CN117357652B - 一种用于治疗癌症的联合用药物及其药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于治疗癌症的联合用药物及其药物组合物及其用途，本发明属于医药技术领域。本发明将盐霉素与抑制system Xc活性或抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂联合使用，发现其对于肿瘤有显著的抑制效果，与单独使用盐霉素或铁死亡诱导剂相比，发挥了显著的协同增效的抗肿瘤作用。本发明联合用药物可以杀死恶性肿瘤细胞，特别是能有效消除耐药性更强的小细胞类型肿瘤。本发明盐霉素和铁死亡诱导剂联合用药物可用于制备治疗癌症，特别是恶性前列腺癌的药物，在临床治疗恶性肿瘤上具有重要的临床意义。

Description

一种用于治疗癌症的联合用药物及其药物组合物及其用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗癌症的联合用药物及其药物组合物及其用途。
背景技术
肿瘤是目前临床上导致患者死亡的主要因素之一，严重危害了人类健康。肿瘤耐药性的产生使治疗效果大大降低，最终威胁患者生命安全。
铁死亡是近年来发现的一种铁离子依赖性的调节性细胞死亡方式，其主要生化特征是细胞内氧化还原稳态的失衡和脂质过氧化的产生，导致线粒体变小、膜密度增高和嵴的减少等。肿瘤细胞由于代谢水平高，因此和正常细胞相比，含铁量较高，对铁死亡也较敏感。诱导肿瘤细胞的铁死亡用于癌症治疗是当前的研究热点。
盐霉素（Sal）为一元羧酸聚醚类动物专用抗生素，已有研究发现盐霉素可阻滞前列腺肿瘤细胞周期、诱导细胞发生铁死亡，从而抑制前列腺肿瘤细胞转移能力。
谷氨酰胺是人体血液中含量最丰富的非必须氨基酸，也是肿瘤细胞培养过程中的必需成分。谷氨酰胺被转运到细胞后，作为合成许多氨基酸、蛋白质、核苷酸和其他生物重要分子的前体，并提供还原型辅酶Ⅱ（NADPH）和谷胱甘肽（GSH）来维持氧化还原平衡。因此，谷氨酰胺在细胞生长和增殖中起着至关重要的作用。谷氨酰胺与谷氨酸在身体里可以相互转化，细胞外基质中高浓度的谷氨酸盐或谷氨酰胺可抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白（System Xc）对胱氨酸的摄取，进而抑制谷胱甘肽的合成。已经有报道证明谷氨酸盐和谷氨酰胺可以活化细胞铁死亡通路，但是其并不能有效杀伤肿瘤细胞。
Erastin （埃拉斯汀）以 RAS 和小 T(ST) 抗原表达细胞的根除剂命名，是一种铁死亡诱导剂，Erastin能够抑制system Xc活性，抑制其对胱氨酸的摄取，从而抑制谷胱甘肽的合成。ML-210 是一种选择性的 glutathione peroxidase 4 (GPX4) 的共价抑制剂，其抑制GPX4酶活性，抑制其将细胞膜上高度氧化的脂质过氧化物转化为无氧化性的脂醇类物质。但其对肿瘤细胞的半数抑制浓度（IC50）达到10-20μM级别，在动物体内治疗肿瘤的用量需达到10-40mg/kg，因此其药用价值有限。
但目前未有关于盐霉素与谷氨酰胺、谷氨酸或Erastin等能抑制system Xc活性的物质联合使用高效诱导肿瘤铁死亡的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗癌症的联合用药物及其药物组合物及其用途。
本发明提供了一种治疗癌症的联合用药物，它含有相同或者不同规格的同时或者分别给药的盐霉素和铁死亡诱导剂；
所述铁死亡诱导剂为抑制system Xc活性的铁死亡诱导剂、或抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂；
所述抑制system Xc活性铁死亡诱导剂为Erastin、谷氨酰胺、谷氨酸、或谷氨酸盐；
其中所述Erastin其结构为；
所述抑制GPX4酶活性铁死亡诱导剂为ML210，其结构式为；
所述盐霉素与Erastin摩尔比为（100- 51200）nM：5μM；
盐霉素与谷氨酸或谷氨酸盐摩尔比为（100- 51200）nM ：3mM ；
盐霉素与谷氨酰胺摩尔比为（100-51200）nM：（4-50）mM；
所述盐霉素和ML210的摩尔比为（100- 51200）nM：5μM。
进一步地，
所述盐霉素与Erastin摩尔比为1:5；盐霉素与谷氨酸、谷氨酸盐摩尔比为1:200；盐霉素与谷氨酰胺质量浓度比例为1:40；所述盐霉素和抑制GPX4酶活性铁死亡诱导剂的质量浓度比为1:4。
进一步地，
