CN115177618A - Flt3抑制剂在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了一种FLT3抑制剂(Sitravatinib)在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。Sitravatinib可靶向结合FLT3‑ITD，抑制FLT3‑ITD及其耐药突变FLT3‑ITD‑TKD的激酶活性，从而展现出对FLT3‑ITD及其突变FLT3‑ITD‑TKD阳性的急性髓系白血病的良好治疗效果。本发明的Sitravatinib对比AC220，Gilteritinib治疗FLT3‑ITD具有优势治疗作用以及对AC220，Gilteritinib耐药的FLT3‑ITD‑TKD突变细胞具有优势治疗作用，表现出很好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种FLT3抑制剂(Sitravatinib)在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
背景技术
急性髓细胞白血病(AML)是造血祖干细胞的恶性克隆性疾病。AML是成人最常见的急性白血病，发病率及死亡率均非常高。目前，强化化疗和异基因造血干细胞移植是其主要治疗手段，然而，AML的预后很差，成人患者的5年生存率只有约20％。AML患者中最常见的突变为FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)基因突变，约30％AML病例发生FLT3突变，FLT3属于III型受体酪氨酸激酶家族成员，在许多造血祖细胞的表面表达，FLT3信号对造血干祖细胞的正常发育至关重要。内部串联重复(ITD)是最常见的FLT3突变类型(FLT3-ITD；约占所有AML的25％)，另外约有7-10％的患者存在FLT3酪氨酸激酶域突变(FLT3-TKD)。这两种形式的突变都可以导致FLT3的异常激活并引起STAT5、PI3K和MAPK多个胞内信号通路的异常激活，这些信号通路的激活可以促进AML细胞的增殖或者抑制AML细胞凋亡。FLT3-ITD与AML患者的不良预后密切相关，因此，靶向FLT3-ITD是一种可行的AML治疗方式。目前已经开发出许多FLT3抑制剂，其中索拉非尼(sorafenib)、奎扎替尼(AC220)、吉瑞替尼(Gilteritinib)已经被批准在临床使用。尽管FLT3抑制剂在FLT3-ITD阳性AML患者的临床治疗上可产生较好的治疗效果，但大多数患者在治疗后的几个月至一年内容易出现耐药进而导致疾病复发和进展。FLT3-TKD区域的继发突变如D835位点突变(D835F/H/V/Y)，F691L，Y842C是FLT3抑制剂耐药、复发的重要原因，其中F691L突变是目前所有临床使用的FLT3抑制剂都无法克服的耐药突变，被称之为“守门人突变”。因而，开发新的可以克服FLT3-ITD-TKD耐药突变的FLT3-ITD靶向抑制剂是非常有意义的。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种FLT3抑制剂(Sitravatinib)在制备治疗急性髓系白血病药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供了一种FLT3抑制剂或其药学上可接受的盐在制备因FLT3-ITD激酶或FLT3-ITD-TKD突变型激酶异常激活而导致的疾病的药物中的应用，所述FLT3抑制剂为Sitravatinib。
Sitravatinib(MGCD516,MG-516)是一种新型的、靶向多种激酶的FLT3抑制剂，包括c-Kit，PDGFRβ，PDGFRα，c-Met和Axl。Sitravatinib在非小细胞肺癌、黑色素瘤、肉瘤等实体瘤的治疗中都显示出较好的治疗效果。经过实验可得，本发明的Sitravatinib可以治疗因FLT3-ITD激酶或FLT3-ITD-TKD突变型激酶异常激活而导致的疾病，尤其是FLT3-ITD及FLT3-ITD-TKD耐药突变阳性的急性髓系白血病。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述疾病包括急性髓系白血病。
