从免疫沉淀物中分离的DNA用于PCR扩增，正常兔IgG用作阴性对照。(F) 在1% O2条件下，Western-blot检测PLAGL2敲低的HCC细胞系（HCCLM3-shCtrl和shPLAGL2）和PLAGL2过表达的HCC细胞系（Huh-7-zsGreen和PLAGL2）中的HIF1α/2α表达。将Huh-7-zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞系在1% O2条件下，无血清DMEM饥饿16小时后，用EGFR抑制剂厄洛替尼（10μM）预处理6小时，然后EGF刺激6小时，用所示抗体进行蛋白质印迹检测。 **** p <0.0001。
图7.抑制PLAGL2的表达促进HCC对EGFR抑制剂的敏感性。(A) Huh-7细胞接种于96孔板，每孔3000个细胞，用厄洛替尼(10μM)处理48h后，检测细胞活力，计算抑制率(%)，用10μM的厄洛替尼处理Huh-7细胞24小时和48小时，进行迁移和侵袭试验，计算抑制率(%)。(B)克隆形成实验。用不同梯度浓度的厄洛替尼处理细胞48h，然后培养14d，进行克隆形成试验，固定、染色，计算抑制率(%)。 (C) HCCLM3-shCtrl和HCCLM3-shPLAGL2细胞 (2×106)分别接种于6周龄雄性BALB/C裸鼠右前肢皮下进行体内移植瘤试验，当肿瘤体积达到约100mm3时，每隔2天测量肿瘤生长情况，然后给予溶剂对照和厄洛替尼(40 mg/kg/d)。(D,E)第16天处死小鼠，取瘤组织拍照，并称取肿瘤重量。(F) 免疫组化检测肿瘤组织中Ki67、PCNA和PLALGL2的表达。* p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。
图8. PLAGL2表达与厄洛替尼临床疗效的相关性。(A) 厄洛替尼PDX给药示意图。（B）PDXs给予溶剂对照或厄洛替尼（40mg/kg），免疫组化Ki67和PCNA染色结果显示PLAGL2低表达的PDXs中肿瘤细胞增殖下降。（C）PLAGL2免疫组化染色评分 vs（ki67/PCNA）抑制率统计图。（D）PLAGL2通过EGFR激活Akt介导的肝癌增殖、转移和厄洛替尼不敏感的机制示意图。
图9. （A）示意PLAGL2在胆管癌癌巢中显著高表达；（B）示意与对照细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制HCCC9810细胞的增殖；（C）与对照细胞相比，过表达PLAGL2显著促进REB细胞的增殖；（D、E）与对照组细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制了裸鼠皮下瘤的增长。
图10. （A）示意PLAGL2在胆囊癌癌巢中显著高表达；（B）示意与对照细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制GBC-SD细胞的增殖；（C）与对照细胞相比，过表达PLAGL2显著促进GBC-SD细胞的增殖；（D、E）与对照组细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制了裸鼠皮下瘤的增长。
图11.（A，B）示意厄洛替尼同2ME联用能显著的抑制皮下瘤增殖；（C）示意厄洛替尼同2ME联用对于皮下瘤重量的影响；（D）示意HE染色结果；（E）示意Ki67免疫组化染色结果。
图12.GEO数据库分析PLAGL2在HCC中的表达。（A）GSE10143，（B）GSE25097，（C）GSE14520，（D）GSE76472，（E）GSE45436，（F）用KMplot对肝癌患者进行Kaplan-Meier生存期分析
图13. (A) RT-PCR和Western-blot验证肝癌细胞(HCCLM3、Hep3B、T1115、PLC/PRF/5、Huh-7)中PLAGL2稳定敲低。(B) RT-PCR和Western-blot验证肝癌细胞肝癌细胞(HCCLM3、T1115、PLC/PRF/5、Huh-7)中PLAGL2稳定过表达。(C)T1115细胞敲低PLAGL2，细胞生长和克隆形成数量均受到抑制。(D) HCCLM3细胞过表达PLAGL2后，细胞生长和克隆形成数量均上调。(E) T1115细胞中过表达PLAGL2后，细胞生长和克隆形成数量均上调。*p<0.001。