所述谷氨酸盐为谷氨酸钠；
所述盐霉素与谷氨酰胺摩尔比为（1-50）μM：（4-32）mM。
进一步地，
所述盐霉素与谷氨酰胺摩尔比为（100- 51200）nM：50mM。
进一步地，
所述癌症为ACSL4基因标准化每百万标签数≥15的癌症。
本发明还提供了一种治疗癌症的药物组合物，其特征在于：它是以盐霉素和铁死亡诱导剂组成为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的；
所述铁死亡诱导剂为抑制system Xc活性的铁死亡诱导剂、或抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂；
所述抑制system Xc活性铁死亡诱导剂为Erastin、谷氨酰胺、谷氨酸、谷氨酸盐；
所述Erastin其结构为；
所述抑制GPX4酶活性铁死亡诱导剂为ML210，其结构式为；
所述盐霉素与Erastin摩尔比为（100- 51200）nM ：5μM；
盐霉素与谷氨酸或谷氨酸盐摩尔比为（100- 51200）nM ：3mM ；
盐霉素与谷氨酰胺摩尔比为（100-51200）nM：（4-50）mM；
所述盐霉素和ML210的摩尔比为（100- 51200）nM：5μM。
进一步地，
所述盐霉素与Erastin摩尔比为1:5；盐霉素与谷氨酸、谷氨酸盐摩尔比为1:200；盐霉素与谷氨酰胺质量浓度比为1:40；所述盐霉素和抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂的质量浓度比为1:4。
本发明还提供了一种上述的治疗癌症的联合用药物或上述所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途，其特征在于：
所述癌症为ACSL4基因的标准化每百万标签数≥15的癌症。
进一步地，所述癌症为神经内分泌前列腺癌。
标准化每百万标签数normolized Tags Per Million（nTPM），是一种用于衡量基因表达水平的单位，常用于转录组学研究中。nTPM是通过对转录组测序数据进行标准化处理得到的结果，能够更准确地反映基因在不同样本中的表达量差异。
ACSL4基因nTPM≥15的前列腺癌具有神经内分泌分化特征，恶性程度更高。本发明恶性癌症，是指ACSL4基因nTPM≥15的癌症。
实验结果表明，本发明的有益效果为将盐霉素与抑制system Xc活性或与抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂联合使用或将它们制成药物组合物使用，发现其对于肿瘤有显著的抑制效果，与单独使用盐霉素或铁死亡诱导剂相比，发挥了显著的协同增效的抗肿瘤作用。本发明通过盐霉素和抑制system Xc活性的铁死亡诱导剂或抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂的联合用药或将它们制成药物组合物使用可以杀死恶性肿瘤细胞，消除恶性肿瘤。并且本发明通过使用siRNA抑制ACSL4基因表达后，发现本发明盐霉素和铁死亡诱导剂联合用药物对癌细胞杀伤力明显降低，本发明发现神经内分泌分化前列腺癌（NEPC）中ACSL4高表达。本发明盐霉素和铁死亡诱导剂联合用药物可用于制备治疗癌症，特别是ACSL4基因高表达nTMP≥15的恶性前列腺癌，在临床治疗恶性肿瘤上具有重要的临床意义。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1、单独使用Sal，以及Sal与Gln联用时，前列腺癌C4-2B（腺癌）和PC-3（神经内分泌表型小细胞癌）细胞凋亡以及死亡数量流式结果图；其中，左下象限是正常细胞；右下象限是早期凋亡的细胞；右上象限是晚期凋亡或者细胞膜破损的细胞，左上象限是死亡的细胞。
图2、C4-2B和PC-3细胞单独使用Sal，以及Sal与Gln联用时，细胞数量统计学分析结果图，图2A：图1中左上、右上象限细胞（代表死亡细胞）占比柱状图；图2B：图1右下象限细胞（代表早期凋亡细胞）占比柱状图。(*)P<0 .05，(**)P<0 .01，(***)P<0 .001。
图3、Gln对Sal毒性的影响分析图，图3A：PC-3细胞加入不同量的Gln时细胞存活率图；图3B：不同浓度Gln与高、低浓度Sal（1μM或50μM）联合用药时，PC-3细胞存活率图； 图3C：C4-2B和PC-3细胞分别在有Gln（30mM）和没有Gln的培养基中加入不同浓度的盐霉素，细胞活性曲线图，图3D： Gln（50mM）对Sal毒性的影响图。