Sitravatinib可靶向结合FLT3-ITD，抑制FLT3-ITD及其耐药突变FLT3-ITD-TKD的激酶活性，从而展现出对FLT3-ITD及其突变FLT3-ITD-TKD阳性的急性髓系白血病的良好治疗效果。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述FLT3-ITD-TKD突变型激酶包括FFLT3-ITD-F691L、FLT3-ITD-Y842C中的至少一种。
作为本发明所述应用的优选实施方式，在动物给药时，所述Sitravatinib的有效剂量为10-30mg/kg/d，优选为30mg/kg/d。
本发明还提供了Sitravatinib在抑制携带FLT3-ITD-TKD突变型激酶的细胞株的增殖、促进携带FLT3-ITD-TKD突变型激酶的细胞株凋亡中的应用。
本发明还提供了Sitravatinib在制备抑制FLT3-ITD-TKD突变型激酶引起的FLT3信号通路的活化药物中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述细胞株包括MOLM-13、MV-4-11、BaF3-FLT3-ITD--F691L、BaF3-FLT3-ITD-Y842C细胞中的至少一种。
在本发明中，Sitravatinib对FLT3-ITD AML细胞系的增殖抑制作用优于Gilteritinib。Sitravatinib显著促进MOLM-13、MV4-11的凋亡，且比现有临床药物Gilteritinib有显著优势。同时，Sitravatinib可抑制FLT3的磷酸化及其调控的下游信号通路活化。Sitravatinib能显著抑制MOLM-13、MV-4-11及BaF3-FLT3-ITD细胞内的P-FLT3、P-stat5、P-AKT及P-ERK蛋白表达。
通过流式细胞术检测周期实验发现，Sitravatinib对FLT3-ITD AML细胞系MOLM-13、MV-4-11的周期抑制作用显著强于Gilteritinib。Sitravatinib以浓度依赖的方式显著抑制MV4-11、MOLM-13细胞的周期，且比Gilteritinib有显著的优势。
本发明还提供了一种FLT3-ITD激酶或FLT3-ITD-TKD突变型激酶的靶向抑制剂，所述靶向抑制剂包括Sitravatinib。
Sitravatinib可靶向结合FLT3-ITD，抑制FLT3-ITD激酶或FLT3-ITD-TKD突变型激酶活性，进而有效治疗急性髓系白血病。
另外，本发明还提供了一种治疗急性髓系白血病的药物组合物，所述药物组合物包括所述的靶向抑制剂和其他能抑制FLT3-ITD激酶或FLT3-ITD-TKD突变型激酶活性的药物。
作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物的制剂形式包括片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、注射液、脂质体或气雾剂中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
Sitravatinib可靶向结合FLT3-ITD，抑制FLT3-ITD及其耐药突变FLT3-ITD-TKD的激酶活性，从而展现出对FLT3-ITD及其突变FLT3-ITD-TKD阳性的急性髓系白血病的良好治疗效果。本发明的Sitravatinib对比AC220，Gilteritinib治疗FLT3-ITD具有优势治疗作用以及对AC220，Gilteritinib耐药的FLT3-ITD-TKD突变细胞具有优势治疗作用，表现出很好的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1中的不同细胞经不同浓度的Sitravatinib处理48小时后通过CellTilterGlo实验检测细胞增殖情况结果图；
图2为MV4-11细胞经浓度梯度的Sitravatinib、Gilteritinib处理48小时后使用Annexin V-APC/PI凋亡试剂盒和流式细胞术检测细胞凋亡情况结果图。
图3为MOLM-13细胞经浓度梯度的Sitravatinib、Gilteritinib处理48小时后使用Annexin V-APC/PI凋亡试剂盒和流式细胞术检测细胞凋亡情况结果图。
图4为MOLM-13、MV-4-11细胞经浓度梯度的Sitravatinib处理48小时后westernbot检测PARP1、cleavaged-PARP1、Caspase8、cleavaged-Caspase8蛋白的表达结果图，tubulin为内参蛋白；
