CN113321691A - 一种鸟苷提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种鸟苷提纯方法，步骤为：A、将鸟苷发酵液调节pH值为9.5～11.5，加热后利用陶瓷膜过滤系统分离发酵液得含鸟苷的滤液，所述加热温度为80～100℃；B、将步骤A的滤液流经大孔活性炭填充柱，吸附分离滤液中的大分子蛋白和杂质，得到澄清的收集液；C、将步骤B的收集液，利用热泵蒸发器浓缩得浓缩液；D、将步骤C的浓缩液，用盐酸调节pH6.5～7.5，降温结晶，析出鸟苷晶体，15～25℃分离得到粗品；粗品加入溶解罐，加热溶解，加入聚硅铁絮凝，脱色，过滤，滤液降温结晶，分离得到精品，烘干得到鸟苷成品。本发明提纯工艺成本低，鸟苷质量、收率提高。

Description

一种鸟苷提纯方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种鸟苷提纯方法。

背景技术

鸟苷(Guanosine)，也称为鸟嘌呤核苷，又名9-β-D-呋喃核糖基鸟嘌呤，难溶于冷水，易溶于温水，18℃下1320mL水中溶解1g；然而在沸水浴中，33mL水中就能溶解1g。还可溶于酸碱，如稀盐酸、热乙酸等；不溶于有机溶剂，如醇、醚、氯仿和苯等。鸟苷的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体，由于其磷酸化的5’-鸟苷酸二钠具有呈味特性，加之与谷氨酸钠有协同效应，因此可提高味精鲜味数倍至数十倍。同时它还是利巴韦林、阿昔洛韦、无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等核苷类抗病毒药物的重要原料。目前，鸟苷需求以每年10～20％的速度增加。现有的从发酵液中提纯分离鸟苷的方法为发酵液过膜除去菌体，得到的滤清液再通过超滤膜除蛋白、再进一步精制获得鸟苷。然而，现有的鸟苷提取方法主要存在以下问题：首先，超滤膜脱除蛋白投入成本高、纯化不完全、清洗难度大和运行耗电量大，膜组件在实际使用的过程中由于温度高和碱性大且难以再生完全，损坏频繁，严重影响正常生产的进行；其次，膜滤液结晶的过程中，由于鸟苷浓度低，结晶液体积大，需要耗用大量的冷媒降温结晶，且结晶不完全，母液量大，难以回收，鸟苷损失较多；再次，精制用普通的絮凝剂和活性炭脱色难以除去残余的杂蛋白，导致精制后的鸟苷含量难以提高，鸟苷品质需要进一步提高，才能达到市场使用要求。

发明内容

针对上述技术缺陷，本发明解决现有提取工艺中鸟苷收率较低的问题，同时保证所提取的鸟苷品质。本发明提供一种鸟苷提纯方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种鸟苷提纯方法，包括以下步骤：A、将鸟苷发酵液调节pH值为9.5～11.5，加热后利用陶瓷膜过滤系统分离发酵液，浓缩液为菌体溶液，干燥成饲料蛋白，透析液为含鸟苷的滤液，所述加热温度为80～100℃；B、将步骤A的滤液流经大孔活性炭填充柱，吸附分离滤液中的大分子蛋白和杂质，得到澄清的收集液；C、将步骤B的收集液，利用热泵蒸发器浓缩，得到鸟苷浓度为15～35％，温度为75～85℃的浓缩液；D、将步骤C的浓缩液，用盐酸调节pH6.5～7.5，降温结晶，析出鸟苷晶体，15～25℃分离得到粗品；E、在溶解罐中加入水，将步骤D的粗品加入溶解罐，加热溶解，再加入聚硅铁絮凝，脱色，过滤，滤液降温结晶，分离得到精品，烘干得到鸟苷成品。

