ES2717682T3 - Células con conversión mejorada de pentosas - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Células con conversión mejorada de pentosas.

Compendio de la invención

Un objetivo de la invención es proveer células con conversión mejorada de pentosas. Otro objetivo de la invención es proveer cepas recombinantes que tienen conversión mejorada de xilosa y/o L-arabinosa. Otro objetivo es proveer cepas que tienen conversión mejorada de xilosa y/o L-arabinosa en presencia de glucosa. Otro objetivo es reducir el tiempo de fermentación en la fermentación de mezclas de azúcares que comprenden pentosas y hexosas.

De acuerdo con la invención se logran uno o más de estos objetivos. De acuerdo con la presente invención, se provee una célula de Saccharomyces que expresa constitutivamente un polipéptido heterólogo u homólogo que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27 o una variante de la misma que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 45% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 20, de acuerdo con la reivindicación 1.

Las células de acuerdo con los ejemplos tienen conversión mejorada de pentosas y llevan a tiempos reducidos de fermentación en la fermentación de mezclas de azúcares que comprenden pentosa y hexosa. En una realización, el polipéptido tiene actividad de glioxalasa.

La invención también provee:

- un proceso para producir un producto de fermentación donde dicho proceso comprende fermentar un medio que contiene una fuente de xilosa o L-arabinosa con una célula de la invención de manera tal que la célula fermenta xilosa y/o L-arabinosa para dar el producto de la fermentación;

- el uso de una célula de la invención en un proceso para la producción de un producto de fermentación.

Traff-Bjerre et al. (Yeast, 21:141-150, 2004) divulgan una célula huésped de Saccharomyces cerevisiae que fermenta xilosa y glucosa en donde la aldosa reductasa GRE3 es sobreexpresada para mejorar la conversión de xilosa en etanol. Aguilera et al. (Current Genetics, 31:273-283, 2001) han demostrado que la GRE3 complementa la deficiencia del sistema de glioxalasa de una cepa mutante glo1 A de Saccharomyces cerevisiae.

Descripción detallada de la invención

A lo largo de toda la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprende" e "incluye" y variaciones tales como "que comprende", "que incluye" e "incluido en" se deben interpretar de manera inclusiva. Es decir, dichas palabras se utilizan con la intención de proveer la posible inclusión de otros elementos o números enteros que no se hayan mencionado específicamente, donde el contexto lo permita.

De acuerdo con la invención, la célula de Saccharomyces comprende actividad de glioxalasa I. La glioxalasal (GLO1) es un gen que codifica la glioxalasa I (EC 4.4.1.5), la cual está involucrada en el catabolismo de metilglioxal (2). El metilglioxal es un compuesto tóxico formado como un subproducto de la glicólisis.

Los nombres alternativos para glioxalasa son por ejemplo lactoilglutatión liasa, aldocetomutasa, cetona-aldehído mutasa, metilglioxalasa, S-D- lactoilglutatión metilglioxal liasa.

Un método de catabolismo de metilglioxal comprende un sistema de glioxalasa en el cual el metilglioxal es condensado con glutatión por GLO1 p para producir S-D-lactoilglutatión. Este tioléster de glutatión es luego hidrolizado a ácido láctico y glutatión por la glioxalasa II (Glo2p y Glo4p). La expresión de GLO1 es inducida por metilglioxal y es inducida específicamente por estrés osmótico de un modo dependiente de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAP) glicerol de alta osmolaridad (Hog1p) (1).

La eliminación de GLO1 genera hipersensibilidad a metilglioxal. En S. cerevisiae, la glioxalasa I (GLO1p) es nativa y se presenta como un monómero. Este sistema muestra muchas de las características típicas de las enzimas que eliminan toxinas endógenas. En primer lugar, al contrario del increíble rango de sustratos de muchas de las enzimas involucradas en el metabolismo xenobiótico, muestra una especificidad estrecha por sustrato. En segundo lugar, se requieren tioles intracelulares como parte de su mecanismo enzimático y en tercer lugar, el sistema actúa para reciclar metabolitos reactivos de nuevo a una forma en la cual pueden ser útiles para el metabolismo celular.

En una realización, la invención se relaciona con una célula que expresa una glioxalasa, en donde la secuencia de aminoácidos de la glioxalasa tiene al menos 45% de identidad con la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 20 y en donde la secuencia de nucleótidos está constitutivamente integrada homologa o heteróloga a la célula.

Secuencia de aminoácidos/polinucleótidos

La célula de la invención se define en referencia a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o una secuencia que tiene al menos 45% de identidad de secuencia con la misma. En una realización, la proteína tiene al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98% o al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.

En una realización, la célula comprende y/o expresa un polipéptido que tiene los aminoácidos H, E, H y E correspondientes a las posiciones H25, E89, H269 y E318 y/o H185, E242, H117 y E163 en la SEQ ID NO: 20. En una realización, la célula comprende y/o expresa un polipéptido que tiene un fragmento (E,s,d)-L-X-(H,Y)-(N,s) correspondiente al fragmento E242-L243-X-H245-N246 en la SEQ ID NO: 20. En una realización, la célula comprende y/o expresa un polipéptido que tiene un fragmento G-(F,Y)-G-H correspondiente al fragmento G266-Y267-G268-H269 en la SEQ ID NO: 20. En una realización, la célula comprende y/o expresa un polipéptido que tiene un fragmento G-X(6)-(F,i)-X(2,3)-D-X(3)-Y correspondiente al fragmento G301-X(6)- F308-X(2)-D311-X(3)-Y315 en la SEQ ID NO: 20.

En lo anterior, los aminoácidos están indicados con código de una letra. X es cualquier aminoácido; (X,Y) aminoácido X o Y; X(y) un número y de aminoácidos X y X(y,z) un número y o z de aminoácidos X. El código en minúsculas indica un aminoácido que tiene una ocurrencia baja.

Una célula de Saccharomyces de acuerdo con la presente invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una glioxalasa con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27 o una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 92%, por lo menos aproximadamente 93%, por lo menos aproximadamente 94%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 96%, por lo menos aproximadamente 97%, por lo menos aproximadamente 98% o por lo menos aproximadamente 99% o por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos que se establece en la SEQ ID NO: 27.

Por lo tanto, la invención provee células de Saccharomyces con secuencias de polinucleótidos que comprenden el gen que codifica el polipéptido de glioxalasa, así como a sus secuencias codificantes.

Los polinucleótidos de la invención se pueden aislar o sintetizar. Los polipéptidos de glioxalasa y los polinucleótidos de glioxalasa de la presente pueden ser polipéptidos sintéticos, con sus respectivos polinucleótidos. Los polinucleótidos sintéticos se pueden optimizar por el uso de codones, preferiblemente de acuerdo con los métodos descritos en los documentos W02006/077258 y/o PCT/EP2007/055943. El documento PCT/EP2007/055943 se refiere a la optimización de pares de codones.

El término se refiere a moléculas de polinucleótidos, que son moléculas de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN), ya sea de una sola hebra o de doble hebra. Un polinucleótido puede estar presente ya sea en forma aislada, o puede estar comprendido en moléculas o vectores de ácido nucleico recombinante, o puede estar comprendido en una célula huésped.

La palabra "polipéptido" se utiliza aquí para cadenas que contienen más de siete residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos que se dan aquí se han escrito de izquierda a derecha y en la dirección desde el extremo amino terminal al extremo carboxi terminal. El código de aminoácidos de una letra que se utiliza aquí es conocido comúnmente en la técnica.

Un polipéptido "aislado" o una proteína "aislada" significan un polipéptido o proteína que ha sido retirado de su ambiente nativo. Por ejemplo, polipéptidos y proteínas producidos de manera recombinante, expresados en células huésped se consideran aislados para el propósito de la invención, ya que los mismos son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido purificados sustancialmente por cualquier técnica apropiada tal como, por ejemplo, el método de purificación en un solo paso que se divulga en Smith y Johnson, Gene 67:31 -40 (1988).

Los polinucleótidos de la presente invención, como por ejemplo un polinucleótido que codifica los polipéptidos de glioxalasa, se pueden aislar o sintetizar usando técnicas de biología molecular estándar y la información sobre las secuencias que se provee aquí.

El polinucleótido que codifica los polipéptidos de glioxalasa de la invención se puede amplificar usando ADNc, ARNm o como alternativa, ADN genómico, como un molde y oligonucleótidos cebadores apropiados de acuerdo con las técnicas estándar de amplificación por PCR. El ácido nucleico amplificado de esa manera se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar por análisis de su secuencia de ADN.

Cinética enzimática

Las enzimas son proteínas catalizadoras que, al igual que todos los catalizadores, aceleran la velocidad de una reacción química sin ser consumidas en el proceso.

Las mismas consiguen este efecto uniéndose transitoriamente al sustrato y, al hacer esto, reduciendo la energía de activación que es necesaria para convertirlo en un producto.

Hay varios factores que influyen sobre la velocidad con que trabaja una enzima, por ejemplo, la concentración de moléculas del sustrato (que se denomina [S], expresada en unidades de molaridad), la temperatura, la presencia de inhibidores (inhibidores competitivos que se unen al mismo sitio que el sustrato o inhibidores no competitivos que se unen a otro sitio de la enzima reduciendo su poder catalítico), pH, y otros similares.

La cinética enzimática estudia y describe la velocidad con que trabajan las enzimas. Hay muchos métodos de medición. La enzima convierte al sustrato en producto a una velocidad inicial que es aproximadamente lineal durante un corto período de tiempo luego del inicio de la reacción. A medida que la reacción procede y se consume el sustrato, la velocidad se reduce de manera continua, ya que el sustrato aún está presente en niveles de saturación. Para medir la velocidad inicial (y máxima), típicamente se llevan a cabo ensayos enzimáticos cuando la reacción solo ha progresado hasta un pequeño porcentaje de la completitud total. La duración del período de velocidad inicial depende entre otras cosas de las condiciones del ensayo.

El estudio de la cinética enzimática es importante debido a dos razones básicas. En primer lugar, contribuye a explicar cómo funcionan las enzimas, y en segundo lugar, contribuye a predecir cómo se comportarán las enzimas en los organismos vivos. Las constantes cinéticas, Km y Vmax, son fundamentales para intentar comprender cómo las enzimas trabajan juntas para controlar el metabolismo.

La constante de Michaelis Km se define experimentalmente como la concentración a la cual la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de Vmax. Vmax es la velocidad máxima con que la enzima cataliza la reacción: a medida que [S] crece, la enzima se satura con sustrato y la velocidad alcanza Vmax, la velocidad máxima de la enzima.

Km es (aproximadamente) una medida inversa de la afinidad entre la enzima y su sustrato o de la fuerza con que se unen. Cuanto menor sea el valor de Km (en mM), mayor será la afinidad, y por lo tanto será menor la concentración de sustrato que es necesaria para obtener una determinada velocidad.

La célula huésped

La célula huésped es capaz de convertir uno o más azúcares pentosas, como por ejemplo arabinosa o xilosa en un producto de fermentación.

El diseño genético se describe en detalle de aquí en adelante. Las levaduras se definen aquí como microorganismos eucariotas e incluyen todas las especies de la subdivisión Eumycotina (Alexopoulos, C. J., 1962, En: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York) que crecen predominantemente en forma unicelular.

Las levaduras pueden reproducirse ya sea por gemación de un talo unicelular o pueden reproducirse por fisión del organismo. Una levadura como célula huésped transformada pertenece al género Saccharomyces. Preferiblemente, la levadura es capaz de realizar una fermentación anaeróbica, más preferiblemente es capaz de realizar una fermentación alcohólica anaeróbica.

Preferiblemente el huésped es un huésped industrial. Un huésped industrial y célula de levadura industrial se puede definir de la siguiente manera. Los ambientes donde viven las células de levadura en los procesos industriales son significativamente diferentes a los del laboratorio. Las células de levadura industriales deben ser capaces de desempeñarse bien en múltiples condiciones ambientales que pueden variar durante el proceso. Dichas variaciones incluyen el cambio de fuentes de nutrientes, pH, concentración de etanol, temperatura, concentración de oxígeno, etc., que tienen todas juntas una potencial influencia sobre el desarrollo celular y la producción de etanol de Saccharomyces cerevisiae. En condiciones industriales adversas, las cepas tolerantes al ambiente deberían permitir un robusto crecimiento y producción. Las cepas de levadura industrial generalmente son más robustas ante los cambios de condiciones ambientales que pueden ocurrir en las aplicaciones en que se las utiliza, como por ejemplo en la industria de la panificación, en la industria cervecera, en la elaboración de vinos y en la industria del etanol. Algunos ejemplos de levaduras industriales (S. cerevisiae) son: Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) y Thermosacc® (Lallemand).

En una realización, el huésped es tolerante a inhibidores. Células huésped tolerantes a inhibidores se pueden seleccionar realizando una selección entre cepas en base a su crecimiento en materiales que contienen inhibidores, por ejemplo como se ilustra en Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, donde se seleccionó una cepa de S. cerevisiae ATCC 26602 tolerante a inhibidores.

Transformación

Los polinucleótidos de acuerdo con la invención se pueden expresar en un huésped apropiado. Por lo tanto, se pueden utilizar técnicas de transformación estándar.

La invención se refiere también a una construcción de ácido nucleico que comprende al polinucleótido que se describió anteriormente, por ejemplo un vector.

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, incluyendo a los vectores de clonación y expresión, que comprende un polinucleótido de la invención que codifica una proteína de polipéptido de glioxalasa o un equivalente funcional de los mismos y métodos para cultivar, transformar o transfectar dichos vectores en una célula huésped apropiada, por ejemplo en condiciones en que ocurre la expresión de una glioxalasa de la invención. Según se usa aquí, el término "vector" se refiere a moléculas de ácido nucleico capaces de transportar otro ácido nucleico al cual se las ha unido.

Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar a un vector recombinante replicable, por ejemplo a un vector de clonación o expresión. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. De esta manera, en una realización adicional, la invención provee un método de la invención para hacer polinucleótidos introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y cultivando la célula huésped en condiciones que causan la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula huésped. Las células huésped apropiadas se describen más adelante.

Aquellos con experiencia en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped que será transformada, del nivel de expresión de proteína que se desea, etc. Los vectores de la invención, como por ejemplo los vectores de expresión, se pueden introducir en las células huésped para producir de esa manera proteínas o péptidos, codificadas por ácido nucleicos según se ha descrito aquí. Los vectores, como por ejemplo los vectores de expresión recombinantes, de la invención se pueden diseñar para la expresión de proteínas de polipéptidos de glioxalasa en células procariotas o eucariotas.

Por ejemplo, los polipéptidos de glioxalasa se pueden expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus), hongos filamentosos, células de levadura o células de mamíferos. Las células huésped apropiadas se exponen con mayor profundidad en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). De aquí en adelante se describen ejemplos representativos de huéspedes apropiados.

Los medios de cultivo y condiciones apropiados para las células huésped descritas anteriormente son conocidos en la técnica.

Para la mayoría de los hongos filamentosos y levaduras, el vector o la construcción de expresión preferiblemente está integrado al genoma de la célula huésped para obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también hay disponibles vectores episómicos apropiados a los cuales se pueden incorporar la construcción de expresión para obtener un nivel de expresión alto y estable, donde los ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos 2p y pKD1 de Saccharomyces y Kluyveromyces, respectivamente, o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo AMA1 de Aspergillus). En el caso en que las construcciones de expresión están integradas al genoma de las células huésped, las construcciones o bien están integradas en loci del genoma al azar, o bien en loci objetivo predeterminados usando recombinación homóloga, en cuyo caso los loci objetivo preferiblemente comprenden un gen altamente expresado.

