CN108603194A - 在癌症治疗中用作治疗剂的单羧酸转运蛋白4(mct4)反义寡核苷酸(aso)抑制剂 - Google Patents

在癌症治疗中用作治疗剂的单羧酸转运蛋白4(mct4)反义寡核苷酸(aso)抑制剂 Download PDF

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Abstract

本申请提供了用于调节MCT4活性或用于治疗癌症的组合物、方法和用途。所述组合物包含用于施用给癌细胞的反义寡核苷酸(ASO)，其中所述癌细胞可能特征在于升高的MCT4表达。所述癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；宫颈癌；肝癌；膀胱癌；和小细胞肺癌pr。所述前列腺癌可为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。

Description

在癌症治疗中用作治疗剂的单羧酸转运蛋白4(MCT4)反义寡 核苷酸(ASO)抑制剂
技术领域
本发明提供了用于调节单羧酸转运蛋白4(MCT4)表达的化合物、组合物和方法。特别地，本发明涉及能调节人MCT4mRNA表达的反义寡核苷酸(ASO)，及其用于治疗包括各种癌症在内的各种适应症的用途和方法。具体地，本发明涉及治疗癌症诸如包括去势抵抗性前列腺癌(CRPC)在内的前列腺癌的疗法和方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年11月30日提交的标题为“作为单羧酸转运蛋白4治疗性组合物的反义寡核苷酸及其用于治疗癌症的方法(ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES ASMONOCARBOXYLATE TRANSPORTER 4THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND METHODS FOR THEIRUSE IN THE TREATMENT OF CANCER)”的美国临时专利申请第62/260,837号的权益。
背景
前列腺癌是西方世界男性中最常见的非皮肤癌和第二大的癌症相关死亡原因(Siegel R,等,2012.,62(1):10-29)。前列腺癌最初是雄激素依赖性的，尽管雄激素剥夺疗法(ADT)可诱导明显的肿瘤消退，但对ADT的耐受性不可避免地出现，从而导致去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。目前用于治疗CRPC的标准治疗是全身性的基于多西他赛的化疗，与基于米托蒽醌的疗法相比，患者的总体存活期增加了约2个月(Petrylak DP,等,N Engl JMed.2004；351(15):1513-1520；Tannock IF,等,N Engl J Med.2004；351(15):1502-1512)。近来，西普鲁塞-T、卡巴他赛、阿比特龙、MDV3100和镭-223显示出更持久的总体存活益处并且由FDA批准用于治疗CRPC(Bishr M和Saad F.,Nat Rev Urol.2013；10(9):522-528)。虽然近来通过使用靶向雄激素受体(AR)-信号传导轴的更强大的化疗治疗剂诸如恩杂鲁胺(Ning等,2013)和阿比特龙(de Bono等,2011)提高了转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)治疗的功效，但患者的总体存活期仅略有增加(Badrising等,2014；Loriot等,2013；Tannock等,2004)。此外，认为此类药物的进一步改进的形式可促进前列腺腺癌向神经内分泌前列腺癌(NEPC)(一种目前无法治愈的疾病的亚型)的分化转化(Beltran等,2011；Nadal等,2014；Yuan等,2007)。然而，这些药物都没有疗效，并且它们逐渐提高了总体存活期。建立更有效的治疗靶标和药物，特别是靶向转移性CRPC和mCRPC的分子驱动因子的那些靶标和药物，对于改善疾病管理和患者存活至关重要(Lin D,等,Curr OpinUrol.2013；23(3):214-219)。
越来越多的证据表明，靶向重新编程的癌症能量代谢提供了独特的有效治疗性干预方法(Zhang和Yang,2013)。对于葡萄糖利用，与正常静息细胞不同，癌细胞通常偏爱与乳酸产生偶联的糖酵解，即一种称为有氧糖酵解或瓦博格效应(Warburg effect)的过程(Warburg,1956)。这导致葡萄糖消耗升高，这是原发性和转移性癌症的近乎普遍的特性。此外，也导致乳酸产生升高的谷氨酰胺的异常利用已被观察到对于癌症是非常常见的(Koochekpour等,2012)。这些代谢能途径导致癌细胞增加乳酸分泌至其微环境中，从而促进了多种致癌性、乳酸盐-刺激的过程，包括组织侵袭/转移、血管新生和对缺氧的响应(Choi等,2013；Choi等,2014；Doherty和Cleveland,2013；Ullah等,2006)。此外，乳酸-诱导的癌细胞微环境酸化(至pH 6.0-6.5)可以导致局部宿主抗癌免疫的抑制(Choi等,2013；Parks等,2013)。18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(FDG-PET)在临床上最常用于癌症导致的葡萄糖代谢增强的现象。尽管这种成像技术并不普遍用于前列腺癌(Jadvar,2009)，但有证据表明前列腺癌细胞的葡萄糖代谢通过AR信号传导和进展至治疗耐受性而增加(Tennakoon等,2014；Vaz等,2012)。因此，靶向有氧糖酵解途径可能有效治疗晚期前列腺癌。
单羧酸转运蛋白(MCT)家族由参与乳酸和其它代谢单羧酸盐转运的质膜转运蛋白组成。特别地，乳酸/H+的细胞外流被认为主要由MCT4(SLC16A3)介导(Dimmer等,2000)。MCT4的表达与高度糖酵解的细胞有关(Halestrap,2013；Manning Fox等,2000；Ullah等,2006)，并且MCT4在肿瘤中的升高表达具有临床相关性，因为它已与多种类型的癌症中的不良患者预后相关(Fisel等,2013；Lisanti等,2013；Ohno等,2014)，所述癌症包括前列腺癌(Hao等,2010；Pértega-Gomes等,2011)。此外，升高的MCT4表达可能在促进前列腺癌进展的癌症-基质相互作用中是重要的(Sanità等,2014)。这一信息连同癌症-产生的乳酸的癌症生长促进能力表明抑制MCT的表达或功能为各种各样的赘生物提供了有希望的治疗策略(Marchiq等,2015)。然而，仍然缺乏特异性靶向MCT4-介导的乳酸外流的治疗性策略。
随着最近FDA批准了可提高患者存活期的更新型药剂，用于去势抵抗性前列腺癌(CRPC)治疗的治疗性选择已经发生了很大变化。特别地，第二代雄激素受体拮抗剂恩杂鲁胺(ENZ)批准用于治疗多西他赛后以及最近多西他赛前情况中的转移性CRPC。然而，在2年的临床实践内，在大多数患者中ENZ耐受性的发展是明显的(Claessens等2014)，并且迄今为止没有任何已知的疗法被证明对耐ENZ的CRPC有效。因此，可有效抑制耐ENZ的CRPC的新型治疗剂将是有用的。
概述
本发明部分基于以下发现：用MCT4反义寡核苷酸(ASO)(SEQ ID NO:1-23和SEQ IDNO:46-50)抑制MCT4表达可用于治疗癌症。用某些ASO抑制MCT4表达导致减少的癌细胞增殖。此外，增殖减少扩展至去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。
在第一方面，提供了用于治疗癌细胞的组合物，该方法包括将选自SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:46-50中的一种或多种寡核苷酸施用至细胞。
在另一方面，提供了药物组合物，该组合物包含(a)可选自SEQ ID NO:1-23和SEQID NO:46-50中的一种或多种寡核苷酸的反义寡核苷酸(ASO)；和(b)药学上可接受的载体。
根据另一方面，提供了商业包装，其包括(a)本文所述的反义寡核苷酸序列和药学上可接受的载体；和(b)其用于调节MCT4活性的用途的说明书。
在另一方面，提供了商业包装，其包括：(a)可选自SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:46-50的寡核苷酸的ASO；和(b)用于治疗癌症的说明书。
在另一方面，提供了治疗癌症的方法，该方法包括施用可具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列的反义寡核苷酸(ASO)。
在另一方面，提供了治疗癌症的方法，该方法包括施用具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列的MCT4反义寡核苷酸(ASO)。
