ES2893294T3 - Inhibidores de oligonucleótidos antisentido (ASO) del transportador de monocarboxilato4 (MCT4) para su uso como agentes terapéuticos en el tratamiento de cáncer - Google Patents

Inhibidores de oligonucleótidos antisentido (ASO) del transportador de monocarboxilato4 (MCT4) para su uso como agentes terapéuticos en el tratamiento de cáncer Download PDF

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Abstract

Un oligonucleótido antisentido (ASO) MCT4, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: (a) TCCCATGGCCAGGAGGGTTG (SEQ ID NO:1); (b) GTCCCGGAAGACGCTCAGGT (SEQ ID NO:2); (c) AAGGACGCAGCCACCATGCC (SEQ ID NO:3); (d) TTGGCGTAGCTCACCACGAA (SEQ ID NO:4); (e) AGATGCAGAAGACCACGAGG (SEQ ID NO:5); (f) CCACTCTGGAATGACACGGT (SEQ ID NO:6); (g) GTAGGAGAAGCCAGTGATGAC (SEQ ID NO:7); (h) AGCATGGCCAGCAGGATGGA (SEQ ID NO:8); (i) GGCTGGAAGTTGAGTGCCAA (SEQ ID NO:9); (j) CATGCCGTAGGAGATGCCAA (SEQ ID NO: 10); (k) CTCAGGCTGTGGCTCTTTGG (SEQ ID NO:11); (1) TAGCGGTTCAGCATGATGA (SEQ ID NO:12); (m) AGCACGGCCCAGCCCCAGCC (SEQ ID NO:13); (n) GAGCTCCTTGAAGAAGACACT (SEQ ID NO:14); (o) CAGGATGGAGGAGATCCAGG (SEQ ID NO:15); (p) AGACCCCCCACAAGCATGAC (SEQ ID NO:16); (q) GAAGTTGAGTGCCAAACCCAA (SEQ ID NO:17); (r) CCCGTTGGCCATGGGGCGCC (SEQ ID NO: 18); (s) GCCAGCCCGTTGGCCAT GGG (SEQ ID NO:19); (t) AGGAAGACAGGGCTACCTGC (SEQ ID NO:20); (u) GCACACAGGAAGACAGGGCT (SEQ ID NO:21); (v) CAGGGCACACAGGAAGACAG (SEQ ID NO:22); (w) CAGCAGTTGAGCAGCAGGCC (SEQ ID NO:23); (x) ATGGCCAGGAGGGTTG (SEQ ID NO:46); (y) CATGGCCAGGAGGGTT (SEQ ID NO:47); (z) CCATGGCCAGGAGGGT (SEQ ID NO:48); y (aa) CCCATGGCCAGGAGGG (SEQ ID NO:49).

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de oligonucleótidos antisentido (ASO) del transportador de monocarboxilat04 (MCT4) para su uso como agentes terapéuticos en el tratamiento de cáncer
Campo de la invención
La presente invención proporciona compuestos, composiciones y métodos para modular la expresión de transportador de monocarboxilato4 (MCT4). En particular, esta invención se relaciona a oligonucleótidos antisentido (ASOs) capaces de modular la expresión humana MCT4 mARN, y sus usos en el tratamiento de varias indicaciones, incluyendo varios cánceres. En particular la invención se relaciona a terapias para el tratamiento de cánceres tal como cáncer de próstata, incluyendo cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC).
Antecedentes de la invención
El cáncer de próstata es el cáncer más común no cutáneo y la segunda causa principal de muertes relacionadas al cáncer para hombres en el mundo occidental (Siegel R, y col., 2012., 62(1 ):10-29). Los cánceres de próstata son inicialmente dependientes de andrógenos, y mientras la terapia de privación de andrógenos (ADT) puede inducir regresión tumoral marcada, surge inevitablemente resistencia a a Dt , llevando a cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). El cuidado estándar actual para tratar CRPC es sistémico, quimioterapia basada en docetaxel, incrementando la supervivencia total de pacientes a alrededor de 2 meses comparado a terapia basada en mitoxantrona (Petrylak DP, y col., N Engl J Med. 2004; 351 (15):1513-1520; Tannock IF, y col., N Engl J Med. 2004; 351 (15):1502-1512). Recientemente, sipuleucel-T, cabazitaxel, abiraterona, MDV3100 y Radium-223 han mostrado beneficio de supervivencia total más prolongado y son aprobados por la FDA para el tratamiento de CRPC (Bishr M and Saad F., Nat Rev Urol. 2013; 10(9):522-528). Aunque la eficacia del tratamiento de cáncer de próstata metastásico resistente a la castración (mCRPC) ha sido recientemente mejorado usando quimioterapias más poderosas teniendo como objetivo el (AR)-eje de señalización receptor de andrógenos, tal como enzalutamida (Ning y col., 2013) y abiraterona (de Bono y col., 2011), la supervivencia total de los pacientes ha únicamente marginalmente incrementado (Badrising y col., 2014; Loriot y col., 2013; Tannock y col., 2004). Además, se pensaba que versiones adicionalmente mejoradas de tales fármacos pueden promover trans-diferenciación de adenocarcinoma prostático para el cáncer de próstata neuroendócrino (NEPC), un subtipo de la enfermedad que es actualmente incurable (Beltran y col., 2011; Nadal y col., 2014; Yuan y col., 2007) Sin embargo, ninguno de estos fármacos es curativo e incrementalmente mejoran la supervivencia total. El establecimiento de más objetivos y fármacos terapéuticamente efectivos, específicamente aquellos que tienen como objetivo los conductores moleculares de CRPC y mCRPC metastásicos, es de importancia crítica para administración mejorada de la enfermedad y supervivencia del paciente (Lin D, y col., Curr Opin Urol. 2013; 23(3):214-219).
Hay evidencia en incremento de que tener como objetivo el metabolismo de cánceres de energía reprogramada ofrece un enfoque único para intervención terapéutica efectiva (Zhang and Yang, 2013). Para utilización de glucosa, las células cancerígenas, tan distintas de las células en reposo normales, en general tiene una preferencia por glucólisis acoplada a la producción de ácido láctico, es decir un proceso llamado glucólisis aeróbica o el efecto Warburg (Warburg, 1956). Esto lleva a consume elevado de glucosa, una propiedad casi universal de cánceres primario y metastásico. Además, la utilización aberrante de glutamina, también llevando a producción elevada de ácido láctico, has ha sido observada es altamente común para cánceres (Koochekpour y col., 2012). Estas vías de energía metabólica llevan la secreción incrementada de ácido láctico por las células cancerígenas en su microentorno, facilitando múltiples procesos estimulados por lactato, oncogénicos, incluyendo metástasis/invasión del tejido, neo-angiogénesis y respuestas a hipoxia (Choi y col., 2013; Choi y col., 2014; Doherty and Cleveland, 2013; Ullah y col., 2006). Además, la acidificación inducida de ácido láctico del microentorno de células cancerígenas (para pH 6.0-6.5) puede llevar a la supresión de la inmunidad contra el cáncer del hospedero local (Choi y col., 2013; Parks y col., 2013). El fenómeno de metabolismo mejorado de la glucosa por cánceres es más comúnmente explotado clínicamente por tomografía de emisión de positrón 18F-fluorodeoxiglucosa (FDG-PET). Aunque esta técnica de formación de imágenes no se usa generalmente para cáncer de próstata (Jadvar, 2009), hay evidencia sugiriendo que el metabolismo de la glucosa de células de cáncer de próstata es incrementado por señalización y progresión de AR para Resistencia al tratamiento (Tennakoon y col., 2014; Vaz y col., 2012). Como tal, tener como objetivo la vía glicolítica aeróbica pudiera ser efectivo para tratar cánceres de próstata avanzados.
La familia del transportador de monocarboxilato (MCT) consiste de proteínas del transportador de membrana de plasma implicadas en el transporte de ácido láctico y otros monocarboxilatos metabólicos. En particular, el eflujo celular del ácido láctico/H+ se pensó es predominantemente mediado por MCT4 (SLC16A3) (Dimmer y col., 2000). La expresión MCT4 ha sido asociada con células altamente glicolíticas (Halestrap, 2013; Manning Fox y col., 2000; Ullah y col., 2006), y expresión elevada de MCT4 en tumores clínicamente relevantes ya que ha sido asociada con pronóstico pobre del paciente en múltiples tipos de cáncer (Fisel y col., 2013; Lisanti y col., 2013; Ohno y col., 2014), incluyendo cáncer de próstata (Hao y col., 2010; Pértega-Gomes y col., 2011). Además, la expresión MCT4 elevada puede ser importante en interacciones de cáncer-estroma facilitando la progresión del cáncer de próstata (Sanitá y col., 2014). Esta información, junto con la habilidad de promover el crecimiento del cáncer del ácido láctico generado por el cáncer, sugiere que la inhibición de la expresión o función de MCTs proporciona una estrategia terapéutica prometedora para una amplia variedad de neoplasmas (Marchiq y col., 2015). Sin embargo, aún falta una estrategia terapéutica que tenga específicamente como objetivo el eflujo mediado de MCT4 del ácido láctico.
Las opciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) han cambiado considerablemente con las aprobaciones recientes de la FDA de agentes más nuevos que mejoren la supervivencia del paciente. En particular, Enzalutamida (ENZ), un antagonista de receptor de andrógenos de segunda generación aprobado para tratar CRPC metastásico en ajuste de post-docetaxel y más recientemente, pre-docetaxel. Sin embargo, dentro de 2 años de práctica clínica, el desarrollo de Resistencia de ENZ fue evidente en la mayoría de los pacientes (Claessens y col.2014) hasta la fecha no se ha demostrado que hubiera terapias efectivas para CRPC resistente a ENZ. De este modo, un agente terapéutico novedoso que pueda efectivamente suprimir CRPC resistente a ENZ sería útil.