图14.敲低PLAGL2促使肝癌细胞周期阻滞于G0/G1期。(A,B) 流式检测在HCCLM3和T1115细胞中稳定敲低PLAGL2后细胞周期的变化。(C,D) RT-PCR检测细胞中CDK4、CDK6和Cyclin D1 mRNA表达水平。(E,F) Western-blot检测CDK4、CDK6和CyclinD1蛋白表达水平。**p<0.01，*p<0.001。
图15.PLAGL2与EGFR表达的关联性。(A) GEPIA数据库分析 (GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/) PLAGL2与EGFR的关联性。(B) qRT-PCR和Western-blot检测在T1115细胞中敲低PLAGL2抑制EGFR mRNA和蛋白的表达。(C) qRT-PCR和Western-blot检测在HCCLM3和T1115中过表达PLAGL2促进EGFR mRNA和蛋白的表达。(D) EGF刺激Huh-7-zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞0、15和30分钟，流式检测膜表面EGFR的表达。(E) EGF刺激Huh-7-zsGreen和Huh-7-PLAGL2细胞0、15分钟，激光共聚焦显微镜观察EGFR的分布，比例尺=20μm。 ** p <0.01，*** p <0.001。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实验材料：HCCLM3、Huh7、hep3B、PLC/PRF/5、HCCC9810、REB、GBC-SD细胞购自中科院上海细胞所，T1115细胞由陆军军医大学提供；慢病毒载体构建和病毒包装由上海吉玛制药技术有限公司完成。本研究小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司。
缩写说明：PLAGL2，多形腺瘤基因like-2； RTKs，酪氨酸激酶受体； EGF，表皮生长因子； EGFR，表皮生长因子受体； HIF，缺氧诱导因子； EMT，上皮-间质转化； PI3K，磷酸肌醇3-激酶； mTORC，雷帕霉素复合物的机制靶标； PDK1，磷酸肌醇依赖性激酶-1； HCC，肝细胞癌； PDX，患者来源的异种移植物； ChIP，染色质免疫共沉淀； qRT-PCR，实时定量聚合酶链反应； CCK-8，细胞计数试剂盒-8；IHC，免疫组化; shRNA，短发夹RNA。
生物实施例1 PLAGL2在肝癌组织中具有高表达
TCGA 数据库分析同正常肝组织相比PLAGL2在肝癌中表达水平显著升高（P <0.001, 图1A）。GEO数据库（GSE10143, GSE54236, GSE25097, GSE14520, GSE76472,GSE45436）分析PLAGL2在肝癌中的表达要显著高于正常肝组织，在GSE45436数据库中，我们发现PLAGL2在年轻肝癌患者（<40岁）中表达显著升高（图12 A-F）。生存期分析发现PLAGL2与病人的生存期呈负相关（P<0.05，图1B）。 Kaplan-Meier分析PLAGL2表达同肝癌的生存期呈负相关（图1B）。为了验证数据库分析结果，我们收集临床肝癌患者癌旁（n=33）、癌巢（n=34）样本，以及临床血管瘤患者的肝组织样本（n=10）作为正常肝组织对照。通过RT-PCR的方法检测PLAGL2的表达水平，结果表明，PLAGL2在癌巢组织中的表达水平显著高于癌旁和正常肝组织（图1C）。检测30对配对的临床肝癌患者的癌旁和癌巢组织中PLAGL2的mRNA表达水平发现，患者癌巢组织中PLAGL2的表达水平要显著高于癌旁（图1D）。通过免疫组化的方法检测临床肝癌样本中PLAGL2在癌巢和癌旁的表达水平及分布情况，结果表明，PLAGL2在癌巢组织中的表达水平显著高于癌旁组织（图1E）。通过Western blot的方法检测10对配对的临床肝癌患者的癌旁和癌巢组织，结果表明，PLAGL2在患者癌巢组织中的表达要显著高于癌旁。综上所述，数据库和临床样本分析显示PLAGL2的表达与肝癌的发生发展和预后密切相关。