Por lo tanto, los vectores de expresión útiles para la presente invención incluyen vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levadura, elementos cromosómicos de levaduras, virus tales como baculovirus, papova virus, vaccinia virus, adenovirus, virus de viruela aviar, virus de la enfermedad de Aujeszky y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, como por ejemplo aquellos derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, como por ejemplo cósmidos y fagémidos.

El vector puede incluir, además, secuencias que flanquean al polinucleótido originando un ARN que comprende secuencias homólogas a secuencias genómicas eucariotas o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de una célula huésped.

Un vector de clonación integrativo puede integrar al azar o en un locus diana predeterminado en el(los) cromosoma(s) de la célula huésped al cual se integrará.

El sistema vector puede ser un único vector, como por ejemplo un único plásmido, o dos o más vectores, como por ejemplo dos o más plásmidos, que juntos contienen el total del ADN que se desea introducir en el genoma de la célula huésped.

El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en dirección antisentido para proveer la producción de ARN antisentido.

Se puede introducir un vector de ADN en células procariotas o eucariotas por técnicas de transformación o transfección convencionales. Según se usa aquí, los términos "transformación" y "transfección" se utilizan con la intención de referirse a toda una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, que incluyen la coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transducción, infección, lipofección, transfección mediada por lípidos catiónicos o electroporación. Los métodos apropiados para transformar o transfectar células huésped se pueden ver en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spríng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y otros manuales de laboratorio.

El polinucleótido De acuerdo con la invención se expresa constitutivamente. En la presente, el término "constitutivo", usualmente con respecto a la célula huésped, significa que el polinucleótido no está presente (o no solo) como se encuentra presente naturalmente en el huésped. En ese sentido también puede explicarse como que el polinucleótido es llevado dentro de la célula por la intervención humana. Una característica de un gen constitutivo expresado es que el gen se transcribe continuamente, sin importar las condiciones de crecimiento, tal como la fuente de carbono o la fase de crecimiento de las células. El polinucleótido puede ser heterólogo al genoma de la célula huésped. El término "heterólogo", usualmente con respecto a la célula huésped, significa que el polinucleótido no se encuentra naturalmente en el genoma de la célula huésped o que el polipéptido no es producido naturalmente por dicha célula.

El polinucleótido puede ser homólogo al genoma de la célula huésped. El término "homólogo", usualmente con respecto a la célula huésped, significa que el polinucleótido se encuentra naturalmente en el genoma de la célula huésped o que el polipéptido es producido naturalmente por esa célula.

En otra realización, la invención presenta células, por ejemplo, células huésped transformadas o células huésped recombinantes que contienen un ácido nucleico abarcado por la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula dentro de la cual (o dentro de un ancestro de la misma) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen células tanto procariotas como eucariotas, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, y otras similares, se prefieren especialmente las células de levadura, incluyendo por ejemplo las de Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae.

Se puede seleccionar una célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de una manera específica que se desea. Dichas modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos proteicos puede facilitar el óptimo funcionamiento de la proteína.

Diversas células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento posterior a la traducción y la modificación de proteínas y productos génicos. Las líneas celulares o sistemas huésped apropiados que son familiares para aquellos con experiencia en la técnica de la biología y/o la microbiología molecular se pueden seleccionar de manera de asegurar la modificación y el procesamiento deseados y correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, se pueden utilizar células huésped eucariotas que posean la maquinaria celular necesaria para un correcto procesamiento del transcripto primario, la glucosilación y la fosforilación del producto génico. Dichas células huésped son bien conocidas en la técnica.

Si se desea, una célula según se ha descrito anteriormente se puede utilizar para la preparación de un polipéptido de acuerdo con la invención. Un método con dichas características típicamente comprende cultivar una célula huésped (por ejemplo transformada o transfectada con un vector de expresión según se ha descrito anteriormente) en condiciones que permitan proveer la expresión (por el vector) de una secuencia codificante que codifica el polipéptido, y opcionalmente recuperando al polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar a un vector recombinante replicable, por ejemplo un vector de expresión. El vector se puede utilizar para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. De esta manera, en una realización adicional, la invención provee un método para hacer un polinucleótido de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible y cultivando la célula huésped en condiciones que permiten realizar la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula huésped.

Los vectores se pueden transformar o transfectar en una célula huésped apropiada como se ha descrito anteriormente para proveer la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en condiciones que permitan proveer la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifica el polipéptido.

Aquí, se utilizan las técnicas de aislamiento, hibridación, transformación y clonación estándar (por ejemplo, según se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Homología e identidad

Se dice que las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos son homologas cuando exhiben un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homólogas indican un origen evolutivo común. Si dos secuencias homólogas están relacionadas cercanamente o más distantemente, está indicado por el "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo respectivamente. Aunque es cuestionable, la indicación de "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", "nivel de homología" o "porcentaje de homología", con frecuencia se usan en forma intercambiable.

Una comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático. La persona con experiencia será consciente del hecho de que hay disponibles varios programas de computación diferentes para alinear dos secuencias y determinar la homología entre dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison en D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para el alineamiento de dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). El algoritmo alinea secuencias de aminoácidos así como también secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa informático NEEDLE. Para el propósito de esta invención se usó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp 276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Para las secuencias de proteínas se usó EBLOSUM62 como matriz de sustitución. Para las secuencias de nucleótidos se usó EDNAFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parámetros óptimos que se usaron para el alineamiento de secuencias de aminoácidos son una penalidad por falta de coincidencia abierta de 10 y una penalidad por extensión de falta de coincidencia de 0,5. La persona con experiencia apreciará que todos estos diferentes parámetros darán resultados levemente diferentes pero que el porcentaje de identidad global de dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan diferentes algoritmos.

Definición de homología global

La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias completas a lo largo de la región alineada total que incluye cualquier falta de coincidencia o extensión. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total del alineamiento incluyendo las faltas de coincidencia. La identidad como se define en la presente se puede obtener de NEEDLE y se rotula a la salida del programa como "IDENTIDAD".

Definición de identidad más larga

La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: número de posiciones correspondientes en el alineamiento que muestran un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido entre la longitud total del alineamiento después de la sustracción del número total de faltas de coincidencia en el alineamiento. La identidad como se define en la presente se puede obtener de NEEDLE mediante el uso de la opción NOBRIEF y se rotula a la salida del programa como "identidad más larga".

Con la identidad con la SEQ ID NO: 20 como se define anteriormente en la presente, en la tabla 1 se da una revisión de aminoácidos de GLO1 que están activos en células De acuerdo con la invención.

Tabla 1: Revisión de los aminoácidos de GLO1 activos en la célula De acuerdo con la invención (véanse los ejemplos) e identidad con GLO1 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 20).

Por lo tanto, en una realización el nucleótido o aminoácido de GLO1 deriva de un microorganismo que se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces rouxii y Candida magnolia.

En una realización, el nucleótido o aminoácido de GLO1 deriva de un microorganismo que se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Kluyveromyces lactis y Candida magnolia.

En una realización, el nucleótido de GLO es una secuencia de nucleótidos con optimización de pares de codones, en donde la secuencia es SED ID NO: 34, SED ID NO: 35, SED ID NO: 36, SED ID NO: 37, SED ID NO: 38.

En una realización, el nucleótido de GLO es una secuencia de nucleótidos con optimización por pares de codones, en donde la secuencia es SED ID NO: 34, SED ID NO: 35, SED ID NO: 36, o SED ID NO: 37.

Con las diversas realizaciones de la invención que se describen aquí se puede realizar una combinación cruzada. La invención se relaciona con una célula de acuerdo con la reivindicación 1. Dicha célula también se denomina aquí una célula huésped transformada. A continuación se describen realizaciones de la misma.

La célula es capaz de utilizar L-arabinosa y xilosa. En una realización, la célula es capaz de convertir L-arabinosa en L-ribulosa y/o xilulosa 5-fosfato y/o en un producto de fermentación que se desea, por ejemplo uno de aquellos que se mencionan aquí.

Los organismos, por ejemplo cepas de S. cerevisiae, capaces de producir etanol a partir de L-arabinosa se pueden producir por modificación de una célula huésped, introduciendo los genes de araA (L-arabinosa isomerasa), araB (L-ribuloquinasa) y araD (L-ribulosa-5-P4-epimerasa) de una fuente apropiada. Dichos genes se pueden introducir en una célula huésped para que la misma sea capaz de utilizar arabinosa. Un enfoque con las características que se dan ha sido descrito en el documento WO2003/095627. Se pueden utilizar los genes araA, araB y araD de Lactobacillus plantarum según se ha divulgado en el documento WO2008/041840. Se pueden utilizar el gen araA de Bacillus subtillis y los genes araB y araD de Escherichia coli según se divulga en el documento EP1499708. En otra realización, los genes araA, araB y araD pueden derivar de por lo menos uno de los géneros Clavibacter, Arthrobacter y/o Gramella, en particular uno de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens y/o Gramella forsetii, según se divulga en el documento WO 2009011591.

La célula huésped transformada comprende una o más copias del gen de xilosa isomerasa.

Una persona con experiencia puede determinar el número de copias por cualquier método conocido. En una realización, la célula huésped transformada es capaz de fermentar glucosa, arabinosa, xilosa y galactosa.

En una realización, la célula es capaz de convertir el 90% o más de la glucosa, xilosa arabinosa, galactosa y manosa disponible, para obtener un producto de fermentación. En una realización, la célula es capaz de convertir 91% o más, 92% o más, 94% o más, 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más o 100% de toda la glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa y manosa disponible, para obtener un producto de fermentación.

En una realización de la invención, la célula huésped transformada es capaz de fermentar uno o más azúcares adicionales, preferiblemente un azúcar C5 y/o C6, por ejemplo, manosa. En una realización de la invención, la célula huésped transformada comprende uno o más de: un gen xylA, un gen XYL1 y un gen XYL2 y/o un gen XKS1, para permitir que la célula huésped transformada fermente xilosa; la supresión del gen de aldosa reductasa (GRE3); sobreexpresión de genes de la PPP, TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1 para permitir el incremento del flujo a través de la vía metabólica de la pentosa fosfato en la célula.

En una realización, la célula huésped transformada es una célula industrial, más preferiblemente una levadura industrial (como se definió anteriormente en la presente).

En una realización, la célula huésped transformada es tolerante a inhibidores. La tolerancia a inhibidores es la resistencia a compuestos inhibidores. La presencia y el nivel de los compuestos inhibidores en la lignocelulosa pueden variar ampliamente con la variación de materia prima, el método de pretratamiento y el proceso de hidrólisis. Algunos ejemplos de categorías de inhibidores son los ácidos carboxílicos, furanos y/o compuestos fenólicos. Algunos ejemplos de ácidos carboxílicos son: ácido láctico, ácido acético o ácido fórmico. Algunos ejemplos de furanos son el furfural y el hidroximetilfurfural. Algunos ejemplos de compuestos fenólicos son vanillín, ácido siríngico, ácido ferúlico y ácido cumárico. Las cantidades típicas de inhibidores son, para los ácidos carboxílicos, de entre varios gramos por litro y 20 gramos por litro o más, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de la hidrólisis. Para los furanos, de entre varios cientos de miligramos por litro y varios gramos por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de la hidrólisis.

Para los fenólicos: entre varias decenas de miligramos por litro, y un gramo por litro, dependiendo de la materia prima, el pretratamiento y las condiciones de la hidrólisis.

Las células huésped transformadas de acuerdo con la invención pueden ser tolerantes a inhibidores, es decir las mismas pueden soportar inhibidores comunes al nivel que tienen típicamente en las condiciones de pretratamiento y de hidrólisis comunes, de manera que las células huésped transformadas pueden tener una amplia aplicación, es decir que las mismas se pueden utilizar con diferentes materias primas, diferentes métodos de pretratamiento y diferentes condiciones de hidrólisis.

En una realización, la célula industrial huésped transformada se construye sobre la base de una célula huésped tolerante a inhibidores, donde la construcción se realiza según se describe de aquí en adelante. Las células huésped tolerantes a inhibidores se pueden seleccionar realizando una selección entre cepas por su crecimiento en materiales que contienen inhibidores, por ejemplo como se ilustra en Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, donde se seleccionó una cepa de S. cerevisiae tolerante a inhibidores, ATCC 26602.

En una realización, la célula huésped transformada está libre de marcadores. Según se usa aquí, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección o el cribado para encontrar una célula huésped que contenga el marcador. Libre de marcadores significa que los marcadores están esencialmente ausentes en la célula huésped transformada. El estar libre de marcadores es particularmente ventajoso cuando marcadores antibióticos se ha utilizado en la construcción de la célula huésped transformada y luego se retiran. La eliminación de marcadores se puede realizar usando cualquier técnica apropiada de la técnica anterior, por ejemplo, por recombinación intramolecular. Un método apropiado de eliminación de marcadores se ilustra en los ejemplos.

Una célula huésped transformada puede ser capaz de convertir biomasa vegetal, celulosas, hemicelulosas, pectinas, almidón, derivados de almidón, por ejemplo en azúcares fermentables. Por lo tanto, una célula huésped transformada puede expresar una o más enzimas tales como una celulasa (una endocelulasa o una exocelulasa), una hemicelulasa (una endo- o exo-xilanasa o arabinasa) necesaria para la conversión de celulosa en glucosa monomérica y hemicelulosa en xilosa y arabinosa monomérica, una pectinasa capaz de convertir pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico o una amilasa para convertir almidón en monómeros de glucosa.

La célula huésped transformada también puede comprender a aquellas actividades enzimáticas necesarias para la conversión de azúcar en un producto de fermentación que se desea, como por ejemplo etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactama o una cefalosporina. En una realización, la célula huésped transformada es una célula que es naturalmente capaz de realizar una fermentación alcohólica, preferiblemente, una fermentación alcohólica anaeróbica. Una célula huésped transformada preferiblemente tiene una alta tolerancia al etanol, una alta tolerancia a un pH bajo (es decir que es capaz de crecer a un pH menor que aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3, o aproximadamente 2,5) y a sustancias orgánicas y/o una alta tolerancia a las temperaturas elevadas.

Cualquiera de las anteriores características o actividades de una célula huésped transformada puede estar naturalmente presente en la célula o se puede introducir o modificar mediante una modificación genética.

Construcción de la célula huésped transformada

De acuerdo con una realización, los genes se pueden introducir en la célula huésped por introducción en una célula huésped de uno o más de:

a) los genes araA, araB y araD bajo el control de promotor(es) constitutivo(s) fuerte(s);

b) genes de PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1, opcionalmente bajo el control de uno o más promotores constitutivos fuertes;

c) supresión de un gen de aldosa reductasa;

d) un gen xylA y un gen XKS1 bajo el control de promotor(es) constitutivo(s) fuerte(s);

e) un gen xylA bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, que se puede integrar en el genoma en múltiples loci;

y evolución adaptativa para producir la célula huésped transformada. La célula anterior se puede construir usando técnicas de expresión recombinante.

Expresión recombinante

La célula huésped transformada es una célula recombinante. Es decir, una célula huésped transformada comprende una secuencia de nucleótidos que no se encuentra naturalmente en la célula en cuestión, o está transformada con la misma o está modificada genéticamente con dicha secuencia.

Las técnicas para la expresión recombinante de enzimas en una célula, así como para las modificaciones genéticas adicionales de una célula huésped transformada son bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Típicamente, dichas técnicas incluyen la transformación de una célula con una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia relevante. Dichos métodos se conocen, por ejemplo, de los manuales estándar, como por ejemplo Sambrook y Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, o F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987). Los métodos para la transformación y modificación genética de células huésped se conocen, por ejemplo, de los documentos EP-A- 0635 574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A- 0635574 y US 6.265.186.