在另一方面，提供了反义寡核苷酸(ASO)，其中所述寡核苷酸可具有选自以下的序列：(a)TCCCATGGCCAGGAGGGTTG(SEQ ID NO:1)；(b)GTCCCGGAAGACGCTCAGGT(SEQ ID NO:2)；(c)AAGGACGCAGCCACCATGCC(SEQ ID NO:3)；(d)TTGGCGTAGCTCACCACGAA(SEQ ID NO:4)；(e)AGATGCAGAAGACCACGAGG(SEQ ID NO:5)；(f)CCACTCTGGAATGACACGGT(SEQ ID NO:6)；(g)GTAGGAGAAGCCAGTGATGAC(SEQ ID NO:7)；(h)AGCATGGCCAGCAGGATGGA(SEQ ID NO:8)；(i)GGCTGGAAGTTGAGTGCCAA(SEQ ID NO:9)；(j)CATGCCGTAGGAGATGCCAA(SEQ ID NO:10)；(k)CTCAGGCTGTGGCTCTTTGG(SEQ ID NO:11)；(l)TAGCGGTTCAGCATGATGA(SEQ ID NO:12)；(m)AGCACGGCCCAGCCCCAGCC(SEQ ID NO:13)；(n)GAGCTCCTTGAAGAAGACACT(SEQ ID NO:14)；(o)CAGGATGGAGGAGATCCAGG(SEQ ID NO:15)；(p)AGACCCCCCACAAGCATGAC(SEQ ID NO:16)；(q)GAAGTTGAGTGCCAAACCCAA(SEQ ID NO:17)；(r)CCCGTTGGCCATGGGGCGCC(SEQ ID NO:18)；(s)GCCAGCCCGTTGGCCATGGG(SEQ ID NO:19)；(t)AGGAAGACAGGGCTACCTGC(SEQ ID NO:20)；(u)GCACACAGGAAGACAGGGCT(SEQ ID NO:21)；(v)CAGGGCACACAGGAAGACAG(SEQ ID NO:22)；(w)CAGCAGTTGAGCAGCAGGCC(SEQ ID NO:23)；(x)ATGGCCAGGAGGGTTG(SEQ ID NO:46)；(y)CATGGCCAGGAGGGTT(SEQ ID NO:47)；(z)CCATGGCCAGGAGGGT(SEQ ID NO:48)；和(aa)CCCATGGCCAGGAGGG(SEQ ID NO:49)。
在另一方面，提供了药物组合物，该组合物包含(a)反义寡核苷酸(ASO)，其具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列；和(b)药学上可接受的载体。
在另一方面，提供了具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列的反义寡核苷酸(ASO)用于治疗癌症的用途。
在另一方面，提供了具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列的反义寡核苷酸(ASO)在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在另一方面，提供了组合疗法，该组合包含(a)反义寡核苷酸(ASO)，其具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列；和(b)多西他赛。组合疗法还可包含药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一方面，提供了商业包装，其包括具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列的ASO；以及用于治疗癌症的说明书。
反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO:46-49的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:1的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:2的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:3的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:4的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:5的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:6的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:7的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQID NO:8的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:9的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:10的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:11的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:12的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:13的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:14的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:15的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:16的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ IDNO:17的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:18的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:19的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:20的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:21的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:22的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:23的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:46的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:47的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ IDNO:48的序列。反义寡核苷酸(ASO)可具有SEQ ID NO:49的序列。
ASO还可包含经修饰的核苷间连键。经修饰的核苷间连键可为肽-核酸连键、吗啉代连键、N3’至P5’氨基磷酸酯连键、甲基膦酸酯连键或硫代磷酸酯连键。经修饰的核苷间连键可为肽-核酸连键。经修饰的核苷间连键可为吗啉代连键。经修饰的核苷间连键可为N3’至P5’氨基磷酸酯连键。经修饰的核苷间连键可为甲基膦酸酯连键。经修饰的核苷间连键可为硫代磷酸酯连键。ASO还可包含经修饰的糖部分。所述经修饰的糖部分可为2'-O-烷基寡核糖核苷酸。ASO可具有2'MOE缺口聚物(gapmer)修饰。ASO还可包含经修饰的核碱基。经修饰的核碱基可为5-甲基嘧啶或5-丙炔基嘧啶。该细胞可为人细胞。该癌症可能特征在于升高的MCT4表达。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；宫颈癌；肝癌；膀胱癌；和小细胞肺癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；宫颈癌；肝癌；和膀胱癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；宫颈癌；和肝癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；和宫颈癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；和乳腺癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；和肾细胞癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；和小细胞肺癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；宫颈癌；肝癌；和小细胞肺癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；宫颈癌；膀胱癌；和小细胞肺癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；肝癌；膀胱癌；和小细胞肺癌。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；宫颈癌；肝癌；膀胱癌；和小细胞肺癌。该癌症可为前列腺癌。前列腺癌可为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；肝癌；和膀胱癌。前列腺癌可为耐恩杂鲁胺(ENZ)的CRPC。该癌症可为转移性前列腺癌。ASO可以与MCT4的mRNA基本上互补。ASO可经静脉内施用。ASO可局部施用至组织。可将ASO在施用前与脂质颗粒混合。可将ASO在施用前封装于脂质体中。
ASO还可包含经修饰的核苷间连键。经修饰的核苷间连键可为肽-核酸连键、吗啉代连键、N3’至P5’氨基磷酸酯连键、甲基膦酸酯连键或硫代磷酸酯连键。ASO还可包含经修饰的糖部分。该经修饰的糖部分可为2'-O-烷基寡核糖核苷酸。ASO还可具有2'MOE缺口聚物修饰。ASO还可包含经修饰的核碱基。经修饰的核碱基可为5-甲基嘧啶或5-丙炔基嘧啶。
该细胞可为人细胞。该癌症可能特征在于升高的MCT4表达。该癌症可选自以下的一种或多种：前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；宫颈癌；肝癌；膀胱癌；和小细胞肺癌。前列腺癌可为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。前列腺癌可为耐恩杂鲁胺(ENZ)的CRPC或转移性CRPC(mCRPC)。