进一步：在上述鸟苷提纯方法中，所述步骤B中大孔活性炭填充柱的活性炭孔径在2～100nm，颗粒为10～40目，吸附杂质后，用水反冲除去固体杂质，加碱再生，洗水，脱除大分子蛋白和杂质；所述步骤E中的溶解控制鸟苷浓度为3～10％，加热温度为80～95℃。所述步骤E中的絮凝过程为加入溶液总体积0.1～1％的絮凝剂聚硅铁，保温絮凝15～30min。传统使用的聚合硫酸铝、聚合氯化铝含有铝离子，对人体有害；聚丙烯酰胺中残留及使用过程中分解的丙烯酰胺具有毒性；聚合氯化铝挥发盐酸，危害健康；聚合硫酸铝酸性，需要加入较多碱去中和。聚硅铁适用范围广，PH值5～13范围内可使用，中性条件使用效果好；不含铝离子，对人体无毒无害；絮凝速度快、矾花密实、絮体尺寸大，沉降速度快、沉降性能优异，大幅降低了过滤难度和过滤时间；絮凝效率高，比聚铝、聚铁类产品用量更少。

所述步骤E中的脱色过程为加入溶液总体积0.2～2％的粉末活性炭，保温脱色15～30min，分离温度5～15℃。步骤E脱色过滤，采用两步过滤法。首先，料液经过烛式过滤器(一级粗过滤器)，截留大量活性炭，然后料液经过陶瓷膜(二级精密过滤器)，截留微小杂质。相比传统采用PA过滤器一步过滤法，两步过滤法具有如下优点：1、鸟苷溶解度小，溶解温度高，90～100℃才能溶解清澈，因此，需要90～100℃保温过滤，传统PA过滤器使用的PA滤棒高温容易老化，更换频繁，费用高；两步法一级粗过滤器选用耐高温滤布的烛式过滤器，二级精密过滤器选用陶瓷膜，可以耐受高温的使用条件。2、鸟苷溶解液杂质多，传统PA过滤器孔径小、精度高，截留杂质容易堵塞PA棒微孔，过滤速度很快衰减，需要频繁反冲洗，过滤时间长，相同过滤面积，流量小，且大量的活性炭累积在滤棒表面，充满空间，经常使滤棒接口断裂，造成漏碳，停止生产；两步法首先粗过滤，再精过滤，大量的活性碳截留在粗过滤器，精密过滤活性炭量少，保证了总过滤速度。3、传统PA过滤器过滤完毕排出的是活性碳渣和水的混合液，需要进一步将固液分离，才能得到固体炭渣，进行环保处理；两步法过滤完毕，直接从粗过滤器排出干炭渣，利于后续环保处理。所述步骤A陶瓷膜孔径为20～200nm。所述步骤C热泵蒸发器为单效、双效或多效浓缩炉中的任意一种。所述步骤E烘干是指利用闪蒸干燥器，条件为进风温度控制在150～200℃，混合温度控制在120～180℃。

本发明将收集液采用多效热泵蒸发浓缩。热泵蒸发器工作原理是二次蒸汽的压力和温度比较低，难以通过换热器换热利用，但是，二次蒸汽与生蒸汽的焓值相差并不大，通过提高二次蒸汽的压力，则二次蒸汽中的热能可得到反复应用，而此过程需要的外加能量远小于由此可收回的可利用能量，从而达到节能的目的。采用热能压缩器，利用较高压力的工作蒸汽，将蒸发出来二次蒸汽压缩，提高其压力，进而作为蒸发器加热蒸汽，二次蒸汽得到循环利用，节能降耗，增加了结晶液中鸟苷的浓度，减少了分离鸟苷后母液的体积，鸟苷损失少。本发明将粗品溶解液用聚硅铁絮凝后再脱色，进一步脱除杂质，使产品含量提高，提高了产品品质。本发明采用的大孔活性炭填充柱提纯、多效蒸发和聚硅铁絮凝脱色的提纯工艺，有利于质量、收率的提高和成本的降低。即根据鸟苷的特点，本发明对于各个提取阶段的浓度、温度及pH值参数进行了有效的调控，能够有效的去除蛋白和其他杂质，提高收率，另外通过各个阶段的投料配方，絮凝剂，脱色剂等手段控制，进一步提高鸟苷品质。本方法应用于工业大规模生产鸟苷具有重要的意义。