Típicamente, la construcción de ácido nucleico puede ser un plásmido, por ejemplo un plásmido con un bajo número de copias o un plásmido con un alto número de copias. La célula de acuerdo con la presente invención puede comprender una única copia o múltiples copias de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima, por ejemplo por múltiples copias de una construcción que consiste en un nucleótido o mediante el uso de una construcción que tiene múltiples copias de la secuencia correspondiente a la enzima.

La construcción de ácido nucleico se puede mantener episómicamente y de esa manera comprende una secuencia para la replicación autónoma, como por ejemplo una secuencia de replicación autosómica. Una construcción episómica de ácido nucleico apropiada puede basarse, por ejemplo, en los plásmidos 2p o pKD1 para levadura (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968- 975) o los plásmidos a Ma (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489). Como alternativa, cada construcción de ácido nucleico se puede integrar en una o más copias en el genoma de la célula. La integración al genoma de la célula puede ocurrir al azar por recombinación no homologa pero preferiblemente, la construcción de ácido nucleico se puede integrar al genoma de la célula por recombinación homóloga, como es bien sabido en la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635574 y US 6.265.186).

La mayoría de los plásmidos episómicos o 2p son relativamente inestables en levadura, perdiéndose en aproximadamente 10-2 o más células luego de cada generación. Aun en condiciones de cultivo selectivo, solo entre un 60% y 95% de las células retiene el plásmido episómico. El número de copias de la mayoría de los plásmidos episómicos varía en el rango de 20-100 por célula de huéspedes cir+. Sin embargo, los plásmidos no están distribuidos por igual entre las células, y en las poblaciones hay una alta variancia en el número de copias por célula. Las cepas transformadas con plásmidos integrativos son extremadamente estables, aun en ausencia de una presión selectiva. Sin embargo, la pérdida de plásmido puede ocurrir con frecuencias de entre aproximadamente 10-3 y 10-4 por recombinación homóloga entre el ADN repetido en tándem, que lleva al silenciamiento por formación de bucles de la secuencia del vector. Preferiblemente, en el caso de una integración estable, el diseño del vector se realiza de manera tal que, ante la pérdida de los genes marcadores de selección (que también ocurre por recombinación homóloga intramolecular) el silenciamiento por formación de bucles de la construcción integrada ya no es posible. Preferiblemente, los genes se integran así de manera estable. La integración estable se define aquí como una integración al genoma, donde ya no es posible el silenciamiento por formación de bucles de la construcción integrada. Preferiblemente, los marcadores de selección están ausentes. Típicamente, la secuencia que codifica la enzima estará conectada de manera operativa a una o más secuencias de ácidos nucleicos, capaz de proveer o contribuir a la transcripción y/o traducción de la secuencia correspondiente a la enzima.

El término "conectada de manera operativa" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos tienen una relación que les permite funcionar de la manera que se desea. Por ejemplo, se conecta un promotor o potenciador de manera operativa a una secuencia codificante, y dicho promotor o potenciador afecta la transcripción de la secuencia codificante.

Según se usa aquí, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona controlando la transcripción de uno o más genes, situados en dirección 5' con respecto a la dirección de la transcripción del sitio de inicio de la transcripción del gen, y está identificado estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente del ADN, sitios de inicio de la transcripción y todas las otras secuencias de ADN conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo pero está sometido a la regulación ambiental o del desarrollo.

El promotor que se puede utilizar para obtener la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima de acuerdo con la presente invención, puede no ser nativo de la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima que se debe expresar, es decir un promotor que es heterólogo para la secuencia de nucleótidos (secuencia codificante) a la cual está conectado de manera operativa. Sin embargo, el promotor puede ser homólogo, es decir, endógeno, de la célula huésped.

Los promotores están ampliamente disponibles y son conocidos por las personas con experiencia. Los ejemplos apropiados de dichos promotores incluyen por ejemplo a los promotores de genes glucolíticos, como por ejemplo promotores de la fosfofructoquinasa (PFK), de triosa fosfato isomerasa (TPI), de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD, TDH3 o GAPDH), de transportadores de piruvatoquinasa (PYK), de transportadores de fosfogliceratoquinasa (PGK) de levaduras u hongos filamentosos; se pueden ver más detalles sobre dichos promotores provenientes de levaduras en (WO 93/03159). Otros promotores útiles son promotores de genes que codifican proteínas ribosómicas, el promotor del gen de lactasa (LAC4), promotores de alcohol deshidrogenasa (ADH1, ADH4, y otros similares), y el promotor de enolasa (ENO). Otros promotores, tanto constitutivos como inducibles, y potenciadores o secuencias activadoras en dirección 5' serán conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Los promotores que se utilizan en las células huésped de la invención se pueden modificar, si se desea, para afectar sus características de control. Los promotores apropiados en este contexto incluyen promotores naturales tanto constitutivos como inducibles así como promotores diseñados por ingeniería genética, que son bien conocidos por las personas con experiencia en la técnica. Los promotores apropiados para las células huésped eucariotas pueden ser; GAL7, GAL10 o GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO1, TPI1 y AOX1. Otros promotores apropiados incluyen PDC1, GPD1, p Gk 1, TEF1 y TDH3.

En una célula huésped transformada, el extremo 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la enzima preferiblemente está conectada de manera operativa a una secuencia terminadora de la transcripción. Preferiblemente, la secuencia terminadora puede operar en una célula huésped que se haya seleccionado, tal como por ejemplo en las especies de levaduras que se hayan seleccionado. En todo caso, la selección del terminador no es crítica; el mismo puede ser, por ejemplo, de cualquier gen de levadura, aunque a veces pueden funcionar terminadores de genes eucariotas que no son de levadura. Usualmente, una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima comprende un terminador. Preferiblemente, dichos terminadores se combinan con mutaciones que previenen la degradación del ARNm mediada por mutaciones terminadoras en la célula huésped transformada (véase, por ejemplo, Shirley et al., 2002, Genetics 161:1465-1482).

La secuencia de terminación de la transcripción preferiblemente también comprende una señal de poliadenilación.

Opcionalmente, en una construcción de ácido nucleico apropiada para utilizar en la invención puede haber presente un marcador seleccionable. Según se usa aquí, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite la selección de una célula huésped que contiene el marcador o el cribado para encontrar la misma. El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibióticos gracias al cual se puede utilizar el antibiótico apropiado para seleccionar células transformadas entre células que no hayan sido transformadas. Algunos ejemplos de marcadores apropiados de resistencia a antibióticos incluyen por ejemplo los de dihidrofolato reductasa, higromicina-B-fosfotransferasa, 3'-O-fosfotransferasa II (resistencia a kanamicina, neomicina y G418). Los marcadores antibióticos pueden ser más convenientes para la transformación de células huésped poliploides. También se pueden utilizar marcadores de ausencia de resistencia a antibióticos, como por ejemplo marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2) o el gen TPIde S. Pombe (descrito por Russell P R, 1985, Gene 40: 125-130). En una realización preferida, las células huésped transformadas con las construcciones de ácidos nucleicos están libres de genes marcadores. En EP-A-0635 574 se divulgan métodos para construir células huésped microbianas recombinantes libres de genes marcadores, basados en el uso de marcadores bidireccionales tales como el gen amdS (acetamidasa) de A. nidulans o los genes URA3 y LYS2 de levadura. Como alternativa, a las construcciones de ácidos nucleicos de la invención se les puede incorporar un marcador seleccionable, tal como proteína fluorescente verde, lacL, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa o beta-glucuronidasa, que permita realizar una selección para obtener las células transformadas.

Otros elementos adicionales opcionales que pueden estar presentes en las construcciones de ácidos nucleicos apropiadas para utilizar en la invención incluyen, pero de manera no taxativa, una o más secuencias directrices, potenciadores, factores de integración y/o genes reporteros, secuencias intrón, centrómeros, telómeros y/o secuencias de unión a la matriz (MAR). Las construcciones de ácidos nucleicos de la invención también pueden comprender una secuencia para la replicación autónoma, como por ejemplo una secuencia ARS.

De esa manera, el proceso de recombinación se puede ejecutar con técnicas de recombinación conocidas. Aquellos con experiencia en la técnica conocen diversos medios para la expresión y sobreexpresión de enzimas en una célula huésped transformada. En particular, una enzima se puede sobreexpresar incrementando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula huésped, por ejemplo por integración de copias adicionales del gen en el genoma de la célula huésped, por expresión del gen de un vector de expresión episómico multicopias o por introducción de un vector de expresión episómico que comprende múltiples copias del gen.

Como alternativa, la sobreexpresión de enzimas en las células huésped de la invención se puede obtener usando un promotor que no es nativo de la secuencia codificante para la enzima que se desea sobreexpresar, es decir un promotor que es heterólogo a la secuencia codificante a las cuales está conectado operativamente. Aunque el promotor preferiblemente es heterólogo a la secuencia codificante a las cuales está conectado operativamente, también es preferible que el promotor sea homólogo, es decir, es endógeno de la célula huésped. Preferiblemente el promotor heterólogo es capaz de producir un mayor nivel en el estado estacionario del transcripto que comprende la secuencia codificante (o es capaz de producir más moléculas transcriptas, es decir moléculas de ARNm, por unidad de tiempo) que es el promotor que es nativo de la secuencia codificante. En este contexto, los promotores apropiados incluyen tanto promotores naturales constitutivos como inducibles así como promotores diseñados por ingeniería genética.

En una realización, la célula huésped transformada está libre de marcadores, lo que significa que ni en el genoma ni tampoco extra cromosómicamente hay presentes marcadores auxotróficos ni dominantes, en particular marcadores con resistencia a antibióticos.

La secuencia codificante que se utiliza para la sobreexpresión de las enzimas mencionadas anteriormente puede ser preferiblemente homóloga a la célula huésped. Sin embargo, se pueden utilizar secuencias codificantes que sean heterólogas del huésped.

Cuando se hace referencia a la producción de la enzima en una célula modificada genéticamente, la sobreexpresión de una enzima significa que la enzima se produce con un mayor nivel de actividad enzimática específica en comparación con la célula huésped sin modificar, en condiciones idénticas. Usualmente esto significa que la proteína con actividad enzimática (o proteínas en el caso de enzimas con múltiples subunidades) se produce en mayor cantidad, o bien en un mayor nivel en el estado estacionario en comparación con la célula huésped sin modificar, en condiciones idénticas. De manera similar esto usualmente significa que el ARNm que codifica la proteína con actividad enzimática se produce en mayor cantidad, o bien nuevamente en un mayor nivel en el estado estacionario en comparación con la célula huésped sin modificar en condiciones idénticas. Preferiblemente en un huésped, una enzima que se va a sobreexpresar se sobreexpresa en un factor de por lo menos aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa la sobreexpresión. Se debe entender que dichos niveles de sobreexpresión pueden ser válidos para el nivel en el estado estacionario de la actividad enzimática, el nivel en el estado estacionario de la proteína de la enzima así como para el nivel en el estado estacionario del transcripto que codifica la enzima.

Preferiblemente, la glioxalasa se expresa en citosol.

Adaptación

La adaptación es el proceso evolucionario mediante el cual una población llega a ser más apropiada (adaptada) para vivir en su hábitat o hábitats. Este proceso se realiza durante el transcurso de varias generaciones o durante muchas de ellas, y es uno de los fenómenos básicos de la biología.

El término adaptación también puede referirse a una característica que es especialmente importante para la supervivencia de un organismo. Dichas adaptaciones son producidas, en una población variable, por las formas más apropiadas para reproducirse de manera más exitosa, por selección natural.

Los cambios de condiciones ambientales alteran el resultado de la selección natural, afectando los beneficios de la subsiguiente selección de las adaptaciones que mejoren la aptitud de un organismo para las nuevas condiciones. En el caso de un cambio ambiental extremo, la aparición y fijación de adaptaciones beneficiosas puede ser esencial para la supervivencia. Un gran número de factores diferentes, tales como por ejemplo la disponibilidad de nutrientes, temperatura, disponibilidad de oxígeno, etcétera, puede impulsar la evolución adaptativa.

Aptitud

Hay una clara relación entre el grado de adaptación (el grado en que un organismo es capaz de vivir y reproducirse en un determinado conjunto de hábitats) y la aptitud. La aptitud es una estimación y un predictor de la velocidad de la selección natural. Mediante la aplicación de la selección natural, las frecuencias relativas de fenotipos alternativos variarán con el transcurso del tiempo, si se los puede heredar.

Cambios genéticos

Cuando la selección natural actúa sobre la variabilidad genética de la población, el mecanismo subyacente son los cambios genéticos. Por este medio, la población se adapta genéticamente a sus circunstancias. Los cambios genéticos pueden dar como resultado estructuras visibles, o pueden ajustar la actividad fisiológica del organismo de una manera que sea más apropiada para el hábitat que ha sufrido cambios.

Puede ocurrir que los hábitats cambien frecuentemente. Por lo tanto, la consecuencia es que el proceso de adaptación nunca termina de completarse. Con el transcurso del tiempo, puede suceder que el ambiente cambie gradualmente, y que la especie resulte estar cada vez mejor adaptada a su entorno. Por otro lado, puede suceder que ocurran cambios relativamente rápidos en el ambiente, y que entonces la especie resulte estar cada vez peor adaptada. La adaptación es un proceso genético, que sucede todo el tiempo en cierta medida, también cuando la población no cambia de hábitat o de ambiente.

La evolución adaptativa

En su preparación, las células huésped transformadas se pueden someter a evolución adaptativa. Una célula huésped transformada se puede adaptar al uso de azúcares por selección de mutantes, ya sea espontáneos o inducidos (por ejemplo por radiación o compuestos químicos), para cultivarla en el azúcar que se desea, preferiblemente como única fuente de carbono, y más preferiblemente en condiciones anaeróbicas. La selección de mutantes se puede llevar a cabo por técnicas que incluyen la transferencia en series de cultivos por ejemplo como ha sido descrito por Kuyper et al. (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664) o por cultivo bajo presión selectiva en un cultivo quimiostático. Por ejemplo, en una célula huésped preferida, por lo menos una de las modificaciones genéticas descritas anteriormente, incluyendo a las modificaciones que se obtienen por selección de mutantes, confieren a la célula huésped la capacidad de prosperar en xilosa como fuente de carbono, preferiblemente como única fuente de carbono, y preferiblemente en condiciones anaeróbicas. Cuando se utiliza XI como gen para convertir xilosa, preferiblemente la célula esencialmente no produce xilitol, por ejemplo la cantidad de xilitol que se produce es menor que el límite de detección o es por ejemplo menor que aproximadamente 5, aproximadamente 2, aproximadamente 1, aproximadamente 0,5, o aproximadamente 0,3 % del carbono que se consume sobre una base molar.

La evolución adaptativa también ha sido descrita por ejemplo en Wisselink H.W. et al., Applied and Environmental Microbiology Ago. 2007, p. 4881 -4891.

En una realización de evolución adaptativa, se aplica un régimen que consiste en un cultivo por lotes repetido con ciclos repetidos de cultivos consecutivos en diferentes medios, por ejemplo en tres medios con diferentes composiciones (glucosa, xilosa y arabinosa; xilosa y arabinosa. Véase Wisselink et al. (2009) Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2009, p. 907-914.

