BR112015008370A2 - células com conversão de pentose melhorada - Google Patents

Abstract

células com conversão de pentose melhorada, processo para a produção de um produto da fermentação, vetor de clonagem ou expressão, constructo e polinucleotídeo a invenção refere-se a uma célula capaz de converter um ou mais açúcares de pentose e um ou mais açúcares hexose em produto de fermentação que expressa constitutivamente um ou mais polipeptídeos heterólogos ou homólogos tendo a sequência de aminoácidos ilustrada na seq id no: 20, ou um polipeptídeo variante correspondente tendo pelo menos 45% de identidade com seq id no 20. em uma modalidade o polipeptídeo heterólogo tem atividade de glioxalase.

Description

CÉLULAS COM CONVERSÃO DE PENTOSE MELHORADA, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DA FERMENTAÇÃO, VETOR DE CLONAGEM OU EXPRESSÃO, CONSTRUCTO E POLINUCLEOTÍDEO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção é direcionada a células com melhor conversão de pentose. Mais especificamente, a invenção refere-se a células que têm conversão melhorada de xilose e/ou L-arabinose. As células são úteis para a produção de produtos da fermentação, por exemplo, para a produção de etanol de açúcares que são derivados de material lignocelulósico.

FUNDAMENTAÇÃO DA INVENÇÃO

[002] Consumo em larga escala de combustíveis fósseis (combustíveis à base de petróleo) tradicionais nas últimas décadas tem contribuído para altos níveis de poluição. Isso, junto com a percepção de que o estoque mundial de combustíveis fósseis não é ilimitado e uma consciência ambiental crescente, tem estimulado novas iniciativas para estudar a viabilidade de combustíveis alternativos, tal como o etanol, que é uma fonte de combustível de queima livre de partículas que libera menos CO2 do que a gasolina sem chumbo em uma base por litro.

[003] Apesar do etanol derivado de biomassa possa ser produzido pela fermentação de açúcares hexose obtidos a partir de muitas fontes diferentes, os substratos normalmente utilizados para a produção em escala comercial de álcool como combustível, tais como cana-de-açúcar e amido de milho, são caros. Os aumentos na produção de álcool como combustível irão, por conseguinte, exigir a utilização de matérias-primas de baixo custo.

5/111

[004] Atualmente, somente matéria-prima lignocelulósica derivada de biomassa vegetal está disponível em quantidades suficientes para substituir as culturas atualmente utilizadas para a produção de etanol. Na maior parte do material lignocelulósico, o segundo açúcar mais comum açúcar, depois de glicose, é xilose. Além disso, a L-arabinose é um açúcar derivado de um material lignocelulósico. Assim, para um processo de produção do combustível economicamente viável, ambos os açúcares hexose e pentose devem ser fermentados para formar etanol. A levedura Saccharomyces cerevisiae é robusta e bem adaptada para a produção de etanol, mas é incapaz de produzir etanol a partir de xilose como fonte de carbono. Existe, portanto, uma necessidade de um organismo que possua estas propriedades, de forma a permitir a produção comercialmente viável de etanol a partir de matérias-primas de lignocelulose. A xilose isomerase de fungo anaeróbio Piromyces Sp.E2 foi introduzida em S. cerevisiae e altos níveis de atividades enzimáticas foram observados permitindo essa cepa crescer por via anaeróbia e produzir etanol a partir de xilose (W0 03/062340 e WO 06/009434). Tais cepas de leveduras pela primeira vez forneceram taxas específicas de consumo de xilose e formação de etanol que são compatíveis com a produção de etanol em uma escala comercial.

[005] No entanto, é ainda desejável melhorar a conversão de pentose e reduzir o tempo de fermentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Um objeto da invenção é fornecer células com uma melhor conversão de pentose. Outro objeto da invenção é fornecer cepas recombinantes que têm melhorado a conversão de xilose e/ou L-arabinose. Outro objeto consiste é fornecer 6/111 cepas que têm melhorado a conversão de xilose e/ou L- arabinose na presença de glicose. Outro objeto é reduzir o tempo de fermentação em fermentação de misturas de açúcar compreendendo hexose e pentose.

[007] Um ou mais destes objetos são alcançados de acordo com a invenção. De acordo com a presente invenção, é fornecida uma célula que expressa constitutivamente um polipeptídeo heterólogo ou homólogo, tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20 ou uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 27, ou uma variante da mesma tendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 45% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20.

[008] As células de acordo com os exemplos têm melhorado a conversão de pentose e levam à redução dos tempos de fermentação em fermentação de misturas de açúcar compreendendo pentose e hexose. Em uma modalidade, o polipeptídeo tem atividade de glioxalase.

[009] A invenção também fornece: - um processo para a produção de um produto da fermentação, cujo processo compreende a fermentação de um meio contendo uma fonte de xilose e ou L-arabinose com uma célula da invenção, tal que a célula fermenta xilose e/ou L- arabinose no produto de fermentação; - a utilização de uma célula da invenção em um processo para a produção de um produto de fermentação.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0010] Figura 1: Gráfico do cassete de expressão de GLO1 com o promotor PGK1 e terminador PGl1.

[0011] Figura 2: Mapa do plasmídeo pRN228 (ver 7/111 exemplos).

[0012] Figura 3: Mapa do plasmídeo pRN935 (ver exemplos).

[0013] Figura 4: Mapa do plasmídeo pRN685 (ver exemplos).

[0014] Figura 5: Mapa do plasmídeo pRN1048 (ver exemplos).

[0015] Figura 6: Mapa do plasmídeo pRN1129 (ver exemplos).

[0016] Figura 7: Mapa do vetor do tipo ponte de levedura pRN599 (ver exemplos).

[0017] Figura 8: Mapa do plasmídeo pRN1049.

[0018] Figura 9: Dados de expressão do gene. Expressão de fold normalizada para Cepas RN1001Epl e RN1001Gpl.

[0019] Figura 10: Curva de produção de CO2 para o crescimento de cepas RN1001Gpl (topo) e RN1001Epl (fundo).

[0020] Figura 11: Curva de crescimento de cepas RN1001Epl e RN1001Gpl mostrando o consumo de açúcar.

[0021] Figura 12: Mapa do plasmídeo pRN324.

[0022] Figura 13: Mapa do plasmídeo pRN1142.

[0023] Figura 14: Mapa mostrando sítio de integração no genoma de S. cerevisiae: sítio de Integração 1 (Chr XV, coordenadas 458319 pb 459320 pb). O mapa especificado é indicado pela região entre as duas linhas verticais tracejadas.

[0024] Figura 15: Esquema que mostra mecanismo de integração dos fragmentos de PCR (His ou His-Gio) no genoma de S. cerevisiae.

[0025] Figura 16: Expressão de dados do gene. Expressão de fold normalizada para GLO1 de cepas RN1041 (topo) e RN1216 8/111

(fundo).

[0026] Figura 17: Curva de produção de CO2 para o crescimento de cepas RN1041H, RN1041HG-1 e RN1041HG-2.

[0027] Figura 18: Curva de consumo de açúcar de cepas RN1041H (topo), RN1041HG-1 (meio) e RN1041HG-2 (fundo).

[0028] Figura 19: Curva de produção de CO2 para o crescimento de cepas RN1216H, RN1216HG-1 e RN1216HG-2.

[0029] Figura 20: Curva de consumo de açúcar de cepas RN1216H (topo), RN1216HG-1 (meio) e RN1216HG-2 (fundo) que mostra o consumo de açúcar.

[0030] Figura 21: Mapa do plasmídeo pDB1175 (ver exemplos).

[0031] Figura 22: Mapa do plasmídeo pDB1176 (ver exemplos).

[0032] Figura 23: Mapa do plasmídeo pDB1177 (ver exemplos).

[0033] Figura 24: Mapa do plasmídeo pOB1178 (ver exemplos).

[0034] Figura 25: Mapa do plasmídeo pRN1179 (ver exemplos).

[0035] Figura 26: Esquema que mostra mecanismo de integração de fragmentos de PCR no genoma de S. cerevisiae.

[0036] Figura 27: Curva de produção de CO2 para o crescimento de cepas RN1216 ScG_H, RN1216 CglaG_H, RN1216 ZrouG_H, RN1216 KIG_H, RN1216 CmagG_H e RN1216 H.

[0037] Figura 28: Curva de consumo de açúcar de cepa RN1216 ScG_H.

[0038] Figura 29: Curva de consumo de açúcar de cepa RN1216 CglaG_H.

[0039] Figura 30: Curva de consumo de açúcar de cepa 9/111

RN1216 ZrouG_H.

[0040] Figura 31: Curva de consumo de açúcar de cepa RN1216 KIG_H.

[0041] Figura 32: Curva de consumo de açúcar de cepa RN1216 CmagG_H.

[0042] Figura 33: Curva de consumo de açúcar de cepa RN1216 H. Breve descrição da listagem de sequências

[0043] SEQ ID NO 1: Promotor PGK1 de iniciador direto.

[0044] SEQ ID NO 2: Terminador PGI1 de iniciador reverso.

[0045] SEQ ID NO 3: Gene ACT1 do iniciador direto.

[0046] SEQ ID NO 4: Gene ACT1 do iniciador reverso.

[0047] SEQ ID NO 5: gene GLO1 do iniciador direto, Q- PCR.

[0048] SEQ ID NO 6: gene GLO1 do iniciador reverso, Q- PCR.

[0049] SEQ ID NO 7: gene ALG9 do iniciador direto, Q- PCR.

[0050] SEQ ID NO 8: gene ALG9 do iniciador reverso, Q- PCR.

[0051] SEQ ID NO 9: gene UBC6 do iniciador direto, Q- PCR.

[0052] SEQ ID NO 10: gene UBC6 do iniciador reverso, Q- PCR.

[0053] SEQ ID NO 11: cassete HIS3 do iniciador direto, flanco 5' INT1.

[0054] SEQ ID NO 12: cassete GLO1 do iniciador reverso, flanco 3' INT1.

[0055] SEQ ID NO 13: cassete HIS3 do iniciador direto, 10/111 flanco 3' INT1.

[0056] SEQ ID NO 14: flanco 5' INT1 do iniciador direto.

[0057] SEQ ID NO 15: flanco 5' INT1 do iniciador reverso.

[0058] SEQ ID NO 16: flanco 3' INT1 do iniciador direto.

[0059] SEQ ID NO 17: flanco 3' INT1 do iniciador reverso.

[0060] SEQ ID NO 18: Sequência de nucleotídeos do flanco 5' do sítio de integração INT1.

[0061] SEQ ID NO 19: Sequência de nucleotídeos do flanco 3' do sítio de integração INT1.

[0062] SEQ ID NO 20: Sequência de proteína do GLO1 de S. cerevisiae.

[0063] SEQ ID NO 21: Sequência de proteína do GLO1 de Candida glabrata.

[0064] SEQ ID NO 22: Sequência de proteína do GLO1 de Zygosaccharomyces rouxii.

[0065] SEQ ID NO 23: Sequência de proteína do GLO1 de Kluyveromyces lactis.

[0066] SEQ ID NO 24: Sequência de proteína do GLO1 de Candida magnoliae.

[0067] SEQ ID NO 25: Iniciador dianteiro do GLO1 ORF.

[0068] SEQ ID NO 26: Iniciador reverso do GL01 ORF Reversa.

[0069] SEQ ID NO 27: Sequência de nucleotídeos de GLO1 de S. cerevisiae.

[0070] SEQ ID NO 28: Iniciador dianteiro dos cassetes de expressão de GLO1 homólogo (incluindo o promotor e terminador).

[0071] SEQ ID NO 29: Iniciador reverso dos cassetes de 11/111 expressão de GLO1 homólogo (incluindo o promotor e terminador).

[0072] SEQ ID NO: 30: Iniciador dianteiro do cassete HIS3, que consiste de 20 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 3' dos cassetes de expressão de GLO1 homólogo.

[0073] SEQ ID NO 31: Iniciador reverso do cassete HIS3, que consiste de 20 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 5' do flanco 3' de 500 pb INT1.