生物实施例2 PLAGL2对体内外肝癌的增殖促进作用
PLAGL2表达与临床肝癌密切相关，因此，我们研究PLAGL2在肝癌发展过程中是否起着重要作用。构建HCCLM3、Hep3B和T1115稳定敲低PLAGL2细胞株，构建Huh-7、PLC/PRF/5和T1115稳定过表达PLAGL2的细胞株，通过RT-PCR和Western blot验证PLAGL2敲低和过表达效果（图13A，B）。在构建敲低PLAGL2体系时，采用了本发明设计的PLAGL2干扰序列：
正义链： 5’-3’ GUAAGAAUUACAAUACGAATT
反义链： 5’-3’ UUCGUAUUGUAAUUCUUACCG。
稳定敲低PLAGL2的细胞株的构建方法如下：以HCCLM3细胞为例，通过基因合成制备上述PLAGL2干扰序列，连接到商品化干扰载体（购自上海吉玛制药有限公司，为商品化慢病毒包装载体LV16穿梭质粒）中，通过慢病毒包装体系包装慢病毒，把慢病毒加入到HCC细胞中，通过嘌呤霉素进行两周筛选，得到稳定敲低PLAGL2的HCCLM3细胞株。
我们检测了PLAGL2表达对细胞增殖和克隆形成的影响，结果显示，与对照细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制HCCLM3, Hep3B和T1115细胞的增殖和克隆形成（图2A，图13C）。与对照细胞相比，过表达PLAGL2显著促进Huh7、PLC/PRF/5、HCCLM3和T1115细胞的增殖和克隆形成。（图2B，图13D,E）。以上结果表明PLAGL2在体外可以促进肝癌细胞增殖。
为了验证PLAGL2在体内对肝癌细胞增殖的影响，我们通过裸鼠皮下瘤试验验证敲低或过表达PLAGL2对肝癌细胞成瘤能力的影响。通过检测肿瘤生长曲线，肿瘤体积和皮下瘤重量，我们发现与对照组细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制了裸鼠皮下瘤的增长。免疫组化显示PLAGL2、Ki67和PCNA表达显著降低（图2C）。通过检测肿瘤生长曲线，肿瘤体积和皮下瘤重量，我们发现与对照组细胞相比，PLAGL2过表达显著促进了皮下瘤的增长。免疫组化显示PLAGL2、Ki67和PCNA表达显著上调（图2D）。综述所述，体内外试验结果表明PLAGL2在肝癌细胞增殖过程中起着重要的作用。
为了研究PLAGL2促进增殖作用的机制，通过流式分析了PLAGL2对肝癌细胞周期的影响。结果显示，稳定敲低PLAGL2显著增加G0/G1期细胞比例，降低了G2/M期细胞比例（图14A,B）。鉴于细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）在G1/S转换过程中起重要作用，我们对稳定过表达和敲低PLGAL2的肝癌细胞株进行细胞周期相关蛋白的检测。结果显示，敲低PLAGL2后CDK4/6和Cyclin D1表达水平显著下降（图14C,E），过表达PLAGL2后CDK4/6和Cyclin D1表达水平显著上调（图14D,F）。综上所述，PLAGL2通过调节Cyclin D1的表达促进肝癌细胞增殖。
生物实施例3 PLAGL2促进HCC转移
体外小室迁移和侵袭试验显示HCCLM3-shPLAGL2和Hep3B-shPLAGL2迁移和侵袭细胞数显著低于对照组，同时Huh7-PLAGL2和PLC/PRF/5-PLAGL2的迁移和侵袭细胞数显著高于其对照组（图3A,B）。通过体外实验，RT-PCR及WB证明PLAGL2敲低后能够下调N-Cadherin和Vimentin的表达，过表达PLAGL2后能上调N-Cadherin和Vimentin的表达（图3C,D）。构建尾静脉肺转移模型，35天后通过活体成像观察发现敲低PLAGL2后抑制了肝癌细胞的肺转移（图3E）。这些结果均能够表明，PLAGL2在HCC的迁移和侵袭中起着重要的作用。
生物实施例4 PLAGL2参与EGFR的转录调控