Transformación de levadura y estabilidad genética

La ingeniería genética, es decir la transformación de células de levadura con ADN recombinante, se volvió factible por primera vez en 1978 [Beggs, 1978; Hinnen et al., 1978], Desde entonces, la tecnología de ADN recombinante en levaduras se ha establecido por mérito propio. Hay disponible una multitud de diferentes construcciones de vectores. Generalmente, dichos vectores plásmidos, denominados vectores de lanzadera, contienen material genético derivado de vectores de E. coli que consisten en un origen de replicación y un marcador seleccionable (frecuentemente el gen p-lactamasa, ampR), que les permite ser propagados en E. coli antes de su transformación en células de levadura. Adicionalmente, los vectores de lanzadera contienen un marcador seleccionable para su selección en levaduras. Los marcadores pueden ser genes que codifican enzimas para la síntesis de un aminoácido o nucleótido en particular, de manera que las células que portan la correspondiente supresión (o mutación) genómica sean complementadas por auxotrofía o autotrofía. Como alternativa, dichos vectores contienen marcadores de resistencia dominantes heterólogos, que proveen células recombinantes de levadura (es decir las células que han absorbido el ADN y expresan el gen marcador) con resistencia hacia ciertos antibióticos, como G418 (Geneticina), higromicina-B o fleomicina. Además, dichos vectores pueden contener una secuencia de sitios (combinados) de restricción (sitio de clonación múltiple o MCS) que permitirán clonar ADN extraño en dichos sitios, aunque también existen métodos alternativos.

Tradicionalmente, se pueden distinguir cuatro tipos de vectores de lanzadera por la ausencia o presencia de elementos genéticos adicionales:

• Plásmidos integrativos (Ylp) que se integran al genoma del huésped por recombinación homóloga en el locus del marcador u otro gen, cuando éste es abierto por restricción y el ADN linealizado se utiliza para la transformación de las células de levadura. Esto generalmente da como resultado la presencia de una copia del ADN extraño insertada en este sitio del genoma en particular.

• Plásmidos episómicos (YEp) que portan parte de la secuencia de ADN del plásmido 2p necesaria para la replicación autónoma en células de levadura. En la célula de levadura se propagan múltiples copias del plásmido transformado y se mantienen como episomas.

• Plásmidos de replicación autónoma (YRp) que portan un origen de replicación de levadura (ARS) que permite propagar el plásmido transformado varios cientos de veces.

• Plásmidos CEN (YCp) que, además de una secuencia ARS portan una secuencia centromérica (derivada de uno de los cromosomas nucleares) que normalmente garantiza una segregación mitótica estable y usualmente reduce el número de copias del plásmido autorreplicado a solo uno.

Dichos plásmidos se introducen en las células de levadura por transformación. La transformación de células de levadura se puede realizar por varias técnicas diferentes, como por ejemplo por permeabilización de células con acetato de litio (Ito et al., 1983) y métodos de electroporación.

En la aplicación comercial de microorganismos recombinantes, la inestabilidad del plásmido es el problema más importante. La inestabilidad es la tendencia de las células transformadas a perder sus propiedades adquiridas por la transformación debido a cambios en los plásmidos, o a la pérdida de los mismos. Este problema ha sido expuesto en detalle por Zhang et al. (Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Advances, Vol. 14, No. 4, pp. 401-435, 1996). Las cepas transformadas con plásmidos integrativos son extremadamente estables, aun en ausencia de presión selectiva (Sherman, F. http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman f/yeast/9.html y referencias que figuran en dicha publicación).

El ADN heterólogo se introduce usualmente en el organismo en la forma de plásmidos extra-cromosómicos (YEp, YCp e YRp). Desafortunadamente, se ha descubierto que las nuevas características pueden no ser retenidas tanto en bacterias como en levaduras, especialmente si la presión de selección no se aplica de manera continua. Esto se debe a la inestabilidad segregacional del plásmido híbrido cuando las células recombinantes se cultivan durante un período de tiempo prolongado. Esto causa la heterogeneidad y variabilidad clonal de la población, y eventualmente hace que se obtenga una población de células en la cual la mayoría de las células ha perdido las propiedades que se introdujeron por transformación. Si se están utilizando vectores con marcadores auxotróficos, el cultivo en medios ricos frecuentemente hace que se obtenga una rápida pérdida del vector, porque el vector solo se retiene en los medios mínimos. La alternativa, el uso de marcadores antibióticos dominantes, frecuentemente no es compatible con los procesos de producción. El uso de antibióticos puede no ser deseable desde el punto de vista de la registración (la posibilidad de que cantidades de trazas del antibiótico terminen en el producto final) o debido a razones económicas (los costes del uso de antibióticos a escala industrial).

La pérdida de vectores causa problemas en las situaciones de producción a gran escala. Existen métodos alternativos para la introducción de ADN en levaduras, como por ejemplo el uso de plásmidos integrativos (Ylp). El ADN se integra al genoma del huésped por recombinación, para dar como resultado una gran estabilidad. (Caunt, P. Stability of recombinant plasmids in yeast. Journal of Biotechnology 9(1988) 173 - 192). Los inventores han descubierto que un método de integración en el que se utilizan los transposones del huésped es una buena alternativa. En una realización, se pueden integrar genes al genoma de la célula huésped transformada. La introducción inicial (es decir antes de la evolución adaptativa) de múltiples copias se ejecuta de la manera conocida en la técnica, que permite obtener la introducción de los genes. En una realización, esto se puede realizar usando un vector con partes homólogas a secuencias repetidas (transposones), de la célula huésped. Cuando la célula huésped es una célula de levadura, secuencias repetidas apropiadas son las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocido como secuencia delta. Los elementos Ty entran dentro de dos subfamilias bastante similares denominadas Ty1 y Ty2. Dichos elementos tienen una longitud de aproximadamente 6 kilobases (kb) y están unidas por repeticiones terminales largas (LTR), secuencias de aproximadamente 335 pares de bases (Boeke JD et al., The Saccharomyces cerevisiae Genome Contains Functional and Nonfunctional Copies of Transposon Ty1. Molecular and Cellular Biology, Abr. 1988, p. 1432-1442 Vol. 8, No. 4). En la cepa de S. cerevisiae completamente secuenciada, S288c, los transposones más abundantes son Ty1 (31 copias) y Ty2 (13 copias) (Gabriel A, Dapprich J, Kunkel M, Gresham D, Pratt SC, et al. (2006) Global mapping of transposon location. PLoS Genet 2(12):e212.doi:10.1371/journal.pgen.0020212). Dichos transposones consisten en dos marcos de lectura abiertos (ORFs) superpuestos, cada uno de los cuales codifica varias proteínas. Las regiones codificantes están flanqueadas por las LTRs casi idénticas mencionadas anteriormente. Otros elementos Ty de S. cerevisiae, aunque menos abundantes y más distintivos, comprenden a Ty3, Ty4 y Ty5. Para cada familia de elementos Ty de longitud completa hay un orden de magnitud más de elementos con solo LTR dispersos a través del genoma. Se piensa que los mismos surgen por la recombinación LTR-LTR de elementos de longitud completa, con silenciamiento por formación de bucles de las regiones internas que codifican la proteína.

Se ha aprovechado el mecanismo de retrotransposición del retrotransposón Ty para integrar múltiples copias a través de todo el genoma (Boeke et al., 1988; Jacobs et al., 1988). Las repeticiones terminales largas (LTR) del elemento Ty, conocidas como secuencias delta, también son buenos objetivos para la integración por recombinación homóloga ya que se encuentran en aproximadamente 150-200 copias que son ya sea Ty asociadas o en sitios aislados (Boeke, 1989; Kingsman y Kingsman, 1988). (Parekh R. N. (1996). An Integrating Vector for Tunable, High Copy, Stable Integration into the Dispersed Ty DELTA Sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Prog. 1996, 12, 16-21). Por evolución adaptativa, el número de copias puede cambiar.

Genes araA, araB y araD

Una célula huésped transformada es capaz de utilizar arabinosa. Por lo tanto, una célula huésped transformada es capaz de convertir L-arabinosa en L-ribulosa y/o xilulosa 5-fosfato y/o en un producto de fermentación que se desea, por ejemplo uno de aquellos que se mencionan aquí.

Los organismos, por ejemplo las cepas de S. cerevisiae, que son capaces de producir etanol a partir de L-arabinosa se pueden producir por modificación de una célula introduciendo los genes araA (L-arabinosa isomerasa), araB (L-ribuloquinasa) y araD (L-ribulosa-5-P4-epimerasa) de una fuente apropiada. Dichos genes se pueden introducir en una célula huésped transformada de manera tal que la misma sea capaz de utilizar arabinosa. Un enfoque con dichas características ha sido descrito en el documento WO2003/095627. Los genes araA, araB y araD de Lactobacillus plantarum se pueden utilizar según se divulga en el documento WO2008/041840. El gen araA de Bacillus subtillis y los genes araB y araD de Escherichia coli se pueden utilizar según se divulga en el documento EP1499708. En otra realización, los genes araA, araB y araD se pueden derivar de por lo menos uno de los géneros Clavibacter, Arthrobacter y/o Gramella, en particular, de uno de: Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens, y/o Gramella forsetii, según se divulga en el documento WO 2009011591.

Genes de PPP

Una célula huésped transformada puede comprender una o más modificaciones genéticas que incrementen el flujo de la vía metabólica de la pentosa fosfato (PPP). En particular, la(s) modificación(es) genética(s) puede(n) hacer que se obtenga un mayor flujo a través de la parte no oxidativa de la vía metabólica de la pentosa fosfato. Aquí se entiende que una modificación genética que causa un mayor flujo de la parte no oxidativa de la vía metabólica de la pentosa fosfato significa una modificación que incrementa el flujo en un factor de por lo menos aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con el flujo de una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la modificación genética que causa el incremento del flujo. El flujo de la parte no oxidativa de la vía metabólica de la pentosa fosfato se puede medir cultivando el huésped modificado en xilosa como única fuente de carbono, determinando la velocidad específica del consumo de xilosa y restando la velocidad de producción específica de xilitol de la velocidad de consumo específica de xilosa, si se produce algo de xilitol. Sin embargo, el flujo de la parte no oxidativa de la vía metabólica de la pentosa fosfato es proporcional a la velocidad de crecimiento en xilosa como única fuente de carbono, preferiblemente con la velocidad de crecimiento anaeróbico en xilosa como única fuente de carbono. Hay una relación lineal entre la velocidad de crecimiento en xilosa como única fuente de carbono (jmax) y el flujo de la parte no oxidativa de la vía metabólica de la pentosa fosfato. La velocidad específica del consumo de xilosa (Qs) se relaciona con la velocidad de crecimiento específica (^j ) y el rendimiento de biomasa en azúcar (Yxs) de acuerdo con:

Qs = ms J / ysx

o

1/ysx = ms/j 1/ ysx

Por lo tanto, si ^j es constante, el mayor flujo de la parte no oxidativa de la vía metabólica de la pentosa fosfato se puede deducir del incremento de la velocidad máxima de crecimiento en dichas condiciones, a no ser que el transporte (absorción) sea limitante.

Hay diversas maneras de introducir en la célula huésped una o más modificaciones genéticas que incrementan el flujo de la vía metabólica de la pentosa fosfato. Las mismas incluyen por ejemplo obtener mayores niveles de actividad en el estado estacionario de xilulosa quinasa y/o una o más de las enzimas de la parte no oxidativa de la vía metabólica de la pentosa fosfato y/o un menor nivel de la actividad no específica de aldosa reductasa en el estado estacionario. Dichos cambios de los niveles de actividad en el estado estacionario se pueden realizar por selección de mutantes (espontáneos o inducidos por sustancias químicas o por radiación) y/o por tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, por sobreexpresión o desactivación, respectivamente, de genes que codifican las enzimas o factores que regulan dichos genes.

En una célula huésped preferida, la modificación genética comprende la sobreexpresión de por lo menos una enzima de la (parte no oxidativa de la) vía metabólica de la pentosa fosfato. Preferiblemente, la enzima se selecciona de entre el grupo que consiste en las enzimas que codifican ribulosa-5- fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Diversas combinaciones de enzimas de la (parte no oxidativa de la) vía metabólica de la pentosa fosfato pueden estar sobreexpresadas. Por ejemplo las enzimas que se sobreexpresan puede ser por lo menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y ribulosa-5-fosfato epimerasa; o por lo menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transcetolasa; o por lo menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa y transaldolasa; o por lo menos las enzimas ribulosa-5-fosfato epimerasa y transcetolasa; o por lo menos las enzimas ribulosa-5- fosfato epimerasa y transaldolasa; o por lo menos las enzimas transcetolasa y transaldolasa; o por lo menos las enzimas ribulosa-5- fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa; o por lo menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, transcetolasa y transaldolasa; o por lo menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, y transaldolasa; o por lo menos las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, y transcetolasa. En una realización de la invención cada una de las enzimas ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5- fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa está sobreexpresada en la célula huésped. Es más preferida una célula huésped en la cual la modificación genética comprende por lo menos la sobreexpresión de las enzimas tanto transcetolasas como transaldolasas, ya que una célula huésped con dichas características ya es capaz de un crecimiento anaeróbico en xilosa. De hecho, en algunas condiciones, las células huésped convertidoras de xilosa que solo sobreexpresan la transcetolasa y la transaldolasa ya tienen la misma velocidad de crecimiento anaeróbico en xilosa que las células huésped que sobreexpresan las cuatro enzimas, es decir la ribulosa-5-fosfato isomerasa, ribulosa-5-fosfato epimerasa, transcetolasa y transaldolasa. Además, las células huésped que sobreexpresan las enzimas tanto ribulosa-5-fosfato isomerasa como ribulosa-5- fosfato epimerasa son preferibles respecto de las células huésped que sobreexpresan solo la isomerasa o solo la epimerasa, ya que la sobreexpresión de solo una de dichas enzimas puede producir desequilibrios metabólicos.

La enzima ''ribulosa 5-fosfato epimerasa" (EC 5.1.3.1) se define aquí como una enzima que cataliza la epimerización de la D-xilulosa 5-fosfato en D- ribulosa 5-fosfato y viceversa. La enzima se conoce también como fosforribulosa epimerasa; eritrosa-4-fosfato isomerasa; fosfocetopentosa 3- epimerasa; xilulosa fosfato-3-epimerasa; fosfocetopentosa epimerasa; ribulosa 5-fosfato-3-epimerasa; D-ribulosa fosfato-3-epimerasa; D-ribulosa 5-fosfato epimerasa; D-ribulosa-5-P-3-epimerasa; D-xilulosa-5-fosfato-3-epimerasa; pentosa-5-fosfato-3-epimerasa; o D-ribulosa-5-fosfato-3-epimerasa. Una ribulosa 5-fosfato epimerasa se puede definir además por su secuencia de aminoácidos. De manera similar, una ribulosa 5-fosfato epimerasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima así como por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una ribulosa 5-fosfato epimerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la ribulosa 5-fosfato epimerasa se denomina aquí RPE1.

La enzima "ribulosa 5-fosfato isomerasa" (EC 5.3.1.6) se define aquí como una enzima que cataliza la isomerización directa de la D-ribosa 5-fosfato a D-ribulosa 5-fosfato y viceversa. La enzima se conoce también como fosfopentosa isomerasa; fosforriboisomerasa; ribosa fosfato isomerasa; 5- fosforribosa isomerasa; D- ribosa 5-fosfato isomerasa; D-ribosa-5-fosfato cetol- isomerasa; o D-ribosa-5- fosfato aldosa-cetosa-isomerasa. Una ribulosa 5- fosfato isomerasa se puede definir además por su secuencia de aminoácidos. De manera similar, una ribulosa 5-fosfato isomerasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima así como por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una ribulosa 5-fosfato isomerasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la ribulosa 5-fosfato isomerasa se denomina aquí RKI1.