[0074] SEQ ID NO 32: Iniciador reverso do flanco 5' de 500 pb INT1, que consiste de 23 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 5' de cassetes de expressão de GL01 homólogo.

[0075] SEQ ID NO 33: Iniciador dianteiro do flanco 5' de 500 pb INT1, que consiste de 24 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 3' de cassetes de expressão de HIS3.

[0076] SEQ ID NO 34: Sequência de nucleotídeos otimizada com par de códon de GL01 de S. cerevisiae.

[0077] SEQ ID NO 35: Sequência de nucleotídeos otimizada com par de códon de GL01 de Candida glabrata.

[0078] SEQ ID NO 36: Sequência de nucleotídeos otimizada com par de códon de GL01 de Candida magnoliae.

[0079] SEQ ID NO 37: Sequência de nucleotídeos otimizada com par de códon de GL01 de Kluyveromyces lactis.

[0080] SEQ ID NO: 38: Sequência de nucleotídeos otimizada com par de códon de GL01 de Zygosaccharomyces 12/111 rouxii.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0081] Ao longo do presente relatório e as reivindicações em anexo as palavras "compreendem" e "incluem" e variações tais como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" devem ser interpretados inclusivamente. Ou seja, estas palavras pretendem transmitir a possível inclusão de outros elementos ou inteiros não especificamente descritos, onde o contexto permita.

[0082] De acordo com a invenção, a célula pode compreender uma atividade de glioxalase, preferivelmente uma atividade de glioxalase I. Glioxalase 1 (GL01) é um gene que codifica glioxalase I (EC 4.4.1.5), que está envolvida no catabolismo de metilglioxal (2). Metilglioxal é um composto tóxico formado como um subproduto da glicólise.

[0083] Nomes alternativos para glioxalase são, por exemplo, lactoilglutationa liase, aldocetomutase, cetona- aldeído mutase, metilglioxalase, S-D-lactoilglutationa, metilglioxal liase.

[0084] Um método de catabolismo de metilglioxal compreende um sistema de glioxalase em que metilglioxal é condensado com a glutationa por Glo1p para produzir S-D- lactoilglutationa. Esse glutationa tioéster é então hidrolisado em ácido lático e glutationa pela glioxalase II (Glo2p e Glo4p). Expressão de GL01 é induzida por metilglioxal e é especificamente induzida por stress osmótico em um glicerol (Hog1p) de alta osmolaridade-proteína (MAP) quinase de maneira dependente ativada por mitógenos (1).

[0085] Deleção de GL01 resulta em hipersensibilidade a metilglioxal. Em S. cerevisiae, glioxalase I (Glo1p) é nativa 13/111 e ocorre é um monômero. Esse sistema mostra muitas das características típicas das enzimas que eliminam toxinas endógenas. Em primeiro lugar, em contraste com a faixa de substratos surpreendentes de muitas das enzimas envolvidas no metabolismo xenobiótico, isso mostra a especificidade estreita do substrato. Em segundo lugar, tióis intracelulares são requeridos como parte de seu mecanismo enzimático e em terceiro lugar, o sistema atua para reciclar metabólitos reativos de volta para uma forma que pode ser útil para o metabolismo celular.

[0086] Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma célula que expressa uma glioxalase, em que a sequência de aminoácidos da glioxalase tem pelo menos 45% de identidade com a sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID NO: 20 e que a sequência de nucleotídeos é homóloga ou heteróloga constitutivamente integrada à célula. Sequência de polinucleotídeos/aminoácidos

[0087] A célula da invenção é definida com referência a uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: ou uma sequência tendo pelo menos 45% de identidade da sequência com esta. Em uma modalidade, a proteína tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou, pelo menos, cerca de 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20.

[0088] Em uma modalidade, a célula compreende e/ou expressa um polipeptídeo tendo aminoácidos H, E, H e que 14/111 correspondem às posições H25, E89, E318 e H269 e/ou H185, E242, E163 e H117 na SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade, a célula compreende e/ou expressa um polipeptídeo tendo um fragmento de (E, s, d)-L-X-(H,Y)-(N,s) que corresponde ao fragmento E242-L243-X-H245-N246 na SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade a célula compreende e/ou expressa um polipeptídeo tendo um fragmento de G-(F,Y)-GH correspondente ao fragmento G266-Y267-G268-H269 na SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade a célula compreende e/ou expressa um polipeptídeo tendo um fragmento GX(6)-(F,i)-X (2,3)-D-X(3)-Y correspondente ao fragmento G301-X(6)-F308-X (2)-D311-X(3)-Y315 na SEQ ID NO:

20.

[0089] No acima, os aminoácidos são indicados por uma letra de código. X é qualquer aminoácido; aminoácido (X,Y) X ou Y; X(y) um número y de aminoácidos X e X(y,z) de um número y ou z de aminoácidos X. Código de letra pequeno indica um aminoácido que tem menor ocorrência.

[0090] Em uma modalidade a célula compreende e/ou expressa um polipeptídeo contendo a atividade de glioxalase.

[0091] Uma célula de acordo com a presente invenção pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica uma glioxalase tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 27 ou uma sequência que tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, em menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, de preferência pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos 15/111

75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de ácidos nucleicos ilustrada na SEQ ID NO: 27.

[0092] Por conseguinte, a invenção fornece células com sequências de polinucleotídeos compreendendo o gene que codifica o polipeptídeo de glioxalase, assim como a sua sequência de codificação.

[0093] Os polinucleotídeos da invenção podem ser isolados ou sintetizados. Os polipeptídeos de glioxalase e polinucleotídeos de glioxalase aqui podem ser polipeptídeos sintéticos, respectivamente polinucleotídeos. Os polinucleotídeos sintéticos podem ser otimizados no uso de códons, preferivelmente de acordo com os métodos descritos em WO2006/077258 e/ou PCT/EP2007/055943, que são aqui incorporados por referência. PCT/EP2007/055943 endereça otimização do par de códon.

[0094] O termo refere-se a uma molécula de polinucleotídeo, que é uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA), ou de cadeia simples ou de cadeia dupla. Um polinucleotídeo pode estar presente ou na forma isolada, ou ser compreendido em moléculas ou vetores de ácidos nucleicos recombinantes, ou ser compreendido em uma célula hospedeira.

[0095] O termo "polipeptídeo" é usado aqui para cadeias contendo mais de sete resíduos de aminoácidos. Todas as fórmulas ou sequências de oligopeptídeo ou peptídeo aqui são escritas da esquerda para a direita e no sentido do término amino para término carboxila. O código de uma letra dos 16/111 aminoácidos usados aqui é comumente conhecido na técnica.

[0096] Por polipeptídeo ou proteína "isolado" é intencionado um polipeptídeo ou proteína removidos do seu ambiente nativo. Por exemplo, polipeptídeos e proteínas produzidos de forma recombinante, expressos em células hospedeiras são considerados isolados para o propósito da invenção como são os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram substancialmente purificados por qualquer técnica adequada tal como, por exemplo, o método de purificação de uma etapa descrito em Smith e Johnson, Gene 67: 31-40 (1988).

[0097] Os polinucleotídeos da presente invenção, tal como um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de glioxalase, podem ser isolados ou sintetizados utilizando técnicas de biologia molecular convencionais e a informação de sequência aqui fornecida.

[0098] O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de glioxalase da invenção pode ser amplificado usando DNA, RNAm ou, alternativamente, DNA genômico, como um molde e os iniciadores de oligonucleotídeos apropriados de acordo com técnicas convencionais de amplificação por PCR. O ácido nucleico assim amplificado pode ser clonado em um vetor adequado e caracterizado pela análise da sequência de DNA. Cinética enzimática

[0099] Enzimas são catalisadores de proteína que, como todos os catalisadores, aceleram a velocidade de uma reação química sem ser utilizados no processo.

[00100] Elas atingem seu efeito ligando temporariamente ao substrato e, ao fazê-lo, diminuem a energia de ativação necessária para convertê-lo em um produto.

[00101] A taxa pela qual uma enzima funciona é 17/111 influenciada por vários fatores, por exemplo, a concentração de moléculas de substrato (designada [S], expressa em unidades de molaridade), a temperatura, a presença de inibidores (inibidores competitivos se ligando no mesmo sítio como o substrato ou inibidores não competitivos se ligando a outro sítio na enzima reduzindo o seu poder catalítico), pH, e o semelhante.

[00102] Cinética da enzima estuda e descreve a taxa na qual as enzimas funcionam. Existem muitos métodos de medição. A enzima converte o substrato em produto a uma taxa inicial que é aproximadamente linear durante um curto período após o início da reação. Conforme a reação procede e o substrato é consumido, a taxa continuamente desacelera, conforme o substrato ainda está presente em níveis saturantes. Para medir a taxa inicial (e máxima), ensaios enzimáticos são tipicamente realizados enquanto a reação tem progredido apenas poucos percentuais para a conclusão total. A duração do período inicial da taxa depende, entre outros, das condições do ensaio.

[00103] O estudo da cinética da enzima é importante por duas razões básicas. Em primeiro lugar, ajuda a explicar como as enzimas funcionam, e em segundo lugar, ajuda a prever como se comportam as enzimas em organismos vivos. As constantes cinéticas, Km e Vmax, são fundamentais para tentativas de compreender como as enzimas funcionam juntamente para controlar o metabolismo.

[00104] A constante de Michaelis Km experimentalmente é definida como a concentração à qual a taxa de reação da enzima é metade Vmax. Vmax é a velocidade máxima que a enzima catalisa a reação: conforme [S] fica maior, a enzima torna-se 18/111 saturada com o substrato e a taxa atinge Vmax, taxa máxima da enzima.

[00105] Km é (mais ou menos) uma medida inversa da afinidade ou a força de ligação entre a enzima e o seu substrato. Quanto mais baixo o valor de Km (em mM), maior for a afinidade, consequentemente, menor a concentração de substrato necessária para alcançar uma determinada taxa. A célula hospedeira

[00106] A célula hospedeira pode ser qualquer célula hospedeira adequada para a produção de um produto útil. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula adequada, tal como uma célula procariótica, tal como uma bactéria ou uma célula eucariótica. Tipicamente, a célula irá ser uma célula eucariótica, por exemplo, uma levedura ou um fungo filamentoso. A célula hospedeira é capaz de converter um ou mais açúcares de pentose, tal como a L-arabinose ou xilose em produto de fermentação.

[00107] A célula hospedeira pode ser uma bactéria. Em uma modalidade a bactéria é geneticamente modificada para a conversão de pentose. Em uma modalidade a bactéria não é a Escherichia coli (E.coli). Um exemplo de uma bactéria que é um hospedeiro adequado para a aplicação da invenção é Zymomonas mobilis geneticamente modificada. Tal cepa é, por exemplo, descrita em Yanna et al, Appl Microbial Biotechnol. 2012 Jun; 94 (6): 1667-78.

[00108] O hospedeiro para a invenção pode ser levedura (geneticamente desenhada). Engenharia genética é a seguir descrita em detalhe. As leveduras são aqui definidas como microrganismos eucarióticos e incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Alexopoulos, C. J. 30, 1962, em: 19/111

Inductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque) que predominantemente crescem em forma unicelular.

[00109] As leveduras podem crescer ou por brotamento de um talo unicelular ou podem crescer por fissão do organismo. Uma levedura preferida como uma célula hospedeira transformada pode pertencer aos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia. De preferência, a levedura é aquela capaz de fermentação anaeróbica, mais preferivelmente aquela capaz de fermentação alcoólica anaeróbica.

[00110] Em uma modalidade a célula hospedeira é levedura.