图5为MOLM-13、MV-4-11细胞经浓度梯度的Sitravatinib处理4小时后westernbot检测p-FLT3/FLT3、P-stat5/stat5、P-AKT/AKT、P-ERK/ERK蛋白的表达结果图，tubulin为内参蛋白；
图6为Sitravatinib靶向结合FLT3-ITD蛋白的结果图；图6-A、图6-B为：BaF3-FLT3-ITD细胞经DMSO对照组、1μM/mL Sitravatinib处理1小时后收集细胞蛋白裂解液经不同温度梯度的CETSA实验处理后western bot检测FLT3蛋白的变化。图6-C、图6-D为BaF3-FLT3-ITD细胞经不同浓度梯度的Sitravatinib处理1小时后收集细胞蛋白裂解液经相同温度(53℃)的CETSA实验处理后western bot检测FLT3蛋白变化。
图7为实施例4中Sitravatinib显著延长BaF3-FLT3-ITD白血病模型小鼠的生存时间结果图；图7-A：对照组小鼠开始死亡时停止给药，统计各组小鼠的生存期。图7-B：建模后11天后流式检测外周血细胞白血病的白血病细胞比例。图7-C：建模后12天后从每组小鼠中分别随机取三只小鼠取其脾脏及骨髓，流式检测白血病细胞的浸润情况。图7-D：itravatinib治疗组的小鼠脾脏的拍照图。
图8为Sitravatinib显著延长FLT3-ITD-F691L白血病模型小鼠的生存时间结果图；图8-A：对照组小鼠开始死亡时停止给药，统计对照组、AC220组(10mg/kg/d)、Gilteritinib组(30mg/kg/d)和Sitravatinib组(30mg/kg/d)四组小鼠的生存期。图8-B：治疗9天后流式检测各组小鼠外周血中白血病细胞的负荷图；图8-C：每组小鼠中分别随机取三只小鼠取其脾脏及骨髓流式检测白血病细胞的浸润情况，同时进行脾脏拍照及称重；图8-D：将小鼠脾脏进行伊红(H&E)染色，镜下观察白血病细胞的浸润情况图。
图9为实施例5中Sitravatinib对携带耐药突变的BaF3-FLT3-ITD-TKD细胞具有显著的增殖抑制作用的结果图；图9-A为BaF3-FLT3-ITD、BaF3-FLT3-ITD-D835Y、BaF3-FLT3-ITD-D835V、BaF3-FLT3-ITD-D835F、BaF3-FLT3-ITD-F691L、BaF3-FLT3-ITD-Y842C、BaF3+IL3细胞分别经不同浓度的Sitravatinib处理48小时后用Cell TilterGlo检测细胞增殖情况。图9-B为AC220、Gilteritinib、Sitravatinib对BaF3-FLT3-ITD-D835Y、BaF3-FLT3-ITD-D835V、BaF3-FLT3-ITD-D835F、BaF3-FLT3-ITD-F691L、BaF3-FLT3-ITD-Y842C细胞增殖抑制的IC50。图9-C为BaF3-FLT3-ITD、BaF3-FLT3-ITD-F691L、BaF3-FLT3-ITD-Y842C、BaF3-FLT3-ITD-D835V细胞经浓度梯度的Sitravatinib处理4小时后western bot检测P-FLT3/FLT3、P-stat5/stat5、P-AKT/AKT、P-ERK/ERK蛋白的表达图，tubulin为内参蛋白。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
细胞处理：
MOLM-13、MV-4-11、HL60、NB4、SKNO-1、OCI-AML2、OCI-AML3、U937、BaF3-FLT3-ITD、BaF3-FLT3-ITD-D835Y、BaF3-FLT3-ITD-D835V、BaF3-FLT3-ITD-D835F、BaF3-FLT3-ITD-F691L、BaF3-FLT3-ITD-Y842C细胞均培养在含10％FBS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI-1640培养基中培养，放置于37℃、含有5％CO2的恒温培养箱中。AC220、Gilteritinib、Sitravatinib均用DMSO为溶剂配置成浓度为10mM并置于-20℃保存。FLT3配体用灭菌水为溶剂配制成浓度为20ng于-80℃保存。
实施例1、Sitravatinib显著抑制FLT3-ITD阳性的细胞株的增殖，促进其凋亡，并抑制其FLT3信号通路的活化
Sitravatinib(MGCD516,MG-516)是一种新型的、靶向多种激酶的FLT3抑制剂，包括c-Kit,PDGFRβ，PDGFRα，c-Met和Axl。Sitravatinib在非小细胞肺癌、黑色素瘤、肉瘤等实体瘤的治疗中都显示出较好的治疗效果。