Breve descripción de la invención
El alcance de la presente invención está definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que la inhibición de la expresión MCT4 con oligonucleótidos antisentido MCT4 (ASOs) (SEQ ID NO:1-23 y SEQ ID NO:46-49) puede ser útil en el tratamiento del cáncer. La inhibición de la expresión MCT4 con ciertos ASOs lleva a la proliferación reducida de células cancerígenas. Además, esa reducción en la proliferación se extiende al cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC).
En un primer aspecto, se proporciona un oligonucleótido antisentido (ASO), en donde el oligonucleótido tiene una secuencia selecciona de las siguientes: (a) TCCCATGGcCagGaGGGTTG (SEQ ID NO:1); (b) GTCCCGGAAGACGCTCAGGT (SEQ ID NO:2); (c) AAGGACGCAGCCACCATGCC (SEQ ID NO:3); (d) TTGGCGTAGCTCACCACGAA (SEQ ID NO:4); (e) AGATGCAGAAGACCACGAGG (SEQ ID NO:5); (f) CCACTCTGGAATGACACGGT (SEQ ID NO:6); (g) GTAGGAGAAGCCAGTGATGAC (SEQ ID NO:7); (h) AGCATGGCCAGCAGGATGGA (SEQ ID NO:8); (i) GGCTGGAAGTTGAGTGCCAA (SEQ ID NO:9); (j) CAT GCCGT AGGAGAT GCCAA (SEQ ID NO:10); (k) CTCAGGCTGTGGCTCTTTGG (SEQ ID NO:11); (l) TAGCGGTTCAGCATGATGA (SEQ ID NO:12); (m) AGCACGGCCCAGCCCCAGCC (SEQ ID NO:13); (n) GAGCTCCTTGAAGAAGACACT (SEQ ID NO:14); (o) CAGGATGGAGGAGATCCAGG (SEQ ID NO:15); (p) AGACCCCCCACAAGCATGAC (SEQ ID NO:16); (q) GAAGTTGAGTGCCAAACCCAA (SEQ ID NO:17); (r) CCCGTTGGCCATGGGGCGCC (SEQ ID NO:18); (s) GCCAGCCCGTTGGCCATGGG (SEQ ID NO:19); (t) AGGAAGACAGGGCTACCTGC (SEQ ID NO:20); (u) GCACACAGGAAGACAGGGCT (SEQ ID NO:21); (v) CAGGGCACACAGGAAGACAG (SEQ ID NO:22); (w) CAGCAGTTGAGCAGCAGGCC (SEQ ID NO:23); (x) ATGGCCAGGAGGGTTG (SEQ ID NO:46); (y) CATGGCCAGGAGGGTT (SEQ ID NO:47);(z) CCATGGCCAGGAGGGT (SEQ ID NO:48); y (aa) CCCATGGCCAGGAGGG (SEQ ID NO:49).
En un aspecto adicional, se proporciona una composición farmacéutica, la composición incluye (a) un oligonucleótido antisentido (ASO) que tiene una secuencia seleccionada de una o más de: SEQ ID NOs:1-23 y SEQ ID NOs:46-49; y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, se proporciona un uso de un oligonucleótido antisentido (ASO) que tiene una secuencia seleccionada de una o más de: SEQ ID NOs:1-23 y SEQ ID NOs:46-49 para uso en el tratamiento de cáncer.
En un aspecto adicional, se proporciona una terapia de combinación, la combinación comprende (a) un oligonucleótido antisentido (ASO) que tiene una secuencia seleccionada de una o más de: SEQ ID NOs:1-23 y SEQ ID NOs:46-49 para uso en una terapia de combinación del cáncer, la terapia que comprende administrar el nucleótido antisentido y docetaxel a un paciente. La terapia de combinación puede además incluir un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Solamente como referencia, en la presente memoria se describe un paquete comercial, incluido un ASO que tiene una secuencia seleccionada de una o más de: SEQ ID NOs:1-23 y SEQ Id NOs:46- 49; e instrucciones para el tratamiento de cáncer.
El oligonucleótido antisentido (ASO) tiene la secuencia de SEQ ID NOs:1-23 o SEQ ID NOs:46-49. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:1. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:2. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:3. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:4. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:5. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:6. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:7. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:8. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:9. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:10. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:11. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:12. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:13. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:14. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:15. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:16. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:17. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:18. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ iD NO:19. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:20. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:21. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:22. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:23. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:46. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:47. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:48. El oligonucleótido antisentido (ASO) puede tener la secuencia de SEQ ID NO:49.
El ASO puede además incluir una ligadura internucleósido modificada. La ligadura de internucleósido modificada puede ser una ligadura de péptido-ácido nucleico, una ligadura de morfolina, una ligadura fosforamidato N3’ a P5’, una ligadura metilfosfonato o una ligadura fosforotioato. La ligadura internucleósido modificada puede ser una ligadura de péptido-ácido nucleico. La ligadura internucleósido modificada puede ser una ligadura de morfolina. La ligadura internucleósido modificada puede ser una ligadura fosforamidato N3’ a P5’. La ligadura internucleósido modificada puede ser una ligadura metilfosfonato. La ligadura internucleósido modificada puede ser una ligadura fosforotioato. El ASO puede además incluir una porción de azúcar modificada. La porción de azúcar modificada puede ser oligoribonucleótido 2’-O-alquilo. El ASO puede tener una modificación gapmer 2'MOE. El ASO puede además incluir una nucleobase modificada. La nucleobase modificada puede ser una pirimidina 5-metilo o una pirimidina 5- propinilo. La célula puede ser una célula humana. El cáncer puede caracterizarse por expresión elevada de MCT4. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; cáncer de hígado; cáncer de vejiga; y cáncer de pulmón de células pequeñas. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; Carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; cáncer de hígado; y cáncer de vejiga. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; y cáncer de hígado. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; y cáncer de cuello uterino. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; y cáncer de mama. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; y cáncer pulmonar de células pequeñas. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; cáncer de hígado; y cáncer pulmonar de células pequeñas. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; cáncer de vejiga; y cáncer pulmonar de células pequeñas. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de hígado; cáncer de vejiga; y cáncer pulmonar de células pequeñas. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de cuello uterino; cáncer de hígado; cáncer de vejiga; y cáncer pulmonar de células pequeñas. El cáncer puede ser cáncer de próstata. El cáncer de próstata puede ser cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de hígado; y cáncer de vejiga. El cáncer de próstata puede ser CRPC resistente a enzalutamida (ENZ). El cáncer puede ser cáncer de próstata metastásico. El ASO puede ser sustancialmente complementario al mARN de MCT4. El ASO puede administrarse intravenosamente. El ASO puede administrarse tópicamente a un tejido. El ASO puede mezclarse con partículas de lípidos antes de la administración. El ASO puede encapsularse en liposomas previo a la administración.
El ASO puede además incluir una ligadura de internucleósido modificada. La ligadura internucleósido modificada puede ser una ligadura de péptido-ácido nucleico, una ligadura de morfolina, una ligadura fosforamidato N3’ a P5’, una ligadura metilfosfonato o una ligadura fósforotioato. El ASO puede además incluir una porción de azúcar modificada. La porción de azúcar modificada puede ser un oligorinucleótido 2’-O-alquilo. El ASO puede además tener una modificación gapmer 2'MOE. El ASO puede además incluir una nucleobase modificada. La nucleobase modificada puede ser una pirimidina 5-metilo o una pirimidina 5- propinilo.
La célula puede ser una célula humana. El cáncer puede caracterizarse por expresión elevada de MCT4. El cáncer puede seleccionarse de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; cáncer de hígado; cáncer de vejiga; y cáncer pulmonar de células pequeñas. El cáncer de próstata puede ser cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). El cáncer de próstata puede ser CRPC resistente a enzalutamida (ENZ) o CRPC metastásico (m CRPC).
El ASO puede ser sustancialmente complementario al mARN de MCT4. El ASO puede administrarse intravenosamente. El ASO puede administrarse tópicamente al tejido. El ASO puede administrarse con partículas de lípidos previo a la administración. El ASO puede encapsularse en liposomas previo a la administración. Los oligonucleótidos antisentido pueden usarse como neoadyuvante (previo), complementario (durante), y/o adyuvante (después) de terapia con cirugía, radiación (braquiterapia o haz externo), u otras terapias (equivalente HIFU). Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido MCT4 pueden usarse en combinación con docetaxel, MDV3100, o con moduladores del metabolismo de la glucosa (incluyendo doxiciclina u otros inhibidores mitocondriales).
Breve descripción de los dibujos
Las FIGURAS 1A, 1B, 1C, 1D y 1E muestran la expresión MCT4 en microconfiguraciones de tejido (TMA) de muestras de cáncer de próstata derivadas del paciente disponibles en el Vancouver Próstata Centre Tissue Bank y teñidos para expresión MCT4 , en donde FIGURA 1A y 1B muestran gráficas de barras que confirman que la expresión MCT4 elevada está asociada con grado Gleason alto; FIGURA 1C muestra el gráfico de en donde la expresión MCT4 alta está asociada con tiempo más temprano para recaída según lo medido por los incrementos en el suero PSA; y FIGURA 1D y 1E muestran dos gráficas de barras representando pacientes experimentando terapia prolongada de hormonas neoadyuvante (NHT) y aquellos con CRPC también mostraron expression MCT4 elevada.