[00111] De preferência, o hospedeiro é um hospedeiro industrial, mais preferivelmente uma levedura industrial. Um hospedeiro industrial e célula de levedura industrial podem ser definidos como se segue. Os ambientes de vida das células de levedura em processos industriais são significativamente diferentes do que no laboratório. Células de levedura industrial devem ser capaz de funcionar bem sob várias condições ambientais que podem variar durante o processo. Tais variações incluem as alterações em fontes de nutrientes, pH, concentração de etanol, temperatura, concentração de oxigênio, etc., que em conjunto têm impacto potencial sobre o crescimento celular e a produção de etanol de Saccharomyces cerevisiae. Em condições industriais adversas, as cepas tolerantes ambientais devem permitir um crescimento e produção robustos. Cepas de leveduras industriais são geralmente mais robustas em relação a estas mudanças nas condições ambientais que podem ocorrer nas aplicações em que elas são usadas, como na indústria de cozimento, a indústria 20/111 cervejeira, vinificação e indústria do etanol. Exemplos de levedura industrial (S. cerevisiae) são Ethanol Red® (Fermentis) Fermiol® (DSM) e Thermosacc® (Lallemand).

[00112] Em uma modalidade o hospedeiro é inibidor tolerante. As células hospedeiras tolerantes inibidoras podem ser selecionadas pela avaliação de cepas para crescimento ou inibidores contendo materiais, tal como ilustrado na Kadar et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847- 858, em que uma cepa de S. cerevisiae tolerante inibidora ATCC 26602 foi selecionada. Transformação

[00113] Os polinucleotídeos de acordo com a invenção podem ser expressos em um hospedeiro adequado. Por conseguinte, podem ser utilizadas técnicas padrão de transformação.

[00114] A invenção refere-se ainda a um construto de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo como descrito antes, por exemplo, um vetor.

[00115] Outro aspecto da invenção refere-se, assim, a vetores, incluindo vetores de clonagem e de expressão, compreendendo um polinucleotídeo da invenção que codifica uma proteína do polipeptídeo de glioxalase ou um equivalente funcional do mesmo e métodos de crescimento, transformação ou transfecção de tais vetores em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, sob condições em que a expressão de uma glioxalase da invenção ocorre. Como aqui utilizado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual ela foi ligada.

[00116] Os polinucleotídeos da invenção podem ser 21/111 incorporados em um vetor recombinante replicável, por exemplo, um vetor de clonagem ou expressão. O vetor pode ser usado para replicar o ácido nucleico em uma célula hospedeira compatível. Assim, em outra modalidade, a invenção fornece um método de preparação de polinucleotídeos da invenção através da introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível e crescimento da célula hospedeira sob condições que levam à replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. As células hospedeiras adequadas são descritas abaixo.

[00117] Será observado por aqueles versados na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejado, etc. Os vetores, tais como vetores de expressão, da presente invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para desse modo produzir proteínas ou peptídeos, codificados por ácidos nucleicos como aqui descrito. Os vetores, tais como vetores de expressão recombinantes, da invenção podem ser concebidos para expressão de proteínas de polipeptídeo de glioxalase em células procarióticas ou eucarióticas.

[00118] Por exemplo, polipeptídeos de glioxalase podem ser expressos em células bacterianas tais como E.coli, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), fungos filamentosos, células de levedura ou células de mamíferos. As células hospedeiras adequadas são discutidas ainda em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Os exemplos representativos de hospedeiros adequados 22/111 são descritos a seguir.

[00119] Os meios de cultura e condições apropriadas para as células hospedeiras acima descritos são conhecidos na técnica.

[00120] Para a maioria dos fungos filamentosos e leveduras, o vetor ou construto de expressão é, de preferência, integrado no genoma da célula hospedeira, a fim de obter transformantes estáveis. No entanto, para certas leveduras vetores epissômicos adequados também estão disponíveis em que o construto de expressão pode ser incorporado para expressão estável e de alto nível, os exemplos destes incluem vetores derivados dos plasmídeos 2µ e pKD1 de Saccharomyces e Kluyveromyces, respectivamente, ou vetores contendo uma sequência AMA (por exemplo, AMA1 de Aspergillus). No caso dos construtos de expressão serem integrados no genoma das células hospedeiras, os construtos são integrados em local randomizado no genoma, ou em local alvo pré-determinado usando recombinação homóloga, caso no qual o local alvo compreende preferivelmente um gene altamente expresso.

[00121] Por conseguinte, os vetores de expressão úteis na presente invenção incluem vetores derivados de cromossomo, epissomais e de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófagos, epissoma de leveduras, elementos cromossômicos de levedura, vírus tais como baculovírus, vírus papova, vírus vaccinia, adenovírus, vírus pox de galinha, vírus da pseudo-raiva e retrovírus, e vetores derivados de combinações destes, tais como os derivados de elementos genéticos de plasmídeos e bacteriófagos, como cosmídeos e fagemídeos.

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[00122] O vetor pode ainda incluir sequências que flanqueiam o polinucleotídeo dando origem ao RNA que compreende sequências homólogas às sequências genômicas eucarióticas ou sequências genômicas virais. Isso permitirá a introdução dos polinucleotídeos da invenção no genoma de uma célula hospedeira.

[00123] Um vetor de clonagem integrativa pode integrar em um local alvo pré-determinado ou randômico no cromossoma (s) da célula hospedeira em que é para ser integrado.

[00124] O sistema do vetor pode ser um único vetor, tal como um plasmídeo único, ou dois ou mais vetores, tais como dois ou mais plasmídeos, que em conjunto contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira.

[00125] O vetor pode conter um polinucleotídeo da invenção orientado em uma direção anti-sentido para fornecer a produção de RNA anti-sentido.

[00126] DNA do vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de técnicas de transformação ou transfecção convencionais. Tais como aqui utilizados, os termos "transformação" e "transfecção" são intencionados para referir-se a uma variedade de técnicas reconhecidas na arte para a introdução de ácido nucleico estrangeiro (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transdução, infeção, lipofecção, transfecção mediada por lipídeos catiônicos ou eletroporação. Métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook, et al., (Molecular Clining: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold 24/111

Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) e outros manuais de laboratório.

[00127] O polinucleotídeo de acordo com a invenção é constitutivamente expresso. Aqui, o termo "constitutivo", usualmente em relação à célula hospedeira, significa que o polinucleotídeo não está presente (ou não somente), uma vez que está presente naturalmente no hospedeiro. Nesse sentido, pode também ser explicado como que o polinucleotídeo é trazido para dentro da célula através intervenção humana. Uma característica do gene expresso constitutivo é que o gene está transcrito contínuamente, independentemente das condições de crescimento, tais como a fonte de carbono ou a fase de crescimento das células. O polinucleotídeo pode ser heterólogo ao genoma da célula hospedeira. O termo "heterólogo", usualmente em relação à célula hospedeira, significa que o polinucleotídeo não ocorre naturalmente no genoma da célula hospedeira ou que o polipeptídeo não é naturalmente produzido por aquela célula.

[00128] O polinucleotídeo pode ser homólogo ao genoma da célula hospedeira. O termo "homólogo", usualmente em relação à célula hospedeira, significa que o polinucleotídeo ocorre naturalmente no genoma da célula hospedeira ou que o polipeptídeo é produzido naturalmente por aquela célula.

[00129] Em outra modalidade, a invenção apresenta células, por exemplo, células hospedeiras transformadas ou células hospedeiras recombinantes que contêm um ácido nucleico abrangido pela invenção. Uma "célula transformada" ou "célula recombinante" é uma célula na qual (ou em um ancestral do qual) foi introduzida por meio de técnicas de 25/111

DNA recombinante, um ácido nucleico de acordo com a invenção. Ambas as células procarióticas e eucarióticas são incluídas, por exemplo, bactérias, fungos, leveduras, e o semelhante, especialmente preferidas são células de levedura incluindo, por exemplo, Saccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae.

[00130] Uma célula hospedeira pode ser escolhida que modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto do gene em um modo específico desejado. Tais modificações (p.ex., glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem facilitar o funcionamento ótimo da proteína.

[00131] Várias células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para processamento pós- translacional e modificação de proteínas e produtos de genes. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados familiares daqueles versados na técnica de biologia molecular e/ou microbiologia podem ser escolhidos para assegurar a modificação correta e desejada e o processamento da proteína estrangeira expressa. Para esse fim, as células hospedeiras eucarióticas que possuam a maquinaria celular para o processamento adequado do transcrito primário, glicosilação, e fosforilação do produto do gene podem ser utilizadas. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na técnica.

[00132] Se desejado, uma célula tal como descrita acima pode ser utilizada para a preparação de um polipeptídeo de acordo com a invenção. Tal método normalmente compreende o cultivo de uma célula hospedeira (por exemplo, transformadas ou transfectadas com um vetor de expressão como descrito acima) sob condições para fornecer a expressão (pelo vetor) 26/111 de uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo, e opcionalmente recuperar o polipeptídeo expresso. Os polinucleotídeos da invenção podem ser incorporados em um vetor recombinante replicável, por exemplo, um vetor de expressão. O vetor pode ser usado para replicar o ácido nucleico em uma célula hospedeira compatível. Assim, em outra modalidade, a invenção fornece um método para fazer um polinucleotídeo da invenção através de introdução de um polinucleotídeo da invenção em um vetor replicável, introdução do vetor em uma célula hospedeira compatível e crescimento da célula hospedeira sob condições que levam à replicação do vetor. O vetor pode ser recuperado a partir da célula hospedeira.

[00133] Os vetores podem ser transformados ou transfectados para uma célula hospedeira adequada como descrito acima, para fornecer a expressão de um polipeptídeo da invenção. Esse processo pode compreender a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão como descrito acima sob condições para fornecer a expressão pelo vetor de uma sequência de codificação que codifica o polipeptídeo.

[00134] Técnicas de isolamento, hibridação, transformação e clonagem padrões (por exemplo, como descritas em Sambrook, J., Fritsh, EF, e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Homologia & Identidade

[00135] As sequências de aminoácidos ou nucleotídeos são consideradas homólogas ao exibir um certo nível de 27/111 similaridade. Duas sequências sendo homólogas indicam uma origem evolutiva comum. Se duas sequências homólogas estão intimamente relacionadas ou mais distantemente relacionadas é indicado por "percentagem de identidade" ou "por cento de similaridade", que é alta ou baixa, respectivamente. Embora contestado, para indicar "a percentagem de identidade" ou "por cento de similaridade", "nível de homologia" ou "percentagem de homologia" é frequentemente utilizado alternadamente.

[00136] Uma comparação das sequências e determinação da percentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. A pessoa versada estará ciente do fato de que vários programas de computador diferentes estão disponíveis para alinhar duas sequências e determinar a homologia entre duas sequências (Kruskal, JB (1983) Na orverview of sequence comparison em D. Sankoff e Kruskal JB, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). A percentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências. (Needleman, SB e Wunsch, CD (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). O algoritmo alinha sequências de aminoácidos, bem como sequências de nucleotídeos. O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para o propósito dessa invenção o programa NEEDLE do pacote EMBOSS foi utilizado (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P Longden e Bleasby, A Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, 28/111 http://emboss.bioinformatics.nl/). Para sequências de proteínas, EBLOSUM62 é utilizado para a matriz de substituição. Para as sequências de nucleotídeos, EDNAFULL é usado. Outras matrizes podem ser especificadas. Os parâmetros opcionais utilizados para o alinhamento de sequências de aminoácidos são uma penalidade de intervalo aberto de 10 e uma penalidade de extensão de intervalo de 0,5. A pessoa versada irá observar que todos esses parâmetros diferentes irão produzir resultados ligeiramente diferentes, mas que a percentagem de identidade total de duas sequências não é significativamente alterada ao utilizar diferentes algoritmos. Definição da homologia global

[00137] A homologia ou identidade é a percentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências completas sobre a região total alinhada incluindo eventuais lacunas ou extensões. A homologia ou identidade entre as duas sequências alinhadas é calculada como se segue: Número de posições correspondentes no alinhamento mostrando um aminoácido idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento incluindo as lacunas. A identidade definida como aqui pode ser obtida a partir de NEEDLE e é rotulada na saída do programa como "identidade". Definição da identidade mais longa

[00138] A homologia ou identidade entre as duas sequências alinhadas é calculada como segue: Número de posições correspondentes no alinhamento mostrando um aminoácido idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após subtração do número total de lacunas no alinhamento. A identidade, tal como aqui 29/111 definida, pode ser obtida de NEEDLE usando a opção NOBRIEF e é rotulado na saída do programa como "identidade mais longa".