CellTiter-Glo检测细胞增殖率或活率：
将上述生长状态良好的细胞以每孔细胞数2000-3000接种在96孔板中，然后经不同浓度的AC220、Gilteritinib、Sitravatinib处理48小时后，分别在每个处理孔中加入100μl CellTiter-Glo试剂，于室温静置孵育30分钟，混匀后取50μl移入384孔板中在酶标仪中检测相应的荧光值，根据荧光数值计算细胞增殖率或细胞活率。
蛋白免疫印迹实验：
收集经不同浓度的Sitravatinib处理后的细胞、用适量蛋白裂解液裂解，然后上样至8％SDS-PAGE胶通过电泳分离不同分子量大小的蛋白，转移印迹至硝酸纤维素膜(NC膜)上，随后用5％的脱脂牛奶室温封闭NC膜1小时。加入稀释好的一抗(P-FLT3/FLT3、P-stat5/stat5、P-AKT/AKT、P-ERK/ERK和tubulin抗体)4oC孵育过夜。将一抗回收后用1×TBST缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3次，5分钟/次。然后用5％脱脂牛奶稀释的相应辣根过氧化物酶连接的二抗在室温孵育1小时，弃二抗后用1×TBST缓冲液洗涤膜3次，5分钟/次。最后加入适量的显影液进行曝光显影。
通过Cell TilterGlo实验发现，Sitravatinib对FLT3-ITD AML细胞系、MOLM-13、MV-4-11的增殖抑制作用显著强于FLT3-WT AML细胞系HL60、NB4、U937、SKNO-1、OCI-AML2、OCI-AML3，并且通过流式细胞术检测到Sitravatinib对FLT3-ITD AML细胞系的增殖抑制作用优于Gilteritinib。Sitravatinib显著促进MOLM-13、MV4-11的凋亡，且比现有临床药物Gilteritinib有显著优势。同时，Sitravatinib可抑制FLT3的磷酸化及其调控的下游信号通路活化。
参考图1，MOLM-13、MV-4-11、HL60、NB4、K562、SKNO-1、OCI-AML2、OCI-AML3细胞经相同浓度梯度的Sitravatinib处理48小时后Cell TilterGlo检测细胞增殖情况，可见Sitravatinib对FLT3-ITD AML细胞系MOLM-13、MV-4-11的增殖抑制作用显著强于FLT3-WTAML细胞系HL60、NB4、U937、SKNO-1、OCI-AML2、OCI-AML3。
参考图2-3，分别使用0、1nM、3nM、10nM的Sitravatinib、Gilteritinib处理MV4-11、MOLM-13细胞48小时，流式细胞术检测凋亡细胞，Sitravatinib以浓度依赖的方式显著促进MOLM-13细胞的凋亡，且比Gilteritinib有显著的优势。
参考图4，分别使用0、1nM、3nM、10nM的Sitravatinib处理MV4-11、MOLM-13细胞48小时，Western blot实验显示MOLM-13、MV-4-11的凋亡蛋白的浓度依赖的表达增加，如Cleavaged-PARP1，Cleavaged-Caspase8表达增高。
参考图5，分别使用0、1nM、3nM、10nM的Sitravatinib处理MV4-11、MOLM-13细胞4小时，Sitravatinib能显著抑制MOLM-13、MV-4-11及BaF3-FLT3-ITD细胞内的P-FLT3、P-stat5、P-AKT及P-ERK蛋白表达，提示Sitravatinib可抑制FLT3信号通路的活化。
实施例2、Sitravatinib对FLT3-ITD AML细胞系显著的周期抑制作用
流式检测细胞周期、细胞凋亡率及外周血白血病细胞的含量：
MOLM-13、MV-4-11细胞经相同浓度的Sitravatinib处理24h后收集细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，随后加入3mL预冷70％乙醇，于4℃固定过夜。400g、4℃离心5分钟收集细胞，以1mL的PBS洗涤细胞一次，400μL PBS重悬细胞，加入20ul 1mg/mL RNase A后37度水浴消化30分钟后加入20μl 1mg/mL溴化乙锭(PI)避光4度染色30min，然后转至流式管中，用流式细胞仪检测细胞周期。