EGFR在40%-70%的人类肝癌样本中高表达，在细胞生长调控中起关键的作用。对在HCCLM3细胞稳定敲低PLAGL2后差异基因进行富集分析显示，PLAGL2参与酪氨酸激酶受体信号通路、细胞周期相关通路和EGFR信号通路的传导（图4A）。我们研究了EGFR和PLAGL2在临床肝癌患者肿瘤样本以及相关肝癌细胞系中表达的关联性，发现PLAGL2与EGFR的表达呈正相关（图4B，图15A）。我们研究了PLAGL2对EGFR表达的影响，发现抑制PLAGL2的表达可以显著降低EGFR的转录和蛋白表达水平，而PLAGL2过表达显著增加EGFR转录和蛋白表达水平（图4C,D，图15B,C）。我们还通过免疫荧光检证明过表达PLAGL2能够促进EGFR的表达（图4E）。已有报道PLAG家族可通过与含GRGGG(N)6-8 RGGK片段的共有序列结合来激活转录。如图4F所示，我们分析了EGFR启动子区域序列（从翻译起始点-2000到+1），发现EGFR启动子区域有14个PLAG共有结合位点。为了确定PLAGL2是否能直接激活EGFR的表达，在293T细胞和HCCLM3细胞中转染带有EGFR启动子的荧光素酶报告基因， PLAGL2对该报告基因的激活作用明显高于对照组。为验证PLAGL2与这些位点的结合，我们在HCCLM3细胞中进行了染色质免疫共沉淀分析，PCR引物序列位置信息如图4F所示（P1，P2，P3，P4），检测结果显示EGFR启动子位点-355--123与PLAGL2特异性结合。这些结果表明PLAGL2直接与EGFR启动子结合，参与对EGFR的转录调控。我们进一步通过流式检测EGFR在肝癌细胞膜表面的表达，未经EGF处理的过表达PLAGL2细胞的细胞膜EGFR阳性细胞率高于对照细胞（92.8%vs78.2%）。经EGF刺激后，过表达PLAGL2细胞的细胞膜EGFR阳性细胞率也高于对照细胞（图15D）。已知内吞途径参与介导EGFR表达的下调。EGF诱导EGFR二聚化并内化到细胞质，通过免疫荧光观察EGFR的膜定位，发现过表达PLAGL2显著的抑制了EGFR的内陷（图15E）。综上所述，PLAGL2在EGFR调控中起着关键作用。
生物实施例5 PLAGL2通过EGFR-AKT信号通路促进HCC的增殖和转移
对HCCLM3-shPLAGL2和 HCCLM3-shCtrl细胞进行RNA sequence分析，GSEA富集分析发现差异基因主要富集在PI3K-AKT-mTOR信号通路。通过检测EGF刺激PLAGL2敲低或过表达细胞株下游信号分子，发现p-EGFR，p-AKT308，p-AKT473在PLAGL2敲低细胞株中表达下调，在PLAGL2过表达细胞株中表达上调，但p-ERK1/2并无显著差异。表明AKT相关信号通路是PLAGL2介导HCC增殖和转移的重要通路，而不是ERK1/2相关信号通路。Erlotinib显着抑制了PLAGL2对下游AKT信号通路的活化（图5C）。Erlotinib能够抑制PLAGL2促进肝癌细胞的增殖和转移（图5D）。表明PLAGL2主要通过EGFR-AKT信号通路促进肝癌细胞的增殖和转移。
为了探索活化AKT上游信号通路的具体调节因子，我们发现PI3K抑制剂LY294002能够抑制PLAGL2对AKT Thr308和Ser473的磷酸化，PDK-1抑制剂OSU-03012抑制了PLAGL2对AKT Thr308的磷酸化，mTORC2抑制剂KU0063794抑制了PLAGL2对AKT S473的磷酸化（图5E）。三种抑制剂都能显著的抑制PLAGL2促进肝癌细胞增殖和转移（图5F）。
综上所述，这些结果证明了PLAGL2通过EGFR-PI3K-PDK1轴活化AKT Thr308，通过EGFR-PI3K-mTORC2轴活化AKT Ser473。
生物实施例6 缺氧通过HIF上调PLAGL2