[00139] Com a identidade com a SEQ ID NO: 20 como aqui definido acima uma visão de aminoácidos GL01 que são ativos nas células de acordo com a invenção é fornecida na tabela 1. Tabela 1: Visão geral de aminoácidos GL01 ativos na célula de acordo com a invenção (ver exemplos) e a identidade com GL01 de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 20). Fonte de GLO1 % de identidade SEQ ID NO com SEQ ID NO: 20 Saccharomyces 100 20 cerevisiae Candida glabrata 69 35 Kluyveromyces 61 37 lactis Zygosaccharomyces 67 38 rouxii Candida magnoliae 45 36

[00140] Portanto, em uma modalidade o nucleotídeo ou amino ácido de GL01 é derivado de um micro-organismo escolhido do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Kluyveromyces lactis, Zygosaccharomyces rouxii e Candida magnoliae.

[00141] Em uma modalidade o nucleotídeo ou aminoácido de GL01 é derivado de um micro-organismo escolhido do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Kluyveromyces lactis, e Candida magnoliae.

[00142] Em uma modalidade, o nucleotídeo de GLO é uma 30/111 sequência de nucleotídeo otimizada com par de códons, em que a sequência é SED ID NO: 34, SED ID NO: 35, SED ID NO: 36, SED ID NO: 37, SED ID NO: 38.

[00143] Em uma modalidade, o nucleotídeo de GLO é uma sequência de nucleotídeo otimizada com par de códons, em que a sequência é SED ID NO: 34, SED ID NO: 35, SED ID NO: 36, ou SED ID NO: 37.

[00144] As várias modalidades da invenção aqui descritas podem ser combinadas cruzadamente. A invenção refere-se a uma célula de acordo com a reivindicação 1. Tal célula é aqui também designada como célula hospedeira transformada. Suas modalidades são agora descritas.

[00145] A célula é capaz de utilizar a L-arabinose e xilose. Em uma modalidade, a célula é capaz de converter a L- arabinose em L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo, um daqueles aqui mencionados.

[00146] Organismos, por exemplo, cepas de S. cerevisiae, capazes de produzir etanol a partir de L-arabinose podem ser produzidas por modificação de uma célula hospedeira que introduz os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L- ribuloquinase) e araD (L-ribulose-5-P4-epimerase) genes de uma fonte adequada. Tais genes podem ser introduzidos em uma célula hospedeira, de modo que eles são capazes de utilização de arabinose. Tal abordagem é fornecida é descrita em W02003/095627. Genes araA e araD de Lactobacillus plantarum podem ser usados e são revelados em W02008/041840. O gene araA de Bacillus subtilis e os genes araB e araD de Escherichia coli podem ser usados e são descritos em EP

1.499.708. Em outra modalidade, os genes araA, araB e araD 31/111 podem ser derivados de, pelo menos um dos gêneros Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular um de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens, e/ou Gramella forsetii, como descrito em WO 2009011591.

[00147] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada pode também compreender uma ou mais cópias do gene de xilose isomerase e/ou uma ou mais cópias de xilose redutase e/ou xilitol desidrogenase.

[00148] O número de cópias pode ser determinado pela pessoa versada por qualquer método conhecido. Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada é capaz de fermentar glicose, arabinose, xilose e galactose.

[00149] Em uma modalidade, a célula é capaz de converter 90% ou mais de glicose, xilose, arabinose, galactose e manose disponíveis em um produto de fermentação. Em uma modalidade, a célula é capaz de converter 91% ou mais, 92% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, ou 100% de toda glicose, xilose arabinose, galactose e manose disponíveis em um produto de fermentação.

[00150] Em uma modalidade da invenção, a célula hospedeira transformada é capaz de fermentar um ou mais açúcar adicional, de preferência, açúcar C5 e/ou C6, por exemplo, manose. Em uma modalidade da invenção, a célula hospedeira transformada compreende um ou mais dos seguintes: um gene xylA, gene XYL1 e gene XYL2 e/ou gene XKS1, para permitir que a célula hospedeira transformada fermente xilose; deleção do gene da aldose redutase (GRE3); superexpressão de genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKl1 para permitir o aumento do fluxo através da via da pentose fosfato na célula.

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[00151] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada é uma célula industrial, mais preferivelmente uma levedura industrial (como aqui definida acima, na seção hospedeiro).

[00152] Em uma modalidade a célula hospedeira transformada é inibidora tolerante. Inibidora tolerante é resistente a compostos inibidores. A presença e o nível de compostos inibidores em lignocelulose podem variar amplamente com variação de matéria-prima, método de pré-tratamento, processo de hidrólise. Exemplos de categorias de inibidores são ácidos carboxílicos, furanos e/ou compostos fenólicos. Exemplos de ácidos carboxílicos são ácido lático, ácido acético ou ácido fórmico. Exemplos de furanos são furfural e hidroxi- metilfurfural. Exemplos de compostos fenólicos são vanilina, ácido siringico, ácido ferúlico e ácido cumárico. As quantidades típicas de inibidores são para ácidos carboxílicos: vários gramas por litro, até 20 gramas por litro ou mais, dependendo da matéria-prima, o pré-tratamento e as condições de hidrólise. Para furanos: várias centenas de miligramas por litro até vários gramas por litro, dependendo da matéria-prima, o pré-tratamento e as condições de hidrólise.

[00153] Para fenólicos: várias dezenas de miligramas por litro até um grama por litro, dependendo da matéria-prima, o pré-tratamento e as condições de hidrólise.

[00154] As células hospedeiras transformadas de acordo com a invenção podem ser inibidoras tolerantes, isto é, elas podem suportar inibidores comuns ao nível que elas têm tipicamente têm com condições de pré-tratamento e hidrólise comuns, de modo que as células hospedeiras transformadas 33/111 podem encontrar uma vasta aplicação, ou seja, tem alta aplicabilidade para matéria-prima diferente, diferentes métodos de pré-tratamento e diferentes condições de hidrólise.

[00155] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada industrial é construída com base em uma célula hospedeira inibidora tolerante, em que a construção é realizada como descrito a seguir. As células hospedeiras inibidoras tolerantes podem ser selecionadas as cepas para crescimento em materiais contendo inibidores, tal como ilustrado em Kadar et al, Appl. Biochem. Biotechnol. (2007), Vol. 136-140, 847-858, em que uma cepa de S. cerevisiae inibidora tolerante ATCC 26602 foi selecionada.

[00156] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada é livre de marcador. Como aqui utilizado, o termo "marcador" refere-se a um gene que codifica um traço ou um fenótipo que permite a seleção de, ou seleção, de uma célula hospedeira contendo o marcador. Livre de marcador significa que os marcadores estão essencialmente ausentes na célula hospedeira transformada. Ser livre de marcador é particularmente vantajoso quando os marcadores antibióticos têm sido utilizados na construção da célula hospedeira transformada e são removidos subsequentemente. A remoção dos marcadores pode ser feita usando qualquer técnica adequada da arte anterior, por exemplo, recombinação intramolecular. Um método adequado de remoção do marcador é ilustrado nos exemplos.

[00157] Uma célula hospedeira transformada pode ser capaz de converter biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, amido, derivados de amido, por exemplo, em açúcares 34/111 fermentáveis. Assim, uma célula hospedeira transformada pode expressar uma ou mais enzimas tais como uma celulase (uma endocelulase ou um exocelulase), uma hemicelulase (uma endo- ou exo-xilanase ou arabinase) necessária para a conversão da celulose em monômeros de glicose e xilose em monômeros de hemicelulose e arabinose, uma pectinase capaz de converter pectinas em ácido glucurônico e ácido galacturônico ou uma amilase para converter o amido em monômeros de glicose.

[00158] A célula hospedeira transformada pode ainda compreender aquelas atividades enzimáticas necessárias para a conversão de açúcar em um produto de fermentação desejado, tais como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi- propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido 20 cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico de β-lactama ou uma cefalosporina.

[00159] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada é uma célula que é naturalmente suscetível de fermentação alcoólica, de preferência, fermentação alcoólica anaeróbia. Uma célula hospedeira transformada de preferência tem uma elevada tolerância ao etanol, uma alta tolerância em baixo pH (isto é, capaz de crescimento em um pH menor do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, ou cerca de 2,5) e em direção a tolerância orgânica e/ou alta em altas temperaturas.

[00160] Qualquer das características ou atividades de uma célula hospedeira transformada acima pode estar naturalmente presente na célula ou pode ser introduzida ou alterada por modificação genética. Construção da célula hospedeira transformada 35/111

[00161] De acordo com uma modalidade, os genes podem ser introduzidos na célula hospedeira por introdução em uma célula hospedeira de um ou mais dos seguintes: a) os genes araA, araB e araD sob controle de um forte promotor constitutivo (s); b) PPP-genes TAL1, TKL1, RPE1 e RKl1, opcionalmente sob controlo de um ou mais fortes promotores constitutivos; c) deleção de um gene da aldose redutase; d) um gene xylA e um gene XKS1 sob o controle de um forte promotor constitutivo (s); e) um gene xylA sob controle de um forte promotor constitutivo, o qual tem a capacidade de se integrar no genoma de múltiplos locais; e evolução adaptativa para produzir a célula hospedeira transformada. A célula acima pode estar construída utilizando técnicas de expressão recombinante. Expressão recombinante

[00162] A célula hospedeira transformada é uma célula recombinante. Isto é, uma célula hospedeira transformada compreende ou é transformada com ou está geneticamente modificada com uma sequência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente na célula em questão.

[00163] Técnicas para a expressão recombinante de enzimas em uma célula, assim como para as modificações genéticas adicionais de uma célula hospedeira transformada são bem conhecidas daqueles versados na técnica. Tipicamente, tais técnicas envolvem a transformação de uma célula com construto de ácido nucleico compreendendo a sequência relevante. Tais métodos são, por exemplo, conhecidos de manuais padrão, tais como Sambrook e Russel (2001) "Molecular Cloning: A 36/111

Laboratory Manual (3ª edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel et al., eds, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing e Wiley lnterscience, Nova Iorque (1987). Métodos para a transformação e modificação genética de células hospedeiras são conhecidos, por exemplo, de EP-A 0.635.574, WO 98/46772, WO99/60102, WO 00/37671, W090/14423, EP-A-

0.481.008, EP-A-0.635.574 e US 6.265.186.

[00164] Tipicamente, o construto de ácido nucleico pode ser um plasmídeo, por exemplo, um plasmídeo de baixa cópia ou um plasmídeo de alta cópia. A célula de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou múltiplas cópias da sequência de nucleotídeos que codificam uma enzima, por exemplo, múltiplas cópias de um construto de nucleotídeos ou pelo uso de construto que tem múltiplas cópias da sequência enzimática.

[00165] O construto de ácido nucleico pode ser mantido epissomicamente e, assim, compreende uma sequência de replicação autônoma, tal como uma sequência de replicação autossômica. Um construto de ácido nucleico epissomal adequado pode, por exemplo, basear-se na levedura 2µ ou plasmídeos pKD1(Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968- 975), ou os plasmídeos de AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29: 482-489). Alternativamente, cada construto de ácido nucleico pode ser integrado em uma ou mais cópias no genoma da célula. A integração no genoma da célula pode ocorrer randomicamente por recombinação não homóloga, mas preferivelmente, o construto de ácido nucleico pode ser integrado no genoma da célula por recombinação homóloga como é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, W090/14423, EP- 37/111

A-0.481.008, EP-A-0.635.574 e US 6.265.186).