图4、各物质单独使用以及各物质与Sal联合用药时的LDH释放量图。
图5、Sal对C4-2B与PC-3细胞中铁死亡相关基因的影响情况分析图，图5A：测序结果GSEA通路富集分析图；图5B：盐霉素处理C4-2B细胞后转录组测序图；图5C：蛋白印迹实验检测结果图。
图6、图6A：三条靶向ACSL4基因的siRNA在PC-3细胞中对ACSL4的mRNA表达量的抑制效果图，其中si-1和si-2的效果较好；图6B：敲除PC-3细胞ACSL4导致盐霉素联合谷氨酰胺的杀伤作用下降图。
图7、图7A：临床样本免疫组织化学染色图。图7B ：ACSL4在高恶性的神经内分泌分化前列腺癌（NEPC）样本中表达更高，与CD56、NSE恶性指标呈正相关图。
图8、本发明对ACSL4基因nTPM≥15的细胞系作用效果图。图8A：ACSL4在前列腺细胞系中的表达情况统计图；图8B：在各物质单独使用以及各物质与Sal联合用药时，nTPM为30的Du145细胞的LDH释放量图；图8C ：在各物质单独使用以及各物质与Sal联合用药时，nTPM 为15的NCI-h660细胞的LDH释放量图。
图9、前列腺癌荷瘤裸鼠中，对照组、盐霉素单独使用组、盐霉素联合谷氨酰胺组、盐霉素联合ML210组的肿瘤生长情况图，图9A：带荧光的前列腺癌细胞在不同组别的裸鼠体内的生长图；图9B：肿瘤细胞发射的荧光强度定量分析图。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
system Xc：胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白；
GPX4酶：谷胱甘肽过氧化物酶 4 ；
盐霉素：Sal，CAS：53003-10-4。
iFSP1是 FSP1 (AIFM2) 的选择性有效抑制剂。iFSP1 可选择性地诱导过表达FSP1 的 GPX4敲除细胞发生铁死亡。
本发明细胞实验中：
Erastin、ML210和Sal使用DMSO作为溶剂，配制为10mM母液，超声助溶，再稀释到实验所需浓度后使用。
谷氨酸（或谷氨酸钠）和谷氨酰胺使用细胞完全培养基作为溶剂，配制为相应实验浓度培养液，超声助溶，孔径0.22μm的过滤后使用。
IFSP1使用DMSO溶解，配置为10mM母液，超声助溶，再稀释到实验所需浓度后使用。
本发明动物实验中:
Sal和ML-210的配置方法和细胞实验方法相同，Gln是直接使用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，然后再在其中加入Sal母液，调整到相应浓度。
本发明使用的前列腺癌癌细胞为C4-2B细胞和PC-3细胞。其中，C4-2B细胞是人前列腺癌细胞C4-2的骨转移亚系，PC-3细胞具有神经内分泌分化特征，可以作为研究神经内分泌前列腺癌的模型。
F12K完全培养基： F12K基础培养基购买自Gibco公司，在其中添加10%胎牛血清和1%青霉素、1%链霉素，组成F12K完全培养基。
实施例1、体外细胞实验证明盐霉素（Sal）和与抑制system Xc活性的谷氨酰胺（Gln）对前列腺癌细胞的抑制作用
一、实验方法
1、Sal与Gln联合用药对不同前列腺癌细胞的效果
C4-2B和PC-3细胞用F12K完全培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）培养，接种2*105个细胞于六孔板中（C4-2B和PC-3各接种3个孔），并放置于二氧化碳浓度为5%的37℃恒温培养箱。
待细胞贴壁后，对细胞进行给药处理，将C4-2B 细胞和 PC-3细胞分别分为3组，分别进行以下操作：
对照组（DMSO组）：弃掉原有培养基，重新加入F12K完全培养基，培养6h后，再加入溶剂DMSO，继续孵育48h；
Sal组：弃掉原有培养基，重新加入F12K完全培养基，培养6h后，再加入含有终浓度为800nM Sal的DMSO，继续孵育48h；
联合使用Sal（800nM）与Gln（50mM）组：弃掉原有培养基，重新加入添加有终浓度为50mM Gln的F12K完全培养基，培养6h后，再加入含有终浓度为800nM Sal的DMSO，继续孵育48h。
然后按照细胞流式方法检测细胞凋亡和死亡数量。
2、Sal、Gln单独用药以及不同浓度Gln与Sal联合用药对前列腺癌细胞的抑制作用。
C4-2B和PC-3细胞用F12K完全培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）培养，接种于96孔板中，每孔1000个细胞，共接种9行，每行5个复孔，放置于二氧化碳浓度为5%的37℃恒温培养箱。