与现有技术相比，本发明将发酵液经陶瓷膜处理后直接大孔活性炭填充柱处理，除去发酵液中的大分子蛋白和杂质，收集液杂质少，纯净的结晶液利于结晶体析出，降低结晶母液中有效成分的含量，提高粗品的质量和收率。

具体实施方式

本发明的主旨是通过从发酵液提纯鸟苷，该方法具有粗品质量好、产品品质高的特点，克服了现有技术存在的粗品含杂质多、分离困难、能耗高、收率低的缺点，使鸟苷的收率和质量得到显著提高。下面将通过本发明的实施例进行更加详细的说明。但以下这些实施例只是为了对本发明进行详细的说明而列举的示例，本发明的范围并不只局限于这些实施例。

实施例1

发酵液85立方，鸟苷含量46.5g/L，在搅拌条件下，调pH值至9.5，蒸汽将发酵液加热至96℃，进行陶瓷膜微滤系统过滤，压力0.2～0.5MPa，得到滤清液，加入洗水，一边过滤一边洗涤菌体，过滤完毕，菌体抽去制作菌体蛋白饲料，合并洗水和透析液，通过孔径为50～80nm，颗粒大小为15～35目的大孔活性炭填充柱，得到澄清收集液，用三效热泵蒸发器浓缩，得到鸟苷浓度25.5％的浓缩液，用盐酸调节pH值至7.1，然后6h内缓慢降温至18℃进行结晶、分离，得到鸟苷粗品。再将粗品加入装有水的溶解罐，溶液浓度为4.6％，温度95℃，向其中加入溶液总体积0.3％的絮凝剂聚硅铁，保温絮凝20min，随后加入溶液总体积1％的粉末活性炭，保温脱色15min，过滤，滤液5h内降温至10℃结晶，分离得到鸟苷湿精品，湿品利用闪蒸干燥器烘干，进风温度158℃，混合温度控制在132℃，得到鸟苷成品3.54吨。鸟苷成品的收率89.5％，鸟苷含量99.3％，灼烧残渣0.3％。

实施例2

发酵液88立方，鸟苷含量44.3g/L，在搅拌条件下，调pH值至10.3，蒸汽将发酵液加热至95℃，进行陶瓷膜微滤系统过滤，压力0.2～0.5MPa，得到滤清液，加入洗水，一边过滤一边洗涤菌体，过滤完毕，菌体抽去制作菌体蛋白饲料，合并洗水和透析液，通过孔径为50～80nm，颗粒大小为15～35目的大孔活性炭填充柱，得到澄清收集液，用三效热泵蒸发器浓缩，得到鸟苷浓度20.1％的浓缩液，用盐酸调节pH值至6.8，然后6h内缓慢降温至17℃进行结晶、分离，得到鸟苷粗品。再将粗品加入装有水的溶解罐，溶液浓度为3.2％，温度93℃，向其中加入溶液总体积0.5％的絮凝剂聚硅铁，保温絮凝20min，随后加入溶液总体积0.8％的粉末活性炭，保温脱色15min，过滤，滤液5h内降温至10℃结晶，分离得到鸟苷湿精品，湿品利用闪蒸干燥器烘干，进风温度155℃，混合温度控制在138℃，得到鸟苷成品3.48吨。鸟苷成品的收率89.3％，鸟苷含量99.5％，灼烧残渣0.4％。