通过对HCCLM3-shPLAGL2与HCCLM3-shCtrl中的RNA-seq数据进行了GSEA分析，发现差异基因富集到缺氧信号通路（图6A）。RT-PCR检测缺氧（1％O2持续24 h）在HCCLM3，Huh-7和PLC / PRF/5中显著上调PLAGL2 mRNA水平，Western-blot检测显示由缺氧以时间依赖性方式促进PLAGL2的蛋白表达（图6B）。这些数据表明缺氧能够促进HCC细胞中PLAGL2转录和蛋白水平的表达。为了确定缺氧条件下HIF是否介导PLAGL2表达，BAY872243是HIF1α抑制剂，PT2385是HIF2α的特异性拮抗剂。用BAY-872243或PT2385处理Huh-7，HCCLM3和PLC/PRF/5细胞可阻断缺氧诱导的PLAGL2表达，BAY-872243比PT2385具有更强的阻断能力（图6C）。在Huh7和HCCLM3细胞中稳定敲低HIF-1α和HIF-2α，在常氧条件下，敲低HIF-2α后，PLAGL2表达显著抑制，但敲低HIF-1α并能不显著抑制PLAGL2表达。在缺氧条件下，敲低HIF-2α不能显著抑制PLAGL2表达，但敲低HIF-1α能显著的抑制PLAGL2的表达。为了确定HIF-1 /2α是否直接与PLAGL2的启动子结合，进行了染色质免疫沉淀（ChIP）试验，5'-(A/G)CGTG-3'是HIF保守的结合位点，如图6E所示，分析了启动子（从翻译起始位点到-2000到+1），该区域具有6个HIF结合位点，在缺氧条件下， HIF1α抗体能够结合PLAGL2转录起始位点（TSS）前376 bp片段， HIF-2α抗体能够结合PLAGL2 TSS前690 和508 bp片段，在常氧状态下，HIF-1α抗体不能结合PLAGL2启动子序列，HIF-2α的抗体能够结合PLAGL2 TSS前690 和508 bp片段。在缺氧条件下，在HCCLM3细胞中敲低PLAGL2时，HIF1α和HIF-2α的表达显着降低，在Huh-7细胞中过表达PLAGL2则显着增加了HIF-1α和HIF-2α的表达。EGFR抑制剂厄洛替尼抑制了PLAGL2对HIF-1α和HIF-2α的调控（图6F）。以上结果表明HIF-1 /2α直接与PLAGL2启动子结合促进PLAGL2转录，PLAGL2通过EGFR调控HIF-1 /2α表达。证明了在肝癌中缺氧介导的PLAGL2-HIF-1/2α信号环路。
生物实施例7 PLAGL2过表达抑制肝癌对EGFR药物的敏感性
用EGFR小分子激酶抑制剂处理PLAGL2过表达和敲低细胞系。细胞增殖、迁移和侵袭试验结果表明与对照组细胞相比，PLAGL2过表达细胞对厄洛替尼治疗表现出更强的抵抗性（图7A）。克隆形成试验表明PLAGL2过表达细胞对厄洛替尼表现出更强的抵抗性（图7B）。我们将HCCLM3-shCtrl和HCCLM3-shPLAGL2接种裸鼠皮下，通过体内实验证明敲低PLAGL2增加肝癌细胞对厄洛替尼治疗的敏感性。在接种瘤细胞后，所有动物在第十天都长出了肿瘤，开始给予厄洛替尼治疗，敲低PLAGL2的肿瘤对厄洛替尼给药治疗更加敏感，该组的肿瘤体积和重量是所有实验组中最小的（图7C,D,E）。免疫组化Ki67和PCNA染色结果显示，敲低PLAGL2能够和厄洛替尼协同抑制肝癌细胞增殖（图7F）。总之，我们发现PLAGL2敲低可以提高肝癌细胞对EGFR抑制剂的敏感性。
为进一步证实PLAGL2/EGFR途径在厄洛替尼治疗中的临床意义，我们建立了患者来源的异种移植瘤（PDX）模型，并进行七天的厄洛替尼给药治疗。结果发现，在高表达PLAGL2的PDXs中，肿瘤细胞对厄洛替尼具有更强的抵抗性。在低表达PLAGL2的PDXs中，与溶剂对照组相比，厄洛替尼几乎完全抑制了肿瘤细胞的生长（图8A,B,C）。综上所述，肝癌患者PLAGL2的表达水平可作为是否对厄洛替尼应答的生物标记物。
生物实施例8 PLAGL2对体内外胆管癌的增殖促进作用
PLAGL2表达与临床胆管癌密切相关，PLAGL2在胆管癌癌巢中显著高表达（图9A）。因此，本发明进一步研究PLAGL2在胆管癌发展过程中是否起着重要作用。构建HCCC9810敲低PLAGL2细胞株，构建REB稳定过表达PLAGL2的细胞株，在构建敲低PLAGL2体系时，采用了本发明设计的PLAGL2干扰序列：
正义链： 5’-3’ GUAAGAAUUACAAUACGAATT
反义链： 5’-3’ UUCGUAUUGUAAUUCUUACCG，得到了稳定敲低的PLAGL2体系。
我们检测了PLAGL2表达对细胞增殖的影响，结果显示，与对照细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制HCCC9810细胞的增殖（图9B）。与对照细胞相比，过表达PLAGL2显著促进REB细胞的增殖（图9C）。以上结果表明PLAGL2在体外可以促进胆管癌细胞增殖。