待细胞贴壁后进行实验。
1）Gln组：弃掉原有培养基，重新加入Gln终浓度为2mM，4mM，8mM，16mM，32 mM的F12K完全培养基，孵育48h后，使用CCK-8检测方法检测计算细胞存活率。
2）联合使用Sal与Gln组（Gln浓度变化）：弃掉原有培养基，重新加入Gln终浓度为2mM，4mM，8mM，16mM，32 mM的F12K完全培养基，孵育6h后，继续添加Sal使其终浓度为1μM或50μM，孵育48h后，使用CCK-8检测方法检测计算细胞存活率。
3）Sal组：弃掉原有培养基，重新加入F12K完全培养基，孵育6h后，继续添加Sal使其终浓度为0nM、100nM、200nM、400nM、800nM、1600nM、3200nM、6400nM、12800nM、25600nM、51200nM，孵育48h后，使用CCK-8检测方法检测计算细胞存活率。
4）联合使用Sal与Gln组（Sal浓度变化）：弃掉原有培养基，重新加入Gln终浓度为50mM的F12K完全培养基，孵育6h后，继续添加Sal使其终浓度分别为0nM、100nM、200nM、400nM、800nM、1600nM、3200nM、 6400nM、12800nM、25600nM、51200nM，即Sal：Gln摩尔比为（100-51200）nM：50mM孵育48h后，使用CCK-8检测方法检测计算细胞存活率。
二、实验结果
1、盐霉素与谷氨酰胺联合用药效果
从图1和图2可以看出，无论是C4-2B细胞还是PC-3细胞，盐霉素本身均有一定的抑制作用，但是将盐霉素与谷氨酰胺联合使用时，对PC-3细胞的抑制作用显著高于单纯盐霉素的作用，而对C4-2B细胞的抑制作用则反而低于单纯盐霉素的作用，主要原因在于早期凋亡细胞减少。
2、Gln单独用药以及不同浓度Gln与Sal联用时对前列腺癌细胞的抑制作用。
1）从图3A中可以看出，单独使用Gln，在Gln浓度为300μg/ml，600μg/ml，1200μg/ml，2400μg/ml时对PC-3细胞影响不大，在Gln浓度达到4800μg/ml时PC-3细胞存活率才稍微下降。将图3B与图3A进行比较可以看出，在Gln浓度相同条件下，加入少量Sal（1μM），可以看到PC-3细胞存活率明显下降；当加入Sal浓度为50μM，效果更为显著。
实验结果表明当Sal与Gln摩尔比为（1-50）μM：（4-32）mM时，Sal与Gln协同作用，能大幅度降低PC-3细胞存活率。
2）C4-2B和PC-3细胞分别在有Gln（30mM）和没有Gln的培养基中加入不同浓度的Sal（Sal具体浓度如图3C所示），细胞活性曲线图如图3C所示。可以看出，Sal与Gln联合使用时，对PC-3细胞的抑制作用显著高于单纯使用Sal；而Sal与Gln联合使用时对C4-2B细胞的抑制作用与单纯使用Sal相差不明显，甚至在一定范围内，将Sal与Gln联合使用时，对C4-2B细胞的抑制作用低于单纯使用Sal。
3）从图3D可以看出，联合运用Gln（50mM）和Sal，可将Sal的IC50从3473nM显著降低到156nM，但是仅在恶性程度更高的PC-3细胞中有效，对C4-2B 细胞反而有所增加。
实验结果表明，Gln单独用药对恶性程度高的PC-3细胞影响不大，Sal单独用药，在一定程度上可以降低PC-3细胞的存活率；但是Sal与Gln联合用药时，Sal与Gln会产生协同作用，大幅度降低了PC-3细胞存活率，且实验发现少量Gln（50mM）可将Sal对PC-3细胞的IC50从3473nM显著降低到156nM。
Sal与Gln联合用药时，对于C4-2B细胞，两者不会产生协同作用。
实施例2、体外细胞证明盐霉素与多种其他铁死亡诱导剂联合使用
一、实验方法
铁死亡与凋亡的区别就在于是否释放LDH。铁死亡以脂质过氧化物引起的细胞膜破裂为特征，细微的细胞膜破裂会导致细胞内大量LDH释放到细胞外。而凋亡则是细胞皱缩并分割形成凋亡小体，最终被吞噬体吞入降解的细胞死亡方式，整个过程中不会有细胞内容物外泄。因此在铁死亡研究中，往往用LDH释放率来表示发生铁死亡的细胞数量，本发明使用的LDH检测试剂盒购买自碧云天公司，是成熟、常规的检测方法。
使用实施例1中的孵育方法分别对C4-2B 细胞和 PC-3细胞进行孵育，并将细胞接种于96孔板中（每种铁死亡诱导剂对应1个板），每种细胞共接种9行（每行给与不同浓度的盐霉素），每行5个重复孔。