Las FIGURAS 2A, 2B, 2C, 2D, 2E y 2F muestran la selección de eficacia de los ASO que tiene como objetivo MCT4 usando células PC-3 in vitro para inhibición de la expresión MCT4 y la proliferación celular, en donde los ASO MCT4 #1 (SEQ ID NO: 1) y #14 (SEQ ID NO: 5) ejercen sus efectos in vitro de una manera dependiente de dosis, y los efectos persisten pasado 96 horas después de la transfección: FIGURA 2A muestra siARN-silenciamiento de MCT4 en células PC-3 que mostró inhibición importante de proliferación celular, indicando que la inhibición de la expresión MCT4 podría tener eficacia terapéutica comercial; FIGURA 2B muestra la selección de diez ASOs que tiene como objetivo MCT4 lo que reveló efectos inhibitorios variantes en la proliferación celular, con las secuencias #1 (SEQ ID NO: 1) y #14 (SEQ ID NO: 5) mostrando las inhibiciones más profundas; FIGURA 2C muestra los ASO MCT4 induciendo varios niveles de atenuación génica MCT4 según lo medido por qPCR y Western blot, con los ASO #1 y #14 siendo los más efectivos; FIGURA 2D muestra una fuerte correlación (p<0.001) que se encontró entre la expresión mARN MCT4 y los números de células resultantes, indicando que los efectos inhibitorios en la proliferación celular están fuertemente relacionados a la expresión MCT4 disminuida (las líneas punteadas representan 95 % del intervalo de confianza); FIGURA 2E en donde la transfección de 5 nM a 200 nM de los ASO MCT4 demuestra que la inhibición de la proliferación celular y expresión de MCT4 es similarmente dependiente de dosis (IC50 = 32 nM para ASO #14, IC50 = 50 nM para ASO #1); y FIGURA 2F muestra un experimento de curso de tiempo que demuestra que la inhibición de la proliferación celular y la expresión MCT4 seguido de las transfecciones ASO MCT4 persiste hasta al menos 96 horas después de la transfección.
Las FIGURAS 3A, 3B y 3C muestran los ASO MCT4 #1 (SEQ ID NO: 1) y #14 (SEQ ID NO: 5) son efectivos in vitro contra las células humanas de cáncer de próstata que no son PC-3, pero no contra células de cáncer de próstata de ratón: FIGURA 3A muestra que los ASO MCT4 candidatos también son capaces de inhibir la proliferación celular de cáncer de próstata humano C4-2 y expresión de MCT4 de una manera dependiente de dosis con valores IC50 comparables a aquellos observados con las células PC-3; FIGURA 3B muestra los ASO MCT4 candidatos que también inhiben la proliferación celular de cáncer de próstata humano DU145 de una manera dependiente de dosis con valores IC50 similares a aquellos obtenidos con las otras líneas celulares, en donde la inhibición de la proliferación celular está acompañada por una disminución de la expresión MCT4 ; y FIGURA 3C muestra que los ASO MCT4 no tiene alguno de los efectos apreciables en las células de cáncer de próstata de ratón TRAMPC2 y tampoco afectan la proliferación celular ni los niveles de expresión MCT4 de ratón incluso en la concentración probada más alta de 200 nM, mostrando que los ASO probados son específicos para MCT4 humano y que la inhibición de proliferación celular es un fenómeno relacionado a la atenuación génica MCT4.
Las FIGURAS 4A y 4B muestran la transfección de los ASO MCT4 candidatos llevan a una inhibición del metabolism de glucosa de células PC-3: FIGURA 4A muestra que los ASO MCT4 inhibieron significativamente la secreción de ácido láctico y que la acumulación correspondiente de lactato intracelular e inhibición de consume de glucosa también se observa (u.d. = indetectable) 48 horas después de la transfección; y FIGURA 4B muestra un esquema de la vía de glucólisis y los cambios en el metabolismo causados por atenuación génica de MCT4 y caracterizado por análisis qPCR de niveles de expresión de genes de varios genes implicados en glucólisis y conversión de ácido láctico, en donde una disminución importante en la expresión de varios genes en glucólisis sugiere una disminución total en el metabolismo de glucosa y la expresión disminuida de LDHA y PDK1 sugiere una redirección de piruvato lejos de la producción de ácido láctico hacia el ciclo TCA para fosforilación oxidativa.
Las FIGURAS 5A, 5B y 5C muestran una reducción inducida de ASO MCT4 de la expresión MCT4 en células tumorales PC-3 in vivo que se asoció con la inhibición de crecimiento tumoral PC-3, caracterizado por un incremento de apoptosis e inhibición de proliferación celular, basado en tumores PC-3 subcutáneos ratones atímicos desnudos portadores de tumores PC-3 subcutáneos tratados con inyecciones intraperitoneales de los ASO MCT4 #1 (SEQ ID NO: 1), #14 (SEQ ID NO: 5), ASO de control, o vehículo (PBS) a 10 mg/kg diariamente por 5 días seguido de 2 días sin tratamiento para un total de 15 días: FIGURA 5A muestra un gráfico representando el porcentaje del volumen de tumor por día de tratamiento comparando los ASO MCT4 en relación a la tasa de crecimiento tumoral; FIGURA 5B muestra gráfica de barras representando caspasa 3 células positivas y porcentaje de células positivas Ki-67 seguido del tratamiento con los ASO MCT4 como atribuible a un aumento en la apoptosis celular y una disminución en la proliferación celular; y FIGURA 5C muestra tratamiento con la expresión MCT4 disminuida de los ASO en el tumor según lo medido por la tinción IHC.
Las FIGURAS 6A, 6B y 6C muestran que los ASO que tiene como objetivo MCt4 incrementan la agregación de células inmunitarias y alterar las proporciones de células inmunitarias asociadas a tumor in vivo (es decir células NK y células positivas CD3): FIGURA 6A muestra una gráfica de barras en donde los efectos inmunomodulatorios del tratamiento con ASO MCT4 son parcialmente ejercidos a través de un incremento importante en la medida de tales agregaciones de células inmunitarias; FIGURA 6B muestra una gráfica de barras en donde el tratamiento con ASO MCT4 incrementó la proporción de las células NK asociadas con el tumor; y FIGURA 6C muestra una gráfica de barras representando la proporción de células positivas CD3 como un marcador para células NK activadas (ya que los ratones sin pelo carecen de células T) en la presencia de los ASO MCT4 como se compare al control.
Las FIGURAS 7A y 7B muestran que los ASO que tiene como objetivo MCT4 candidatos son capaces de inhibir la proliferación celular y la expresión MCT4 de las células humanas de cáncer de próstata LNCaP 48 horas después de la transfección: FIGURA 7A muestra los ASO MCT4 son capaces de inhibir la proliferación celular LNCaP a niveles comparables a aquellos observados con otras líneas celulares de cáncer de próstata humano; y FIGURA 7B muestra una disminución en la proliferación celular que está asociada con una disminución en la expresión MCT4 , que sugiere que el efecto inhibitorio en los ASO MCT4 puede asociarse con un fenotipo glicolítico que con estado receptor andrógeno.
Las FIGURAS 8A y 8B muestran que los ASO MCT4 son capaces de inhibir la migración celular PC-3 y la invasión de tejido in vitro; FIGURA 8A muestra un tratamiento de células PC3 con los ASO MCT4 candidato que resultó en una inhibición de migración celular a través de un transwell, según lo indicado por una reducción en el número observado de células migradas; y FIGURA 8B muestra que el tratamiento con ASO MCT4 también inhibió la habilidad de las células PC-3 para invadir Matrigel, y sugiere que la secreción de ácido láctico mediada con MCT4 podría desempeñar una función importante en metástasis de cáncer.
Las FIGURAS 9A y 9B muestran que el tratamiento de ratones sin pelo con ASO MCT4 no causó toxicidad en el hospedero según lo medido por los pesos de los animales: FIGURA 9A muestra un gráfico de los pesos de los animales a través de la duración del estudio in vivo, y el tratamiento con los ASO MCT4 no afectó significativamente el peso del animal promedio de cada grupo; y FIGURA 9B muestra que los pesos de los animales individuales también se mantuvieron estables a través del periodo del tratamiento.
Las FIGURAS 10A, 10B, 10C y 10D muestran una comparación de los números totales de células vivas evaluados 48 horas después del tratamiento con SEQ ID NO:5 ASO, Metformina, Doxiciclina, Docetaxel y MDV3100, en donde ASO SEQ ID NO:5 se probó en comparación a cada una de Metformina, Doxiciclina, Docetaxel y MDV3100, sola y en combinación: FIGURA 10A muestra los números totales de células PC3 vivas para ASO s Eq ID NO:5 ASO y Metformina; FIGURA 10B muestra los números totales de células PC3 vivas para ASO SEQ ID NO:5 y Doxiciclina; FIGURA 10C muestra los números totales de células PC3 vivas para ASO S eQ ID NO:5 y Docetaxel; y FIGURA 10D muestra los números totales de células C4-2 vivas para ASO SEQ ID NO:5 y MDV3100.
Descripción detallada de la invención
Cualquiera de los términos no directamente definidos en la presente memoria deberá entenderse tiene los significados comúnmente asociados con ellos según lo entendido dentro del presente campo de la técnica. Ciertos términos se discuten a continuación, o en cualquier otra parte en la especificación, para proporcionar guía adicional al practicante en la descripción de las composiciones, dispositivos, métodos y similares de las modalidades, y cómo hacerlos o usarlos. Se apreciará que pueda decirse lo mismo en más de un modo. Consecuentemente, el lenguaje y sinónimos alternativos pueden usarse para cualquiera uno o más de los términos discutidos en la presente memoria. No se debe poner ningún significado en si sí o no un término se elabora o discute en la presente memoria. Se proporcionan algunos sinónimos o métodos sustituibles, materiales y similares. El hecho de tener uno o varios sinónimos o equivalentes no excluye el uso de otros sinónimos o equivalentes, a menos que se indique explícitamente. El uso de ejemplos en la especificación, incluyendo ejemplos de términos, es para propósitos ilustrativos únicamente y no limita el enfoque y el significado de las modalidades descritas en la presente memoria.