ASO可以与MCT4的mRNA基本上互补。ASO可经静脉内施用。ASO可局部施用至组织。可将ASO在施用前与脂质颗粒混合。可将ASO在施用前封装于脂质体中。利用手术、辐射(短距离放射治疗或外部束)或其它疗法(如HIFU)的情况下，反义寡核苷酸可用作新佐剂疗法(之前)、辅助疗法(期间)和/或佐剂疗法(之后)。例如，MCT4反义寡核苷酸可与多西他赛、MDV3100或葡萄糖代谢的调节剂(包括多西环素或其它线粒体抑制剂)组合使用。
附图简述
图1显示了来自可从温哥华前列腺中心组织库(Vancouver Prostate CentreTissue Bank)获得的患者来源的前列腺癌样品的组织微阵列(TMA)中的MCT4表达，并针对MCT4表达进行染色，其中A)和B)显示了证实升高的MCT4表达与高格里森分级(Gleasongrade)相关的条形图；C)显示了这样的图，其中如通过血清PSA的增加所测量的，高MCT4表达与较早的复发时间相关；以及D)和E)显示代表经历延长的新佐剂激素疗法(NHT)的患者的两个条形图，并且那些患有CRPC的患者也显示出升高的MCT4表达。
图2显示了在体外使用PC-3细胞进行的靶向MCT4的ASO用于抑制MCT4表达和细胞增殖的功效筛选，其中MCT4 ASO#1(SEQ ID NO:1)和#14(SEQ ID NO:5)以剂量依赖性方式发挥其体外作用，并且转染后96小时后该作用持续：A)显示了PC-3细胞中的MCT4的siRNA-沉默显示出对细胞增殖的显著抑制，表明抑制MCT4表达可能具有潜在的治疗功效；B)显示了筛选的10种靶向MCT4的ASO揭示出对细胞增殖的不同抑制作用，其中序列#1(SEQ ID NO:1)和#14(SEQ ID NO:5)显示出最明显的抑制；C)如通过qPCR和蛋白质印迹所测量的，显示了MCT4 ASO诱导不同水平的MCT4敲低，其中ASO#1和#14是最有效的；D)显示了在MCT4mRNA表达与所得的细胞数量之间存在强相关性(p<0.001)，表明对细胞增殖的抑制作用与降低的MCT4表达强烈相关(虚线表示95％置信区间)；E)其中转染5nM至200nM的MCT4 ASO显示了MCT4的细胞增殖和表达的抑制同样是剂量依赖性的(对于ASO#14，IC50＝32nM；对于ASO#1，IC50＝50nM)；和F)显示了时程实验证明MCT4 ASO转染后细胞增殖和MCT4表达的抑制持续长达转染后至少96小时。
图3显示了MCT4 ASO#1(SEQ ID NO:1)和#14(SEQ ID NO:5)在体外针对除抗PC-3以外的人前列腺癌细胞有效，但针对小鼠前列腺癌细胞无效：A)显示了候选MCT4 ASO也能够以剂量依赖性方式抑制C4-2人前列腺癌细胞增殖和MCT4的表达，其IC50值与用PC-3细胞观察到的那些IC50值相当；B)显示了候选MCT4 ASO也以剂量依赖性方式抑制DU145人前列腺癌细胞增殖，其IC50值与用其它细胞系获得的那些IC50值类似，其中细胞增殖的抑制伴随着MCT4表达的降低；和C)显示了候选MCT4 ASO对TRAMPC2小鼠前列腺癌细胞没有任何可察觉的作用，并且即使在200nM的最高测试浓度下它们也不影响细胞增殖和小鼠MCT4表达水平，表明所测试的ASO对人MCT4有特异性，并且细胞增殖的抑制是与MCT4敲低有关的现象。
图4显示了候选MCT4 ASO的转染导致了PC-3细胞葡萄糖代谢的抑制：A)显示了MCT4 ASO显著抑制乳酸分泌，并且在转染后48小时也观察到相应的细胞内乳酸盐积聚和葡萄糖消耗的抑制(ud＝不可检测)；和B)显示了糖酵解途径以及由MCT4敲低引起的且通过参与糖酵解和乳酸转化的各种基因的基因表达水平的qPCR分析进行表征的代谢变化的示意图，其中糖酵解中各种基因表达的显著降低表明葡萄糖代谢的总体降低，并且LDHA和PDK1的表达降低表明丙酮酸盐离开乳酸产生而重新定向至用于氧化磷酸化的TCA循环。
图5显示了基于每天用腹膜内注射10mg/kg的MCT4 ASO#1(SEQ ID NO:1)、#14(SEQID NO:5)、对照ASO或媒介物(PBS)处理，持续5天，然后停止处理2天，持续总共15天的具有皮下PC-3肿瘤的无胸腺裸鼠，在体内MCT4 ASO-诱导的PC-3肿瘤细胞中MCT4表达减少与PC-3肿瘤生长的抑制相关，特征在于凋亡增加和细胞增殖抑制：A)显示了代表根据处理日的肿瘤体积百分比的图，其就肿瘤生长速率而言比较了MCT4 ASO；B)显示了代表用可归因于细胞凋亡增加和细胞增殖减少的MCT4 ASO处理后半胱天冬酶3阳性细胞和Ki-67阳性细胞百分比的条形图；和C)显示了如通过IHC染色所测量的，用MCT4 ASO处理减少了肿瘤中的MCT4表达。
图6显示了靶向MCT4的ASO在体内增加了免疫细胞聚集并改变肿瘤-相关的免疫细胞比例(即NK细胞和CD3阳性细胞)：A)显示了其中用MCT4 ASO处理的免疫调节作用部分通过显著增加此类免疫细胞聚集的程度而发挥作用的条形图；B)显示了其中用MCT4 ASO处理增加了与肿瘤相关的NK细胞的比例的条形图；和C)显示了与对照相比，在MCT4 ASO的存在下，代表作为激活的NK细胞的标志物的CD3阳性细胞(因为裸鼠缺乏T细胞)的比例的条形图。
图7显示了候选的靶向MCT4的ASO能够抑制转染后48小时LNCaP人前列腺癌细胞的细胞增殖和MCT4表达：A)显示了MCT4ASO能够将LNCaP细胞增殖抑制至用其它人前列腺癌细胞系观察到的那些水平相当的水平；和B)显示了细胞增殖减少与MCT4表达减少相关，这表明相比与雄激素受体状态，MCT4 ASO的抑制作用可能与糖酵解表型更相关。
图8显示了候选MCT4 ASO能够在体外抑制PC-3细胞迁移和组织侵袭；A)显示了用候选MCT4 ASO处理PC3细胞导致抑制通过Transwell的细胞迁移，如由观察到的迁移细胞数量减少所指示的；和B)显示了用MCT4 ASO处理还抑制了PC-3细胞侵袭基质胶(Matrigel)的能力，并且表明MCT4-介导的乳酸分泌可在癌症转移中起重要作用。
图9显示了用MCT4 ASO处理裸鼠不会引起如通过动物重量所测量的宿主毒性：A)显示了在整个体内研究持续期间的动物重量的图，并且用MCT4 ASO处理并不显著影响每组的平均动物重量；B)显示了在整个处理期间各个动物重量也保持稳定。
图10显示了用SEQ ID NO:5ASO、甲福明、多西环素、多西他赛和MDV3100处理后48小时评估的总活细胞数的比较，其中相较于单独的甲福明、多西环素、多西他赛和MDV3100中的每一种以及与它们中的每一种的组合，对SEQ ID NO:5ASO进行了测试，(A)显示了SEQID NO:5ASO和甲福明的总的活PC3细胞数；(B)显示了SEQ ID NO:5ASO和多西环素的总的活PC3细胞数；(C)显示了SEQ ID NO:5ASO和多西他赛的总的活PC3细胞数；和(D)显示了SEQID NO:5ASO和MDV3100的总的活C4-2细胞数。
详述
本文中任何未直接定义的术语都应被理解为具有如在本发明领域理解的通常与它们相关的含义。下文或说明书中的其它地方论述了某些术语，以给从业者提供对描述实施方案的组合物、装置、方法等以及如何制备和使用它们的另外指导。应理解，同样的事情可以用超过一种方式来说。因此，可替代的语言和同义词可以用于本文论述的任何一个或多个术语。是否在本文阐述或论述术语没有意义。提供了一些同义词或可替代的方法、材料等。除非明确说明，否则对一个或一些同义词或等同物的叙述不排除使用其它同义词或等同物。在说明书中使用的实例(包括术语的实例)仅用于说明性目的，并不限制本文描述的实施方案的范围和含义。
提供用于“治疗”癌细胞的方法，其中治疗意在涵盖防止细胞增殖、改善与癌症相关的症状以及根除癌细胞。本文所用的术语“治疗”也意在包括在癌症的任何阶段进行的施用，包括化合物的早期施用或晚期施用。本领域技术人员将理解，术语“改善”意在包括使罹患癌症的对象更容忍癌症的前景(例如，通过减少肿瘤负荷)。本领域技术人员还应该理解与癌症相关的术语“根除”将包括全部或部分地从对象中消除癌细胞。因此，如本文所用，“治疗”可以指防止对象中的癌细胞增殖，改善与癌症相关的症状，根除对象的癌症，或它们的组合。
反义寡核苷酸化合物通常是单链RNA化合物，其结合至互补RNA化合物(诸如靶mRNA分子)并通过立体干扰正常翻译机制阻断互补RNA化合物的翻译。这个过程通常是被动的，因为它不需要或涉及另外的酶来介导RNA干扰过程。反义RNA化合物抑制所需基因表达的特异性靶向可能通常涉及设计反义RNA化合物以具有与所需基因同源的互补序列。RNA干扰效应不必完全同源。在本发明的一个实施方案中，反义RNA化合物包括具有足够的互补同源性以结合MCT4mRNA转录物，从而导致MCT4蛋白翻译减少的任何RNA化合物。在本发明的另一个实施方案中，反义RNA化合物包括具有足够的互补同源性以结合MCT4mRNA转录物，从而导致MCT4蛋白翻译减少的任何RNA化合物。反义化合物可以被修饰以增强寡核苷酸的稳定性，特别是用于在体内使用。用于设计和优化反义RNA化合物的方法的许多实例见于期刊文献(即Pan和Clawson 2006；Patzel 2007；Peek和Behlke 2007)。完全序列互补性对于反义化合物调节靶基因表达不是必需的。本申请的发明人提供了调节MCT4表达的反义化合物的非限制性实例。
如本文所述(参见表A和B)或如本文所述使用的反义寡核苷酸序列可通过诸如植入物、移植物、假体、支架等的医疗装置或器具施用。此外，可以设计旨在含有和释放此类化合物或组合物的植入物。一个实例是由适于在一段时间内释放化合物的聚合物材料制成的植入物。
下表A中显示所有测试的MCT4 ASO的抑制百分比。通常，50％的抑制被认为对MCT4ASO有效。
表A：MCT4 ASO序列和MCT4抑制百分比.