配制好Erastin、ML210、谷氨酸（Glu）、Gln和iFSP1，并分别加入至细胞培养基中，稀释为各自相应浓度后， 即Erastin（5μM）、ML210（5μM）、Glu（3mM）、Gln（50mM）和iFSP1（1μM），孵育细胞6h后，再加入不同终浓度（梯度浓度见图4横坐标）的盐霉素（100nM-51200nM），再孵育48小时后检测细胞上清中的LDH含量，并计算LDH释放率。
测量分别单独使用Erastin（800nM-102400nM梯度浓度）、ML210（800nM-102400nM梯度浓度）、Glu（13.6μM-435.2μM梯度浓度）、Gln（2mM-50mM梯度浓度）和iFSP1（800nM-102400nM梯度浓度）以及Sal（100nM-51200nM梯度浓度），前列腺癌PC-3细胞LDH释放率，各物质梯度浓度见图4横坐标。
二、实验结果
从图4可以看出，对于前列腺癌PC-3细胞：
1）分别单独使用Erastin、ML210、Glu、Gln和iFSP1以及Sal，LDH释放率较低；
2）与单独使用iFSP1、Sal相比，不同浓度Sal与iFSP1联用，LDH释放率提升不明显；
3）与单独使用Erastin、ML210、Glu、Gln、Sal相比，不同浓度的Sal分别与Erastin（5μM）、ML210（5μM）、Glu（3mM）、Gln（50mM）、iFSP1（1μM）联合使用，均可有效促进肿瘤破裂，显著提升LDH释放率，证明这几种联合使用的组合物可以有效促进前列腺癌PC-3铁死亡。
实验结果表明，当Erastin、ML210、Glu、Gln分别与Sal联用时LDH释放率显著提升，即当Erastin、ML210、Glu、Gln分别与Sal联用时，前列腺癌PC-3细胞铁死亡率显著提升。
Sal在与能够与抑制system Xc活性的Erastin、Glu和Gln连用时，以及Sal在与抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂ML210联用时对诱导PC-3细胞死亡有显著的协同作用；而Sal在与靶向FSP1酶的铁死亡诱导剂iFSP1联用时，对诱导PC-3细胞死亡没有显著的协同效果。其中，Erastin与Sal的摩尔比例范围为5μM：（100- 51200）nM ；ML210与Sal的比例范围为5μM：（100- 51200）nM ；Glu与Sal的摩尔比例范围为3mM：（100- 51200）nM； Gln 与Sal的比例范围为（4-50）mM ：（100- 51200）nM。
实施例3、盐霉素诱导前列腺癌细胞发生铁死亡依赖于ACSL4酶探究
一、盐霉素诱导前列腺癌细胞发生铁死亡机理探究
（一）实验方法
1、盐霉素处理C4-2B细胞后转录组测序
使用10cm培养皿正常培养6皿C4-2B细胞。在细胞生长到覆盖培养皿50%底面积时，在3皿细胞中加入终浓度为2μM的Sal作为实验组，在另外3皿细胞中加入等体积的DMSO作为对照组。继续培养48小时后，弃掉培养基，加入2ml磷酸盐缓冲液冲洗细胞2次，将细胞放置于冰上，加入1ml磷酸盐缓冲液浸泡细胞，并使用细胞刮将细胞刮下，分别盛放于实验组和对照组离心管中。低温200g离心5分钟后，弃掉上清，迅速将细胞放入液氮5分钟，此后放置于干冰盒保存，送至测序公司进行转录组测序。
对测序结果进行生物信息学分析，发现盐霉素处理C4-2B细胞后，铁死亡通路上调。在通过热图分析，将铁死亡通路中发生了显著变化的基因进行了罗列。
2、蛋白印迹实验检测
通过蛋白印迹实验检测C4-2B与PC-3细胞内铁死亡相关重要蛋白水平。
（二）实验结果
1、盐霉素处理C4-2B细胞后转录组测序结果
盐霉素处理C4-2B细胞后，基因集富集分析（GSEA，Gene SetEnrichmentAnalysis)的通路富集分析结果如图5所示，可以看出铁死亡通路活性上调与给药呈正相关。铁死亡通路的差异基因如图5B所示，可以看出其铁死亡通路相关基因均有显著变化，其中，ACSL4的本底表达量较低，但在受到盐霉素处理后出现了明显的上调。
2、蛋白印迹实验检测结果
C4-2B与PC-3细胞内铁死亡相关重要蛋白印迹实验检测结果如图5C所示，可以看出，ACSL4基因在PC-3中的表达量显著高于C4-2B中的表达量。
二、RNA干扰实验
（一）实验方法
Sal联合Gln诱导铁死亡的效率在PC-3细胞中的效果更强，推测是因为PC-3中ACSL4基因表达量远高于C4-2B中的该蛋白。
1、敲除ACSL4基因
其中，si -1， si -2，si -3，分别代表针对ACSL4基因而设计的三条干扰RNA，以及使用si-ctrl为对照组。