Se proporcionan oligonucleótidos antisentido (ASO) para su uso en el tratamiento de una célula cancerígena, en donde tratar se refiere a abarcar la prevención de proliferación de la célula, aliviar los síntomas asociados con el cáncer, y erradicar la célula cancerígena. El término “tratar” como se usa en la presente memoria también se refiere a incluir la administración en cualquier etapa del cáncer, incluyendo administración temprana de un compuesto o administración tardía. Una persona experta en la técnica apreciaría que el término “aliviar” se refiera a incluir el prospecto de hacer un cáncer más tolerable para un sujeto afligido con el mismo (por ejemplo, reduciendo la carga tumoral). Una persona experta en la técnica también apreciaría que el término “erradicación” con respecto al cáncer incluyera la eliminación de las células cancerígenas en todo o en parte de un sujeto. Por consiguiente, como se usa en la presente memoria “tratamiento” puede referirse a la prevención de proliferación de células cancerígenas en un sujeto, el alivio de los síntomas asociados con el cáncer, la erradicación del cáncer en un sujeto, o combinaciones de los mismos.
Los compuestos de oligonucleótidos antisentido son compuestos ARN de hebra típicamente sencilla que enlazan a los compuestos ARN complementarios, tal como moléculas mARN objetivo, y bloquean el traslado de los compuestos ARN complementarios estéricamente interfiriendo con la maquinaria de traslado normal. Este proceso es usualmente pasivo, en que no requiere o implica enzimas adicionales para mediar el proceso de interferencia de ARN. El objetivo específico de los compuestos ARN antisentido para inhibir la expresión de un gen deseado puede generalmente implicar diseñar el compuesto ARN antisentido para tener una secuencia complementaria homóloga al gen deseado. La homología perfecta no es necesaria para el efecto de interferencia de ARN. En una modalidad de la invención, los compuestos ARN antisentido incluyen cualquier compuesto ARN dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas con homología complementaria suficiente para enlazar a la transcripción mARN MCT4 causando una reducción en el traslado de la proteína MCT4. En otra modalidad de la invención, los compuestos ARN antisentido incluyen cualquier compuesto de ARN dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas con suficiente homología complementaria para enlazar a la transcripción mARN MCT4 causando una reducción en el traslado de la proteína MCT4. Los compuestos antisentido pueden modificarse para mejorar la estabilidad de los oligonucleótidos, particularmente para uso in vivo. Numerosos ejemplos de los métodos para diseñar y optimizar los compuestos ARN antisentido se encuentran en la bibliografía (es decir, Pan and Clawson 2006; Patzel 2007; Peek and Behlke 2007). La complementariedad de secuencia perfecta no es necesaria para el compuesto antisentido para modular la expresión del gen objetivo. Los presentes inventores proporcionan ejemplos no limitantes de los compuestos antisentido que modulan la expresión de MCT4.
Las secuencias de oligonucleótidos antisentido como se describe en la presente memoria (ver TABLAS A y B) o para su uso como se describe en la presente memoria pueden administrarse por medio de un dispositivo médico o aparato como un implante, injerto, prótesis, endoprótesis vascular, etc. También, se pueden diseñar implantes que están destinados a contener y liberar dichos compuestos o composiciones. Un ejemplo sería un implante hecho de un material polimérico adaptado para liberar el compuesto durante un periodo de tiempo.
El porcentaje de inhibición para todos los ASO MCT4 probados se muestra a continuación en la TABLA A. Generalmente un 50 % de inhibición se consideró active para los ASO MCT4.
Tabla A: Secuencias ASO MCT4 e inhibición de porcentaje es MCT4.
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Los oligonucleótidos antisentido (ASOs) que tienen como objetivo MCT4 se proporcionan en la presente memoria según se define en las reivindicaciones adjuntas. Los ASO MCT4 para su uso en la administración a una célula es abarcado por los métodos descritos en la presente memoria. Algunos de los ASO como se usan en la sección de ejemplos tuvieron ligaduras modificadas de internucleósido. En particular, los ASO tuvieron ligaduras fosforotioato entre todos los nucleósidos. Los ASO MCT4 son oligonucleótidos 16 a 20-mer con ligaduras modificadas de fosforotioato. Sin embargo, las variaciones de los ASO MCT4 pueden también tener ligaduras fosfodiéster no modificadas o ligaduras parcialmente modificadas (es decir, cualquier entero entre 1 y 19 ligaduras de fosforotioato u otras ligaduras modificadas). Modificaciones alternativas también se conocen en la técnica.
Los oligonucleótidos antisentido (ASOs) de 16 a 20-mer en longitud que tienen como objetivo MCT4 se proporcionan en la presente memoria.
Una modificación de enlace de oligonucleótido fosforotioato altera la ligadura de fosfato remplazando uno de los oxígenos sin puente con azufre. La introducción de las ligaduras fosforotioato altera las propiedades químicas del oligonucleótido. En particular, la adición de ligaduras fosforotioato reduce la degradación nucleasa del oligonucleótido y de este modo incrementando la vida media in situ. Por consiguiente, esta modificación es particularmente útil para oligonucleótidos antisentido, que cuando se introducen en las células o matrices biológicas pueden interactuar con ácidos nucleicos objetivos para silenciar la expresión de una transcripción particular. Los oligonucleótidos que contienen ligaduras fósforotioato alcanzan esta característica ya sea a través del bloqueo directo del traslado o permitiendo una degradación enzimática de la transcripción objetivo (por ejemplo, por medio de RNasa H).
Aunque las ligaduras de fosforotioato proporcionan vida media mejorada, la introducción de estas ligaduras en un oligonucleótido pueden también introducir limitaciones a su función como oligonucleótidos antisentido. Cada ligadura de fosforotioato crea un centro quiral en cada enlace, que puede resultar en múltiples isómeros del oligonucleótido generados durante la síntesis y los isómeros pueden tener características diferenciales y propiedades funcionales. Sin embargo mucho de los efectos de los isómeros pueden ser mitigados a través del posicionamiento cuidadoso de las modificaciones o usando modificaciones adicionales en conjunto con los enlaces de fosforotioato.
Una o más de las ligaduras fosforotiodiéster de la porción de oligonucleótido pueden modificarse remplazando uno o ambos de los dos átomos de oxígeno de Puente de la ligadura con análogos tal como -NH, -CH2, o -S. También pueden usarse otros análogos conocidos en la técnica.
Un “oligonucleótido modificado” como se usa en la presente memoria se refiere a incluir oligonucleótidos que son sustituidos o modificados. Además de las bases primarias naturales adenina, guanina, citosina, y timina, u otras bases naturales tal como inosina, desoxiinosina e hipoxantina, hay muchas otras modificaciones. Por ejemplo, los análogos de purina isostérica 2 ' deoxi- furanosida, 2’-deoxinebularina o 2 ' deoxixantosina, u otros análogos de purina y pirimidina tal como 5-metil pirimidina o una 5-propinil pirimidina pueden también utilizarse para mejorar la estabilidad e hibridación objetivo.
Un “ azúcar modificado” como se usa en la presente memoria cuando se discute un resto de oligonucleótido, un azúcar modificado o remplazado para ser ribosa, glucosa, sacarosa, o galactosa, o cualquier otro azúcar. Alternativamente, el oligonucleótido puede tener uno o más de sus azúcar sustituidos o modificados en su posición 2', es decir 2 ' alquilo o 2'-O-alquilo. Un ejemplo de un azúcar 2’-O-alil es un 2’-O-metilribonucleótido. Además, el oligonucleótido puede tener uno o más de sus azúcares sustituidos o modificados para formar un azúcar a-anomérico.
Los oligonucleótidos de “segunda generación” como se usa en la presente memoria pueden definirse como oligonucleótidos que son resistentes a la degradación por nucleasas celulares y capaces de hibridar específicamente a su mARN objetivo con afinidad igual o mayor que los ASO de primera generación. Un ejemplo de un ASO de 2da generación es un 2'-O-(2-Metoxietil)-ARN (modificación gapmer 2'MOE). Con un gamper 2'-MOE los extremos 5' y 3' pueden tener nucleótidos 2'-MOE modificados para proteger contra la degradación, pero la brecha ente los extremos 5’ y 3’ pueden ser ligaduras fosforodiéster no modificadas. Numerosas modificaciones que no son modificaciones químicas han sido desarrolladas para mejorar los ASO. Por ejemplo, modificaciones químicas de morfolina, N3’ a P5’ fosforamidato, metilfosfonato se conocen en la técnica (N. Dias, and C. A. Stein 2002). Además, los ácidos nucleicos de péptido (PNAs) también pueden usarse.
Una alineación de 16 truncamientos mer probados de la SEQ ID NO:1 se muestran en la TABLA B junto con su % de inhibiciones MCT4 ,
Tabla B: Alineación de SEQ ID NO 1 con 16 truncamientos mer
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Los compuestos, como se describe en la presente memoria, pueden estar en aislamiento, o pueden ligarse a o en combinación con compuestos trazadores, liposomas, portadores de carbohidratos, portadores poliméricos u otros agentes o exipientes como será aparente para una persona experta en la técnica. En modalidades alternativas, tales compuestos pueden además comprender un medicamento adicional, en donde tales compuestos pueden estar presentes en una cantidad farmacológicamente aceptable.