本文提供了靶向MCT4的反义寡核苷酸(ASO)。本文所述的方法涵盖了将MCT4 ASO用于施用于细胞。如在实施例部分中使用的一些ASO具有经修饰的核苷间连键。特别地，ASO在所有核苷之间都具有硫代磷酸酯连键。MCT4 ASO是具有经修饰的硫代磷酸酯连键的16至20-mer寡核苷酸。然而，MCT4 ASO的变体也可具有未修饰的磷酸二酯连键或部分修饰的连键(即1-19个的任何整数的硫代磷酸酯连键或其它修饰的连键)。可替代的修饰在本领域中也是已知的。
本文提供了靶向MCT4的长度为16至20-mer的反义寡核苷酸(ASO)。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，也可以使用包含SEQ ID NO:1-23或SEQ ID NO.46-49的16、19或20个核苷酸的生物活性寡核苷酸。
硫代磷酸酯寡核苷酸键修饰通过用硫替代一个非桥接氧来改变磷酸酯连键。硫代磷酸酯连键的引入改变了寡核苷酸的化学特性。特别地，加入硫代磷酸酯连键减少了寡核苷酸的核酸酶降解，从而增加了原位半衰期。因此，这种修饰对于反义寡核苷酸是特别有用的，其在引入细胞或生物基质中时可以与靶核酸相互作用以沉默特定转录物的表达。含有硫代磷酸酯连键的寡核苷酸通过直接阻断翻译或使靶转录物能够进行酶促降解(例如经由RNA酶H)实现这个壮举。
虽然硫代磷酸酯连键提供了提高的半衰期，但是将这些连键引入寡核苷酸中也可能会引起对其作为反义寡核苷酸的功能的限制。每个硫代磷酸酯连键在每个键处产生手性中心，这可能导致合成期间产生的寡核苷酸的多种异构体，并且异构体可能具有不同的特征和功能特性。然而，通过仔细定位修饰或通过使用与硫代磷酸酯键结合的另外修饰，可以缓解大部分异构体效应。
寡核苷酸部分的一个或多个硫代磷酸二酯连键可以通过用诸如-NH、-CH2或-S的类似物替代连键的两个桥接氧原子中的一个或两个来修饰。也可以使用本领域已知的其它氧类似物。
如本文所用的“经修饰的寡核苷酸”意在包括经取代或修饰的寡核苷酸。除了天然存在的主要碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶或其它天然碱基诸如肌苷、脱氧肌苷和次黄嘌呤之外，还有许多其它修饰。例如，也可以使用等排的嘌呤2'脱氧呋喃糖苷类似物、2'-脱氧水粉蕈素(2'-deoxynebularine)或2'脱氧黄苷，或其它嘌呤和嘧啶类似物诸如5-甲基嘧啶或5-丙炔基嘧啶来改善稳定性和靶标杂交。
如本文所用的“经修饰的糖”在论述寡核苷酸部分时，经修饰或经替代为核糖、葡萄糖、蔗糖或半乳糖或任何其它糖的糖。可选地，寡核苷酸可使其糖中的一个或多个在其2'位置被取代或修饰，即2'烷基或2'-O-烷基。2'-O-烯丙基糖的一个实例是2'-O-甲基核糖核苷酸。此外，寡核苷酸可以使其糖中的一个或多个被取代或修饰以形成α-异头糖。
如本文所用的“第二代”寡核苷酸可以被定义为对细胞核酸酶降解具有耐受性并且能够以与第一代ASO相等或比第一代ASO高的亲和力与其靶mRNA特异性杂交的寡核苷酸。第二代ASO的实例是2'-O-(2-甲氧基乙基)-RNA(2'MOE缺口聚物修饰)。对于2'-MOE缺口聚物，5'和3'末端可以具有2'-MOE修饰的核苷酸以保护其免受降解，但是5’和3’末端之间的缺口可以是未修饰的磷酸二酯连键。许多其它化学修饰已被开发用于改善ASO。例如，吗啉代、N3’至P5’氨基磷酸酯和甲基膦酸酯化学修饰在本领域中是已知的(N.Dias和C.A.Stein2002)。此外，也可以使用肽核酸(PNA)。
表B中显示了SEQ ID NO:1的测试的16mer截短物的比对以及它们的MCT4抑制％，
表B：SEQ ID NO 1与16mer截短物的比对
SEQ ID NO 序列 MCT4抑制％
1 TCCCATGGCCAGGAGGGTTG 65.52
46 ATGGCCAGGAGGGTTG 76.03
47 CATGGCCAGGAGGGTT 81.21
48 CCATGGCCAGGAGGGT 77.65
49 CCCATGGCCAGGAGGG 65.76
50 TCCCATGGCCAGGAGG 30.52
本文所述的化合物可与如本领域技术人员显而易见的示踪化合物、脂质体、碳水化合物载体、聚合物载体或其它试剂或赋形剂分开，或可与其连接，或与其组合。在替代实施方案中，此类化合物还可包含另外的药物，其中此类化合物可以以药理学有效量存在。
本文所用的术语“药物”是指可施用给患者或测试对象且能够在所述患者或测试对象中产生作用的组合物。所述作用可以是化学的、生物的或物理的，并且所述患者或测试对象可以是人类或非人类动物，诸如啮齿动物(例如转基因小鼠、小鼠或大鼠)、狗、猫、牛、绵羊、马、仓鼠、豚鼠、兔或猪。药物可以包含单独的有效化学实体或与药学上可接受的赋形剂组合的有效化学实体。
术语“药学上可接受的赋形剂”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗微生物剂或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可适用于静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鞘内、局部或经口施用。赋形剂可以包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌水溶液或分散体。使用此类介质来制备药物是本领域已知的。
根据本文所述的一些方案的组合物或化合物可以以多种已知途径中的任一种施用。可适用于施用化合物的方法的实例包括经口、静脉内、吸入、肌内、皮下、局部、腹膜内、直肠内或阴道内栓剂、舌下等。本文所述的化合物可以在适当的情况下作为无菌水溶液施用，或者可以以脂溶性赋形剂或以另一种溶液、悬浮液、贴剂、片剂或糊剂形式施用。包含本文所述的化合物的组合物可以经配制用于通过吸入施用。例如，化合物可以与赋形剂组合以允许分散在气溶胶中。吸入制剂的实例对于本领域技术人员是已知的。可以包括与本文所述的化合物组合的其它试剂以帮助摄取或代谢，或延迟在宿主内的分散，例如在控释制剂中。控释制剂的实例对于本领域技术人员是已知的，并且可以包括微胶囊、碳水化合物或聚合物基质内的栓塞等。本领域已知的用于制备制剂的其它方法可见于例如“Remington’sPharmaceutical Sciences”,(第19版),ed.A.Gennaro,1995,Mack Publishing Company,Easton,Pa。
本文所述的一些方案的组合物或化合物的剂量可根据施用途径(经口、静脉内、吸入等)和施用组合物或化合物的形式(溶液、控释等)变化。确定适当的剂量在本领域技术人员的能力范围内。如本文所用，化合物的“有效量”、“治疗有效量”或“药理学有效量”是指以产生经使用该化合物的术语递送的治疗水平的化合物的浓度存在的本文所述的ASO的量。这可能取决于递送模式，剂量的时间段，接受化合物的对象的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食。确定有效量的方法是本领域已知的。应理解，可能潜在有益的是将本文所述的化合物限制递送至需要抑制MCT4表达的靶组织或细胞中。还应理解，可取的是将本文所述的化合物靶向至所需组织或细胞类型。因此，本文所述的化合物可偶联至靶向部分。该化合物可偶联至细胞摄取部分。该靶向部分还可以发挥细胞摄取部分的功能。
通常，可使用本文所述的反义寡核苷酸而不引起显著毒性。本文所述的化合物的毒性可使用标准技术确定，例如通过在细胞培养物或实验动物中测试和测定治疗指数即LD50(50％群体致死的剂量)与LD100(100％群体致死的剂量)之间的比率。然而，在一些情况下，诸如在若干种疾病情况下，可能适当的是施用显著过量的组合物。本文所述的一些反义寡核苷酸可能在一些浓度下是有毒性的。滴定研究可用于确定毒性和非毒性浓度。可通过检查跨越细胞系的特定反义寡核苷酸的特异性来评价毒性。如果该化合物对其它组织具有任何影响，则可使用动物研究以提供适应症。