MOLM-13、MV-4-11细胞经相同浓度的Sitravatinib处理48h后收集细胞，用预冷PBS洗涤1次，再用1×binding buffer洗涤1次，随后400g、4℃离心5分钟后弃上清，将细胞重悬于100μL 1×binding buffer中，加入5μL AnnexinV APC、2μL PI后轻轻混匀，在避光条件下室温放置15分钟，然后转至流式管中，加入200μL 1×binding buffer后用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。
BaF3-FLT3-ITD和BaF3-FLT3-ITD-F691L细胞注射入小鼠体内建立发病模型后采集适量的小鼠外周血，将外周血裂解红细胞后流式检测白血病细胞(即GFP细胞，FLT3-ITD-F691L质粒带有GFP标签)含量。
实验：分别使用0、1nM、3nM、10nM的Sitravatinib、Gilteritinib处理MV4-11、MOLM-13细胞24小时，流式细胞术检测细胞周期，Sitravatinib以浓度依赖的方式显著抑制MV4-11、MOLM-13细胞的周期，且比Gilteritinib有显著的优势。
因此，Sitravatinib对FLT3-ITD AML细胞系显著的周期抑制作用，且优于A现有临床药物Gilteritinib。
并且Sitravatinib对FLT3-ITD AML细胞系的增殖抑制作用优于AC220和Gilteritinib。将FLT3-ITD质粒转入BaF3细胞构建不依赖IL-3而是依赖FLT3-ITD生长的BaF3-FLT3-ITD细胞，相同浓度梯度的Sitravatinib处理BaF3-FLT3-ITD、BaF3+IL3细胞48小时,Sitravatinib特异性抑制BaF3-FLT3-ITD细胞的增殖。分别使用0、1nM、3nM、10nM的Sitravatinib、Gilteritinib处理MOLM-13细胞24小时使MOLM-13细胞周期阻滞，进入增殖分裂期的细胞显著减少。
实施例3、Sitravatinib靶向结合FLT3-ITD蛋白
Sitravatinib可特异性地抑制FLT3-ITD AML细胞系的增殖及FLT3信号通路的活化，探究Sitravatinib是否能靶向结合FLT3-ITD，本申请通过CETSA实验证明Sitravatinib能直接结合FLT3-ITD。
细胞热力学迁移实验(Cellular thermal shift assay，CETSA)：
细胞热力学迁移实验是根据小分子化合物和靶蛋白结合后能改变蛋白热稳定性的原理来证明小分子化合物是否能与靶蛋白结合的方法。
将FLT3-ITD质粒转入BaF3细胞构建不依赖IL-3而是依赖FLT3-ITD生长的BaF3-FLT3-ITD细胞，此细胞可大量表达FLT3-ITD蛋白。将生长状态良好的BaF3-FLT3-ITD细胞分别经DMSO、1μM Sitravatinib处理1小时后收集细胞通过液氮反复冻融的方式获取蛋白裂解液，然后将等分的蛋白裂解液经不同温度梯度(43℃、44.2℃、45.9℃、48.1℃、51.1℃、53.5℃、55℃)处理后western bot检测FLT3蛋白的变化，发现随着温度升高，FLT3蛋白的稳定性越差；参考图6，相比较对照组，经药物Sitravatinib处理后FLT3蛋白相对更稳定(图6-A，图6-B)。此外，本申请将相同数量的BaF3-FLT3-ITD细胞经不同浓度梯度(0、1nM、3nM、10nM、30nμM、100nM、300nμM、1000nM)Sitravatinib处理1小时后收集细胞蛋白裂解液，然后经相同温度(53℃)处理后western bot检测FLT3蛋白变化，发现随着浓度的增加，FLT3蛋白含量也逐渐增加，提示其稳定性呈Sitravatinib浓度依赖性(图6-C，图6-D)。
实施例4、Sitravatinib对BaF3-FLT3-ITD白血病模型小鼠生存时间的影响
BaF3-FLT3-ITD、BaF3-FLT3-ITD-F691L细胞小鼠体内发病模型的建立实验：