El término “ medicamento” como se usa en la presente memoria se refiere a una composición que puede administrarse a un paciente o sujeto de prueba y es capaz de producir un efecto en el paciente o sujeto de prueba. El efecto puede ser químico, biológico o físico, y el paciente o sujeto de prueba puede ser humano, o un animal no humano, como un roedor (por ejemplo, un ratón transgénico, un ratón o una rata), perro, gato, vaca, oveja, caballo, hámster, cerdo de guinea, conejo o cerdo. Este medicamento puede estar formado de la entidad química efectiva sola o en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
El término “excipiente farmacéuticamente aceptable” puede incluir cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos, antimicrobianos o antihongos, agentes de retraso isotónicos y de absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Un excipiente puede ser idóneo para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intratecal, tópica u oral. Un excipiente puede incluir soluciones acuosas estériles o dispersiones para preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de tales medios para preparación de medicamentos se conoce en la técnica.
Las composiciones o compuestos de acuerdo a algunas modalidades descritas en la presente memoria pueden administrarse en cualquiera de una variedad de rutas conocidas. Los ejemplos de los métodos que pueden ser idóneos para la administración de un compuesto incluyen supositorio oral, intravenoso, por inhalación, intramuscular, subcutáneo, tópico, intraperitoneal, intra-rectal o intravaginal, sublingual, y similares. Los compuestos descritos en la presente memoria pueden administrarse como una solución acuosa estéril, o pueden administrarse en un excipiente soluble en grasa, o en otra solución, suspensión, parche, tableta o formato de pasta según sea apropiado. Una composición que comprende los compuestos descritos en la presente memoria puede formularse para administración por inhalación. Por ejemplo, un compuesto puede combinarse con un excipiente para permitir dispersión en aerosol. Los ejemplos de formulaciones de inhalación serán conocidos para aquellos expertos en la técnica. Otros agentes pueden incluirse en combinación con los compuestos descritos en la presente memoria para ayudar a la absorción o el metabolismo, o retrasar la dispersión dentro del hospedero, como en una formulación de liberación controlada. Los ejemplos de formulaciones de liberación controlada serán conocidos para aquellos expertos en la técnica, y pueden incluir microencapsulación, embolia dentro de una matriz de carbohidratos o polímeros, y similares. Otros métodos conocidos en la técnica para hacer formulaciones se encuentran en, por ejemplo, “ Remington’s Pharmaceutical Sciences” , (19a edición), ed. A. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa.
La dosificación de las composiciones o compuestos de algunas modalidades descritas en la presente memoria pueden variar dependiendo de la vía de administración (oral, intravenosa, inhalación, o similares) y la forma en la cual la composición y compuesto se administra (solución, liberación controlada o similares). La determinación de las dosificaciones adecuadas está dentro de la habilidad de una persona experta en la técnica. Como se usa en la presente memoria, una “cantidad efectiva” , una “cantidad terapéuticamente efectiva” , o una “cantidad farmacológicamente efectiva” de un compuesto se refiere a una cantidad de un ASO como se describe en la presente memoria en una concentración para resultar en un nivel terapéutico del compuesto entregado durante el plazo que el compuesto se use. Esto puede depender del modo de entrega, periodo de tiempo de la dosificación, edad, peso, salud general, sexo y dieta del sujeto recibiendo el compuesto. Los métodos de determinación de las cantidades efectivas se conocen en la técnica. Se entiende que podría ser potencialmente benéfico restringir la entrega de los compuestos descritos en la presente memoria al tejido objetivo o célula en la cual la inhibición de la expresión MCT4 se desea. También se entiende que puede ser deseable tener como objetivo los compuestos en la presente memoria para un tipo de célula o tejido deseado. Los compuestos descritos en la presente memoria pueden de este modo acoplarse a un resto objetivo. Los compuestos pueden acoplarse a un resto de ingesta celular. El resto objetivo también puede funcionar como el resto de ingesta celular.
En general, los oligonucleótidos antisentido como se describen en la presente memoria pueden usarse sin causar toxicidad sustancial. La toxicidad de los compuestos como se describe en la presente memoria puede determinarse usando técnicas estándar, por ejemplo, probando en cultivos celulares o animales experimentales y determinando el índice terapéutico, es decir, la relación entre LD50 (la dosis letal a 50 % de la población) y LD100 (la dosis letal a 100 % de la población). Sin embargo en algunas circunstancias, tal como en condiciones de diarrea severa, puede ser apropiado administrar exceso sustancial de las composiciones. Algunos oligonucleótidos antisentido como se describen en la presente memoria pueden ser tóxicos en algunas concentraciones. Los estudios de valoración pueden usarse para determinar concentraciones tóxicas y no tóxicas. La toxicidad puede evaluarse examinando una especificidad del oligonucleótido antisentido particular a través de las líneas celulares. Los estudios en animales pueden usarse para proporcionar una indicación si el compuesto tiene alguno de los efectos en otros tejidos.
En algunas modalidades, al menos un oligonucleótido antisentido como se describe en la presente memoria para uso, por ejemplo, y sin limitación, en el tratamiento de una célula cancerígena. Como se usa en la presente memoria “ al menos uno” se pretende se refiera a uno o más, es decir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27 etc.
En algunas modalidades, los oligonucleótidos antisentido como se describen en la presente memoria para, por ejemplo, y sin limitación, uso en combinación con otros métodos de tratamiento para al menos una indicación seleccionada de malignidades en las cuales la expresión elevada de MCT4 se observa. Estas incluyen, pero no se limitan a, cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; cáncer de hígado; cáncer de vejiga; y cáncer pulmonar de células pequeñas en mamíferos, incluyendo humanos. Los oligonucleótidos antisentido y pueden usarse como neoadyuvante (previo), complementario (durante), y/o adyuvante (después) de terapia con cirugía, radiación (braquiterapia o haz externo), u otras terapias (por ejemplo, HIFU). Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido MCT4 como se describen en la presente memoria pueden usarse en combinación con docetaxel, MDV3100, o con moduladores de metabolismo de glucosa (incluyendo doxiciclina u otros inhibidores mitocondriales).
Métodos y materiales
Los siguientes métodos y materiales se emplearon con respecto a los EJEMPLOS descritos en la presente memoria.
Cultivos celulares
Las células PC-3 y DU145 CRPC humanas, las células LNCaP de cáncer de próstata humano, y las células TRAMPC2 de cáncer de próstata de ratón se compraron de la American Type Culture Collection (ATCC); las células C4-2 CRPC fueron del Vancouver Próstata Centre, Vancouver, BC, Canadá. Los cultivos humanos de monocapa se mantuvieron en RPMI-1640 (GE Healthcare Hyclone™, Logan, UT) suplementados con 10 % suero bovino fetal (FBS) (GE Healthcare Hyclone™, Logan, UT) mientras las células TRAMPC2 se mantuvieron en DMEM (GE Healthcare Hyclone™, Logan, UT) suplementadas con 5 % FBS. Para recuento celular, las células se tripsinizaron para formar una suspensión de células individuales y se contaron usando un Contador de células automatizado TC20 (Bio-Rad, Hercules, CA). La viabilidad celular se evaluó por la exclusión de azul de tripano.
Construcción e inmunohistoquímica de microconfiguración de Cáncer de próstata humano (TMA)
Las TMA se construyeron manualmente, como se describió previamente (Chiang y col., 2014; Thomas y col., 2011), usando varios especímenes de grados Gleason-exhibiendo cáncer de próstata (n=342), obtenidos del Vancouver Prostate Centre Tissue Bank con el consentimiento escrito de los pacientes informados, información clínica y aprobación del estudio institucional. Todos los especímenes se obtuvieron a través dela prostatactomía radical, excepto las muestras CRPC que se obtuvieron por medio de resección transuretral de la próstata (TURP). La tinción inmunohistoquímica se condujo usando un equipo de tinción automático Ventana™ (modelo Discover XT™; Ventana Medical System™, Tucson, AZ) con un sistema biotina- estreptavidina etiquetado con enzima y un kit DAB Map resistente al solvente (Ventana™). La intensidad de la tinción fue anotada por un patólogo capacitado en una escala de cuatro puntos: 0 representa sin tinción en cualquiera de las células tumorales, 1 representa un borroso o focal, cuestionablemente presenta mancha, 2 representa una mancha de intensidad convincente en una minoría de células, y 3 representa una mancha de intensidad convincente en una mayoría de células.
Anticuerpos
Se usaron los siguientes anticuerpos y conjugados: anticuerpo de conejo anti-MCT4 (Santa Cruz™, Santa Cruz, CA; WB 1:4000, IHC 1:100), anticuerpo de ratón anti-vinculina (Sigma™; WB 1:1000), anticuerpo de conejo caspasa 3 anti-escindido (Cell Signalling Technology™, Danvers, MA; IHC 1:50), anticuerpo de ratón anti-Ki67 (Dako™, Burlington, ON; IHC 1:50), anticuerpo de rata anti-CD31 (Dianova™, Hamburg, Alemania; IHC 1:20), anticuerpo de ratón CD3 marcador celular anti-pan-T (Dako™; IHC 1:50), anti-NK1.1 de ratón biotinilado (Cedarlane™, Burlington, ON; IHC 1:100), anticuerpo de cabra anti-ratón IRDye 800CW (Li-Cor Biosciences™, Lincoln, NE; WB 1:10,000), anticuerpo de cabra anti-ratón IRDye 680RD (Li-Cor Biosciences™; WB 1:10,000), anticuerpo de cabra anti-ratón biotinilado (Vector Laboratories™, Burlingame, CA; IHC 1:200), anticuerpo de cabra anti-ratón biotinilado (Vector Laboratories™; IHC 1:200), y anticuerpo de cabra anti-ratón biotinilado (Vector Laboratories™; IHC 1:200).