La enzima "transcetolasa" (EC 2.2.1.1) se define aquí como una enzima que cataliza la reacción D-ribosa 5-fosfato D-xilulosa 5-fosfato <-> sedoheptulosa 7-fosfato D-gliceraldehído 3-fosfato y viceversa. La enzima se conoce también como glicolaldehído transferasa o sedoheptulosa-7-fosfato; D- gliceraldehído-3-fosfato glicolaldehído transferasa. Una transcetolasa se puede definir además por su secuencia de aminoácidos. De manera similar, una transcetolasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima así como por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una transcetolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la transcetolasa se denomina aquí TKL1.

La enzima "transaldolasa" (EC 2.2.1.2) se define aquí como una enzima que cataliza la reacción: sedoheptulosa 7-fosfato D-gliceraldehído 3-fosfato <-> D-eritrosa 4-fosfato D-fructosa 6-fosfato y viceversa. La enzima se conoce también como dihidroxiacetona transferasa; dihidroxiacetona sintasa; formaldehído transcetolasa; o sedoheptulosa-7-fosfato; D-gliceraldehído-3- fosfato glicerona transferasa. Una transaldolasa se puede definir además por su secuencia de aminoácidos. De manera similar, una transaldolasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima así como por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica la transaldolasa. La secuencia de nucleótidos que codifica la transcetolasa se denomina aquí TAL1.

Genes de xilosa isomerasa o xilosa reductasa

De acuerdo con la invención, en el genoma de la célula huésped se introducen una o más copias de uno o más genes de xilosa isomerasa. La presencia de dichos elementos genéticos confiere a la célula la capacidad de convertir xilosa por isomerización.

En una realización, la o las copias de uno o más genes de xilosa isomerasa se introducen en el genoma de la célula huésped.

Una "xilosa isomerasa" (EC 5.3.1.5) se define aquí como una enzima que cataliza la isomerización directa de D-xilosa para dar D-xilulosa y/o viceversa. La enzima se conoce también como una D-xilosa cetoisomerasa. Aquí, una xilosa isomerasa puede también ser capaz de catalizar la conversión entre D-glucosa y D-fructosa (y, por lo tanto, se puede denominar glucosa isomerasa). Aquí, una xilosa isomerasa puede requerir un catión bivalente, como por ejemplo magnesio, manganeso o cobalto como cofactor.

Por lo tanto, una célula huésped transformada con dichas características es capaz de isomerizar xilosa a xilulosa. La capacidad de isomerizar xilosa a xilulosa se le confiere a la célula huésped por transformación de la célula huésped con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una determinada xilosa isomerasa. Una célula huésped transformada isomeriza xilosa a xilulosa por isomerízación directa de xilosa a xilulosa.

El gen de xilosa isomerasa puede tener diversos orígenes, tal como por ejemplo Piromyces sp., según se divulga en el documento WO2006/009434. Otros orígenes apropiados son: Bacteroides, en particular Bacteroides uniformis, según se describe en el documento PCT/EP2009/52623. En otra realización, en el genoma de la célula huésped se introducen una o más copias de uno o más genes de xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa. En esta realización, la conversión de xilosa se realiza en una conversión en dos pasos de xilosa en xilulosa pasando por un intermediario xilitol catalizada por xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, respectivamente. En una realización de la misma, la xilosa reductasa (XR), xilitol deshidrogenasa (XDH) y xiluloquinasa (XK) pueden estar sobreexpresadas y opcionalmente uno o más de los genes que codifican enzimas productoras de NADPH tienen su expresión incrementada y uno o más de los genes que codifican enzimas consumidoras de NADH tienen su expresión incrementada, según se divulga en el documento WO 2004085627.

Gen XKS1

Una célula huésped transformada puede comprender una o más modificaciones genéticas que incrementan la actividad específica de xilulosa quinasa. Preferiblemente, la modificación o las modificaciones genéticas causan la sobreexpresión de una xiluloquinasa, por ejemplo, por sobreexpresión de una secuencia de nucleótidos que codifica una xiluloquinasa. El gen que codifica la xiluloquinasa puede ser endógeno de la célula huésped o puede ser de una xiluloquinasa que es heteróloga de la célula huésped. Una secuencia de nucleótidos que se utiliza para la sobreexpresión de xiluloquinasa en la célula huésped es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de xiluloquinasa.

La enzima "xiluloquinasa" (EC 2.7.1.17) se define aquí como una enzima que cataliza la reacción ATP D-xilulosa = ADP D-xilulosa 5-fosfato. La enzima se conoce también como una xiluloquinasa fosforiladora, D-xiluloquinasa o ATP:D-xilulosa 5-fosfotransferasa. Una xiluloquinasa que se utiliza en la invención se puede definir además por su secuencia de aminoácidos. De manera similar, una xiluloquinasa se puede definir por una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima así como por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica la xiluloquinasa.

En una célula huésped transformada, una modificación o modificaciones genéticas que incrementan la actividad de la xiluloquinasa específica se pueden combinar con cualquiera de las modificaciones que incrementan el flujo de la vía metabólica de la pentosa fosfato como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, esto no es esencial.

En las células huésped de la invención, una xiluloquinasa que se va a sobreexpresar se sobreexpresa en un factor de por lo menos aproximadamente 1,1, aproximadamente 1,2, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 en comparación con una cepa que es genéticamente idéntica excepto por la(s) modificación(es) genética(s) que causa(n) la sobreexpresión. Se debe entender que dichos niveles de sobreexpresión pueden ser válidos para el nivel en el estado estacionario de la actividad enzimática, el nivel en el estado estacionario de la proteína de la enzima así como para el nivel en el estado estacionario del transcripto que codifica la enzima.

Supresión del gen de aldosa reductasa (GRE3)

Dado que XI se utiliza como gen para convertir xilosa, es ventajoso reducir la actividad de la aldosa reductasa. Por lo tanto, una célula huésped transformada comprende una o más modificaciones genéticas que reduzcan la actividad de la aldosa reductasa en la célula huésped. Preferiblemente, la actividad de aldosa reductasa no específica se reduce en la célula huésped por una o más modificaciones genéticas que reduce(n) la expresión de un gen que codifica una aldosa reductasa no específica o lo desactivan. Preferiblemente, las modificaciones genéticas reducen o desactivan la expresión de cada copia endógena de un gen que codifica una aldosa reductasa en la célula huésped, en una realización, una supresión de aldosa reductasa GRE3 (que aquí se denomina supresión de GRE3). Las células huésped transformadas pueden comprender múltiples copias de genes que codifican aldosa reductasas no específicas como resultado de di-, poli- o aneuploidía, y/o la célula huésped puede contener varias (iso)enzimas diferentes con actividades de aldosa reductasa que difieren en la secuencia de aminoácidos y cada una de las cuales está codificada por un gen diferente. También en dichos casos, preferiblemente se reduce o desactiva la expresión de cada gen que codifica una aldosa reductasa no específica. Preferiblemente, el gen se desactiva por supresión de por lo menos parte del gen o por interrupción del gen, mediante lo cual en este contexto el término gen también incluye cualquier secuencia no codificante hacia 3' ó 5' de la secuencia codificante, cuya supresión (parcial) o desactivación da como resultado una reducción de la expresión de la actividad de aldosa reductasa no específica en la célula huésped.

Una secuencia de nucleótidos que codifica una aldosa reductasa cuya actividad se debe reducir en la célula huésped es una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de aldosa reductasa.

Por lo tanto, una célula huésped que comprende solo una modificación o modificaciones genética(s) que reduce(n) la actividad no específica de aldosa reductasa en la célula huésped se encuentra incluida específicamente en la invención.

La enzima "aldosa reductasa" (EC 1.1.1.21) se define aquí como cualquier enzima que sea capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. En el contexto de la presente invención, una aldosa reductasa puede ser cualquier aldosa reductasa no específica que sea nativa (endógena) de una célula huésped de la invención y que sea capaz de reducir xilosa o xilulosa a xilitol. Las aldosa reductasas no específicas catalizan la reacción:

aldosa NAD(P)H H+ ^ alditol NAD(P)+

La enzima tiene una amplia especificidad y se conoce también como aldosa reductasa; poliol deshidrogenasa (NADP+); alditol:NADP oxidorreductasa; alditol:NADP+ 1-oxidorreductasa; NADPH-aldopentosa reductasa; o NADPH-aldosa reductasa.

Un ejemplo particular de una aldosa reductasa no específica con dichas características es la endógena de S. cerevisiae y que es codificada por el gen GRE3 (Traff et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74). Por lo tanto, una aldosa reductasa de la invención se puede definir además por su secuencia de aminoácidos. De manera similar una aldosa reductasa se puede definir por la secuencia de nucleótidos que codifica la enzima así como por una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica una aldosa reductasa.

Obtención de bioproductos

A lo largo de los años, se ha sugerido la posibilidad de emplear diversos organismos para producir bio-etanol a partir de los azúcares de cultivo. Sin embargo, en todos los procesos prácticos para producir bio-etanol se ha continuado con el uso de las levaduras del género Saccharomyces como productoras de etanol. Esto se debe a las diversas características atractivas que presentan las especies de Saccharomyces en el contexto de los procesos industriales, a saber, su tolerancia elevada a los ácidos, al etanol y a la osmolaridad, su capacidad de desarrollarse de manera anaeróbica y, por supuesto, su gran capacidad de fermentar alcoholes. Las especies de levaduras preferidas para usar como células huésped incluyen S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus o K. fragilis.

Una célula huésped transformada puede ser una célula apropiada para la producción de etanol. Sin embargo, una célula huésped transformada puede ser apropiada para la producción de productos de fermentación diferentes del etanol.

Dichos productos de la fermentación diferentes del etanol incluyen, en principio, cualquier sustancia química en bruto y luego refinada que pueda ser producida por un microorganismo eucariota, tal como una levadura o un hongo filamentoso.

Una célula huésped transformada que se puede utilizar para generar productos de la fermentación diferentes del etanol, y preferida en el contexto de la presente invención, es una célula huésped que comprende una modificación genética que da como resultado una disminución en la actividad de la alcohol deshidrogenasa.

En una realización, la célula huésped transformada se puede utilizar en un proceso donde los azúcares que se producen a partir de la lignocelulosa se convierten en etanol.

Lignocelulosa

La lignocelulosa, que se puede considerar una materia prima renovable potencial, generalmente comprende los polisacáridos celulosa (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Además, parte de la hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo en materias primas derivadas de madera. La hidrólisis enzimática de dichos polisacáridos para dar azúcares solubles, que incluyen tanto a los monómeros como a los multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas ocurre bajo la acción de diferentes enzimas que actúan de manera concertada.

Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tales como arabinanos, pueden acumularse hasta formar una proporción considerable de la masa seca de las paredes celulares típicas de los tejidos vegetales no leñosos (aproximadamente entre un cuarto y la mitad de la masa seca puede consistir en pectinas).

Pretratamiento

Antes del tratamiento enzimático, el material lignocelulósico se puede pretratar. El pretratamiento puede comprender la exposición del material lignocelulósico a un ácido, una base, un solvente, calor, un peróxido, ozono, trituración mecánica, molienda, o una rápida despresurización, o una combinación de dos o más cualesquiera de los mismos. Este pretratamiento químico frecuentemente se combina con un pretratamiento térmico, por ejemplo a entre 150-220°C durante entre 1 y 30 minutos.

Hidrólisis enzimática

El material pretratado se somete comúnmente a una hidrólisis enzimática para liberar azúcares que puedan ser fermentados de acuerdo con la invención. Esto se puede ejecutar por métodos convencionales, por ejemplo poniéndolo en contacto con celulasas, por ejemplo celobiohidrolasa(s), endoglucanasa(s), beta-glucosidasa(s) y opcionalmente otras enzimas. La conversión con celulasas se puede ejecutar a temperaturas ambientes o a mayores temperaturas, con el tiempo de reacción necesario para liberar cantidades suficientes de azúcar(es). El resultado de la hidrólisis enzimática es un producto de hidrólisis que comprende azúcares C5/C6, que aquí se denomina la composición de azúcar.

Composición de azúcar

La composición de azúcar de acuerdo con la invención comprende glucosa, arabinosa y xilosa. En la invención se puede utilizar cualquier composición de azúcar que satisfaga dichos criterios. Otros azúcares opcionales de la composición de azúcar son galactosa y manosa. En una realización preferida, la composición de azúcar es un hidrolizado de uno o más materiales lignocelulósicos. Aquí, la lignocelulosa incluye hemicelulosa y partes de la biomasa con hemicelulosa. También lignocelulosa que incluye fracciones lignocelulósicas de la biomasa. En la siguiente lista se pueden ver algunos materiales lignocelulósicos apropiados: podas de huerta, chaparral, residuos de molino, residuos urbanos de madera, residuos municipales, residuos madereros, residuos de tala, aclareos forestales, cultivos leñosos de corta rotación, residuos industriales, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscaras de soja, cáscara de arroz, paja de arroz, piensos de gluten de maíz, cáscaras de avena, caña de azúcar, el rastrojo de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, hojas de maíz, pasto varilla, miscanthus, sorgo dulce, tallos de canola, tallos de soja, pastos de pradera, pasto navajita, cola de zorra; pulpa de remolacha, pulpa de cítricos, cáscaras de semillas, desechos animales celulósicos, recortes de césped, algodón, algas, árboles, madera blanda, madera dura, álamo, pino, arbustos, pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de la caña de azúcar, maíz, hojas de maíz, cascarillas de maíz, residuos combustibles de maíz, granos de maíz, fibra de los granos, productos y subproductos de la molienda húmeda o seca de los granos, residuos sólidos urbanos, residuos de papel, residuos de jardinería, materiales herbáceos, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos urbanos, residuos de papel, pulpa, residuos de pastera, ramas, arbustos, cañas, maíz, hojas de maíz, un cultivo energético, materia forestal, una fruta, una flor, un grano, una hierba, un cultivo herbáceo, hojas, corteza, agujas, troncos, raíces, árboles jóvenes, arbustos, pasto varilla, árboles, vegetales, cáscaras de fruta, vides, pulpa de remolacha azucarera, medios de molienda de trigo, cáscaras de avena, madera dura o blanda, material de residuos orgánicos generados a partir de un proceso agrícola, residuos de madera forestal o una combinación de cualesquiera dos o más de los mismos.

En la tabla 2 se da un resumen de algunas composiciones de azúcares apropiadas que derivan de la lignocelulosa y las composiciones de azúcares de sus hidrolizados. Las lignocelulosas que se mencionan incluyen: mazorcas de maíz, fibras de maíz, cáscaras de arroz, cáscaras de melón, pulpa de remolacha, paja de trigo, bagazo de caña azucarera, madera, hierba y residuos del prensado de olivas.

Tabla 2: Resumen de composiciones de azúcares de materiales lignocelulósicos. Gal= galactosa, Xil= xilosa, Ara= arabinosa, Man= manosa, Glu= glucosa, Rham= ramnosa. Se da el porcentaje galactosa (% Gal).

Al ver la tabla 2 queda claro que en dichas lignocelulosas hay presente una gran cantidad de azúcar en forma de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa. La conversión de glucosa, xilosa, arabinosa y galactosa en producto de fermentación tiene una gran importancia económica. En algunos materiales lignocelulósicos también hay presente manosa, pero usualmente en menores cantidades que los azúcares mencionados anteriormente. Por lo tanto, de manera ventajosa, la célula huésped transformada también convierte la manosa.