收集生长状态良好的BaF3-FLT3-ITD、BaF3-FLT3-ITD-F691L细胞以数量为5×105个/只尾静脉注射入Balbc小鼠体内，然后随机分为甲基纤维素溶剂对照组、AC220组(10mg/kg/d)、Gilteritinib组(30mg/kg/d)和Sitravatinib组(30mg/kg/d)；2天后分别每天予等体积溶剂、10mg/kg AC220和30mg/kg Gilteritinib、30mg/kg Sitravatinib处理小鼠，治疗9天后眼眶采集小鼠外周血用流式检测白血病细胞(BaF3-FLT3-ITD、BaF3-FLT3-ITD-F691L细胞)比例。治疗9天后从每组小鼠中分别随机取三只小鼠安乐死，取其脾脏及骨髓流式检测白血病细胞比例，并进行脾脏拍照与称重，同时将小鼠脾脏进行伊红(H&E)染色，镜下观察白血病细胞的浸润情况。四个给药组的小鼠每天持续灌胃给药，直到对照组小鼠开始死亡，然后停止继续给药以观察小鼠的生存和死亡情况并做生存期统计。
统计学分析：
本发明采用student's t检验进行统计学分析，实验均重复3次并且得到一致结果，P<0.05表示差异具有统计学意义统计学差异的大小用*表示如下：*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
在体外，我们发现Sitravatinib对携带FLT3-ITD突变的BaF3-FLT3-ITD细胞株具有显著的增殖抑制作用，因此申请人将BaF3-FLT3-ITD细胞移植入BALB/c小鼠体内构建白血病动物模型以探讨Sitravatinib在体内对FLT3-ITD阳性的白血病的治疗效果，参考图7，经Sitravatinib治疗后发病小鼠的生存期明显延长，且比现有临床药物奎扎替尼(AC220)、吉瑞替(Gilteritinib)具有优势。
Sitravatinib治疗后BaF3-FLT3-ITD发病小鼠的生存期明显延长，且比现有临床药物奎扎替尼(AC220)、吉瑞替(Gilteritinib)具有优势(图7-A)。治疗9天后眼眶采集小鼠外周血用流式检测白血病细胞(BaF3-FLT3-ITD细胞)比例，相比对照及AC220、Gilteritinib处理组，Sitravatinib可显著减少小鼠外周血白血病负荷(图7-B)。治疗10天后从每组小鼠中分别随机取三只小鼠安乐死，取其脾脏及骨髓检测白血病细胞比例，可见Sitravatinib能显著减少白血病细胞在脾脏及骨髓中的浸润(图7-C)。脾脏拍照显示Sitravatinib治疗组的小鼠脾脏远远小于对照(图7-D)。
另外，参考图8，本申请人发现Sitravatinib治疗后BaF3-FLT3-ITD-F691L发病小鼠的生存期明显延长，而AC220治疗对小鼠的生存期无明显影响，Gilteritinib治疗仅能稍微延长小鼠生存期(图8-A)。治疗9天后眼眶采集小鼠外周血用流式检测白血病细胞(BaF3-FLT3-ITD-F691L细胞)比例，相比对照及AC220、Gilteritinib处理组，Sitravatinib可显著减少小鼠外周血白血病负荷(图8-B)。治疗10天后从每组小鼠中分别随机取三只小鼠安乐死，取其脾脏及骨髓检测白血病细胞比例，可见Sitravatinib能显著减少白血病细胞在脾脏及骨髓中的浸润，而AC220对白血病细胞的脏器浸润无明显改善，Gilteritinib仅能略微减轻白血病细胞的脏器浸润(图8-B、图8-C)。脾脏拍照显示Sitravatinib治疗组的小鼠脾脏远远小于对照及AC220、Gilteritinib处理组。脾脏进行切片后，伊红(H&E)染色显示Sitravatinib治疗组的小鼠脾脏基本没有白血病细胞浸润，组织形态正常，而对照及AC220、Gilteritinib处理组小鼠脾脏组织结构紊乱，大量白血病细胞浸润(图8-D)，这提示Sitravatinib可明显降低白血病的侵袭和转移。
实施例5、Sitravatinib显著抑制BaF3-FLT3-ITD-TKD耐药细胞的增殖
索拉非尼(sorafenib)、奎扎替尼(AC220)、吉瑞替尼(Gilteritinib)是目前临床上可靶向抑制FLT3-ITD活性的有效药物，但在治疗中，易引起FLT3-TKD继发突变如D835(D835F/H/V/Y)，F691L，Y842C进而导致耐药、复发，而F691L是所有药物都难以克服的耐药突变，被称之为“看门人突变”。本申请人构建了5种Baf3-FLT3-ITD-TKD细胞，发现Sitravatinib除对BaF3-FLT3-ITD具有显著的增殖抑制作用外，对携带FLT3-ITD-TKD耐药突变的细胞包括BaF3-FLT3-ITD-F691L、BaF3-FLT3-ITD-Y842C细胞也具有显著的增殖抑制作用，并且也可抑制上述细胞内的FLT3信号通路活化。