[00166] A maioria dos plasmídeos epissomais ou 2µ é relativamente instável em levedura, sendo perdida em aproximadamente 10-2 ou mais células após cada geração. Mesmo sob condições de crescimento seletivo, apenas 60% a 95% das células retêm o plasmídeo epissomal. O número de cópia da maioria dos plasmídeos epissomais varia 20-100 por célula de hospedeiros cir+. No entanto, os plasmídeos não são distribuídos igualmente entre as células, e há uma grande variação no número de cópias por célula em populações. As cepas transformadas com os plasmídeos integrativos são extremamente estáveis, mesmo na ausência de pressão seletiva. No entanto, a perda de plasmídeo pode ocorrer em aproximadamente 10-3 a 10-4 frequências por recombinação homóloga entre DNA continuamente repetido, levando ao laço da seqüência do vetor. Preferivelmente, o design do vetor no caso de integração estável é assim, que após a perda dos genes marcadores de seleção (que também ocorre por recombinação intramolecular, homóloga) em o laço do construto integrado já não é possível. De preferência, os genes são assim integrados estavelmente. A integração estável é aqui definida como a integração no genoma, em que o laço de construto integrado já não é possível. De preferência, marcadores de seleção estão ausentes. Tipicamente, a sequência de codificação da enzima será operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de ácidos nucleicos capaz de fornecer ou ajudar a transcrição e/ou tradução da sequência enzimática.

[00167] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma 38/111 relação que lhes permite funcionar no seu modo pretendido. Por exemplo, um promotor ou um potenciador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação do dito promotor ou potenciador afeta a transcrição da sequência de codificação.

[00168] Como aqui utilizado, o termo "promotor" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes localizado a montante relativamente à direção de transcrição do sítio de iniciação de transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para a RNA polimerase dependente de DNA, sítios de iniciação de transcrição e outras sequências de DNA conhecidas de uma pessoa versada. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maior parte das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" é um promotor que está ativo sob regulamentação ambiental ou de desenvolvimento.

[00169] O promotor que pode ser utilizado para conseguir a expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima de acordo com a presente invenção pode ser não nativo à sequência de nucleotídeos que codifica a enzima a ser expressa, isto é, um promotor que é heterólogo à sequência de nucleotídeos (sequência de codificação) para o qual está operacionalmente ligado. O promotor pode, no entanto, ser homólogo, isto é endógeno, à célula hospedeira.

[00170] Os promotores estão amplamente disponíveis e são conhecidos da pessoa versada. Os exemplos adequados de tais promotores incluem, por exemplo, promotores de genes glicolíticos, tais como promotores de fosfofrutoquinase (PFK), triose fosfato isomerase (TPI), gliceraldeído-3- 39/111 fosfato desidrogenase (GPO, TDH3 ou GAPDH), piruvato quinase (PYK), fosfoglicerato-quinase (PGK) de leveduras ou fungos filamentosos; mais detalhes sobre tais promotores de leveduras podem ser encontrados em (WO 93/03159). Outros promotores úteis são promotores de genes que codificam proteínas ribossomais, o promotor do gene da lactase (LAC4), promotores de álcool desidrogenase (ADH1, ADH4, e o semelhante), e o promotor da enolase (ENO). Outros promotores, ambos constitutivos e induzíveis, potenciadores ou sequências ativadoras a montante serão conhecidos daqueles versados na técnica. Os promotores usados nas células hospedeiras da invenção podem ser modificados, se desejado, para afetar suas características de controle. Os promotores adequados nesse contexto incluem ambos promotores constitutivos e indutíveis naturais, bem como os promotores modificados, que são bem conhecidos da pessoa versada na técnica. Os promotores adequados em células hospedeiras eucarióticas podem ser GAL7, GAL10, ou GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPOH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, EN01, TPl1, e AOX1. Outros promotores adequados incluem PDC1, GP01, PGK1, TEF1, e TDH3.

[00171] Em uma célula hospedeira transformada, a extremidade 3' da sequência de ácido nucleotídeo que codifica a enzima, de preferência, está operacionalmente ligada a uma sequência de terminação da transcrição. De preferência, a sequência de terminação é operável em uma célula hospedeira de escolha, tal como, por exemplo, as espécies de leveduras de escolha. Em qualquer caso, a escolha do terminador não é crítica; ela pode, por exemplo, ser de qualquer gene de levedura, embora, por vezes, terminadores podem funcionar a 40/111 partir de um gene, não eucariótico, de não levedura. Normalmente, uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima compreende um terminador. De preferência, tais terminadores são combinados com as mutações que impedem o decamimento de RNAm mediado não-sentido na célula hospedeira transformada (ver, por exemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161: 1465-1482).

[00172] A sequência de terminação da transcrição compreende ainda, preferivelmente, um sinal de poliadenilação.

[00173] Opcionalmente, um marcador selecionável pode estar presente em um construto de ácido nucleico adequado para utilização na invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "marcador" refere-se a um gene que codifica um traço ou um fenótipo que permite a seleção de, ou seleção, de uma célula hospedeira contendo o marcador. O gene marcador pode ser um gene de resistência à antibiótico em que o antibiótico apropriado pode ser utilizado para selecionar células transformadas entre as células que não são transformadas. Exemplos de marcadores de resistência a antibióticos adequados incluem, por exemplo, di-hidrofolato redutase, higromicina-β-fosfotransferase, 3'-O-fosfotransferase II (resistência à canamicina, neomicina e G418). Marcadores de resistência aos antibióticos podem ser mais convenientes para a transformação de células hospedeiras poliploides. Também marcadores de resistência a não-antibióticos podem ser usados, tais como marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2) ou o gene TPI de S. pombe (descrito por Russell PR, 1985, Gene 40: 125-130). Em uma modalidade preferida, as células hospedeiras transformadas com os construtos de ácido nucleico 41/111 são livres de gene marcador. Os métodos para a construção de células hospedeiras microbianas livres de gene marcador recombinante estão descritos em EP-A-0.635.574 e são baseados no uso de marcadores bidirecionais tal como o gene de A. nidulans amdS (acetamidase) ou os genes URA3 e LYS2 de levedura. Alternativamente, um marcador detectável tal como uma Proteína Fluorescente Verde, lacL, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase, beta-glucuronidase podem ser incorporados nos construtos de ácido nucleico da invenção que permite a seleção de células transformadas.

[00174] Outros elementos opcionais que podem estar presentes nos construtos de ácido nucleico adequados para utilização na invenção incluem, mas não estão limitados a, uma ou mais sequências líder, potenciadores, fatores de integração e/ou genes repórter, sequências de íntrons, centrômeros, telômeros e/ou sequências de ligação à matriz (MAR). Os construtos de ácido nucleico da presente invenção podem ainda compreender uma sequência de replicação autônoma, tal como uma sequência ARS.

[00175] O processo de recombinação pode, assim, ser executado com técnicas de recombinação conhecidos. Vários meios são conhecidos daqueles versados na técnica para a expressão e superexpressão de enzimas em uma célula hospedeira transformada. Em particular, uma enzima pode ser superexpressa pelo aumento do número de cópias do gene que codifica a enzima na célula hospedeira, por exemplo, através da integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula hospedeira, expressando o gene a partir de um vetor de expressão epissômico de múltiplas cópias ou através da introdução de um vetor de expressão epissômico que compreende 42/111 múltiplas cópias do gene.

[00176] Alternativamente, a superexpressão de enzimas nas células hospedeiras da invenção pode ser alcançada por meio de um promotor que não é nativo com a sequência de codificação da enzima a ser superexpressa, isto é, um promotor que é heterólogo relativamente à sequência de codificação para que ela esteja operacionalmente ligada. Embora o promotor preferivelmente seja heterólogo relativamente à sequência de codificação à qual está operacionalmente ligado, é também preferido que o promotor seja homólogo, isto é, endógeno relativamente à célula hospedeira. De preferência, o promotor heterólogo é capaz de produzir um nível de estado estacionário maior de transcrição que compreende a sequência de codificação (ou seja capaz de produzir mais moléculas de transcrição, ou seja, moléculas de RNAm, por unidade de tempo) do que é o promotor que é nativo à sequência de codificação. Os promotores adequados nesse contexto incluem ambos promotores constitutivos e indutíveis naturais bem como os promotores modificados.

[00177] Em uma modalidade, a célula hospedeira transformada é livre de marcador, o que significa que não há marcadores auxotróficos ou dominantes, em particular marcadores de resistência a antibióticos, está presente no genoma ou extracromossomicamente.

[00178] A sequência de codificação para a superexpressão das enzimas acima mencionadas pode ser de preferência homóloga à célula hospedeira. No entanto, as sequências de codificação que são heterólogas ao hospedeiro podem ser utilizadas.

[00179] A superexpressão de uma enzima, quando se refere 43/111 à produção da enzima em uma célula geneticamente modificada, significa que a enzima é produzida em um nível maior de atividade enzimática específica em comparação com a célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. Normalmente isso significa que a proteína enzimaticamente ativa (ou no caso de proteínas de multi-subunidades de enzimas) é produzida em maiores quantidades, ou melhor, em um nível de estado estacionário maior em comparação com a célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. Similarmente, isso significa normalmente que o RNAm que codifica a proteína enzimaticamente ativa é produzido em maiores quantidades, ou novamente, em vez de um nível de estado estacionário maior em comparação com a célula hospedeira não modificada sob condições idênticas. De preferência, em um hospedeiro, uma enzima a ser superexpressa é superexpressa por pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de ou cerca de 20, em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética que causa a superexpressão. É para ser entendido que estes níveis de superexpressão podem aplicar-se ao nível de estado estacionário da atividade da enzima, o nível de estado estacionário da proteína da enzima, bem como com o nível de estado estacionário da codificação da transição para a enzima.

[00180] De preferência, a glioxalase é expressa no citosol. Adaptação

[00181] A adaptação é o processo evolutivo pelo qual a população se torna mais adequada (adaptada) ao seu habitat ou 44/111 habitats. Esse processo ocorre ao longo de várias a muitas gerações, e é um dos fenômenos básicos da biologia.

[00182] O termo adaptação também pode se referir a uma característica que é especialmente importante para a sobrevivência de um organismo. Estas adaptações são produzidas em uma população variável pelas formas mais adequadas que reproduzem com mais êxito pela seleção natural.

[00183] As alterações nas condições ambientais alteram o resultado da seleção natural, afetando os benefícios seletivos de adaptações posteriores que melhoram uma aptidão do organismo sob as novas condições. No caso de uma mudança extrema do ambiente, a aparência e a fixação de adaptações benéficas podem ser essenciais para a sobrevivência. Um grande número de diferentes fatores tais como, por exemplo, a disponibilidade de nutrientes, temperatura, a disponibilidade de oxigênio, etc., podem conduzir a evolução adaptativa. Aptidão

[00184] Existe uma clara relação entre a adaptabilidade (o grau em que um organismo é capaz de viver e reproduzir-se em um determinado conjunto de habitats) e aptidão. Aptidão é uma estimativa e um preditor da taxa de seleção natural. Através da aplicação da seleção natural, as frequências relativas de fenótipos alternativos irão variar com o tempo, se forem hereditárias. Mudanças genéticas

[00185] Quando a seleção natural atua sobre a variabilidade genética da população, mudanças genéticas são o mecanismo subjacente. Por esse meio, a população se adapta geneticamente às suas circunstâncias. Mudanças genéticas podem resultar em estruturas visíveis, ou podem ajustar a 45/111 atividade fisiológica do organismo de uma maneira que se adapta ao habitat alterado.