Fermentación

El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aeróbico o anaeróbico. Un proceso de fermentación anaeróbico se define en la presente como un proceso de fermentación que se pone en práctica en ausencia de oxígeno, o bien como un proceso en el que sustancialmente no se consume oxígeno, es decir, se trata de un proceso en el que preferiblemente se consume menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/l/h, más preferiblemente 0 mmol/l/h (vale decir, el consumo de oxígeno no es detectable) y donde las moléculas orgánicas pueden hacer las veces tanto de donantes como de aceptores de electrones. En ausencia de oxígeno, el NADH que se produce durante la glucólisis y la formación de biomasa no puede oxidarse a través de un proceso de fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, numerosos microorganismos utilizan el piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones y de hidrógeno, para lo cual es necesario el NAD+. Por lo tanto, en un proceso de fermentación anaeróbico preferido, la pentosa se convierte en productos de fermentación tales como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico y una cefalosporina.

El proceso de fermentación preferiblemente se pone en práctica a una temperatura que es óptima para la célula. Por lo tanto, para la mayoría de las células huésped que provienen de levaduras o de hongos, el proceso de fermentación se lleva a cabo a una temperatura que es menor que aproximadamente 42°C, preferiblemente menor que aproximadamente 38°C. Cuando se emplean células huésped que provienen de levaduras o de hongos filamentosos, el proceso de fermentación preferiblemente se lleva a cabo a una temperatura que es menor que aproximadamente 35, aproximadamente 33, aproximadamente 30 o aproximadamente 28°C, y a una temperatura que es mayor que aproximadamente 20, aproximadamente 22 o aproximadamente 25°C.

El rendimiento del etanol a partir de la xilosa y/o a partir de la glucosa en el proceso preferiblemente es de al menos aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 95 o aproximadamente 98%. El rendimiento del etanol se define en la presente como un porcentaje del rendimiento teórico máximo.

La invención también se relaciona con un proceso para la producción de un producto de la fermentación.

El proceso de fermentación de acuerdo con la presente invención puede ponerse en práctica en condiciones aeróbicas o anaeróbicas. En una realización, el proceso se pone en práctica en condiciones microaerófilas o con un contenido limitado de oxígeno.

En la presente, un proceso de fermentación anaeróbico se define como un proceso de fermentación que se lleva a cabo en ausencia de oxígeno, o bien como un proceso en el que sustancialmente no se consume oxígeno, es decir, se trata de un proceso en el que preferiblemente se consume menos de aproximadamente 5, aproximadamente 2,5 o aproximadamente 1 mmol/l/h de oxígeno, donde las moléculas orgánicas pueden hacer las veces tanto de donadores como de aceptores de electrones.

En un proceso preferido la célula fermenta tanto la xilosa como la glucosa, preferiblemente de manera simultánea, en cuyo caso preferiblemente se utiliza una célula que sea insensible a la represión por glucosa. Además de una fuente de xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá además los ingredientes apropiados que sean necesarios para el crecimiento de la célula. Las composiciones de medios de fermentación para el cultivo de microorganismos tales como las levaduras son bien conocidas en la técnica.

Los procesos de fermentación se pueden llevar a cabo en una modalidad por lotes, semicontinua o continua. También se puede aplicar un proceso separado de hidrólisis y fermentación (SHF) o un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF). Una combinación de dichas modalidades de procesos de fermentación también puede ser posible para obtener una productividad óptima. De aquí en adelante se describen dichos procesos de manera más detallada.

Modalidad SSF

Para la modalidad de sacarificación y fermentación simultánea (SSF), el tiempo de reacción para el paso de licuefacción/hidrólisis o presacarificación depende del tiempo necesario para obtener el rendimiento que se desea, es decir el rendimiento de la conversión de celulosa a glucosa. Dicho rendimiento es preferiblemente lo más alto posible, preferiblemente del 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más, 99% o más, incluso 99,5% o más o 99,9% o más.

De acuerdo con la invención, en la modalidad SSF se obtienen muy altas concentraciones de azúcar en modalidad SHF y muy altas concentraciones de producto (por ejemplo etanol). En la operación por la modalidad SHF la concentración de glucosa es de 25g/L o más, 30 g/L o más, 35g/L o más, 40 g/L o más, 45 g/L o más, 50 g/L o más, 55 g/L o más, 60 g/L o más, 65 g/L o más, 70 g/L o más, 75 g/L o más, 80 g/L o más, 85 g/L o más, 90 g/L o más, 95 g/L o más, 100 g/L o más, 110 g/L o más, 120g/L o más o puede, por ejemplo ser de 25g/L-250 g/L, 30gl/L-200g/L, 40g/L-200 g/L, 50g/L-200g/L, 60g/L-200g/L, 70g/L-200g/L, 80g/L-200g/L, 90 g/L, 80g/L-200g/L.

Concentración de producto en la modalidad SSF

En la operación por la modalidad SSF, la concentración de producto (g/L) depende de la cantidad de glucosa que se produzca, pero esta no es visible porque en la SSF los azúcares se convierten en un producto, y las concentraciones de producto se pueden relacionar con la concentración de glucosa subyacente mediante una multiplicación por el máximo rendimiento teórico (Yps max en gr de producto por gramo de glucosa).

El máximo rendimiento teórico (Yps max en gr de producto por gramo de glucosa) de un producto de fermentación se puede obtener de libros de texto de bioquímica. Para el etanol, 1 mol de glucosa (180 gr) da, de acuerdo con vía metabólica normal de fermentación por glucólisis en levadura, 2 moles de etanol (= 2 x 46 = 92 gr de etanol. El máximo rendimiento teórico de etanol en glucosa es por lo tanto 92/180 = 0,51 gr de etanol/gr de glucosa.

Para el butanol (MW 74 gr/mol) o iso butanol, el máximo rendimiento teórico es de 1 mol de butanol por mol de glucosa. De manera que el Yps max para el (iso-)butanol = 74/180 = 0,41 gr (iso-)butanol/gr de glucosa.

Para el ácido láctico, el rendimiento de la fermentación para la fermentación homoláctica es de 2 moles de ácido láctico (MW = 90 gr/mol) por mol de glucosa. De acuerdo con esta estequiometría, el Yps max = 1 gr ácido láctico /gr de glucosa.

Para otros productos de fermentación se puede realizar un cálculo similar.

Modalidad SSF

En la operación por la modalidad SSF la concentración de producto es de 25g * Yps g/L o más, 30 * Yps g/L o más, 35g * Yps /L o más, 40 * Yps g/L o más, 45 * Yps g/L o más, 50 * Yps g/L o más, 55 * Yps g/L o más, 60 * Yps g/L o más, 65 * Yps g/L o más, 70 * Yps g/L o más, 75 * Yps g/L o más, 80 * Yps g/L o más, 85 * Yps g/L o más, 90 * Yps g/L o más, 95 * Yps g/L o más, 100 * Yps g/L o más, 110 * Yps g/L o más, 120g/L * Yps o más o puede, por ejemplo, ser de 25 * Yps g/L-250 * Yps g/L, 30 * Yps gl/L-200 * Yps g/L, 40 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 50 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 60 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 70 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 80 * Yps g/L-200 * Yps g/L, 90 * Yps g/L, 80 * Yps g/L-200 * Yps g/L.

Por lo tanto, la invención provee un método para la preparación de un producto de fermentación, donde dicho método comprende:

a. degradar lignocelulosa usando un método según se ha descrito aquí; y

b. fermentar el material que se obtiene como resultado,

para preparar de esa manera un producto de fermentación.

Producto de fermentación

El producto de fermentación de la invención puede ser cualquier producto útil. En una realización, el mismo es un producto que se selecciona entre el grupo que consiste en etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacónico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, un aminoácido, como por ejemplo lisina, metionina, triptófano, treonina, y ácido aspártico, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, un antibiótico p-lactámico y una cefalosporina, vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos de alimentación animal, productos químicos especiales, materias primas para la industria química, plásticos, solventes, combustibles, incluyendo biocombustibles y biogás o polímeros orgánicos, y una enzima industrial, como por ejemplo una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, oxidorreductasas, una transferasa o una xilanasa. Por ejemplo los productos de fermentación pueden ser producidos por las células de acuerdo con la invención, siguiendo los métodos de preparación de las células y procesos de fermentación de la técnica anterior, pero sin embargo aquí dichos ejemplos no se deberían considerar limitativos. Las células pueden producir n-butanol, según se describe en el documento WO2008121701 o WO2008086124; ácido láctico según se describe en el documento US2011053231 o US2010137551; ácido 3-hidroxi-propiónico según se describe en el documento WO2010010291; ácido acrílico según se describe en el documento WO2009153047.

Recuperación del producto de la fermentación

Para la recuperación del producto de fermentación se usan tecnologías existentes. Para diferentes productos de fermentación son apropiados diferentes procesos de recuperación. Los métodos existentes para recuperar etanol de mezclas acuosas comúnmente usan técnicas de fraccionamiento y adsorción. Por ejemplo, se puede usar incluso una cerveza para procesar un producto fermentado, que contiene etanol en una mezcla acuosa, para producir una mezcla enriquecida que contiene etanol que luego se somete a fraccionamiento (por ejemplo, destilación fraccionada u otras técnicas). Luego, las fracciones que contienen las mayores concentraciones de etanol se pueden pasar a través de un absorbente para eliminar la mayoría, sino toda el agua remanente del etanol.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención:

Ejemplos

Técnicas generales de biología molecular

A menos que se indique lo contrario, los métodos que se emplean son técnicas bioquímicas convencionales. Los ejemplos de publicaciones donde pueden hallarse metodologías generales apropiadas incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.

Medio

El medio usado en los experimentos fue medio YEP (extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l) o medio YNB sólido (base de nitrógeno de levadura 6,7 g/l, agar 15 g/l), suplementado con azúcares como se indica en los ejemplos. Para el medio YEP sólido, se agregó agar 15 g/l al medio líquido antes de la esterilización.

En los experimentos de AFM, se usó medio mineral. La composición del medio mineral ha sido descrita en Verduyn et al. (Yeast (1992), Volumen 8, 501-517) y fue suplementado con urea 2,325 g/l y azúcares como se indica en los ejemplos.

Transformación de células de levadura

La transformación de levaduras se realizó de acuerdo con el método descrito por Schiestl y Gietz (Current Genetics (1989), Volumen 16, 339-346).

PCR de colonias

Se extrajo ADN genómico a partir de colonias de levaduras simples para PCR De acuerdo con el método descrito por L5oke et al. (BioTechniques (2011), Volumen 50, 325-328).

Procedimiento AFM

El monitor de fermentación de alcohol (AFM; Halotec, Veenendaal, Países Bajos) es un biorreactor paralelo de laboratorio robusto y fácil de usar que permite comparaciones precisas de tasas de conversión de carbono y rendimientos para seis fermentaciones anaeróbicas simultáneas.

El cultivo de partida del experimento AFM contuvo 50 mg de levadura (peso seco). Para determinar esto, se hizo una curva de calibración de la cepa RN1001 de biomasa vs. OD700. Esta curva de calibración se usó en el experimento para determinar el volumen de cultivo celular necesitado para 50 mg de levadura (peso seco).

Antes del inicio del experimento AFM, se hicieron crecer precultivos como se indica en los ejemplos. Para cada cepa se midió la OD700 y se inocularon 50 mg de levadura (peso seco) en 400 ml de medio mineral (Verduyn et al. (Yeast (1992), Volumen 8, 501 -517), suplementado con urea 2,325 g/l y azúcares como se indica en los ejemplos.

Aislamiento de ARN

Se aisló ARN usando el conjunto de elementos Nucleospin RNA II (Machery-Nagel, GmbH & Co. KG, Düren, Alemania), con un protocolo del fabricante levemente adaptado. Antes del inicio del protocolo se trataron las células de levaduras recién crecidas en 0,2 mg de liticasa/ml, sorbitol 1M y solución amortiguada de EDTA 0,1 M durante 30 minutos a 30°C. Luego de este paso, se llevó a cabo el protocolo del fabricante, excepto los pasos 6 y 7 (desalado de la membrana de sílice y el tratamiento con DNasa). Para eliminar el ADN genómico, se realizó un tratamiento con DNasa luego de la elución del ARN de la columna. Para esto se mezclaron 10 gl de solución de ARN con 7 gl de agua libre de DNasa y RNasa, 2 gl de solución amortiguada 10x y 1 gl de DNsa (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot / Alemania). Esta mezcla se incubó durante 30 minutos a 37°C. Para la inactivación de la enzima, se agregó 1 gl de EDTA 25mM (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot / Alemania) y se incubó durante 10 minutos a 65°C.

Síntesis de ADNc

La síntesis de ADNc se realizó sobre el ARN usando el conjunto de elementos de síntesis de ADNc RevertAid™ H Minus First Strand (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot/Alemania).

Q-PCR

Para el experimento de Q-PCR se usó el conjunto de elementos para qPCR DyNAmo Colorflash SYBR Green (Finnzymes, 01620 Vantaa, Finlandia). Se hizo una mezcla de AdN con 1 gl de ADNc, 39 gl de H20 y 10 gl de indicador de muestra amarillo. Para cada reacción se usaron 5 gl de mezcla de ADN con 10 gl de mastermix 2x DyNAmo, 7 gl de H2O, 1 gl de cebador directo 10 gM y 1 gl de cebador revertido 10 gM (los números de los cebadores están indicados en los ejemplos). La Q-PCR se realizó en el sistema Bio-Rad CFX96 Real-Time (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), usando el programa como se indica en la Tabla 3.

Tabla 3: programa Q-PCR

Cepas

Las cepas usadas en los experimentos son RN1001, RN1041 y RN1216. RN1041 ha sido descrita en el documento WO 2012067510. Esta cepa tiene el siguiente genotipo:

MATa, ura3-52, Ieu2-112, his3::loxP, gre3::loxP, loxP-pTPI1 ::TAL1, loxP-pTPl1:.RKI1, loxP-pTPl1-TKL1, loxP-pTPl1-RPE1, delta::pADH1-XKS1- tCYC1-LEU2, delta::URA3-pTPI1-xy/A-tCYC1

MAT a = tipo de cruza a

Mutaciones ura3-52, Ieu2-112, HIS3::\oxP en los genes URA3, LEU2 e HIS3, respectivamente. La mutación ura3-52 es complementada por el gen URA3 en la construcción de sobreexpresión xylA la mutación Ieu2-112 es complementada por el gen LEU2 en la construcción de sobreexpresión XKS1. La eliminación del gen HIS3 provoca la auxotrofia de histidina. Por esta razón, RN1041 necesita de histidina en el medio para el crecimiento. gre3:.loxP es una eliminación del gen GRE3, que codifica para aldosa reductasa. El sitio loxP queda detrás en el genoma luego de la eliminación del marcador.

loxP-pTPl1 designa la sobreexpresión de genes de, en los experimentos descritos en la presente, la vía de pentosas fosfato no oxidativa por reemplazo del promotor nativo por el promotor del gen TPI1. El sitio loxP corriente arriba del promotor fuerte, constitutivo TPI1 permanece en el genoma luego de la eliminación del marcador (Kuyper et al, FEMS Yeast Research 5 (2005) 925- 934).

delta:: significa integración cromosómica de la construcción luego de la recombinación en las repeticiones terminales largas del retrotransposón Ty1.

La cepa RN1001 es la cepa parental de la cepa RN1041, es decir antes de la eliminación del gen HIS3.

La cepa RN1216 tiene el mismo genotipo que la cepa RN1041.