Diseño y selección de ASO
Los ASO fosforotioato-modificados de primera generación contra MCT4 humano fueron racionalmente designados seleccionando secuencias que contienen motivos favorables, excluyendo los desfavorables (Matveeva y col., 2000). La especificidad de las secuencias que tiene como objetivo MCT4 , comparada a los genes de ratón y humano (al menos 3 de 20 bases no coincidentes), se evaluó usando BLAST. Diez secuencias SEQ ID No: 1,4, 5, 9, 11,30, 36, 37, 40 y 41 (ver TABLA A) distribuidas por toda la longitud de la transcripción con perfecta complementariedad a todas las variantes humanas de transcripción MCT4 (NM_001042422.2, NM_001042423.2, NM_001206950.1, NM_001206951.1, NM_001206952.1, y NM_004207.3) fueron seleccionadas y sintetizadas por Eurofins MWG Operon. Las eficacias de atenuación génica de estos diez ASOs se probaron determinando el mARN objetivo y la expresión de proteínas 48 horas después de la transfección de las células usando qPCR y Western blotting. Dos ASOs candidatos (#1 y #14 - SEQ ID NOs: 1 y 5, respectivamente) se seleccionaron para estudios adicionales. Secuencias: ASO #1 (SEQ ID NO: 1), 5'-TCCCATGGCCAGGAGGGTTG-3'; ASO #14 (SEQ ID NO: 5), 5'-AGATGCAGAAGACCACGAGG-3'; un ASO publicado de control sin objetivo, 5'-CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC-3' (Mullick y col., 2011; Samuel y col., 2006).
Una persona experta en la técnica basándose en el conocimiento general en la técnica y la información proporcionada en la presente memoria sería capaz de sintetizar los ASO descritos en la presente memoria o modificar los ASO descritos en la presente memoria.
ASO y transfección siARN
Las células fueron transfectadas en placas de 6 pocillos con ASOs a 100 nM por 48 horas (a menos que se indique de otro modo) usando Oligofectamine™ (Invitrogen™, Carlsbad, CA) o con siARNs con objetivo MCT4 y controles (Dharmacon™, Chicago, IL) a 50 nM por 48 horas usando Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen™), siguiendo las instrucciones del fabricante.
PCR Cuantitativo
El ARN total se aisló usando el RNeasy Mini K it™ (Qiagen Inc. ™ , Hilden, Alemania) y cADN sintetizado usando el QuantiTect Reverse Transcription K it™ (Qiagen™). Los cebadores se designaron usando Primer-BLAST™. Las reacciones qRT-PCR usando KAPA SYBR Fast Universal™ (Kapa Biosystems™, Woburn, MA) se realizaron en triplicado en un sistema ViiA 7 Real-Time PCR™ (Applied Biosystems™, Foster City, CA). Los genes objetivo se normalizaron a un promedio genético de 3 genes de referencia interna (Vandesompele y col., 2002).
Western Blotting
Las células se cosecharon y lisaron en solución amortiguadora RIPA (50 mM Tris-Cl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 % Igepal, 0.5 % Na-desoxicolato, 0.1 % SDS) suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa completa (Roche, Nutley, NJ). La concentración de proteína del lisado se determinó por Pierce BCA Protein Assay™ (Thermo Scientific™, Waltham, MA). El liado se corrió en 8 % SDS gel poliacrilamida (20 ug de proteína por carril) y las proteínas se transfifieron en membrana PVDF (Millipore™, Billerica, MA). El blot se bloqueó con la solución amortiguadora de bloqueo Odyssey™ (Li-cor Biosciences™) y se probó con anticuerpo anti-MCT4. La vinculina se usó como un control de carga. Seguido de la incubación durante toda la noche a 4 °C, el anticuerpo primario se probó con el anticuerpo secundario correspondiente y se detectó usando el Odyssey Infrared Imaging System™ (Li-cor Biosciences™) y Image Studio Version 3.1™ (Li-cor Biosciences™). El análisis de densitometría se hizo usando ImageJ (U. S. National Institutes of Health, Bethesda, MD).
Ensayo modificado de cámara Boyden
La migración y la invasión potencial de las células PC-3 seguido del tratamiento con ASOs MCT4 se investigó usando cámara Boyden modificada recubierta con Matrigel (BD Bioscience™, San Jose, CA) como se describió previamente (Chiang y col., 2014). Brevemente, las células tratadas con ASO se sembraron en la cámara superior a 50,000 células vivas por pocillo. Las células entonces se volvieron a suspender después de 48 horas usando solución amortiguador de disociación (Trevigen™, Gaithersburg, MD) que contiene AMS calcein (12.5 mM; Trevigen™). El número de células migradas/invadidas en la cámara inferior se determinó por medición de fluorescencia (485 nm excitación, 520 nm emisión) de las suspensiones celulares usando el Infinite F500 fluorometer™ (Tecan™, Mannedorf, Suiza).
Determinación de lactato y glucosa
Las células PC-3 transfectadas con ASOs por 48 horas se evaluaron para niveles de lactato y glucosa. Las células se incubaron con medios frescos por 4 horas. Una muestra de los medios entonces se tomó y desproteinó con 10K Spin Columns™ (BioVision™, Milpitas, CA) previo a la determinación de concentración de lactato usando Lactate Assay Kit (BioVision) y concentración de glucosa usando Glucose Assay K it™ (BioVision™). Los niveles intracelulares de lactato se determinaron lisando las células transfectadas de ASO en MQH2 O. Las concentraciones finales se determinaron normalizando al número total de células vivas.
Tratamiento con ASO MCT4 de ratones sin pelo portadores de tumores PC-3
Las células PC-3 (106 células en 1:1 HBSS:Matrigel) se inyectaron subcutáneamente en ambos costados de 24 ratones sin pelo atímicos machos (Simonsen Laboratories™, Gilroy, CA). Una vez que el volumen del tumor hubo alcanzado aproximadamente 100 mm3 , los ratones se aleatorizaron en cuatro grupos y se trataron con inyecciones intraperitoneales de ASO MCT4 #1 (SeQ ID NO: 1), #14 (SEQ ID NO: 5), ASO de control, o vehículo (PBS) a 10 mg/kg diariamente por 5 días seguido de 2 días de descanso de tratamiento por un total de 15 días. La salud de los ratones se monitoreó durante el estudio midiendo los pesos corporales y verificando el comportamiento anormal tal como letargo, falta de hidratación y signos adicionales de debilidad. El tamaño del tumor se midió dos veces a la semana y el volumen del tumor se calculó usando la fórmula: Volumen = Longitud x amplitud x profundidad x 0.5236 (mm3). Los ratones se sacrificaron 1 hora después de la dosis final para la recolección del tejido.
Inmunohistoquímica del tejido del tumor
El tejido tumoral se fijó con formalina e incorporado en parafina para análisis inmunohistoquímico. Los tejidos se seccionaron, sondearon, y tiñeron con DAB (Sigma™) como se describió previamente (Wang y col., 2005). Para Ki-67 y tinción 3 caspasa escindida, las imágenes de cinco campos aleatorios en magnificación 400x se tomaron por tumor y las células se contaron para determinar el porcentaje de las células positivamente teñidas. Para MCT4 , las imágenes de cinco campos aleatorios en magnificación 200x se tomaron por tumor y la intensidad de la tinción fue evaluada por porcentaje de puntuación, usando la fórmula: Intensidad = (% de puntaje del área 3) x 3 (% de puntaje del área 2) x 2 (% de puntaje del área 1) x 1. El grado de agregación de células inmunitarias se cuantificó seguido de la tinción CD31 formando las imágenes de las cinco regiones más prominentes de agregados por tumor a magnificación 200x y determinando el área de porcentaje del campo que ocuparon. Las proporciones de las células inmunitarias se evaluaron como el área de tinción positiva normalizada para el área ocupada por agregados de células inmunitarias en las mismas cinco regiones prominentes.
Análisis estadístico
Todos los resultados agrupados se presentan como Media ± SEM. El análisis estadístico se realizó usando GraphPad Prism 6 ™ (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). La prueba t estudiante se realizó para comparar los medios entre dos grupos. ANOVA de una vía seguido por la prueba post-hoc de Dunnett se usó para comparar los medios de más de dos grupos. ANOVA de dos vías seguido de comparación múltiple post-hoc se aplicó para comparar el crecimiento tumoral. Una prueba de contingencia se hizo para comparar la intensidad de tinción entre cohortes de pacientes en la microconfiguración de tejidos. Una prueba de intervalo logarítmico se hizo para comparar las curvas de supervivencia del paciente. Las pruebas chi-cuadradas se hicieron para correlacionar los niveles de expresión MCT4 con varios parámetros clínicos. Los resultados con un valor p <0.05 se consideraron estadísticamente importantes y son indicados por * para p<0.05, ** para p<0.01, y *** para p<0.001.
Ejemplos
Ejemplo 1: La expresión elevada de proteína MCT4 está asociada con CRPC
Una microconfiguración de tejido (TMA) compuesta de tejidos de cánceres de próstata grado Gleason 3, 4 y 5 se tiñó para proteína MCT4. Como se muestra en las FIGURAS 1A y 1B, los cánceres de próstata grado Gleason 5 tuvieron expresión de proteína MCT4 significativamente incrementada relativo a los especímenes de grado Gleason 3 y 4. También, la expresión MCT4 elevada se asoció con un tiempo más temprano para recaída del tratamiento primario como se midió por incremento en los niveles PSA de suero, con el cohorte alto expresando MCT4 que tiene un tiempo promedio para la recaída de 63.3 meses vs. 94.2 meses para el cohorte bajo expresando MCT4 (FIGURA 1C). Adicionalmente, la expresión alta MCT4 se correlacionó con otras características clínicas asociadas con prognosis pobre, tal como niveles más altos de PSA de suero en diagnóstico y etapa T clínica (TABLA C). Además, la expresión elevada de proteína MCT4 se encontró en tumores de pacientes sometidos a terapia prolongada de hormonas neo-adyuvante (>6 meses) y pacientes CRPC (FIGURAS 1D y 1E), indicando que la expresión elevada de proteína MCT4 en cáncer de próstata está asociada con el desarrollo de CRPC.