为了验证PLAGL2在体内对胆管癌细胞增殖的影响，我们通过裸鼠皮下瘤试验验证敲低PLAGL2对胆管癌细胞成瘤能力的影响。通过检测肿瘤生长曲线和皮下瘤重量，我们发现与对照组细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制了裸鼠皮下瘤的增长（图9D,E）。综述所述，体内外试验结果表明PLAGL2在胆管癌细胞增殖过程中起着重要的作用。
生物实施例9 PLAGL2对体内外胆囊癌的增殖促进作用
PLAGL2表达与临床胆囊癌密切相关，PLAGL2在胆囊癌癌巢中显著高表达（图10A）。因此，我们研究PLAGL2在胆囊癌发展过程中是否起着重要作用。构建GBC-SD敲低PLAGL2细胞株，构建GBC-SD稳定过表达PLAGL2的细胞株，在构建敲低PLAGL2体系时，采用了本发明设计的PLAGL2干扰序列：
正义链： 5’-3’ GUAAGAAUUACAAUACGAATT
反义链： 5’-3’ UUCGUAUUGUAAUUCUUACCG，得到了稳定敲低的PLAGL2体系。
我们检测了PLAGL2表达对细胞增殖的影响，结果显示，与对照细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制GBC-SD细胞的增殖（图10B）。与对照细胞相比，过表达PLAGL2显著促进GBC-SD细胞的增殖（图10C）。以上结果表明PLAGL2在体外可以促进胆囊癌细胞增殖。
为了验证PLAGL2在体内对胆囊癌细胞增殖的影响，我们通过裸鼠皮下瘤试验验证敲低PLAGL2对胆囊癌细胞成瘤能力的影响。通过检测肿瘤生长曲线和皮下瘤重量，我们发现与对照组细胞相比，敲低PLAGL2显著抑制了裸鼠皮下瘤的增长（图10D,E）。综上所述，体内外试验结果表明PLAGL2在胆囊癌细胞增殖过程中起着重要的作用。
生物实施例10 EGFR抑制剂厄洛替尼同HIF1/2α抑制剂(二甲氧基雌二醇，2-Methoxyestradiol，2ME) 联用有效的抑制HCC增殖
我们发现HIF1/2α参与对PLAGL2转录调控，PLAGL2参与对EGFR转录调控，由于EGFR抑制剂厄洛替尼对肝癌治疗效果不佳，HIF1/2α抑制剂能显著的抑制PLAGL2表达，我们通过体内试验验证EGFR抑制剂厄洛替尼同HIF1/2α抑制剂2-Me联用能否有效的抑制肝癌细胞的增殖，设计四种给药组（溶剂对照组Ctrl组，厄洛替尼单独给药组，2ME单独给药组和厄洛替尼和2ME联合给药组，通过裸鼠皮下瘤给药试验发现厄洛替尼同2ME联用能显著的抑制皮下瘤增殖（图11A，B），皮下瘤重量显著降低（图11C）。HE染色显示厄洛替尼和2ME联合给药组肿瘤坏死增多（图11D），Ki67免疫组化染色结果显示，厄洛替尼和2ME联合给药组小鼠肿瘤细胞增殖能力显著下调（图11E）。综上所述，体内试验证明厄洛替尼和2ME联合给药能有效的抑制肝癌细胞增殖。
以上，对本发明示例性的实施方式进行了说明。但是，本发明的保护范围不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> PLAGL2及其在肝癌中的应用
<141> 2020-01-21
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
guaagaauua caauacgaat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
uucguauugu aauucuuacc g 21

Claims (2)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含HIF1/2α抑制剂与EGFR抑制剂的组合，所述HIF1/2α抑制剂选自二甲氧基雌二醇，所述EGFR抑制剂选自厄洛替尼。
2.根据权利要求1的药物组合物在制备抗肝癌药物中的用途。
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