[00186] Pode ocorrer que os habitats mudem com frequência. Portanto, segue-se que o processo de adaptação não é nunca finalmente completo. Com o tempo, pode acontecer que o ambiente mude gradualmente, e as espécies se adaptam aos seus arredores melhor e melhor. Por outro lado, pode acontecer que modificações no ambiente ocorrem de forma relativamente rápida, e, em seguida, as espécies torna-se menos bem adaptadas. A adaptação é um processo genético que acontece durante todo o tempo, em certa medida, também quando a população não altera o habitat ou ambiente. A evolução adaptativa

[00187] As células hospedeiras transformadas podem em sua preparação ser submetidas a evolução adaptativa. Uma célula hospedeira transformada pode ser adaptada para utilização de açúcar pela seleção de mutantes, ou espontânea ou induzida (por exemplo, por produtos químicos ou radiação), para o crescimento do açúcar desejado, de preferência, como única fonte de carbono, e mais preferivelmente sob condições anaeróbias. Seleção de mutantes pode ser efetuada por meio de técnicas incluindo a transferência em série de culturas como, por exemplo, descrito por Kuyper et al., (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664), ou pela cultura sob pressão seletiva em uma cultura em quimiostato. Por exemplo, em uma célula hospedeira preferida, pelo menos uma das modificações genéticas descritas acima incluindo modificações obtidas pela seleção de mutantes conferem à célula hospedeira a capacidade de crescer sobre a xilose como fonte de carbono, preferivelmente como fonte de carbono exclusiva, e, de preferência, sob 46/111 condições anaeróbicas. Quando XI é utilizado como gene para converter xilose, de preferência a célula produz essencialmente nenhum xilitol, por exemplo, o xilitol produzido está abaixo do limite de detecção ou, por exemplo, menos do que cerca de 5, cerca de 2, cerca de 1, cerca de 0,5, ou cerca de 0,3% do carbono consumido em uma base molar.

[00188] Evolução adaptativa também é descrita, por exemplo, em Wisselink H.W. et al, e Applied and Environmental Microbiology Aug. 2007, p. 4881-4891.

[00189] Em uma modalidade da evolução adaptativa um regime que consiste de cultivo de lote repetido com ciclos repetidos de crescimento consecutivo em diferente meio é aplicado, por exemplo, três meios com diferentes composições (glicose, xilose e arabinose; xilose e arabinose. Ver Wisselink et al., (2009) Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2009, p. 907-914. Transformação e estabilidade genética de levedura

[00190] A engenharia genética, isto é, a transformação de células de levedura com DNA recombinante, tornou-se possível pela primeira vez em 1978 [Beggs, 1978; Hinnen et al., 1978]. Tecnologia de DNA recombinante em levedura estabeleceu-se desde então. Uma multitude de diferentes construtos de vetores está disponível. Geralmente, estes vetores de plasmídeo, chamados vetores shuttle, contêm material genético derivado de vetores de E. coli que consistem de uma origem de replicação e um marcador selecionável (frequentemente o gene da β-lactamase, ampR), que lhes permitam ser propagados em E. coli antes da transformação em células de levedura. Além disso, os vetores shuttle contêm um marcador selecionável para seleção em levedura. Os marcadores podem ser os genes 47/111 que codificam as enzimas para a síntese de um determinado aminoácido ou nucleotídeo, de modo que as células que transportam a deleção genômica correspondente (ou mutação) são complementadas por auxotrofia ou autotrofismo. Alternativamente, estes vetores contêm marcadores de resistência dominante heterólogos, que fornecem células de levedura recombinantes (isto é, as células que têm recolhido o DNA e expressa o gene marcador) resistentes em relação a certos antibióticos, como G418 (geneticina), higromicina B ou fleomicina. Além disso, estes vetores podem conter uma sequência de sítios de restrição (combinados) (sítio de clonagem múltiplo ou MCS) que permitem a clonagem de DNA estrangeiro nestes sítios, embora métodos alternativos existam também.

[00191] Tradicionalmente, quatro tipos de vetores shuttle podem ser distinguidos pela ausência ou pela presença de elementos genéticos adicionais: • plasmídeos integrativos (YIp) que através de recombinação homóloga são integrados no genoma do hospedeiro no local do marcador ou outro gene, quando isso é aberto pela restrição e o DNA linearizado é usado para a transformação das células de levedura. Isso resulta geralmente na presença de uma cópia do DNA estrangeiro inserido nesse sítio particular no genoma; • plasmídeos epissômicos (YEp) que carregam parte da sequência de DNA do plasmídeo 2µ necessária para a replicação autônoma em células de levedura. Várias cópias do plasmídeo transformado são propagadas na célula de levedura e mantidas como epissomas; • plasmídeos de replicação autônoma (YRp) que carregam 48/111 uma origem de levedura de replicação (ARS, sequência replicada autonomamente) que permite que os plasmídeos transformados a serem propagados várias centenas de vezes; • plasmídeos CEN (YCp) que carregam em adição a uma sequência ARS uma sequência centromérica (derivada a partir de um dos cromossomos nucleares) que normalmente garante a segregação mitótica estável e geralmente reduz o número de cópias do plasmídeo autoreplicado para apenas um.

[00192] Estes plasmídeos estão sendo introduzidos nas células de levedura por transformação. A transformação de células de leveduras pode ser alcançada por diversas técnicas, tais como a permeabilização das células com acetato de lítio (Ito et al, 1983) e os métodos de eletroporação.

[00193] Na aplicação comercial de micro-organismos recombinantes, instabilidade do plasmídeo é o problema mais importante. A instabilidade é a tendência das células transformadas de perder suas propriedades de mudar por causa de alterações ou perda de plasmídeos. Essa questão é discutida em detalhe por Zhang et al., (Plasmid stability in recombinant Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Advances, Vol. 14, No. 4, pp 401-435, 1996). Cepas transformadas com os plasmídeos integrativos são extremamente estáveis, mesmo na ausência de pressão seletiva (Sherman, F. http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman f/yeast/9.html e referências aí contidas).

[00194] O NDA heterólogo é normalmente introduzido no organismo na forma de plasmídeos extracromossômicos (YEp, YCp e YRp). Infelizmente, verificou-se com ambas as bactérias e leveduras que as novas características não podem ser retidas especialmente se a pressão de seleção não é aplicada 49/111 continuamente. Isso é devido à instabilidade segregacional do plasmídeo híbrido quando células recombinantes crescem durante um longo período de tempo. Isso leva a heterogeneidade da população e variabilidade genética, e, eventualmente, a uma população de células em que a maioria das células perdeu as propriedades que foram introduzidas por transformação. Se vetores com marcadores auxotróficos estão sendo usados, cultivo em meio rico muitas vezes leva a uma perda rápida do vetor, uma vez que o vetor apenas é retido no meio mínimo. A alternativa, o uso de marcadores resistentes a antibióticos dominantes, muitas vezes, não é compatível com os processos de produção. O uso de antibióticos pode não ser desejado a partir de um ponto de vista (a possibilidade de que pequenas quantidades de antibiótico acabem no produto final) ou por razões econômicas (os custos de utilização de antibióticos em escala industrial).

[00195] Perda de vetores leva a problemas em situações de produção em grande escala. Métodos alternativos para introdução de DNA existem em leveduras, tais como o uso de plasmídeos integrantes (YIp). O DNA é integrado no genoma do hospedeiro por recombinação, resultando em alta estabilidade. (Caunt, P. Stability of recombinant plasmids in yeast. Journal of Biotechnology 9 (1988) 173- 192). Verificou-se que um método de integração utilizando os transpósons do hospedeiro é uma boa alternativa. Em uma modalidade genes podem ser integrados no genoma da célula hospedeira transformada. Introdução inicial (ou seja, antes da evolução adaptativa) de cópias múltiplas sendo executada de qualquer maneira conhecida na técnica que leva à introdução dos genes. Em uma modalidade, isso pode ser conseguido utilizando um 50/111 vetor com partes homólogas de sequências repetidas (transposons) da célula hospedeira. Quando a célula hospedeira é uma célula de levedura, as sequências repetidas são adequadas às repetições terminais longas (LTR) do elemento Ty, conhecida como sequência delta. Elementos Ty se dividem em duas subfamílias bastante semelhantes chamadas Ty1 e Ty2. Estes elementos são cerca de 6 quilobases (kb) de comprimento e são delimitadas por repetições terminais longas (LTR), sequências de cerca de 335 pares de bases (JD Boeke et al, The Saccharomyces cerevisiae Genome Contains Functional and Nonfunciontal Copies of Transposon Ty1. Molecular and Cellular Biology, abril de 1988, p. 1432-1442 Vol. 8, N°4). Na cepa de S. cerevisiae completamente sequenciada, S288c, os transposons mais abundantes são Ty1 (31 cópias) e Ty2 (13 cópias) (Gabriel A, Dapprich J, M Kunkel, Gresham D, Pratt SC, et al. (2006) Global mapping of transposon location. PLoS Genet 2 (12): e212.doi: 10.1371/journal.pgen.0020212). Estes transposons consistem de dois quadros de leitura abertos sobrepostos (ORFs), cada um dos quais codificam várias proteínas. As regiões de codificação são flanqueadas pelas acima mencionadas, LTRs quase idênticas. Outros elementos Ty menos abundantes e mais distintas em S. cerevisiae compreendem TY3, TY4 e Ty5. Para cada família de elementos Ty de comprimento completo existe uma ordem de magnitude mais solo de elementos LTR dispersos através do genoma. Estes são pensados para aumentar pela recombinação de LTR-LTR de elementos de comprimento completo com laço fora das regiões de codificação de proteínas internas.

[00196] O mecanismo de retrotransposição de retrotransposon de Ty tem sido explorado para integrar 51/111 múltiplas cópias por todo o genoma (Boeke et al, 1988; Jacobs et al, 1988). As repetições terminais longas (LTR) do elemento Ty, conhecidas como sequências delta, são também bons alvos para integração através de recombinação homóloga já que elas existem em cerca de 150-200 cópias que são ou sítios associados a Ty ou solo (Boeke, 1989; Kingsman and Kingsman 30, 1988). (Parekh RN (1996). Na Integrating Vector for Tunable, High Copy, Stabel Integration into the Dispersed Ty DELTA Sites of Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Prog., 1996, 12, 16-21). Por evolução adaptativa, o número de cópias pode mudar. Genes araA, araB e araD

[00197] Uma célula hospedeira transformada é capaz de utilizar a arabinose. Uma célula hospedeira transformada é, por conseguinte, capaz de converter L-arabinose em L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo, um daqueles aqui mencionados.

[00198] Organismos, por exemplo, cepas de S. cerevisiae, capazes de produzir etanol a partir de L-arabinose podem ser produzidos por modificação de uma célula introduzindo os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribuloquinase) e araD (L-ribulose-5-P4-epimerase) de uma fonte adequada. Tais genes podem ser introduzidos em uma célula hospedeira transformada que é capaz de utilizar a arabinose. Tal abordagem é dada é descrita em W0 2003/095627. Genes araA, araB e araD de Lactobacillus plantarum podem ser usados e são divulgados em W0 2008/041840. O gene araA de Bacillus subtilis e os genes araB e araD de Escherichia coli podem ser usados e são divulgadas em EP 1.499.708. Em outra modalidade, genes araA, araB e araD podem ser derivados, pelo menos, de 52/111 um dos gêneros Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular um de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens, e/ou Gramella forsetii, conforme divulgado em WO

2009011591. Genes-PPP

[00199] Uma célula hospedeira transformada pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumentam o fluxo da via de pentose fosfato (PPP). Em particular, a modificação genética (s) pode levar a um aumento do fluxo através da parte não oxidativa da via da pentose fosfato. Uma modificação genética que provoca um aumento do fluxo da parte não oxidativa da via da pentose fosfato é aqui entendida como significando uma alteração que aumenta o fluxo de pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20, em comparação com o fluxo de uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação genética causando o aumento do fluxo. O fluxo da parte não-oxidativa da via da pentose fosfato pode ser medido através do crescimento do hospedeiro modificado em xilose como única fonte de carbono que determina a taxa de consumo específico de xilose subtraindo a taxa de produção específica de xilitol da taxa de consumo específico de xilose se qualquer xilitol é produzido. No entanto, o fluxo da parte não oxidativa da via da pentose fosfato é proporcional à taxa de crescimento em xilose como única fonte de carbono, de preferência com a taxa de crescimento anaeróbico em xilose como única fonte de carbono. Existe uma relação linear entre a taxa de crescimento em xilose como única fonte de carbono (µmax) e o fluxo da parte não-oxidativa da via de pentose fosfato. A taxa de consumo específico de xilose (Qs) está 53/111 relacionada com a taxa de crescimento específico (µ) e ao rendimento da biomassa em açúcar (YXS) de acordo com: Qs = ms + µ/ySXMAX ou 1/ySX = ms/µ + 1/ySXMAX

[00200] Portanto, se µ é constante, o aumento do fluxo da parte não-oxidativa da via da pentose fosfato pode ser deduzido do aumento na taxa de crescimento máxima sob estas condições, a menos que o transporte (captação é limitante).