Tabla C: Características clinocpatológicas asociadas con expresión alta MCT4 en muestras de pacientes
MCT4 bajo (0+1) MCT4 alto (2+3) Valor p
Gleason
<7 60.7 % (17/28) 39.3 % (11/28) 0.0061**
7 52.0 % (53/102) 48.0 % (49/102)
>7 29.1 % (16/55) 70.9 % (39/55)
PSA
<10 ng/mL 56.3 % (71/126) 43.7 % (55/126) 0.0157
>10 ng/mL 37.3 % (22/59) 62.7 % (37/59)
Etapa T
<pT2 55.4 % (51/92) 44.6 % (41/92) 0.0040
>pT3 34.4 % (32/93) 65.6 % (61/93)
Margen quirúrgico
Negativo 48.5 % (50/103) 51.5 % (53/103) 0.2595
Positivo 40.2 % (33/82) 59.8 % (49/82)
Invasión de cápsula
Negativo 52.1 % (49/94) 47.9 % (45/94) 0.0435
Positivo 37.4 % (34/91) 62.6 % (57/91)
Invasión SV
Negativo 48.3 % (72/149) 51.7 % (77/149) 0.0544
Positivo 30.6 % (11/36) 69.4 % (25/36)
Ejemplo 2: Atenuación génica de MCT4 que inhibe la proliferación celular PC-3
La eficacia terapéutica potencial de inhibición de la expresión MCT4 se investigó usando los ASO y siARN que tienen como objetivo MCT4. Las células humanas CRPC PC-3 se usaron ya que presentan perfil distinto metabólico glicolítico, una propiedad asociada con la expresión MCT4 (Vaz y col., 2012). Como se muestra en la FIGURA 2A, el tratamiento de células PC-3 con siARN MCT4 llevó a una inhibición de proliferación celular, sugiriendo eficacia terapéutica potencial de un enfoque de atenuación génica MCT4. Por consiguiente, se designaron los ASO que específicamente tiene como objetivo MCT4 humano. La selección de diez ASO MCT4 reveló capacidades variantes de inhibición de proliferación celular de PC-3 y expresión MCT4 , con ASOs #1 (SEQ ID NO: 1) y #14 (SEQ ID NO: 5) mostrando la potencia más grande (FIGURAS 2B y 2C). Una correlación fuerte se encontró entre los niveles reducidos de mARN MCT4 en células PC-3 tratadas con los varios ASOs y los números de células resultantes (FIGURA 2D), indicando que la inhibición del crecimiento por los ASO estuvo directamente relacionada a la atenuación génica MCT4.
Ejemplo 3: ASOs MCT4 que inhiben la proliferación celular PC-3
Las actividades inhibitorias de crecimiento de los ASO MCT4 #1 (SEQ ID NO: 1) y #14 (SEQ ID NO: 5) además se caracterizaron. Como se muestra en la FIGURA 2E, la proliferación celular PC-3 se inhibió por ambos ASOs de una manera dependiente de dosis, con ASO #14 siendo ligeramente más efectivo (IC50 = 26 nM) que el ASO #1 (IC50 = 50 nM). Los ASO también redujeron los niveles de mARN MCT4 de una manera dependiente de dosis, reflejando su inhibición de proliferación celular (IC50 ASO #14 = 32 nM, IC50 ASO #1 = 50 nM). Como se muestra en la FIGURA 2F, ambos ASOs mantuvieron la inhibición de la proliferación celular incluso en 96 horas después de la transfección. Mientras los niveles de mARN MCT4 comenzaron a incrementar ligeramente comenzando después de 48 horas después de la transfección, los niveles de proteína MCT4 se mantuvieron bajos incluso en 96 horas.
Ejemplo 4: Los ASO MCT4 ejercen inhibición del crecimiento y una reducción en la expresión MCT4 en una variedad de líneas celulares de cáncer de próstata humano y no MCT4 de ratón
Cuando los ASO MCT4 #1 (SEQ ID NO: 1) y #14 (SEQ ID NO: 5) se transfectaron en células CRPC C4-2 humanas estas inhibieron su proliferación con valores IC50 comparables a aquellos observados con células PC-3, es decir ASO #1 = 40 nM, ASO #14 = 27 nM. Similarmente, estas redujeron la expresión MCT4 con valores IC50 de 50 nM para ASO #1 y 26nM para ASO #14 (FIGURA 3A). Además, cuando los ASO se transfectaron en células de cáncer de próstata DU145 cáncer de próstata humanas, un efecto inhibitorio similar en la proliferación celular y la expresión MCT4 se observó con casi valores IC50 idénticos (FIGURA 3B). La transfección de los ASO en las células de cáncer de próstata LNCaP también mostró una inhibición similar de proliferación celular y expresión MCT4 (FIGURAS 7A-7B), sugiriendo que el efecto inhibitorio está más asociado con un fenotipo glicolítico que el estatus receptor andrógeno. De manera llamativa, la transfección de los ASO MCT4 #1 y #14 en células de cáncer de próstata TRAMPC2 de ratón no llevó a una reducción importante en la proliferación celular o expresión MCT4 de ratón (FIGURA 3C). Tomados juntos, los resultados sugieren que estos ASOs que específicamente tiene como objetivo MCT4 humano y que su efecto inhibitorio en la proliferación celular es una consecuencia de atenuación génica MCT4.
Ejemplo 5: Los ASO MCT4 candidato inhiben el metabolismo de glucosa y migración/invasión del tejido de las células CRPC in vitro
Para examinar adicionalmente los efectos de los ASO que tiene como objetivo MCT4 en células de cáncer de próstata, se ha medido sus efectos en la secreción de ácido láctico, concentraciones de lactato intracelular, y consumo de glucosa de células PC-3. La transfección de las células con ASOs MCT4 #1 (SEQ ID NO: 1) y #14 (SEQ ID NO: 5) llevó a una inhibición marcada de secreción de ácido láctico, una acumulación correspondiente de lactato intracelular y una disminución extensa en consumo de glucosa, medida después de 48 horas de transfección (FIGURA 4A). Además, como se muestra en la FIGURA 4B, el tratamiento con los ASO resultó en regulación de varios genes implicados en la glucólisis, es decir GAPDH, PGK1, PGAM1 y ENO1. Además, la expresión de lactato deshidrogenasa A (LDHA) se encontró estaba decaída, lo que indica una disminución en la conversión de piruvato a ácido láctico. Además, la expresión disminuida se encontró para piruvato deshidrogenasa quinasa-1 (PDK1), una enzima que desvía el piruvato del ciclo TCA y promueve su conversión al ácido láctico. De este modo el tratamiento con los ASO MCT4 llevó a la inhibición de glucólisis aeróbica.
El tratamiento con los ASO MCT4 también inhibió la invasion y migración de tejido de las células PC-3 en cámaras Boyden modificadas (FIGURAS 8A-8B), sugiriendo que la secreción del ácido láctico tan facilitada por MCT4 podría también desempeñar una función importante en el proceso metastásico.
Ejemplo 6: Crecimiento de los xenoinjertos PC-3 en ratones sin pelo tratados con ASOs MCT4
Ratones atímicos sin pelo macho con tumores subcutáneos PC-3 se trataron con ASOs MCT4 #1 (SEQ ID NO: 1)y #14 (SEQ ID NO: 5) por un total de 15 días. Ambos ASOs inhibieron marcadamente el crecimiento de los tumores (FIGURA 5A) sin inducir toxicidad principal del hospedero como se evaluó por el monitoreo de pesos de los animales (FIGURAS 9A-9B) y el comportamiento. El análisis inmunohistoquímico reveló que la inhibición inducida de ASO del crecimiento tumoral se asoció con un incremento en la apoptosis tumoral, según lo medido por la tinción de 3 caspasa escindida y una disminución en la proliferación celular, según lo medido por la tinción Ki-67 (FIGURA 5B). La disminución en el crecimiento tumoral se asoció con una disminución en la expresión de proteína MCT4 (FIGURA 5C), consistente con un efecto anti-proliferativo generado por atenuación génica MCT4. Las imágenes representativas de los tumores de cada grupo mostraron presencia de tinción fuerte de membrana en los tumores de control, que estuvo ausente en los tumores tratados con ASO MCT4 (micrografías no mostradas).
Ejemplo 7: Efectos de los ASO MCT4 en agregados de células inmunitarias en ratones sin pelo
Ya que la acidificación inducida por ácido láctico de los tumores ha sido ligada a la supresión de inmunidad anticáncer del hospedero local (Choi y col., 2013), es de interés determinar si el tratamiento de los ratones sin pelo portadores de tumor PC-3 con ASOs MCT4 ASOs causan cambios en la respuesta inmunitaria del hospedero local de estos ratones aunque su reactividad inmunitaria fue muy limitada. Con ese fin, los agregados de células inmunitarias que habían extravasado de los vasos sanguíneos CD31-positivos, particularmente en la periferia tumoral, fueron cuantificados. Como se muestra en la FIGURA 6A, los xenoinjertos tratados con los dos ASO MCT4 tuvieron agregados de células inmunitarias significativamente más grandes comparado a los tumores de control. Cuando las micrografías se examinaron estas mostraron agregados inmunitarios que se caracterizan por áreas de núcleos pequeños, circulares, densamente compactados que son distintos de las células tumorales circundantes y la tinción para CD31 revela que estas células inmunitarias han extravasado y rodeado los vasos sanguíneos en la periferia tumoral (micrografías no mostradas). La cuantificación de la población de células asesinas naturales (NK), el subtipo de células inmunitarias citotóxicas predominantes en ratones sin pelo (Shultz y col., 2007), reveló que el tratamiento con los ASO MCT4 incrementó marcadamente la proporción de las células NK asociadas a tumor (FIGURA 6B). Además, la activación de las células NK es facilitada por CD3 (Koch y col., 2013), una molécula comúnmente considerada como un marcador de célula T para su asociación con el complejo receptor de células T. Su expresión en las células NK es detectable por inmunohistoquímica (Morice, 2007), y en vista de la ausencia de las células T en los ratones sin pelo, puede usarse como un indicador de activación de células NK (Lanier y col., 1992). El tratamiento con ASO MCT4 también alteró significativamente la composición de las células inmunitarias presentes en los agregados, mediante la cual se tiñe el marcador de células NK NK1.1 que reveló que había una proporción incrementada de células NK asociadas con el tumor (micrografías no mostradas). Como se muestra en la FIGu Ra 6C, la proporción de las células positivas CD3 incrementó con el tratamiento ASO MCT4. Mientras la tinción reveló que la proporción de células NK activadas asociadas con los tumores tratados con ASO también incrementó, sugiriendo la estimulación de inmunidad anti cáncer.