实施例3

发酵液77立方，鸟苷含量47.2g/L，在搅拌条件下，调pH值至11.2，蒸汽将发酵液加热至94℃，进行陶瓷膜微滤系统过滤，压力0.2～0.5MPa，得到滤清液，加入洗水，一边过滤一边洗涤菌体，过滤完毕，菌体抽去制作菌体蛋白饲料，合并洗水和透析液，通过孔径为50～80nm，颗粒大小为15～35目的大孔活性炭填充柱，得到澄清收集液，用三效热泵蒸发器浓缩，得到鸟苷浓度23.2％的浓缩液，用盐酸调节pH值至6.9，然后6h内缓慢降温至19℃进行结晶、分离，得到鸟苷粗品。再将粗品加入装有水的溶解罐，溶液浓度为3.1％，温度94℃，向其中加入溶液总体积0.6％的絮凝剂聚硅铁，保温絮凝20min，随后加入溶液总体积0.7％的粉末活性炭，保温脱色15min，过滤，滤液5h内降温至10℃结晶，分离得到鸟苷湿精品，湿品利用闪蒸干燥器烘干，进风温度153℃，混合温度控制在136℃，得到鸟苷成品3.30吨。鸟苷成品的收率90.7％，鸟苷含量99.4％，灼烧残渣0.3％。

上述实施例1-3的测试方法如下：

含量

准确称取于105℃±2℃干燥3h的试样0.25g，用新配PH7.0磷酸盐缓冲液溶解，并定容至1000mL，充分摇匀，吸10mL至250mL容量瓶中用PH7.0缓冲液定容至刻度，此溶液即为试样液。将试样液注入10mm石英比色皿，以pH7.0缓冲溶液作空白，于紫外分光光度计252nm波长下，测定吸收度。计算鸟苷含量。

灼烧残渣

将干净的坩埚置于高温箱形电阻炉，打开盖于(800±20)℃下灼烧至恒重(1h),取出坩埚，盖上坩埚盖，于石棉网上放置3min，再将坩埚放于干燥器中冷却至室温，称量，加入试样1g，精确到0.0001g于电炉上加热，使试样炭化至黑色，冷却后，再加入1mL浓硫酸(A.R.),再放入电炉上加热至无烟,将坩埚送入温度800℃的高温箱形电阻炉中，打开坩埚盖，关闭炉门，逐渐升高温度，(800士20)℃下灼烧至恒重，取出坩埚，盖上坩埚盖，于石棉网上放置3min,再放入干燥器中冷却至室温，称重。计算灼烧残渣。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种鸟苷提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将鸟苷发酵液调节pH值为9.5～11.5，加热后利用陶瓷膜过滤系统分离发酵液得含鸟苷的滤液，所述加热温度为80～100℃；

B、将步骤A的滤液流经大孔活性炭填充柱，吸附分离滤液中的大分子蛋白和杂质，得到澄清的收集液；

C、将步骤B的收集液，利用热泵蒸发器浓缩，得到鸟苷浓度为15～35％，温度为75～85℃的浓缩液；

D、将步骤C的浓缩液，用盐酸调节pH6.5～7.5，降温结晶，析出鸟苷晶体，15～25℃分离得到粗品；

E、在溶解罐中加入水，将步骤D的粗品加入溶解罐，加热溶解，再加入聚硅铁絮凝，脱色，过滤，滤液降温结晶，分离得到精品，烘干得到鸟苷成品。

2.根据权利要求1所述鸟苷提纯方法，其特征在于：所述步骤B中大孔活性炭填充柱的活性炭孔径在2～100nm，颗粒为10～40目。

3.根据权利要求1所述鸟苷提纯方法，其特征在于：所述步骤E中的溶解控制鸟苷浓度为3～10％，加热温度为80～95℃。

4.根据权利要求3所述鸟苷提纯方法，其特征在于：所述步骤E中的絮凝过程为加入溶液总体积0.1～1％的絮凝剂聚硅铁，保温絮凝15～30min。

5.根据权利要求4所述鸟苷提纯方法，其特征在于：所述步骤E中的脱色过程为加入溶液总体积0.2～2％的粉末活性炭，保温脱色15～30min，分离温度5～15℃。

6.根据权利要求1所述的鸟苷提纯方法，其特征在于：所述步骤A陶瓷膜孔径为20～200nm。

7.根据权利要求1所述的鸟苷提纯方法，其特征在于：所述步骤C热泵蒸发器为单效、双效或多效浓缩炉中的任意一种。

8.根据权利要求1所述的鸟苷提纯方法，其特征在于：所述步骤E烘干是指利用闪蒸干燥器，条件为进风温度控制在150～200℃，混合温度控制在120～180℃。