si -1， si -2，si -3，si-ctrl序列如下：
si-1（SEQ ID NO.1）：CCAAGUAGACCAACGCCUUTT；
si-2（SEQ ID NO.2）：CCUCUUAUUUGCUGUGAAATT；
si-3（SEQ ID NO.3）：GCUGCAAAUGCCAUGAAAUTT；
对照组si-ctrl（SEQ ID NO.4）UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；
本发明RNA干扰实验设计3条siRNA，首先验证siRNA的效率，再从中挑选出干扰效率最好的2条siRNA进行下一步实验。
实验步骤为：将PC-3细胞接种于6孔板中，共四个孔，分别为si-ctrl对照组，si-1组、si-2组、si-3组，每个孔2万个细胞。将6孔板放置于细胞培养箱中，待细胞贴壁生长后，更换5%血清、不含双抗的F12K培养基。使用赛默飞公司的Lipofectamine RNAiMAX试剂对细胞进行转染。
2、盐霉素，Gln，以及联合用药分别添加量以及孵育时间
在si-ctrl对照组，si-1组、si-2组细胞接受RAN干扰12h后，将3种处理后的细胞消化下来，重新接种于96孔板中，每种细胞都设置DMSO、Sal、Gln、和Gln+Sal组，每组5复孔。
DMSO组加入与实验组等量DMSO作为对照，48h后检测细胞活性；
Sal组加入终浓度1μM的Sal，48h后检测细胞活性；
Gln组使用含有50mM谷氨酰胺的完全培养基，48h后检测细胞活性；
Gln+Sal组使用含有50mM谷氨酰胺的完全培养基培养6h后，再加入终浓度1μM的Sal，48h后检测细胞活性。
3、ACSL4在临床样本中的表达情况和前列腺癌神经内分泌分化的相关性研究
1）免疫组织化学染色检测ACSL4在（前列腺）腺癌和神经内分泌分化癌中的表达差异。
2）在TCGA公共数据库前列腺癌中，ACSL4的表达与前列腺癌神经内分泌分化指标的相关性分析。
（二）实验结果
1、所设计的siRNA可在PC-3细胞中有效敲低ACSL4基因的表达如图6A，其中si-1和si-2两个序列的效率最高。
2、从图6B中可以看出，在PC-3中敲除ACSL4基因导致Sal联合Glu的杀伤作用下降。
3、临床样本中，ACSL4在高恶性的神经内分泌分化前列腺癌（NEPC）样本中表达更高，且与CD56、NSE等恶性指标呈正相关。
4、从图8可知，神经内分泌表型的前列腺癌细胞系，ACSL4表达高。在神经内分泌表型的前列腺癌细胞系ACSL4基因的nTPM≥15，即ACSL4高表达，而在性激素敏感型前列腺癌细胞系中ACSL4基因的nTPM<15即ACSL4低表达。
实验结果表明，ACSL4在临床上恶性程度较高的神经内分泌分化型前列腺癌（NEPC，例如PC-3，DU145，NCI-H660）中高表达，而盐霉素与铁死亡诱导剂发挥的抗肿瘤作用则依赖于ACSL4的高表达，ACSL4基因的标准化每百万标签数normolized Tags PerMillion（nTPM）≥15的癌症。
PC-3细胞ACSL4基因的nTPM为32.5。 NCI-H660细胞ACSL4基因的nTPM为15，Du145细胞ACSL4基因nTPM为27。
nTPM是一种用于衡量基因表达水平的单位，常用于转录组学研究中。nTPM是通过对转录组测序数据进行标准化处理得到的结果，nTPM能够更准确地反映基因在不同样本中的表达量差异。
实施例4、Sal与其他铁死亡诱导剂联合使用对NCI-H660细胞与Du145细胞效果探究
一、实验方法
收集前列腺腺癌及神经内分泌分化肿瘤样本各18例，通过组织固定、石蜡包埋、切片和免疫组织化学染色方法，检测ACSL4蛋白（抗体信息：品牌abcam，货号：ab155282）在切片样本中的表达情况，并拍照，实验结果如图7A所示，可以看出，在临床样本中，ACSL4在高恶性的神经内分泌分化前列腺癌（NEPC）样本中表达更高。
在TCGA前列腺癌公共数据中使用Pearson相关性分析方法，分析ACSL4与CD56和NSE神经内分泌肿瘤相关指标的相关性，实验结果如图7B所示，ACSL4在高恶性的神经内分泌分化前列腺癌（NEPC）样本中表达更高，与CD56、NSE恶性指标呈正相关。
NCI-H660和Du145细胞均为转移性前列腺癌细胞系，具有神经内分泌肿瘤表型和较高的恶性程度，根据图8A可知，ACSL4基因在NCI-H660和Du145中表达量较高（nTPM＞15），故对联合使用组合物诱导这类细胞发生铁死亡的作用进行验证。
（一）Sal联合Gln或ML210对Du145细胞LDH释放的影响。