[00201] Um ou mais modificações genéticas que aumentam o fluxo da via de pentose fosfato podem ser introduzidas na célula hospedeira de várias formas. Estas incluindo, por exemplo, alcançam altos níveis estáveis de xilulose quinase e/ou uma ou mais das enzimas da via da pentose fosfato da parte não-oxidativa e/ou um nível em estado estacionário reduzido de redutase aldose inespecífica. Estas mudanças nos níveis da atividade em estado estacionário podem ser efetuadas pela seleção de mutantes espontâneos (ou induzidas por produtos químicos ou radiação) e/ou por tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, por superexpressão ou inativação, respectivamente, dos genes que codificam as enzimas ou fatores que regulam estes genes.

[00202] Em uma célula hospedeira preferida, a modificação genética compreende a superexpressão de pelo menos uma enzima da via da pentose fosfato (parte não-oxidativa). De preferência, a enzima é selecionada do grupo que consiste em enzimas que codificam a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transaldolase e transcetolase. Várias combinações de enzimas da via da pentose fosfato (parte não-oxidativa) podem ser superexpressas. Por exemplo, 54/111 as enzimas que são superexpressas podem ser, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato epimerase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas transcetolase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, transaldolase e transcetolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, e transaldolase; ou, pelo menos, as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, e transcetolase.

Em uma modalidade da invenção cada uma das enzimas ribulose-5- fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transaldolase e transcetolase é superexpressa na célula hospedeira.

Mais preferida é uma célula hospedeira na qual a modificação genética compreende, pelo menos, a superexpressão de ambas as enzimas transcetolase e transaldolase como uma tal célula hospedeira já é capaz de um crescimento anaeróbico em xilose.

Na verdade, em algumas condições células hospedeiras que convertem xilose superexpressam apenas a transcetolase e a transaldolase já têm a mesma taxa de crescimento anaeróbico em xilose como fazem as células hospedeiras que superexpressam todas as quatro enzimas, isto é, a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transaldolase e transcetolase.

Além disso, as células hospedeiras que superexpressam ambas as enzimas

55/111 ribulose-5-fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato epimerase são preferidas em relação às células hospedeiras que super- expressam apenas a isomerase ou apenas a epimerase como superexpressão de apenas uma destas enzimas podem produzir desequilíbrios metabólicos.

[00203] A enzima "ribulose-5-fosfato epimerase" (EC

5.1.3.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a epimerização de D-xilulose 5-fosfato em D-ribulose-5-fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como fosforibulose epimerase; eritrose-4-fosfato isomerase; fosfocetopentose 3- epimerase; xilulose fosfato 3-epimerase; fosfocetopentose epimerase; ribulose-5-fosfato 3-epimerase; D-ribulose-fosfato 3-epimerase; D-ribulose-5-fosfato-epimerase; D-ribulose-5-P 3-epimerase; D-xilulose-5-fosfato 3-epimerase; pentose-5- fosfato 3-epimerase; ou D-ribulose-5-fosfato 3-epimerase. Uma ribulose-5-fosfato epimerase pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácidos. Igualmente uma ribulose-5-fosfato epimerase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codificam a enzima, assim como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma ribulose-5-fosfato epimerase. A sequência de nucleotídeos que codifica a ribulose-5-fosfato epimerase é aqui designada RPE1.

[00204] A enzima "ribulose-5-fosfato isomerase" (EC

5.3.1.6) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D-ribose-fosfato em D-ribulose-5- fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como fosfopentosisomerase; fosforiboisomerase; ribose fosfato isomerase; 5-fosforibose isomerase; D-ribose-5-fosfato isomerase; D-ribose-5-fosfato cetal-isomerase; ou D-ribose-5- 56/111 fosfato de aldose-cetose-isomerase. Uma ribulose-5-fosfato isomerase pode ser ainda definida pela sua sequência de aminoácidos. Igualmente uma ribulose-5-fosfato isomerase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, assim como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma ribulose-5-fosfato isomerase. A sequência de nucleotídeos que codifica a ribulose-5-fosfato isomerase é aqui designada por RKl1.

[00205] A enzima "transcetolase" (EC 2.2.1.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: D-ribose 5- fosfato + D-xilulose 5-fosfato de <-> sedoheptulose 7-fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como glicolaldeidetransferase ou sedoheptulose 7- fosfato; D-gliceraldeído-3-fosfato glicolaldehidetransferase. Um transcetolase pode ser ainda definida por seu aminoácido. Igualmente uma transcetolase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma transcetolase. A sequência de nucleotídeos que codifica a transcetolase é aqui designada TKL1.

[00206] A enzima "transaldolase" (EC 2.2.1.2) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: sedoheptulose 7-fosfato + D-gliceraldeído 3-fosfato <-> D-eritrose 4- fosfato + D-frutose 6-fosfato e vice-versa. A enzima também é conhecida como dihidroxiacetonetransferase; dihidroxiacetona sintase; formaldeído transcetolase; ou sedoheptulose 7fosfato: D-gliceraldeído-3-fosfato gliceronetransferase. Uma transaldolase pode ser ainda definida por sua sequência de 57/111 aminoácidos. Igualmente uma transaldolase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, bem como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica um transaldolase. A sequência nucleotídica que codifica a transcetolase é aqui designada TAL1. Genes de xilose isomerase ou xilose redutase

[00207] De acordo com a invenção, uma ou mais cópias de um ou mais genes de xilose isomerase e/ou uma ou mais xilose redutase e xilitol desidrogenase são introduzidas no genoma da célula hospedeira. A presença destes elementos genéticos confere à célula a capacidade de converter xilose por isomerização ou redução.

[00208] Em uma modalidade, uma ou mais cópias de um ou mais genes de xilose isomerase são introduzidas no genoma da célula hospedeira.

[00209] Uma "xilose isomerase" (EC 5.3.1.5) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D-xilose em D-xilulose e/ou vice-versa. A enzima também é conhecida como um D-xilose cetoisomerase. Uma xilose isomerase aqui pode também ser capaz de catalisar a conversão entre a D-glicose e D-frutose (e consequentemente, portanto, pode ser referida como uma glicose isomerase). A xilose isomerase aqui pode exigir um cátion bivalente, tais como magnésio, manganês ou cobalto como um cofator.

[00210] Por conseguinte, tal uma célula hospedeira transformada é capaz de isomerizar a xilose em xilulose. A capacidade de isomerizar xilose em xilulose conferido à célula hospedeira por transformação da célula hospedeira com um construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência de 58/111 nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase definida. Uma célula hospedeira transformada isomeriza a xilose em xilulose pela isomerização direta de xilose em xilulose.

[00211] O gene da xilose isomerase pode ter várias origens, tais como, por exemplo, Piromyces sp. como revelado em WO2006/009434. Outras origens adequadas são Bacteroides, em particular Bacteroides uniformis como descrito em PCT/EP2009/52623. Em outra modalidade, uma ou mais cópias de um ou mais genes de xilose redutase e xilitol desidrogenase são introduzidos no genoma da célula hospedeira. Nessa modalidade, a conversão de xilose é conduzida em uma conversão em duas etapas de xilose em xilulose por meio de um intermediário como xilitol catalisado por xilose redutase e xilitol desidrogenase, respectivamente. Em uma modalidade da mesma xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XDH) e xiluloquinase (XK) podem ser superexpressas e, opcionalmente, um ou mais dos genes que codificam enzimas produtoras de NADPH são supra-regulados e um ou mais dos genes que codificam enzimas consumidoras de NADH são supra-reguladas, conforme divulgado em WO 2004085627. Gene XKS1

[00212] Uma célula hospedeira transformada pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumentam a atividade específica da xilulose quinase. De preferência, a modificação genética ou modificação causa a superexpressão de uma xiluloquinase, por exemplo, por superexpressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xiluloquinase. O gene que codifica a xiluloquinase pode ser endógeno à célula hospedeira ou pode ser uma xiluloquinase que é heteróloga à célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeos utilizada 59/111 para a superexpressão de xiluloquinase na célula hospedeira é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de xiluloquinase.

[00213] A enzima "xiluloquinase" (EC 2.7.1.17) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação de ATP + D- xilulose = ADP + D-xilulose 5-fosfato. A enzima também é conhecida como um xiluloquinase de fosforilação, D- xiluloquinase ATP: D-xilulose 5-fosfotransferase. Uma xiluloquinase utilizada na invenção pode ser ainda definida pela sua sequência de aminoácidos. Igualmente uma xiluloquinase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos que codifica a enzima, assim como por uma sequência de nucleotídeos que hibrida com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma xiluloquinase.

[00214] Em uma célula hospedeira transformada, uma modificação genética ou modificações que aumenta (m) atividade específica de xiluloquinase podem ser combinadas com qualquer uma das modificações que aumentam o fluxo da via de pentose fosfato como descrito acima. Essa não é, contudo, essencial.

[00215] Nas células hospedeiras da invenção, uma xiluloquinase a ser superexpressa é superexpressa por pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20, em comparação com uma cepa que é geneticamente idêntica, exceto para a modificação(ões) genética, provocando a superexpressão. É para ser entendido que estes níveis de superexpressão podem aplicar-se ao nível de estado estacionário da atividade da enzima, o nível de estado estacionário da proteína da enzima, assim como com o nível de 60/111 estado estacionário do transcrito que codifica a enzima. Deleção do gene da aldose redutase (GRE3)

[00216] Na modalidade, em que XI é utilizado como gene para converter xilose, pode ser vantajoso reduzir a atividade da aldose redutase. Uma célula hospedeira transformada pode, por conseguinte, compreender uma ou mais modificações genéticas que diminuem a atividade da aldose redutase na célula hospedeira. De preferência, a atividade da aldose redutase inespecífica é reduzida na célula hospedeira através de uma ou mais modificações genéticas que diminuem a expressão de ou inativa um gene que codifica uma aldose redutase inespecífica. De preferência, a modificação (ões) genética reduz ou inativa a expressão de cada cópia de um gene endógeno que codifica uma aldose redutase na célula hospedeira, em uma modalidade da deleção da aldose redutase GRE3 (aqui chamada deleção de GRE3). As células hospedeiras transformadas podem compreender múltiplas cópias de genes codificadores de aldose redutases inespecíficas como um resultado de di-, poli- ou aneuploidia, e/ou a célula hospedeira pode conter várias (iso)enzimas diferentes com atividade da aldose redutase que diferem na sequência de aminoácidos e que são cada codificada por um gene diferente. Também em tais casos, de preferência, a expressão de cada gene que codifica uma aldose redutase inespecífica é reduzida ou inativada. De preferência, o gene é inativado por deleção de pelo menos uma parte do gene ou por rompimento do gene, em que, nesse contexto, o termo gene inclui também qualquer sequência não codificante a montante ou a jusante da sequência de codificação, a deleção (parcial) ou inativação da que resulta em uma redução de expressão da atividade da 61/111 aldose redutase inespecífica na célula hospedeira.

[00217] Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma aldose redutase, cuja atividade é para ser reduzida na célula hospedeira é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade de aldose redutase.

[00218] Assim, uma célula hospedeira que compreende apenas uma modificação ou modificações genéticas que reduz (em) atividade da aldose redutase não específica na célula hospedeira está especificamente incluída na invenção.