Ejemplo 1

Construcción de un plásmido de sobreexpresión de glioxalasa

El ORF de GLO1 se obtuvo de CEN.PK113-7D usando los cebadores SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26. Posteriormente el ORF de GLO1 amplificado por PCR se clonó en un vector romo TOPO usando el conjunto de elementos para clonado por PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se transformó en E.coli químicamente competentes One Shot® TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se realizaron aislamientos de ADN Miniprep sobre varias colonias. Los plásmidos obtenidos se confirmaron por análisis con enzimas de restricción. El plásmido correcto fue llamado pRN935.

La sobreexpresión de GLO1 se realizó en un plásmido 2p. Por lo tanto, se construyó un plásmido 2 p con el casete de expresión de GLO1. La construcción del casete de expresión de GLO1 con el promotor PGK1 y terminador PGI1 se muestra en la Figura 1. Los mapas físicos de los plásmidos que contienen estos tres elementos, presentes en los plásmidos pRN228, pRN935 y pRN685, se dan en las Figuras 2, 3 y 4 respectivamente. Posteriormente el casete de expresión de GLO1 construido se amplificó por PCR usando los cebadores SEQ ID NO: 1 (pPGK1-5'-F; Figura 1) y SEQ ID NO: 2 (tPGI1-3'-R; Figura 1). El producto de PCR se purificó en columna usando el conjunto de elementos de extracción en gel GeneJET™ (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot / Alemania), se clonó en un vector romo TOPO usando el conjunto de elementos de clonado por PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se transformó en E.coli químicamente competentes One Shot® TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se realizaron aislamientos de ADN miniprep sobre varias colonias. Los plásmidos obtenidos se confirmaron por análisis con enzimas de restricción. Se obtuvieron dos plásmidos diferentes, un plásmido con el casete de expresión de GLO1 insertado en orientación invertida (pRN1048, Figura 5) y un plásmido con el casete de expresión de GLO1 insertado en orientación al derecho (pRN1129, Figura 6). Posteriormente el casete de expresión de GLO1, de pRN1048, se clonó en el vector de transferencia de levaduras pRN599 (Figura 7) entre los sitios para Kpnl y Apal. El plásmido resultante se transformó en E.coli químicamente competentes One Shot® TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se realizaron aislamientos de ADN miniprep sobre varias colonias. Los plásmidos obtenidos se confirmaron por análisis con enzimas de restricción. El plásmido correcto fue llamado pRN1049 (Figura 8).

El plásmido pRN228 contiene los siguientes elementos importantes: el promotor PGK1 flanqueado por los sitios de restricción para Spel y Pstl y un marcador de resistencia a kanamicina.

El plásmido pRN935 contiene los siguientes elementos importantes: el ORF de GLO1 flanqueado por los sitios de restricción para Pstl y Sallí y un marcador de resistencia a kanamicina.

El plásmido pRN685 contiene los siguientes elementos importantes: el terminador de PGI1 flanqueado por los sitios de restricción para Xhol y Hindlll y un marcador de resistencia a kanamicina.

El plásmido pRN599 contiene los siguientes elementos importantes: un origen de replicación de 2 j seguido por un marcador kanMX (que consiste en un promotor TEF1 de Ashbya gossypii, un gen de resistencia KanMX y el terminador TEF1 de Ashbya gossypii) y un marcador de resistencia a ampicilina.

El cebador SEQ ID NO: 1 es el cebador directo del promotor PGK1.

El cebador SEQ ID NO: 2 es el cebador revertido del terminador PGI1.

El cebador SEQ ID NO: 25 es el cebador directo para la amplificación del gen GLO1.

El cebador SEQ ID NO: 26 es el cebador revertido para la amplificación del gen GLO1.

Ejemplo 2

Transformación de la cepa de levadura con el plásmido de sobreexpresión

El plásmido de sobreexpresión GLO1 construido pRN1049 se usó para transformar la cepa de levadura RN1001. También se creó una cepa testigo por transformación de la cepa de levadura RN1001 con el plásmido vacío pRN599. Se seleccionaron los transformantes correctos sobre placas con YEP que contenían glucosa 2% y G418 200 jg/ml. La cepa RN1001 que contenía pRN1049 es llamada RN1001Gpl. La cepa testigo RN1001 que contenía el plásmido vacío pRN599 se llama RN1001 Epl.

El nivel de expresión de GLO1 en RN1001Gpl se determinó por Q-PCR. Se usó la cepa testigo RN1001Epl como referencia. Para este experimento se hicieron crecer ambas cepas durante la noche en medio YEP que contenía glucosa 2% y G418 200 jg/ml. Posteriormente se aisló ARN a partir de los cultivos y se revisó si hubo contaminación con ADN genómico por PCR usando los cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. No se encontró contaminación. Luego se realizó una síntesis de ADNc sobre el ARN usando el conjunto de elementos RevertAid (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot / Alemania). Luego se realizó un experimento de Q-PCR con los cebadores SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Se usaron dos genes estándares internos como referencia, ALG9 usando los cebadores SEQ iD NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y UBC6 usando los cebadores SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. Los datos de expresión de GLO1 se normalizaron en base al gen estándar interno con los mejores valores CT dupla, en este caso ALG9. La cepa RN1001Gpl mostró una mayor expresión de GLO1 en comparación con RN1001Epl (Figura 9). Como se indica en la Figura 9, el nivel de expresión normalizada del gen GLO1 fue aproximadamente 5 veces mayor en la cepa RN1001Gpl en comparación con RN1001 Epl, mientras que la expresión normalizada del gen UBC6 fue la misma en ambas cepas.

El cebador SEQ ID NO: 3 es idéntico a una secuencia del gen ACT1.

El cebador SEQ ID NO: 4 es idéntico a una secuencia del gen ACT1.

El cebador SEQ ID NO: 5 es idéntico a una secuencia del gen GLO1.

El cebador SEQ ID NO: 6 es idéntico a una secuencia del gen GLO1.

El cebador SEQ ID NO: 7 es idéntico a una secuencia del gen ALG9.

El cebador SEQ ID NO: 8 es idéntico a una secuencia del gen ALG9.

El cebador SEQ ID NO: 9 es idéntico a una secuencia del gen UBC6.

El cebador SEQ ID NO: 10 es idéntico a una secuencia del gen UBC6.

Ejemplo 3

Experimentos AFM

Luego de la verificación de la mayor expresión de GLO1 en RN1001Gpl en comparación con la cepa testigo RN1001Epl por Q-PCR (Ejemplo 2), se inició un experimento AFM para determinar la tasa de conversión de los azúcares presentes a etanol por medida de la producción de CO2 durante el experimento, ya que el etanol y el CO2 se producen en cantidades equimolares. Durante el experimento, se tomaron muestras para HPLC de los cultivos a diferentes tiempos, con el objetivo de determinar la tasa de consumo de glucosa y xilosa y la tasa de producción de etanol.

Se hicieron precultivos de ambas cepas, por inoculación de un poco de material celular de la placa de agar en 100 ml de YEP que contenía glucosa 2% y G418200 gg/ml. Al día siguiente, se inocularon 400 ml de medio mineral que contenía glucosa 2% y xilosa 2% con material celular de los precultivos. En el experimento AFM no se agregó G418 al medio mineral.

Las curvas de producción de CO2 (Figura 10) exhiben una tasa de producción de CO2 más rápida y mayor en RN1001 Gpl en comparación con RN1001 Epl, indicando un consumo más rápido de glucosa y xilosa en RN1001 GpI en comparación con la cepa testigo RN1001Epl. Los datos de HPLC (Tablas 4 y 5, y Figura 11) confirmaron las tasas más rápidas de consumo de xilosa en la cepa RN1001Gpl en comparación con la cepa RN1001Epl. La glucosa ya había sido consumida en el segundo punto de tiempo (16,5 horas), mientras que no fue el caso para la cepa RN1001 Epl.

Tabla 4: Datos de HPLC de RN1001Gpl

Tabla 5: Datos de HPLC de RN1001 Epl

Dado que no se agregó G418 al experimento AFM, se determinó cuántas células aún contenían su plásmido. Por lo tanto al final del último experimento AFM se plaqueó la misma cantidad de cultivo celular en placas de agar con YEPD y placas de agar con YEPD que contenían G418. Se obtuvo cuatro veces más de colonias en las placas de agar sin G418. Estos resultados mostraron que aproximadamente el 25% de las células aún contenían su plásmido, indicando la pérdida del plásmido en RN1001 Gpl y RN1001 Epl. Por lo tanto se construyeron nuevos transformantes que contenían una copia extra, constitutivamente expresada del gen GLO1, integrado establemente en el genoma.

Ejemplo 4

Construcción de los fragmentos integrativos

Para superar el problema de la pérdida de plásmido durante el experimento AFM, se integró el casete de expresión de GLO1 al genoma de las cepas de levadura junto con HIS3 para la selección de los transformantes correctos. Para ello, se construyó un plásmido que contenía el casete de expresión de GLO1 y el casete de expresión de HIS3. El casete de expresión de GLO1 (presente en pRN1129) y el casete de expresión de HIS3 (presente en pRN324) se extrajo del plásmido usando las enzimas de restricción Pvull y Sphl o ApaLI (Figuras 6 y 12). Posteriormente se ligaron ambos fragmentos junto con el sitio Pvull. El fragmento resultante se amplificó por PCR usando los cebadores SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, se clonó en un vector romo TOPO usando el conjunto de elementos para clonado por PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se transformó en E.coli químicamente competentes One Shot® TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se prepararon aislamientos de ADN por miniprep de varias colonias. Se verificaron los plásmidos obtenidos por análisis con enzimas de restricción. El plásmido correcto se llamó pRN1142 (Figura 13).

Posteriormente el fragmento GLO1 y HIS3 se amplificó por PCR usando los cebadores SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 y pRN1142 como molde. Para crear una cepa testigo, se amplificó por PCR el casete de expresión de HIS3 con los cebadores SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13 y pRN324 como molde. Para la integración en el genoma, se necesita obtener dos flancos de 500 pb del sitio de integración 1 (INT1), en la Figura 14 se da un mapa del sitio de integración (obtenido de http://www.yeastgenome.org/). Se amplificaron por PCR flancos 5' y 3' de 500pb, para la integración a INT1, usando los cebadores SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 15 para el flanco 5' y los cebadores SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 para el flanco 3'. Como molde se usó ADN genómico de RN1001. Todas las reacciones de PCR se purificaron en columna usando el conjunto de elementos de extracción en gel GeneJET™ (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot / Alemania). La secuencia de nucleótidos del flanco 5' está incluida como SEQ ID NO: 18 y el flanco 3' como SEQ ID NO: 19.

El plásmido pRN324 contiene los siguientes elementos importantes: el casete de expresión de HIS3 flanqueado por los sitios de restricción ApaLI y Pvull, y un marcador de resistencia a ampicilina.

El plásmido pRN1129 contiene los siguientes elementos importantes: el casete de expresión de GLO1 (que consiste en el promotor PGK1, el ORF de GLO1 y el terminador PGI1) flanqueado por los sitios de restricción Pvull y Sphl, y un marcador de resistencia a kanamicina.

El cebador SEQ ID NO: 11 es el cebador directo del casete HIS3, que consiste en 25 nucleótidos y una cola de 50 nucleótidos en el extremo 5', idénticos a los 50 nucleótidos del extremo 3' del flanco 5' de 500 pb de INT1.

El cebador SEQ ID NO: 12 es el cebador revertido del casete GLO1, que consiste en 25 nucleótidos y una cola de 50 nucleótidos en el extremo 5', idénticos a los 50 nucleótidos del extremo 5' del flanco 3' de 500 pb de INT1.

El cebador SEQ ID NO: 13 es el cebador revertido del casete HIS3, que consiste en 25 nucleótidos y una cola de 50 nucleótidos en el extremo 5', idénticos a los 50 nucleótidos del extremo 5' del flanco 3' de 500 pb de INT1.

El cebador SEQ ID NO: 14 es el cebador directo del flanco 5' de 500 pb de INT1.

El cebador SEQ ID NO: 15 es el cebador revertido del flanco 5' de 500 pb de INT1.

El cebador SEQ ID NO: 16 es el cebador directo del flanco 3' de 500 pb de INT1.

El cebador SEQ ID NO: 17 es el cebador revertido del flanco 3' de 500 pb de INT 1.

Todas las secuencias de los cebadores mencionadas anteriormente también están indicadas en la Figura 15.

Ejemplo 5

Transformación de cepas de levaduras con fragmentos integrativos

El mecanismo de integración de los fragmentos de PCR al genoma se muestra esquemáticamente en la Figura 15. Los fragmentos de PCR obtenidos (Ejemplo 4) se usaron para transformar las cepas RN1041 y RN1216, ambas siendo auxotróficas por histidina. Se seleccionaron los transformantes correctos en placas de YNB que contenían glucosa 2%. Se confirmó la integración de los casetes de expresión en el genoma en los transformantes por PCR de las colonias, usando los cebadores SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 17. La cepa RN1041 conteniendo los casetes de expresión HIS3 y GLO1 es llamada RN1041HG, y la cepa testigo RN1041 conteniendo el casete de expresión HIS3 es llamada RN1041H. La cepa RN1216 conteniendo los casetes de expresión HIS3 y GLO1 es llamada RN1216HG, y la cepa testigo RN1216 conteniendo el casete de expresión HIS3 es llamada RN1216H.

Para ambas cepas testigo, RN1041H y RN1216H, se seleccionó una colonia para Q-PCR. A partir de RN1041HG y RN1216HG, se seleccionaron dos colonias individuales para la Q-PCR (clon 1 y clon 2).

La expresión del gen GLO1 en los transformantes se confirmó en un experimento de Q-PCR. Para el experimento de Q-PCR todas las cepas seleccionadas se hicieron crecer durante la noche en medio YEP que contenía glucosa 2%. Posteriormente se aisló ARN de los cultivos y se estudió si había contaminación con ADN genómico por PCR usando los cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. No se encontró contaminación. Luego se realizó una síntesis de ADNc sobre el ARN usando el conjunto de elementos RevertAid (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot / Alemania). Luego se realizó un experimento de Q-PCR con los cebadores SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Se usaron dos genes estándares internos como referencia, ALG9 usando los cebadores SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y UBC6 usando los cebadores SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. Los datos de expresión de GLO1 se normalizaron en base al gen estándar interno con los mejores valores CT dupla, en este caso UBC6. Las 4 cepas que contenían HIS3 y GLO1 mostraron una expresión normalizada mayor de GLO1 en comparación con su cepa testigo (Figura 16), aproximadamente entre 4 y 5 veces mayor en el antecedente RN1041 en comparación con ALG9 y aproximadamente entre 2 y 3 veces mayor en el antecedente RN1216.

Ejemplo 6

Experimentos AFM

Luego de verificar la mayor expresión de GLO1 en las 4 cepas que contenían HIS3 y GLO1 en comparación con sus cepas testigo por Q-PCR (Ejemplo 5), se inició un experimento AFM para determinar la tasa de conversión de los azúcares presentes a etanol por medida de la producción de CO2 durante el experimento, ya que el etanol y el CO2 se producen en cantidades equimolares. Durante el experimento, se tomaron muestras para HPLC de los cultivos a diferentes tiempos, con el objetivo de determinar la tasa de consumo de azúcar y la tasa de producción de etanol. Las mismas 6 cepas se ensayaron en este experimento AFM ya que fueron usadas en el experimento de Q-PCR para la determinación de la expresión de GLO1.

Se hicieron precultivos de las 3 cepas derivadas de RN1041 (RN1041H, RN1041HG-1 y RN1041HG-2), por inoculación de un poco de material celular de la placa en 100 ml de YEP que contenía glucosa 2%. Al día siguiente se inocularon 400 ml de medio mineral que contenía glucosa 2% y xilosa 2% con material celular de los precultivos.