在一些实施方案中，本文所述的至少一种反义寡核苷酸可用于例如且不限于治疗癌细胞。如本文所用，“至少一种”旨在意指一种或多种，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27种等。
在一些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸可以，例如但不限于，与针对选自其中观察到MCT4表达升高的恶性肿瘤的至少一种适应症的其它治疗方法组合使用。这些包括但不限于在包括人类在内的哺乳动物中的前列腺癌；肾细胞癌；乳腺癌；宫颈癌；肝癌；膀胱癌；和小细胞肺癌。利用手术、辐射(短距离放射治疗或外部束)或其它疗法(例如，HIFU)的情况下，反义寡核苷酸可用作新佐剂疗法(之前)、辅助疗法(期间)和/或佐剂疗法(之后)。例如，本文所述的MCT4反义寡核苷酸可以与多西他赛、MDV3100或与葡萄糖代谢调节剂(包括多西环素或其它线粒体抑制剂)组合使用。
方法和材料
关于本文所述的实施例，采用以下方法和材料。
细胞培养物
人PC-3和DU145CRPC细胞、人LNCaP前列腺癌细胞和小鼠TRAMPC2前列腺癌细胞购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)；C4-2CRPC细胞来自温哥华前列腺中心(Vancouver Prostate Centre)(Vancouver,BC,Canada)。将人单层培养物维持在补充有10％胎牛血清(FBS)(GE Healthcare HycloneTM,Logan,UT)的RPMI-1640(GE Healthcare HycloneTM,Logan,UT)中，而将TRAMPC2细胞维持在补充有5％FBS的DMEM(GE Healthcare HycloneTM,Logan,UT)中。对于细胞计数，将细胞胰蛋白酶化以形成单细胞悬液并使用TC20自动细胞计数器(TC20Automated Cell Counter，Bio-Rad,Hercules,CA)计数。通过台盼蓝排除评估细胞活力。
人前列腺癌组织微阵列(TMA)构建和免疫组织化学
使用具有患者书面知情同意书、临床信息和机构研究批准的从温哥华前列腺中心组织库获得的各种格里森分级-展示前列腺癌样本(n＝342)，如前所述(Chiang等,2014；Thomas等,2011)，手动构建TMA。除了经由经尿道前列腺切除术(TURP)获得的CRPC样品外，所有样本均通过根治性前列腺切除术获得。使用具有酶标记的生物素-链霉亲和素系统的VentanaTM自动染色仪(型号Discover Discover XTTM；Ventana Medical SystemTM,Tucson,AZ)和耐溶剂的DAB Map试剂盒(VentanaTM)进行免疫组织化学染色。由训练有素的病理学家以四点量表对染色强度进行评分：0代表任何肿瘤细胞上无染色，1代表微弱或局灶、可疑存在的染色，2代表在少数细胞中令人信服的强度的染色，以及3代表了大多数细胞中令人信服的强度的染色。
抗体
使用以下抗体和缀合物：兔抗-MCT4抗体(Santa CruzTM,Santa Cruz,CA；WB 1:4000,IHC 1:100)，小鼠抗-纽蛋白抗体(SigmaTM；WB1:1000)，兔抗-裂解的半胱天冬酶3抗体(Cell Signalling TechnologyTM,Danvers,MA；IHC 1:50)，小鼠抗-Ki67抗体(DakoTM,Burlington,ON；IHC 1:50)，大鼠抗-CD31抗体(DianovaTM,Hamburg,Germany；IHC1:20)，小鼠抗-泛-T细胞标志物CD3抗体(DakoTM；IHC 1:50)，生物素化小鼠抗-NK1.1(CedarlaneTM,Burlington,ON；IHC 1:100)，IRDye800CW山羊抗-小鼠抗体(Li-Cor BiosciencesTM,Lincoln,NE；WB1:10,000)，IRDye 680RD山羊抗-兔抗体(Li-Cor BiosciencesTM；WB1:10,000)，生物素化山羊抗-兔抗体(Vector LaboratoriesTM,Burlingame,CA；IHC 1:200)，生物素化山羊抗-大鼠抗体(Vector LaboratoriesTM；IHC1:200)和生物素化山羊抗-小鼠抗体(Vector LaboratoriesTM；IHC 1:200)。
ASO设计和选择
通过选择含有有利基序同时排除不利基序的序列来合理设计针对人MCT4的第一代硫代磷酸酯-修饰的ASO(Matveeva等,2000)。使用BLAST评价与人和小鼠基因(20个碱基中有至少3个错配)相比靶向MCT4的序列的特异性。选择与全部人MCT4转录物变体(NM_001042422.2、NM_001042423.2、NM_001206950.1、NM_001206951.1、NM_001206952.1和NM_004207.3)完全互补的分布于转录物整个长度的十个序列SEQ ID No:1、4、5、9、11、30、36、37、40和41(参见表A)，并由Eurofins MWG Operon合成。通过使用qPCR和蛋白质印迹测定细胞转染后48小时靶mRNA和蛋白表达来测试这十个ASO的敲低效率。选择两个候选ASO(分别为#1和#14-SEQ ID NO:1和5)用于进一步研究。序列：ASO#1(SEQ ID NO:1)，5’-TCCCATGGCCAGGAGGGTTG-3’；ASO#14(SEQ ID NO:5)，5’-AGATGCAGAAGACCACGAGG-3’；公开的非靶向对照ASO，5’-CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC-3’(Mullick等,2011；Samuel等,2006)。
基于本领域常识和本文提供的信息，本领域技术人员将能够合成本文所述的ASO或修饰本文所述的ASO。
ASO和siRNA转染
按照制造商的说明书，将细胞在6孔板中使用OligofectamineTM(InvitrogenTM,Carlsbad,CA)用100nM的ASO转染48小时(除非另有说明)，或使用LipofectamineTM2000(InvitrogenTM)用50nM的靶向MCT4的siRNA和对照(DharmaconTM,Chicago,IL)转染48小时。
定量PCR
使用RNeasy Mini KitTM(Qiagen Inc.TM,Hilden,Germany)分离总RNA，并使用QuantiTect Reverse Transcription KitTM(QiagenTM)合成cDNA。使用Primer-BLASTTM设计引物。在ViiA 7Real-Time PCRTM系统(Applied BiosystemsTM,Foster City,CA)中以一式三份进行使用KAPA SYBR Fast UniversalTM(Kapa BiosystemsTM,Woburn,MA)的qRT-PCR反应。将靶基因归一化至3个内参基因的几何平均值(Vandesompele等,2002)。
蛋白质印迹
收获细胞，并将其在补充有完整蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Nutley,NJ)的RIPA缓冲液(50mM Tris-Cl pH 7.4,150mM NaCl,1％Igepal,0.5％脱氧胆酸钠,0.1％SDS)中裂解。通过Pierce BCA Protein AssayTM(Thermo ScientificTM,Waltham,MA)测定裂解物的蛋白质浓度。将裂解物在8％SDS聚丙烯酰胺凝胶(每条泳道20ug蛋白质)上运行，并将蛋白质转移到PVDF膜(MilliporeTM,Billerica,MA)上。将印迹用OdysseyTM封闭缓冲液(Li-corBiosciencesTM)封闭并用抗-MCT4抗体探测。纽蛋白用作上样对照。在4℃下孵育过夜后，将一抗用相应的二抗探测，并使用Odyssey Infrared Imaging SystemTM(Li-corBiosciencesTM)和Image Studio Version 3.1TM(Li-cor BiosciencesTM)检测。使用ImageJ(美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health),Bethesda,MD)完成密度测定分析。