Ejemplo 8: Terapias de combinación con SEQ ID NO: 5
Varias estrategias de combinación se seleccionaron en las concentraciones IC50 aproximadas para determinar si los efectos sinérgicos pueden encontrarse combinando terapias actuales contra el cáncer (ver TABLA D) con ASO MCT4 SEQ ID NO:5. En las FIGURAS 10A-10C, los números totales de células vivas PC3 se evaluaron 48 horas después del tratamiento con Metformina, Doxiciclina y docetaxel tanto solos como en combinación con ASO MCT4 SEQ ID NO:5. Sin embargo, las células C4-2 se usaron para probar MDV3100, SEQ ID NO:5 y una combinación de SEQ ID NO:5 y MDV3100 (FIGURA 10D). La combinación de Docetaxel con a So MCT4 SEQ ID NO:5 mostró efecto sinérgico con índice de combinación = 0.780.
Tabla D: Concentraciones IC50 de SEQ ID No. 5, Metformina, Doxiciclina, Docetaxel MDV3100
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Aunque las modalidades descritas en la presente memoria han sido descritas con algún detalle a modo de ilustración y ejemplo a los efectos de la claridad de la comprensión, será fácilmente evidente para los expertos en la materia a la luz de las enseñanzas descritas en este documento que pueden realizarse cambios y modificaciones sin desviarse del espíritu o enfoque de aplicación de las reivindicaciones adjuntas. Tales modificaciones incluyen la sustitución de equivalentes conocidos por cualquier aspecto de la invención con el fin de lograr el mismo resultado sustancialmente de la misma manera. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números definiendo el intervalo. La palabra “comprende” se usa en la presente memoria como un término abierto, sustancialmente equivalente a la frase “ incluyendo, pero no limitado a” , y la palabra “comprende” tiene un significado correspondiente. Como se usa en la presente memoria, las formas singulares “un” , “uno” y “ la/el” incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo. Así, por ejemplo, referencia a “una cosa” incluye más de una tal cosa. La cita de las referencias en la presente memoria no es una admisión de que tales referencias son previas a la técnica para una modalidad de la presente invención. La invención incluye todas las modalidades y variaciones sustancialmente como se describe en la presente memoria y con referencia a las figuras. Referencias
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Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    Un oligonucleótido antisentido (ASO) MCT4 , en donde el oligonucleótido tiene una secuencia seleccionada de las siguientes:
    (a) TCCCATGGCCAGGAGGGTTG (SEQ ID NO:1);
    (b) GTCCCGGAAGACGCTCAGGT
  2. (SEQ ID NO:2);
    (c) AAGGACGCAGCCACCATGCC
  3. (SEQ ID NO:3);
    (d) TTGGCGTAGCTCACCACGAA
  4. (SEQ ID NO:4);
    (e) AGATGCAGAAGACCACGAGG (SEQ ID NO:5);
    (f) CCACTCTGGAATGACACGGT (SEQ ID NO:6);
    (g) GTAGGAGAAGCCAGTGATGAC (SEQ ID NO:7);
    (h) AGCATGGCCAGCAGGATGGA (SEQ ID NO:8);
    (i) GGCT GGAAGTT GAGT GCCAA (SEQ ID NO:9);
    (j) CAT GCCGT AGGAGAT GCCAA (SEQ ID NO: 10);
    (k) CTCAGGCTGTGGCTCTTTGG (SEQ ID NO:11);
    ( l) TAGCGGTTCAGCATGATGA (SEQ ID NO:12);
    (m) AGCACGGCCCAGCCCCAGCC (SEQ ID NO:13);
    (n) GAGCTCCTTGAAGAAGACACT (SEQ ID NO:14);
    (o) CAGGATGGAGGAGATCCAGG (SEQ ID NO:15);
    (p) AGACCCCCCACAAGCAT GAC (SEQ ID NO:16);
    (q) GAAGTTGAGTGCCAAACCCAA (SEQ ID NO:17);
    (r) CCCGTTGGCCATGGGGCGCC (SEQ ID NO: 18);
    (s) GCCAGCCCGTTGGCCAT GGG (SEQ ID NO:19);
    (t) AGGAAGACAGGGCTACCTGC (SEQ ID NO:20);
    (u) GCACACAGGAAGACAGGGCT (SEQ ID NO:21);
    (v) CAGGGCACACAGGAAGACAG (SEQ ID NO:22);
    (w) CAGCAGTTGAGCAGCAGGCC (SEQ ID NO:23);
    (x) ATGGCCAGGAGGGTTG (SEQ ID NO:46);
    (y) CATGGCCAGGAGGGTT (SEQ ID NO:47);
    (z) CCATGGCCAGGAGGGT (SEQ ID NO:48); y
    (aa) CCCATGGCCAGGAGGG (SEQ ID NO:49).
    El ASO de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia seleccionada de las siguientes:
    (a) TCCCATGGCCAGGAGGGTTG (SEQ ID NO:1);
    (b) AGATGCAGAAGACCACGAGG
  5. (SEQ ID NO:5);
    (c) ATGGCCAGGAGGGTTG (SEQ ID NO:46);
    (d) CATGGCCAGGAGGGTT (SEQ ID NO:47);
    (e) CCATGGCCAGGAGGGT (SEQ ID NO:48); y
    (f) CCCATGGCCAGGAGGG (SEQ ID NO:49).
    El ASO de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia seleccionada de las siguientes:
    (a) AAGGACGCAGCCACCATGCC (SEQ ID NO:3);
    (b) TTGGCGTAGCTCACCACGAA (SEQ ID NO:4);
    (c) CCACTCTGGAATGACACGGT (SEQ ID NO:6);
    (d) GGCTGGAAGTTGAGTGCCAA (SEQ ID NO:9);
    (e) AGCACGGCCCAGCCCCAGCC (SEQ ID NO:13); y
    (f) GAGCTCCTTGAAGAAGACACT (SEQ ID NO:14).
    El ASO de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido tiene una secuencia seleccionada de las siguientes:
    (a) GTCCCGGAAGACGCTCAGGT (SEQ ID NO:2);
    (b) AGCATGGCCAGCAGGATGGA (SEQ ID NO:8);
    (c) CTCAGGCTGTGGCTCTTTGG (SEQ ID NO:11);
    (d) CAGGATGGAGGAGATCCAGG (SEQ ID NO:15);
    (e) GAAGTT GAGT GCCAAACCCAA (SEQ ID NO:17);
    (f) CCCGTTGGCCATGGGGCGCC (SEQ ID NO:18);
    (g) GCCAGCCCGTTGGCCATGGG (SEQ ID NO:19); y
    (h) CAGGGCACACAGGAAGACAG (SEQ ID NO:22).
    El ASO de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el ASO además comprede: una ligadura internucleósido modificada; una porción de azúcar modificada; una modificación gapmer 2'MOE; o una nucleobase modificada.
  6. 6. El ASO de la reivindicación 5, en donde la ligadura internucleósido modificada es una ligadura de ácido péptido-nucleico, una ligadura morfolina, una ligadura fosforoamidato N3’ a P5’, una ligadura metilfosfonato o una ligadura fosforotioato; en donde la porción de azúcar modificada es 2’-O-alquilo oligoribonucleótido; o en donde la nucleobase modificada es una pirimidina 5-metilo o una pirimidina 5- propinilo.
  7. 7. Una composición farmaceútica, comprendiendo la composición (a) un oligonucleótido antisentido (ASO) MCT4 según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 ; y (b) un portador farmacéuticamente aceptable.
  8. 8. Un oligonucleótido antisentido (ASO) MCT4 según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para uso en el tratamiento del cáncer.
  9. 9. El ASO según la reivindicación 8 para uso según la reivindicación 8, en donde el cáncer se caracteriza por expresión elevada de MCT4.
  10. 10. El ASO según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para uso según la reivindicación 9, en donde el cáncer se selecciona de uno o más de los siguientes: cáncer de próstata; carcinoma de células renales; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; cáncer de hígado; cáncer de vejiga; y cáncer pulmonar de células pequeñas.
  11. 11. El ASO según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, para uso según la reivindicación 10, en donde el cáncer de próstata es cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) o en donde el cáncer de próstata es CRPC resistente a enzalutamida (ENZ).
  12. 12. El ASO según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, para uso según las reivindicaciones 8-11, en donde el ASO se mezcla con partículas de lípido previo a la administración o en donde el ASO se encapsula en liposomas previo a la administración.
  13. 13. Un oligonucleótido antisentido (ASO) MCT4 que tiene una secuencia seleccionada de una o más de: SEQ ID NOs:1-23 y SEQ ID NOs:46-49 para uso en una terapia de cáncer, comprendiendo la terapia la administración de nucleótido antisentido y Docetaxel a un paciente.
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