Du145 细胞用F12K完全培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）培养，并将细胞接种于若干个96孔板中，每板共接种9行（每行给与不同浓度的盐霉素），每行5个重复孔，放置于二氧化碳浓度为5%的37℃恒温培养箱，待细胞贴壁后进行实验。
Gln和ML210终浓度分别为50mM和5μM的培养基，替换掉96孔板中原有培养基。孵育细胞6h后，加入不同终浓度（梯度浓度见图8B横坐标）的Sal（100nM- 51200nM），再孵育48小时后检测细胞上清中的LDH含量，并计算LDH释放率，实验结果如图8B所示。
同时，分别单独使用Gln（2mM-50mM梯度浓度）和ML210（800nM-102400nM梯度浓度）以及Sal（100nM-51200nM梯度浓度），孵育48h，检测各浓度对应的细胞LDH释放率，各物质梯度浓度见图8B横坐标，实验结果如图8B所示。
（二）Sal联合Gln或ML210对NCI-h660细胞LDH释放的影响。
该细胞为悬浮细胞，无需胰酶消化。NCI-h660细胞的培养基为：在RPMI-1640培养基中加入5%FBS、1%双抗、10nM雌二醇（品牌Sigma，货号E2758）、10nM氢化可的松（品牌MCE，货号HY-N0583）和1 x ITS（即胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠混合物，品牌Sigma，货号I3146），传代时收集细胞培养上清，置于15ml离心管中，200g离心5分钟后，弃掉上清；加入1ml磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞并使用血球计数板进行细胞计数，算得细胞总数和密度。
将细胞悬液分装至若干个15ml离心管中（有多少个药物浓度，就设置多少个15ml离心管），使每个管中含有12000个细胞，200g离心5分钟后，弃掉上清。
在NCI-h660细胞的培养基中分别加入终浓度为50mM的 Gln，或终浓度为5μM 的ML210，再分成若干份，分别加入不同终浓度（梯度浓度见图8C横坐标）的Sal（100nM-51200nM）。将上述含有Sal与Gln或Sal与ML210的培养基分别加入上述含有细胞的15ml离心管中，重悬细胞，并接种至96孔板中，每孔2000个细胞，每种药物浓度对应5个复孔。孵育48小时后，检测并计算细胞LDH释放率。结果如图8C。
同时，分别单独使用含有Gln（2mM-50mM梯度浓度）和ML210（800nM-102400nM梯度浓度）以及Sal（100nM-51200nM梯度浓度）的NCI-h660细胞的培养基，加入上述含有细胞的15ml离心管中，重悬细胞，并接种至96孔板中，每孔2000个细胞，每种药物浓度对应5个复孔后，孵育48h，检测各浓度对应的细胞LDH释放率，各物质梯度浓度见图8C横坐标，实验结果如图8C所示。
二、实验结果
从图8B和8C分别可以看出，对于Du145和NCI-h660细胞：
1）分别单独使用Gln、ML210以及Sal，Du145和NCI-h660细胞的LDH释放率都较低；
2）与单独使用Gln、ML210和Sal相比，不同浓度的Sal分别与ML210（5μM）或Gln（50mM）联合使用，均可有效促进肿瘤破裂，显著提升Du145和NCI-h660细胞的LDH释放率，证明这几种联合使用的组合物可以有效促进Du145和NCI-h660细胞发生铁死亡。即促进ACSL4高表达（nTPM＞15）的前列腺癌细胞系发生铁死亡。
3）结合图4和图8(A-C)，可以看出，当sal与抑制system Xc活性或与抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂联合使用时，可以大幅度提高使ACSL4高表达的肿瘤细胞发生铁死亡，且肿瘤细胞的ACSL4高表达量越高，联合用药促进肿瘤细胞铁死亡效果越明显。
实施例5、Sal与其他铁死亡诱导剂联合使用的体内抑瘤效果
一、实验方法
1、构建PC-3细胞胫骨荷瘤模型
本发明构建了PC-3细胞裸鼠胫骨荷瘤模型，具体方法为：收集人工构建稳定表达荧光素酶的PC-3细胞，将5*105个PC-3细胞悬浮于50μL磷酸盐缓冲液中，吸入胰岛素针。小鼠麻醉后，弯曲小鼠膝关节，暴露出胫骨平台，将胰岛素针头平行于胫骨方向，由胫骨平台旋转打孔、插入骨髓腔，缓慢注入针内50μL肿瘤悬浮液后，旋转拔出针头。
荷瘤5天后，通过小动物活体成像仪检测肿瘤生长情况，确定PC-3细胞胫骨荷瘤模型构建成功。