实验过程：本申请将FLT3-ITD、FLT3-ITD-D835Y、FLT3-ITD-D835V、FLT3-ITD-D835F、FLT3-ITD-F691L、FLT3-ITD-Y842C质粒转进BaF3细胞中，构建依赖突变FLT3生长的BaF3细胞。BaF3-FLT3-ITD、BaF3-FLT3-ITD-D835Y、BaF3-FLT3-ITD-D835V、BaF3-FLT3-ITD-D835F、BaF3-FLT3-ITD-F691L、BaF3-FLT3-ITD-Y842C细胞分别经相同浓度梯度的AC220、Gilteritinib、Sitravatinib处理48小时后用Cell TilterGlo检测细胞增殖情况。AC220、Gilteritinib、Sitravatinib均可显著抑制BaF3-FLT3-ITD细胞的增殖，但AC220、Gilteritinib对BaF3-FLT3-ITD细胞增殖抑制的IC50分别约为Sitravatinib IC50的2.3倍和2.9倍。5种FLT3-ITD-TKD细胞对AC220均耐药，Gilteritinib虽然对Baf3-FLT3-ITD-D835Y、Baf3-FLT3-ITD-D835V、Baf3-FLT3-ITD-D835F、FLT3-ITD-Y842有效，但Gilteritinib对BaF3-细胞增殖抑制的IC50较高且之前的报道证明Gilteritinib在体内对FLT3-ITD-F691L阳性的细胞无抑制作用。参考图9，但Sitravatinib可以显著抑制包括BaF3-FLT3-ITD-F691L在内的Baf3-FLT3-ITD-TKD细胞增殖(图9-A、图9-B)。Western blot实验显示Sitravatinib能显著抑制BaF3-FLT3-ITD、BaF3-FLT3-ITD-D835V、BaF3-FLT3-ITD-F691L、BaF3-FLT3-ITD-Y842C细胞内的P-FLT3、P-stat5、P-AKT及P-ERK蛋白表达(图9-C)，这提示Sitravatinib可抑制FLT3-ITD-TKD引起的FLT3信号通路的活化。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种FLT3抑制剂或其药学上可接受的盐在制备因FLT3-ITD激酶或FLT3-ITD-TKD突变型激酶异常激活而导致的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述FLT3抑制剂为Sitravatinib。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疾病包括急性髓系白血病。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述FLT3-ITD-TKD突变型激酶包括FLT3-ITD-F691L、FLT3-ITD-Y842C中的至少一种。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在动物给药时，所述Sitravatinib的有效剂量为10-30mg/kg/d，优选为30mg/kg/d。
5.Sitravatinib在抑制携带FLT3-ITD-TKD突变型激酶的细胞株的增殖、促进携带FLT3-ITD-TKD突变型激酶的细胞株凋亡中的应用。
6.Sitravatinib在制备抑制FLT3-ITD-TKD突变型激酶引起的FLT3信号通路的活化药物中的应用。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞株包括MOLM-13、MV-4-11、BaF3-FLT3-ITD--F691L、BaF3-FLT3-ITD-Y842C细胞中的至少一种。
8.一种FLT3-ITD激酶或FLT3-ITD-TKD突变型激酶的靶向抑制剂，其特征在于，所述靶向抑制剂包括Sitravatinib。
9.一种治疗急性髓系白血病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求8所述的靶向抑制剂和其他能抑制FLT3-ITD激酶或FLT3-ITD-TKD突变型激酶活性的药物。
10.如权利要求9所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的制剂形式包括片剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、微囊、微球、注射液、脂质体或气雾剂中的一种或多种。
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