改良的博伊登室测定
如前所述(Chiang等,2014)，使用基质胶-涂覆的改良博伊登室(BD BioscienceTM,San Jose,CA)研究用MCT4 ASO处理后PC-3细胞的迁移和侵袭潜力。简而言之，将ASO-处理的细胞以每孔50,000个活细胞接种在上室中。然后在48小时后使用含有钙黄绿素AMS(12.5mM；TrevigenTM)的解离缓冲液(TrevigenTM,Gaithersburg,MD)将细胞再悬浮。通过使用Infinite F500荧光计TM(TecanTM,Switzerland)对细胞悬液进行荧光测量(485nm激发，520nm发射)来测定下室中迁移/侵袭的细胞的数量。
乳酸盐和葡萄糖测定
评估用ASO转染48小时的PC-3细胞的乳酸盐和葡萄糖水平。将细胞用新鲜培养基孵育4小时。然后在使用乳酸盐测定试剂盒(Lactate Assay Kit，BioVision)测定乳酸盐浓度和使用葡萄糖测定试剂盒TM(Glucose Assay KitTM，BioVision TM)测定葡萄糖浓度之前，将培养基的样品取出并采用10K Spin ColumnsTM(BioVisionTM,Milpitas,CA)脱蛋白。通过在MQH2O中裂解ASO-转染的细胞来测定细胞内乳酸盐水平。通过归一化至活细胞总数来确定终浓度。
用MCT4 ASO处理PC-3荷瘤裸鼠
将PC-3细胞(在1:1HBSS:基质胶中的106个细胞)皮下注射到24只雄性无胸腺裸鼠(Simonsen LaboratoriesTM,Gilroy,CA)的两侧。一旦平均肿瘤体积达到大约100mm3，将小鼠随机分成四组，并每天用腹膜内注射10mg/kg的MCT4 ASO#1(SEQ ID NO:1)、#14(SEQ IDNO:5)、对照ASO或媒介物(PBS)处理，持续5天，然后停止处理2天，持续总共15天。在整个研究过程中通过测量体重和检查异常行为诸如嗜睡、缺乏水合作用和另外的虚弱迹象来监测小鼠的健康。每周测量两次肿瘤大小，并使用以下公式计算肿瘤体积：体积＝长度×宽度×深度×0.5236(mm3)。在用于组织收获的最终剂量后1小时处死小鼠。
肿瘤组织的免疫组织化学
将肿瘤组织用福尔马林固定并石蜡包埋以用于免疫组织化学分析。如前所述(Wang等,2005)，将组织切片、探测并用DAB(SigmaTM)染色。对于Ki-67和裂解的半胱天冬酶3染色，每个肿瘤取得放大400倍的5个随机视野的图像，并对细胞计数以确定阳性染色细胞的百分比。对于MCT4，每个肿瘤取得放大200倍的五个随机视野的图像，并且使用以下公式通过评分百分比评估染色强度：强度＝(％面积评分3)×3+(％面积评分2)×2+(％面积评分1)×1。在CD31染色后，通过在200倍放大率下对每个肿瘤的聚集物的五个最显著的区域进行成像并确定它们所占据的视野的面积百分比来量化免疫细胞聚集物的程度。将免疫细胞的比例评价为归一化至在相同的五个显著区域中由免疫细胞聚集物占据的面积的阳性染色面积。
统计学分析
所有汇集的结果均以平均值±SEM表示。使用GraphPad Prism 6TM(GraphPadSoftware,Inc.,La Jolla,CA)进行统计分析。进行学生t检验以比较两组之间的平均值。使用单向ANOVA，然后使用事后邓尼特氏检验(Dunnett’s test)来比较多于两组的平均值。应用双向ANOVA，然后应用事后多重比较来比较肿瘤生长。进行偶然性检验以比较组织微阵列上的患者群组之间的染色强度。进行对数轶检验(Log-rank test)以比较患者存活曲线。进行卡方检验(Chi-squared test)以将MCT4表达水平与各种临床参数相关联。p值<0.05的结果被认为是统计学显著的，并且*表示p<0.05，**表示p<0.01且***表示p<0.001。
实施例
实施例1：升高的MCT4蛋白表达与CRPC相关
对由来自格里森3级、4级和5级人前列腺癌的组织组成的组织微阵列(TMA)针对MCT4蛋白染色。如图1A和B所示，相对于格里森3级和4级样本，格里森5级前列腺癌具有显著增加的MCT4蛋白表达。此外，升高的MCT4表达与来自初级治疗中通过血清PSA水平的增加所测量的较早的复发时间相关，其中对比表达低MCT4的群组的94.2个月的中位复发时间，表达高MCT4的群组的中位复发时间为63.3个月(图1C)。此外，高MCT4表达与同不良预后相关的其它临床特征相关，诸如在诊断和临床T阶段的较高的血清PSA水平(表C)。此外，在经受延长的新辅助激素疗法(>6个月)的患者和CRPC患者的肿瘤中发现了升高的MCT4蛋白表达(图1D和E)，表明在前列腺癌中升高的MCT4蛋白表达与CRPC的发展相关。
表C：患者样品中与高MCT4表达相关的临床-病理学特征
实施例2：MCT4的敲低抑制PC-3细胞增殖
使用靶向MCT4的siRNA和ASO研究了抑制MCT4表达的潜在治疗功效。使用人PC-3CRPC细胞，因为它们表现出不同的糖酵解代谢谱，即一种与MCT4表达相关的特性(Vaz等,2012)。如图2A所示，用MCT4siRNA处理PC-3细胞导致对细胞增殖的抑制，表明了MCT4敲低方法的潜在治疗功效。因此，设计了特异性靶向人MCT4的ASO。筛选的10种MCT4 ASO揭示出抑制PC-3细胞增殖和MCT4表达的不同能力，其中ASO#1(SEQ ID NO:1)和#14(SEQ ID NO:5)显示出最大的效力(图2B和2C)。在用各种ASO处理的PC-3细胞中降低的MCT4mRNA水平与所得的细胞数量之间存在强相关性(图2D)，表明ASO的生长抑制与MCT4敲低直接相关。
实施例3：MCT4 ASO抑制PC-3细胞增殖
另外表征了MCT4 ASO#1(SEQ ID NO:1)和#14(SEQ ID NO:5)的生长抑制活性。如图2E所示，两种ASO以剂量依赖性方式抑制PC-3细胞增殖，其中ASO#14(IC50＝26nM)比ASO#1(IC50＝50nM)稍微更有效。ASO还以剂量依赖性方式降低了MCT4mRNA水平，反映出它们抑制细胞增殖(IC50ASO#14＝32nM,IC50ASO#1＝50nM)。如图2F所示，即使在转染后96小时，两种ASO仍维持细胞增殖的抑制。虽然转染48小时后MCT4mRNA水平开始略微升高，但MCT4蛋白水平即使在96小时仍然保持较低。
实施例4：MCT4 ASO在多种人前列腺癌细胞系中发挥生长-抑制和MCT4表达减少的作用，但不导致小鼠MCT4表达减少
当将MCT4 ASO#1(SEQ ID NO:1)和#14(SEQ ID NO:5)转染至人C4-2CRPC细胞中时，它们抑制其增殖，其IC50值与用PC-3细胞观察到的那些IC50值相当，即ASO#1＝40nM，ASO#14＝27nM。类似地，它们减少了MCT4表达，其中ASO#1的IC50值为50nM，ASO#14的IC50值为26nM(图3A)。此外，当将ASO转染至人DU145前列腺癌细胞中时，观察到对细胞增殖和MCT4表达的类似抑制作用，其中IC50值几乎相同(图3B)。将ASO转染至LNCaP前列腺癌细胞中也显示出细胞增殖和MCT4表达的类似的抑制(图7)，表明相比雄激素受体状态，抑制作用与糖酵解表型更相关。重要的是，将MCT4 ASO#1和#14转染至小鼠TRAMPC2前列腺癌细胞中并未导致细胞增殖或小鼠MCT4表达的显著降低(图3C)。综上所述，该结果表明这些ASO特异性靶向人MCT4，并且它们对细胞增殖的抑制作用是MCT4敲低的结果。
实施例5：候选MCT4 ASO在体外抑制CRPC细胞中的葡萄糖代谢和组织侵袭/迁移