2、动物给药
将造模成功的小鼠随机分为4组，每组5只，分别为对照组（model组）、Sal组、Sal+Gln组、Sal+Ml210组。
model组：给与含1/1000（体积比）DMSO的磷酸盐缓冲液腹腔注射。
Sal组：将盐霉素母液加入至PBS中，稀释为0.4mg/ml，每只小鼠尾静脉给予50uL；
Sal+Gln组：将Gln溶于磷酸盐缓冲液，配制成浓度为16mg/ml注射液，并在其中加入盐霉素母液，使Sal终浓度为0.4mg/ml，每只小鼠尾静脉给予50uL，其中Sal与Gln最终注射量质量浓度比为1:40；
Sal+ML210组：在磷酸盐缓冲液中加入Sal和ML210母液，两者终浓度分别为0.4mg/ml和1.6mg/ml，每只小鼠尾静脉给予50uL，其中Sal与ML210最终注射量质量浓度比为1：4。
每天给1次药，每组按照上述剂量给药，给药30天后，通过小动物活体成像仪测量肿瘤大小，来判断联合用药效果。
二、实验结果
通过小动物活体成像仪测量得到光子强度（photon flux）（图9B），代表肿瘤发出的荧光强度，与肿瘤细胞的数量成正相关。
从图9A和图9B中可以看出，Sal和Gln联合使用以及Sal和ML210联合使用对于肿瘤组织的抑制效果最佳，显著优于单独使用Sal。结果说明Sal和Gln联合使用以及Sal和ML210联合使用治疗前列腺癌时能够发挥协同增效的治疗作用。
综上，本发明将盐霉素与抑制system Xc活性或与抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂联合使用或将它们制成药物组合物使用，发现其对于肿瘤有显著的抑制效果，与单独使用盐霉素或铁死亡诱导剂相比，发挥了显著的协同增效的抗肿瘤作用。本发明通过盐霉素和抑制system Xc活性的铁死亡诱导剂或抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂的联合用药或将它们制成药物组合物使用可以杀死恶性肿瘤细胞，消除恶性肿瘤。并且本发明通过使用siRNA抑制ACSL4基因表达后，发现本发明盐霉素和铁死亡诱导剂联合用药物对癌细胞杀伤力明显降低，本发明发现神经内分泌分化前列腺癌（NEPC）中ACSL4高表达。本发明盐霉素和铁死亡诱导剂联合用药物可用于制备治疗癌症，特别是ACSL4基因高表达nTMP≥15的恶性前列腺癌，在临床治疗恶性肿瘤上具有重要的临床意义。

Claims (4)

1.一种治疗癌症的联合用药物，其特征在于：它含有相同或者不同规格的同时或者分别给药的盐霉素和铁死亡诱导剂；
所述铁死亡诱导剂为抑制system Xc活性的铁死亡诱导剂、或抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂；
所述抑制system Xc活性铁死亡诱导剂为Erastin；
其中所述Erastin其结构为
所述抑制GPX4酶活性铁死亡诱导剂为ML210，其结构式为；
所述盐霉素与Erastin摩尔比为(100-51200)nM：5μM；
所述盐霉素和ML210的摩尔比为(100-51200)nM：5μM；
所述癌症为前列腺癌。
2.根据权利要求1所述的联合用药物，其特征在于，
所述盐霉素与Erastin摩尔比为1:5；所述盐霉素和抑制GPX4酶活性铁死亡诱导剂的质量浓度比为1:4。
3.一种治疗癌症的药物组合物，其特征在于：它是以盐霉素和铁死亡诱导剂组成为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的；
所述铁死亡诱导剂为抑制system Xc活性的铁死亡诱导剂、或抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂；
所述抑制system Xc活性铁死亡诱导剂为Erastin；
所述Erastin其结构为
所述抑制GPX4酶活性铁死亡诱导剂为ML210，其结构式为
所述盐霉素与Erastin摩尔比为(100-51200)nM：5μM；
所述盐霉素和ML210的摩尔比为(100-51200)nM：5μM；
所述癌症为前列腺癌。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于：
所述盐霉素与Erastin摩尔比为1:5；所述盐霉素和抑制GPX4酶活性的铁死亡诱导剂的质量浓度比为1:4。
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