Las curvas de producción de CO2 de las cepas derivadas de RN1041 (Figura 17) mostraron tasas de producción de CO2 más rápidas y mayores en RN1041HG (clon 1 y 2) en comparación con RN1041H, indicando un consumo más rápido de glucosa y xilosa en RN1041HG (clon 1 y 2) en comparación con la cepa testigo RN1041H. Los datos de HPLC (Tablas 6, 7 y 8, y Figura 18) de hecho confirman el consumo más rápido de xilosa en las cepas RN1041HG (clon 1 y 2) en comparación con la cepa RN1041H, la glucosa ya había sido consumida en el segundo punto de tiempo (15 horas).

Tabla 6: Datos de HPLC de RN1041H

Tabla 7: Datos de HPLC de RN1041HG-1

Tabla 8: Datos de HPLC de RN1041HG-2

Estos resultados claramente mostraron que la sobreexpresión del gen GLO1 lleva a una fermentación más rápida y más eficaz de azúcares de biomasa, llevando a un tiempo reducido de fermentación. Esto significa que los azúcares están siendo convertidos más eficazmente a etanol.

Se inició un nuevo experimento AFM con las cepas derivadas de RN1216. Se hicieron precultivos de las 3 cepas (RN1216H, RN1216HG-1 y RN1216HG-2) por inoculación de un poco de material celular de la placa de agar en 100 ml de YEP que contenía glucosa 2%. Al día siguiente se inocularon 400 ml de medio mineral que contenían glucosa 5% y xilosa 5% con material celular de los precultivos.

Las curvas de producción de CO2 de RN1216 (Figura 19) mostraron tasas de producción de CO2 más rápidas y mayores en RN1216HG (clon 1 y 2) en comparación con RN1216H, indicando un consumo más rápido, más eficaz de glucosa y xilosa en RN1216HG (clon 1 y 2) en comparación con la cepa testigo RN1216H. Los datos de HPLC (Tablas 9, 10 y 11, y Figura 20) confirmaron el consumo más rápido de glucosa y xilosa en las cepas RN1216HG (clon 1 y 2) en comparación con la cepa RN1216H.

Tabla 9: Datos de HPLC de RN1216H

Tabla 10: Datos de HPLC de RN1216HG-1

Tabla 11: Datos de HPLC de RN1216HG-2

Estos resultados confirmaron nuevamente los resultados anteriores: la sobreexpresión del gen GLO1 lleva a una fermentación más rápida y más eficaz de azúcares de biomasa, en este caso xilosa y glucosa, llevando a un tiempo de fermentación total reducido y conversión más eficaz de los azúcares mencionados anteriormente a etanol.

Ejemplo 7

Variantes de GLO1

Los homólogos de GLO1, de otros organismos diferentes de S. cerevisiae, se expresan del mismo modo que el descrito en los ejemplos previos. Para esto, se sintetizaron secuencias de genes en base a las secuencias proteicas, listadas como SED ID NO: 20 a SEQ ID NO: 24. La secuencia del marco de lectura abierto se generó por el método descrito en el documento WO/2008/000632. Las secuencias proteicas derivan de Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Zygosaccharomyces rouxii, Kluyveromyces lactis y Candida magnoliae. Como referencia, se usó el gen GLO1 de tipo salvaje de S. cerevisiae (véase los ejemplos previos).

Las construcciones obtenidas de este modo se usan para transformar la cepa RN1216, como se describió en los ejemplos previos.

Todos los transformantes muestran tasas de consumo de azúcar mejoradas cuando se ensayaron en el experimento AFM (véase también el ejemplo 10), en base a los perfiles de dióxido de carbono y las concentraciones de azúcar reales durante el experimento.

En una realización, las siguientes características que están presentes en algunas versiones de GLO1 activas, especialmente en términos de cofermentación mejorada de sustratos de azúcar mezclados, son como sigue:

Tabla 12: patrones característicos de GLO1

Secuencia Posición en S. cerevisiae (SEQ ID No 20)

(E,s,d)-L-X-(H,Y)-(N,s) E242-L243-X-H245-N246

G-(F,Y)-G-H G266-Y267-G268-H269

G-X(6)-(F,i)-X(2,3)-D-X(3)-Y G301 -X(6)-F308-X(2)-D311 -X(3)-Y315

En la tabla 12, X designa un aminoácido (es decir cualquier aminoácido).

Si se mencionan dos residuos de aminoácidos entre paréntesis, se aplica a cualquiera (por ejemplo (F,Y)).

Las minúsculas designan variantes menores, por ejemplo (F,i) significa en la mayoría de los casos, que se observa el aminoácido F, pero en unos pocos casos el aminoácido I (isoleucina).

Ejemplo 8

Construcción de los fragmentos integrativos

Los homólogos de GLO1 se integraron en el genoma de la cepa de levadura RN1216 junto con HIS3 para la selección de los transformantes correctos. Para esto, se construyeron plásmidos, cada uno conteniendo un homólogo de GLO1 diferente junto con el promotor PGK1 y el terminador PGI1. Los plásmidos se construyeron De acuerdo con el método descrito en el documento PCT/EP2013/056623. Los plásmidos se llamaron pDB1175 (Figura 21), pDB1176 (Figura 22), pDB1177 (Figura 23), pDB1178 (Figura 24) y pDB1179 (Figura 25).

Posteriormente se amplificaron por PCR los diferentes casetes de expresión de GLO1 usando los cebadores SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 29 y pDB1175, pDB1176, pDB1177, pDB1178 y pDB1179 como molde. El casete de expresión HIS3 se amplificó por PCR usando SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31 y pRN324 (Figura 12) como molde. Para la integración al genoma, se necesita obtener dos flancos de 500 pb del sitio de integración 1 (INT1) (descrito en el ejemplo 4). Se amplificó por PCR un flanco 5' y 3' de 500 pb, para la integración a INT1, usando los cebadores SEQ iD nO: 14 y SEQ ID NO: 32 para el flanco 5' y los cebadores SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 17 para el flanco 3'. Como molde se usó ADN genómico de RN1001. Todas las reacciones de PCR se purificaron en columna con el uso del conjunto de elementos de extracción en gel GeneJET™ (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot / Alemania).

El plásmido pDB1175 contiene los siguientes elementos importantes: el casete de expresión Sc_GLO1 (que consiste en el promotor PGK1, el ORF de GLO1 optimizado por pares de codones de Saccharomyces cerevisiae y el terminador PGI1), y un marcador de resistencia a kanamicina.

El plásmido pDB1176 contiene los siguientes elementos importantes: el casete de expresión Cgla_GLO1 (que consiste en el promotor PGK1, el ORF de GLO1 optimizado por pares de codones de Candida glabrata y el terminador PGI1), y un marcador de resistencia a kanamicina.

El plásmido pDB1177 contiene los siguientes elementos importantes: el casete de expresión Zrou_GLO1 (que consiste en el promotor PGK1, el ORF de GLO1 optimizado por pares de codones de Zygosaccharomyces rouxii y el terminador PGI1), y un marcador de resistencia a kanamicina.

El plásmido pDB1178 contiene los siguientes elementos importantes: el casete de expresión Kl_GLO1 (que consiste en el promotor PGK1, el ORF de GLO1 optimizado por pares de codones de Kluyveromyces lactis y el terminador PGI1), y un marcador de resistencia a kanamicina.

El plásmido pDB1179 contiene los siguientes elementos importantes: el casete de expresión Cmag_GLO1 (que consiste en el promotor PGK1, el ORF de GLO1 optimizado por pares de codones de Candida magnoliae y el terminador PGI1), y un marcador de resistencia a kanamicina.

Plásmido pRN324: descrito en el ejemplo 4

El cebador SEQ ID NO: 28 es el cebador directo de los casetes de expresión de GLO1 homólogo (incluyendo promotor y terminador). El cebador SEQ ID NO: 29 es el cebador revertido de los casetes de expresión de GLO1 homólogo (incluyendo promotor y terminador). El cebador SEQ ID NO: 30 es el cebador directo del casete HIS3, que consiste en 20 nucleótidos y una cola de 50 nucleótidos en el extremo 5', idénticos a los 50 nucleótidos del extremo 3' de los casetes de expresión de los homólogos GLO1. El cebador SEQ ID NO: 31 es el cebador revertido del casete HIS3, que consiste en 21 nucleótidos y una cola de 50 nucleótidos en el extremo 5', idénticos a los 50 nucleótidos del extremo 5' del flanco 3' de 500 pb de INT1. El cebador SEQ ID NO: 32 es el cebador revertido del flanco 5' de 500 pb de INT1, que consiste en 23 nucleótidos y una cola de 50 nucleótidos en el extremo 5', idénticos a los 50 nucleótidos del extremo 5' de los casetes de expresión del homólogo de GLO1. El cebador SEQ ID NO: 33 es el cebador directo del flanco 3' de 500 pb de INT1, que consiste en 24 nucleótidos y una cola de 50 nucleótidos en el extremo 5', idénticos a los 50 nucleótidos del extremo 3' del casete de expresión HIS3.

Todas las secuencias de cebadores mencionadas anteriormente también están indicadas en la Figura 26.

Ejemplo 9

Transformación de cepa de levadura con fragmentos integrativos

El mecanismo de integración de los fragmentos de PCR en el genoma se muestra esquemáticamente en la Figura 26. Los fragmentos obtenidos por PCR (Ejemplo 8) se usaron para transformar la cepa RN1216, la cual contiene auxotrofía por histidina. Se seleccionaron los transformantes correctos en placas de YNB que contenían glucosa 2%. Se confirmó la integración de los casetes de expresión en el genoma en los transformantes por PCR de las colonias, usando los cebadores SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 17, para la integración de los casetes de expresión en el genoma. Las cepas correctas se nombraron como a continuación: RN1216 ScG_H, RN1216 CglaG_H, RN1216 ZrouG_H, RN1216 KIG_H y RN1216 CmagG_H.

La cepa RN1216 ScG_H contiene el casete de expresión Sc_GLO1 y el casete de expresión HIS3.

La cepa RN1216 CglaG_H contiene el casete de expresión Cgla_GLO1 y el casete de expresión HIS3.

La cepa RN1216 ZrouG_H contiene el casete de expresión Zrou_GLO1 y el casete de expresión HIS3.

La cepa RN1216 KIG_H contiene el casete de expresión KI_GLO1 y el casete de expresión HIS3.

La cepa RN1216 CmagG_H contiene el casete de expresión Cmag_GLO1 y el casete de expresión HIS3.

Ejemplo 10

Experimento AFM

Se inició un experimento AFM para determinar la tasa de conversión de los azúcares presentes a etanol por medida de la producción de CO2 durante el experimento, ya que el etanol y el CO2 se producen en cantidades equimolares. Durante el experimento, se tomaron muestras para HPLC de los cultivos a diferentes tiempos, con el objetivo de determinar la tasa de consumo de azúcar y la tasa de producción de etanol. Las cepas ensayadas en este experimento AFM son las 5 cepas construidas descritas en el ejemplo 9, y como cepa testigo se usó la cepa RN1216H la cual se describe en el ejemplo 5.

Se hicieron precultivos de las 6 cepas, por inoculación de un poco de material celular de la placa en 100 ml de YEP que contenía glucosa 2%. Al día siguiente, se inocularon 400 ml de medio mineral que contenía glucosa 5% y xilosa 5% con material celular de los precultivos.

Las curvas de producción de CO2 de las cepas derivadas de RN1216 (Figura 27) mostraron tasas de producción de CO2 más rápidas y mayores en RN1216 ScG_H, RN1216 CglaG_H, RN1216 KIG_H y RN1216 CmagG_H en comparación con RN1216H, indicando un consumo más rápido de glucosa y xilosa en estas 4 cepas variantes de GLO1 en comparación con la cepa testigo RN1216H. La cepa RN1216 ZrouG_H mostró tasas de producción de CO2 más rápidas y mayores en las primeras 20 horas del experimento en comparación con RN1216H, indicando un consumo más rápido de glucosa y más lento de xilosa en comparación con las otras 5 cepas en este experimento AFM. Los datos de HPLC (Tablas 13, 14, 15, 16, 17, 18 y Figuras 28, 29, 30, 31, 32, 33) de hecho confirmaron un consumo más rápido de glucosa y xilosa en las cepas RN1216 ScG_H, Rn 1216 CglaG_H, RN1216 KIG_H y RN1216 CmagG_H en comparación con la cepa RN1216H. Los datos de HPLC también confirman el consumo más rápido de glucosa en las cepas RN1216 ZrouG_H en comparación con las otras 5 cepas ensayadas en este experimento AFM.

Tabla 13: Datos de HPLC de RN1216 ScG H

Tabla 14: Datos de HPLC RN1216 de CglaG_H

Ti (h ) Gl ( /l) Xil ( /l) Et l ( /l)

Tabla 15: Datos de HPLC de RN1216 ZrouG H

Tabla 16: Datos de HPLC de RN1216 KIG H

Tabla 17: Datos de HPLC de RN1216 CmagG_H

( ) G ( /) ( /) ( /)

Tabla 18: Datos de HPLC de RN1216H

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una célula de Saccharomyces capaz de convertir uno o más azúcares pentosa y uno o más azúcares hexosa en producto de fermentación que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una isomerasa de xilosa que confiere la habilidad de convertir xilosa por isomerización o reducción, expresando dicha célula constitutivamente uno o más polipéptidos heterólogos u homólogos que tienen la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 20 o un polipéptido variante de la misma que tiene al menos 45% de identidad con la SEQ ID NO: 20 y que tiene actividad de glioxalasa I, en donde la célula comprende una o más modificaciones genéticas que resultan en una disminución de la actividad de aldosa reductasa en la célula.

2. Una célula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido heterólogo tiene actividad de glioxalasa I.

3. Una célula de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la célula comprende una o más modificaciones genéticas que resultan en:

(a) un aumento en el transporte de xilosa en la célula;

(b) un aumento en la actividad de xilulosa quinasa;

(c) un aumento en el flujo a través de la vía de pentosas fosfato;

(d) una disminución en la sensibilidad a la represión por catabolito;

(e) un aumento en la tolerancia a etanol, osmolaridad o ácidos orgánicos; o

(f) una producción reducida de subproductos.

4. Una célula de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la o las modificaciones genéticas dan como resultado la sobreexpresión de al menos un gen que codifica una enzima de la parte no oxidativa de la vía de pentosas fosfato.

5. Una célula de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el gen es un gen que codifica una ribulosa-5-fosfato isomerasa, una ribulosa-5-fosfato epimerasa, una transcetolasa o una transaldolasa.

6. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde la o las modificaciones genéticas dan como resultado la sobreexpresión de un gen que codifica una xilulosa quinasa.

7. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 que tiene la capacidad de usar L-arabinosa, en donde los genes TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1 están sobreexpresados.

8. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la región codificante del gen GRE3 está inactivada por reemplazo de la región codificante por una secuencia de nucleótidos que comprende los genes TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1.

9. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde se expresan los genes araA, araB y araD.

10. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde uno o más genes expresados constitutivamente o sobreexpresados constitutivamente son integrados establemente al genoma de la célula.

11. Un proceso para producir un producto de fermentación, comprendiendo el proceso fermentar un medio que contiene una fuente de xilosa y/o arabinosa con una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 tal que la célula fermenta xilosa al producto de fermentación.

12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el producto de fermentación se elige de la lista que incluye etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacónico, un aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, un antibiótico p-lactámico y una cefalosporina.

13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el producto de fermentación es etanol.

14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en donde el proceso es anaeróbico.