为了进一步检测靶向MCT4的ASO对前列腺癌细胞的影响，我们测量了它们对PC-3细胞的乳酸分泌、细胞内乳酸盐浓度和葡萄糖消耗的影响。如在转染48小时后测量的，用MCT4 ASO#1(SEQ ID NO:1)和#14(SEQ ID NO:5)转染细胞导致乳酸分泌的显著抑制、相应的细胞内乳酸盐积聚和葡萄糖消耗的大量减少(图4A)。此外，如图4B所示，用ASO处理导致参与糖酵解的各种基因即GAPDH、PGK1、PGAM1和ENO1的下调。此外，发现乳酸脱氢酶A(LDHA)的表达被抑制，表明丙酮酸盐向乳酸的转化减少。此外，发现丙酮酸脱氢酶激酶-1(PDK1)的表达降低，所述酶是一种将丙酮酸盐从TCA循环移开并促使其转化为乳酸的酶。因此，用MCT4 ASO进行处理导致有氧糖酵解的抑制。
用MCT4 ASO处理也抑制了改良博伊登室中PC-3细胞的迁移和组织侵袭(图8)，表明由MCT4促进的乳酸分泌也可在转移性过程中起重要作用。
实施例6：用MCT4 ASO处理的裸鼠中PC-3异种移植物的生长
用MCT4 ASO#1(SEQ ID NO:1)和#14(SEQ ID NO:5)处理具有皮下PC-3肿瘤的雄性无胸腺裸鼠共15天。如通过监测动物重量(图9)和行为所评估的，两种ASO均显著抑制肿瘤生长(图5A)而不诱导主要的宿主毒性。免疫组织化学分析揭示了，ASO-诱导的肿瘤生长抑制与细胞凋亡的增加(如通过裂解的半胱天冬酶3染色所测量的)以及细胞增殖的减少(如通过Ki-67染色所测量的)相关(图5B)。肿瘤生长的减少与MCT4蛋白表达减少相关(图5C)，这与MCT4敲低产生的抗增殖效应一致。来自每组的肿瘤的代表性图像显示出在对照肿瘤中存在强烈的膜染色，这在MCT4ASO-处理的肿瘤中不存在(显微照片未显示)。
实施例7：MCT4 ASO对裸鼠中肿瘤细胞聚集物的影响
由于乳酸-诱导的肿瘤酸化与局部宿主抗癌免疫性的抑制有关(Choi等,2013)，因此令人感兴趣的是确定用MCT4 ASO处理PC-3荷瘤裸鼠是否引起这些小鼠的局部宿主免疫响应改变，即使它们的免疫反应性非常有限。为此，量化了从CD31-阳性血管，特别是在肿瘤周边中的CD31-阳性血管外溢的免疫细胞聚集物。如图6A所示，与对照肿瘤相比，用两种MCT4 ASO处理的异种移植物具有显著更大的免疫细胞聚集物。当检查显微照片时，它们显示出免疫聚集物的特征在于与周围的肿瘤细胞不同的小的、圆形的、密集堆积的核的区域，并且针对CD31的染色揭示了这些免疫细胞已经外溢并围绕肿瘤周边的血管(显微照片未显示)。对裸鼠中自然杀伤(NK)细胞群(主要的细胞毒性免疫细胞亚型)的定量(Shultz等，2007)揭示了用MCT4 ASO进行处理显著增加了肿瘤-相关的NK细胞的比例(图6B)。此外，CD3促进NK细胞的激活(Koch等,2013)，该分子由于与T-细胞受体复合物结合而通常被认为是T-细胞标志物。其在NK细胞中的表达可通过免疫组织化学检测(Morice,2007)，并且鉴于裸鼠中不存在T细胞，其可用作NK细胞激活的指标(Lanier等,1992)。用MCT4 ASO进行的处理也显著改变了聚集物中存在的免疫细胞的组成，由此使用NK细胞标志物NK1.1进行染色揭示了与肿瘤相关的NK细胞的比例增加(显微照片未显示)。如图6C所示，CD3阳性细胞的比例随着MCT4 ASO处理而增加。同时染色揭示了与ASO-处理的肿瘤相关的激活的NK细胞的比例也增加，表明刺激了抗癌免疫性。
实施例8:与SEQ ID NO:5的组合疗法
以近似的IC50浓度筛选各种组合策略以确定是否可通过将当前癌症治疗剂(参见表D)与MCT4 ASO SEQ ID NO:5组合来发现协同效应。在图10A-C中，在用甲福明、多西环素和多西他赛单独处理以及与MCT4 ASO SEQ ID NO:5组合处理后48小时评估总的活PC3细胞数。然而，C4-2细胞用于测试MDV3100、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:5与MDV3100的组合(图10D)。多西他赛与MCT4 ASO SEQ ID NO:5的组合显示出组合指数＝0.780的协同效应。
表D：SEQ ID No.5、甲福明、多西环素、多西他赛、MDV3100的IC50浓度
药物 IC50浓度 药物类别
SEQ ID No.5 50nM MCT4抑制性ASO
甲福明 4mM 葡萄糖代谢调节剂
多西环素 15μM 可能的线粒体抑制剂
多西他赛 2.5nM 批准用于前列腺癌的化疗
MDV3100 50μM 批准用于前列腺癌的第二代抗雄激素药
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实例详细描述了本文描述的实施方案，但是根据本文所述的教导，本领域技术人员将显而易见的是可以对其进行改变和修改而不脱离所附权利要求的精神或范围。这样的修改包括用本发明的任何方面的已知等同物替代以便以基本相同的方式实现相同的结果。数字范围包括定义范围的数字。词语“包括”在本文中用作开放式术语，基本上等同于短语“包括但不限于”，并且词语“包含”具有相应的含义。如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个个/一种(an)”和“该”包括复数指示物。因此，例如，对“一件事”的提及包括多于一件这样的事情。本文参考文献的引用不是承认此类参考文献是本发明实施方案的现有技术。本发明包括基本上如本文所述并参考附图的所有实施方案和变型。
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Claims (59)

1.治疗癌症的方法，所述方法包括施用具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列的反义寡核苷酸(ASO)。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述ASO还包含经修饰的核苷间连键。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的核苷间连键是肽-核酸连键、吗啉代连键、N3’至P5’氨基磷酸酯连键、甲基膦酸酯连键或硫代磷酸酯连键。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述ASO还包含经修饰的糖部分。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述经修饰的糖部分是2'-O-烷基寡核糖核苷酸。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述ASO具有2'MOE缺口聚物修饰。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述ASO还包含经修饰的核碱基。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述经修饰的核碱基是5-甲基嘧啶或5-丙炔基嘧啶。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症的特征在于升高的MCT4表达。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自以下的一种或多种：前列腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌和小细胞肺癌。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述前列腺癌是耐恩杂鲁胺(ENZ)CRPC。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述ASO与MCT4的mRNA基本上互补。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述ASO经静脉内施用。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述ASO局部施用至组织。
17.如权利要求1所述的方法，其中将所述ASO在施用前与脂质颗粒混合。
18.如权利要求1所述的方法，其中将所述ASO在施用前封装于脂质体中。
19.反义寡核苷酸(ASO)，其中所述寡核苷酸具有选自以下的序列：
(a)TCCCATGGCCAGGAGGGTTG(SEQ ID NO:1)；
(b)GTCCCGGAAGACGCTCAGGT(SEQ ID NO:2)；
(c)AAGGACGCAGCCACCATGCC(SEQ ID NO:3)；
(d)TTGGCGTAGCTCACCACGAA(SEQ ID NO:4)；
(e)AGATGCAGAAGACCACGAGG(SEQ ID NO:5)；
(f)CCACTCTGGAATGACACGGT(SEQ ID NO:6)；
(g)GTAGGAGAAGCCAGTGATGAC(SEQ ID NO:7)；
(h)AGCATGGCCAGCAGGATGGA(SEQ ID NO:8)；
(i)GGCTGGAAGTTGAGTGCCAA(SEQ ID NO:9)；
(j)CATGCCGTAGGAGATGCCAA(SEQ ID NO:10)；
(k)CTCAGGCTGTGGCTCTTTGG(SEQ ID NO:11)；
(l)TAGCGGTTCAGCATGATGA(SEQ ID NO:12)；
(m)AGCACGGCCCAGCCCCAGCC(SEQ ID NO:13)；
(n)GAGCTCCTTGAAGAAGACACT(SEQ ID NO:14)；
(o)CAGGATGGAGGAGATCCAGG(SEQ ID NO:15)；
(p)AGACCCCCCACAAGCATGAC(SEQ ID NO:16)；
(q)GAAGTTGAGTGCCAAACCCAA(SEQ ID NO:17)；
(r)CCCGTTGGCCATGGGGCGCC(SEQ ID NO:18)；
(s)GCCAGCCCGTTGGCCATGGG(SEQ ID NO:19)；
(t)AGGAAGACAGGGCTACCTGC(SEQ ID NO:20)；
(u)GCACACAGGAAGACAGGGCT(SEQ ID NO:21)；
(v)CAGGGCACACAGGAAGACAG(SEQ ID NO:22)；
(w)CAGCAGTTGAGCAGCAGGCC(SEQ ID NO:23)；
(x)ATGGCCAGGAGGGTTG(SEQ ID NO:46)；
(y)CATGGCCAGGAGGGTT(SEQ ID NO:47)；
(z)CCATGGCCAGGAGGGT(SEQ ID NO:48)；和
(aa)CCCATGGCCAGGAGGG(SEQ ID NO:49)。
20.如权利要求19所述的ASO，其中所述ASO还包含经修饰的核苷间连键。
21.如权利要求20所述的ASO，其中所述经修饰的核苷间连键是肽-核酸连键、吗啉代连键、N3’至P5’氨基磷酸酯连键、甲基膦酸酯连键或硫代磷酸酯连键。
22.如权利要求19所述的ASO，其中所述ASO还包含经修饰的糖部分。
23.如权利要求22所述的ASO，其中所述经修饰的糖部分是2'-O-烷基寡核糖核苷酸。
24.如权利要求19所述的ASO，其中所述ASO具有2'MOE缺口聚物修饰。
25.如权利要求19所述的ASO，其中所述ASO还包含经修饰的核碱基。
26.如权利要求25所述的ASO，其中所述经修饰的核碱基是5-甲基嘧啶或5-丙炔基嘧啶。
27.如权利要求19-26中任一项所述的ASO，其用于治疗癌症。
28.药物组合物，所述组合物包含(a)反义寡核苷酸(ASO)，其具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列；和(b)药学上可接受的载体。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述ASO还包含经修饰的核苷间连键。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其中所述经修饰的核苷间连键是肽-核酸连键、吗啉代连键、N3’至P5’氨基磷酸酯连键、甲基膦酸酯连键或硫代磷酸酯连键。
31.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述ASO还包含经修饰的糖部分。
32.如权利要求30所述的药物组合物，其中所述ASO还包含经修饰的糖部分。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述经修饰的糖部分是2'-O-烷基寡核糖核苷酸。
34.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述ASO具有2'MOE缺口聚物修饰。
35.如权利要求28所述的药物组合物，其中所述ASO还包含经修饰的核碱基。
36.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述经修饰的核碱基是5-甲基嘧啶或5-丙炔基嘧啶。
37.商业包装，其包含：
a.ASO，其具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列；和
b.用于治疗癌症的说明书。
38.如权利要求37所述的商业包装，其中所述癌症选自以下的一种或多种：前列腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌和小细胞肺癌。
39.如权利要求37所述的商业包装，其中所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。
40.具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列的反义寡核苷酸(ASO)用于治疗癌症的用途。
41.具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列的反义寡核苷酸(ASO)在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
42.如权利要求40和41所述的用途，其中所述ASO还包含经修饰的核苷间连键。
43.如权利要求42所述的用途，其中所述经修饰的核苷间连键是肽-核酸连键、吗啉代连键、N3’至P5’氨基磷酸酯连键、甲基膦酸酯连键或硫代磷酸酯连键。
44.如权利要求40或41所述的用途，其中所述ASO还包含经修饰的糖部分。
45.如权利要求44所述的用途，其中所述经修饰的糖部分是2'-O-烷基寡核糖核苷酸。
46.如权利要求40或41所述的用途，其中所述ASO具有2'MOE缺口聚物修饰。
47.如权利要求40或41所述的用途，其中所述ASO还包含经修饰的核碱基。
48.如权利要求47所述的用途，其中所述经修饰的核碱基是5-甲基嘧啶或5-丙炔基嘧啶。
49.如权利要求40或41所述的用途，其中所述细胞是人细胞。
50.如权利要求40或41所述的用途，其中所述癌症的特征在于升高的MCT4表达。
51.如权利要求50所述的用途，其中所述癌症选自以下的一种或多种：前列腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌和小细胞肺癌。
52.如权利要求51所述的用途，其中所述前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。
53.如权利要求52所述的用途，其中所述前列腺癌是耐恩杂鲁胺(ENZ)CRPC。
54.如权利要求40或41所述的用途，其中所述ASO与MCT4的mRNA基本上互补。
55.如权利要求40或41所述的用途，其中所述ASO经静脉内施用。
56.如权利要求40或41所述的用途，其中所述ASO局部施用至组织。
57.如权利要求40或41所述的用途，其中将所述ASO在施用前与脂质颗粒混合。
58.如权利要求40或41所述的用途，其中将所述ASO在施用前封装于脂质体中。
59.组合疗法，所述组合包含(a)反义寡核苷酸(ASO)，其具有选自SEQ ID NO:1-23和SEQ ID NO:46-49中的一个或多个的序列；和(b)多西他赛。
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