[00219] A enzima "aldose redutase" (EC 1.1.1.21) é aqui definida como qualquer enzima que é capaz de reduzir a xilose ou xilulose em xilitol. No contexto da presente invenção, uma aldose redutase pode ser qualquer aldose redutase inespecífica que é nativa (endógena) a uma célula hospedeira da invenção e que é capaz de reduzir xilose ou xilulose em xilitol. Aldose redutases inespecíficas catalisam a reação: aldose + NAD(P)H + H+ → alditol + NAD(P)+

[00220] A enzima tem uma especificidade ampla e é também conhecida como aldose redutase; poliol desidrogenase (NADP+); alditol:NADP oxidoredutase; alditol:NADP+ 1-oxidorredutase; NADPH-aldopentose redutase; ou NADPH-aldose redutase.

[00221] Um exemplo particular de tal uma aldose redutase inespecífica que é endógena à S. cerevisiae e que é codificada pelo gene GRE3 (Traff et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74). Assim, uma aldose redutase da invenção pode ser ainda definida pela sua sequência de aminoácidos. Igualmente uma aldose redutase pode ser definida pelas sequências de nucleotídeos que codificam a enzima, bem como por uma sequência de nucleotídeos hibridiza com uma sequência de nucleotídeos de referência que codifica uma 62/111 aldose redutase. Produção de bioprodutos

[00222] Ao longo dos anos foram feitas sugestões para a introdução de vários organismos para a produção do bio-etanol a partir de açúcares de culturas. Na prática, no entanto, todos os maiores processos de produção de bio-etanol têm continuado a usar as leveduras do gênero Saccharomyces como produtor de etanol. Isso se deve às muitas características atraentes das espécies de Saccharomyces para processos industriais, isto é, uma alta tolerância ácida, ao etanol e osmolar, a capacidade de crescimento anaeróbico, e, claro, a sua alta capacidade fermentativa alcoólica. Espécies de levedura preferidas como células hospedeiras incluem S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K tragi.

[00223] Uma célula hospedeira transformada pode ser uma célula adequada para a produção de etanol. Uma célula hospedeira transformada pode, no entanto, ser apropriada para a produção de produtos da fermentação outros que etanol.

[00224] Tais produtos da fermentação não-etanólica incluem, em princípio, qualquer massa ou produto químico que possa ser produzido por um microrganismo eucariota tal como uma levedura ou um fungo filamentoso.

[00225] Uma célula hospedeira transformada que pode ser usada para a produção de produtos da fermentação não etanólicos é uma célula hospedeira que contém uma modificação genética que resulta na diminuição da atividade do álcool desidrogenase.

[00226] Em uma modalidade a célula hospedeira transformada pode ser utilizada em um processo em que os 63/111 açúcares provenientes da lignocelulose são convertidos em etanol. Lignocelulose

[00227] A lignocelulose, que pode ser considerada como um matéria-prima renovável potencial, geralmente compreende a celulose (glicanos) e hemicelulose (xilanos, heteroxilanos e xiloglicanos) de polissacarídeos. Além disso, alguma hemicelulose pode estar presente como glucomananas, por exemplo, em matérias-primas derivadas da madeira. A hidrólise enzimática destes polissacáridos em açúcares solúveis, incluindo ambos os monômeros e multímeros, por exemplo, glicose, celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses ocorrem sob a ação de enzimas diferentes atuando em conjunto.

[00228] Além disso, pectinas e outras substâncias pécticas tais como arabinanos podem constituir consideravelmente proporção da massa seca de tipicamente paredes de células de tecidos de plantas não-lenhosas (cerca de um quarto a metade da massa seca pode ser pectinas). Pré-tratamento

[00229] Antes do tratamento enzimático, o material ligno- celulósico pode ser pré-tratado. O pré-tratamento pode compreender a exposição do material lignocelulósico a um ácido, uma base, um solvente, calor, um peróxido, ozônio, trituração mecânica, trituração, moagem ou despressurização rápida, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais destes. Esse pré-tratamento químico é muitas vezes combinado com pré- tratamento com calor, por exemplo, entre 150-220°C durante 1 a 30 minutos.

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Hidrólise enzimática

[00230] O material pré-tratado é normalmente submetido a hidrólise enzimática para liberar açúcares que podem ser fermentados de acordo com a invenção. Isso pode ser executado através de métodos convencionais, por exemplo, contatando com celulases, por exemplo, celobiohidrolase (s), endoglucanase (s), beta-glicosidase (s) e opcionalmente outras enzimas. A conversão com as celulases pode ser executada à temperatura ambiente ou a temperaturas maiores, em um tempo de reação para liberar quantidades suficientes de açúcar (es). O resultado da hidrólise enzimática é o produto da hidrólise compreendendo açúcares C5/C6, aqui designados como a composição de açúcar. A composição de açúcar

[00231] A composição de açúcar de acordo com a invenção compreende glucose, arabinose e xilose. Qualquer composição de açúcar pode ser utilizada na presente invenção que preenche aqueles critérios. Açúcares opcionais na composição de açúcar são galactose e manose. Em uma modalidade preferida, a composição de açúcar é um hidrolisado de um ou mais material lignocelulósico. Lignocelulose aqui inclui hemicelulose e partes de hemicelulose de biomassa. Também lignocelulose inclui frações lignocelulósicas de biomassa. Materiais lignocelulósicos adequados podem ser encontrados na seguinte lista: priming de pomar, chaparral, resíduos de moinho, resíduos de madeira urbana, resíduos urbanos, resíduos de madeira, desbastes de floresta, culturas lenhosas de curta rotação, resíduos industriais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha de linho, casca de soja, casca de arroz, palha de 65/111 arroz, alimentos com glúten de milho, casca de aveia, cana- de-açúcar, palha de milho, talos de milho, espigas de milho, palha de milho, gramíneas, miscanthus, sorgo doce, talos de canola, talos de soja, grama de pradaria, gamagrass, rabo de raposa; polpa de beterraba, polpa de fruta cítrica, cascas de semente, resíduos animais celulósicos, recortes de grama, algodão, algas, árvores, madeira macia, madeira dura, álamo, pinheiro, arbustos, gramíneas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, milho, palha de milho, espiga de milho, grão de milho, fibra de palma, produtos e subprodutos da moagem úmida ou seca de grãos, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel, resíduos de jardim, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, resíduos de papel, polpa, resíduos de fábricas de papel, galhos, arbustos, cana, milho, palha de milho, cultura energética, floresta, uma fruta, uma flor, um grão, um grama, uma cultura herbácea, uma folha, casca, uma agulha, um tronco, uma raiz, um rebento, um arbusto, gramínea, uma árvore, um vegetal, casca de fruta, uma videira, polpa de beterraba, triguilho, casca de aveia, madeira dura ou macia, resíduo orgânico gerado de um processo agrícola, resíduo de madeira de silvicultura, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais destes.

[00232] Um resumo de algumas composições de açúcar adequadas derivados de lignocelulose e a composição de açúcar de seus hidrolisados é fornecida na tabela 2. As lignoceluloses listadas incluem: espigas de milho, fibra de milho, casca de arroz, casca de melão, polpa de beterraba, palha de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, madeira, grama e prensagem da azeitona.

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Tabela 2: Resumo de composições de açúcar a partir de materiais lignocelulósicos.

Gal = galactose, Xil = xilose, Ara = arabinose, Man = manose, Gli = glicose, Ram = ramnose.

A porcentagem de galactose (% de Gal) é fornecida.

Material Gal.

Gal Xil Ara Man Gli Ram Soma lignocelulósico em % Espiga de milho 10 286 36 227 11 570 1,7 a Espiga de milho 131 228 160 144 663 19,8 b Casca de arroz 9 122 24 18 234 10 417 2,2 a Casca de arroz 8 120 28 209 12 378 2,2 b Casca de melão 6 120 11 208 16 361 1,7 Polpa de 51 17 209 11 211 24 523 9,8 beterraba Palha de trigo 15 249 36 396 696 2,2 Idaho Fibra de milho 36 176 113 372 697 5,2 Bagaço de cana 14 180 24 5 391 614 2,3 Palha de milho 19 209 29 370 626 Athel (madeira) 5 118 7 3 493 625 0,7 Eucalipto 22 105 8 3 445 583 3,8 (madeira) CWR (grama) 8 165 33 340 546 1,4 JTW (grama) 7 169 28 311 515 1,3 MSW 4 24 5 20 440 493 0,9 Planta caniço 16 117 30 6 209 1 379 4,2 malhado

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Semente de 13 163 28 6 265 1 476 2,7 caniço malhado Resíduo da prensagem de 15 111 24 8 329 487 3,1 oliva

[00233] É evidente a partir da tabela 2 que nestas lignoceluloses uma quantidade alta de açúcar é presença na forma de glicose, xilose, arabinose e galactose. A conversão da glicose, xilose, arabinose e galactose no produto da fermentação é, portanto, de grande importância econômica. Também manose está presente em alguns materiais de lignocelulose seja normalmente em quantidades menores do que os açúcares mencionados anteriormente. Vantajosamente, por conseguinte, também manose é convertida pela célula hospedeira transformada. Fermentação

[00234] O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação anaeróbica ou aeróbica. Um processo de fermentação anaeróbia é aqui definido como um processo de fermentação realizado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência menos do que cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/l/h, mais preferivelmente 0 mmol/l/h é consumido (isto é, consumo de oxigênio não é detectável), e em que as moléculas orgânicas servem como doador de elétrons e receptores de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na formação de glicólise e de biomassa, não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Para resolver este problema muitos microrganismos utilizam piruvato ou um dos seus derivados 68/111 como um elétron e receptor de hidrogênio regenerando assim NAD+.

[00235] Assim, em uma fermentação anaeróbica preferida pentose é convertida em produtos de fermentação, tais como etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3- propano-diol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactama e uma cefalosporina.

[00236] O processo de fermentação é de preferência realizado a uma temperatura que é ótima para a célula. Assim, para a maioria das leveduras ou células hospedeiras de fungos, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura que é inferior a cerca de 42°C, de preferência inferior a cerca de 38°C. Para levedura ou células hospedeiras de fungos filamentosos, o processo de fermentação é preferivelmente realizado a uma temperatura que é inferior a cerca de 35, cerca de 33, cerca de 30 ou cerca de 28°C e a uma temperatura que é maior do que cerca de 20, cerca de 22, ou cerca de 25°C.

[00237] O rendimento de etanol em xilose e/ou glicose no processo é de preferência pelo menos cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 95 ou cerca de 98%. O rendimento de etanol é aqui definido como uma percentagem do rendimento máximo teórico.

[00238] A invenção também se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação.

[00239] O processo de fermentação de acordo com a presente invenção pode ser executado sob condições aeróbicas e anaeróbicas. Em uma modalidade, o processo é realizado sob 69/111 condições limitadas micro-aerofílicas ou oxigênio.

[00240] Um processo de fermentação anaeróbia é aqui definido como um processo de fermentação realizado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência inferior a cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/l/h, e em que as moléculas orgânicas servem como doadores de elétrons e receptores de elétrons.

[00241] Em um processo preferido, a célula fermenta tanto a xilose quanto a glicose, de preferência simultaneamente, caso em que de preferência uma célula é utilizada que é insensível à repressão da glicose. Além disso, a uma fonte de xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação vai ainda compreender o ingrediente apropriado necessário para o crescimento da célula. As composições do meio de fermentação para crescimento de microrganismos, tais como leveduras são bem conhecidas na técnica.

[00242] Os processos de fermentação podem ser realizados em modo contínuo, semi-descontínuo ou em lotes. O processo de fermentação e hidrólise separada (SHF) ou um processo de fermentação e sacarificação simultânea (SSF) pode também ser aplicado. Uma combinação destes modos de processo de fermentação pode também ser possível para uma produtividade ótima. Estes processos são descritos a seguir em mais detalhe. Modo SSF

[00243] Para modo de fermentação e de sacarificação simultânea (SSF), o tempo de reação para a etapa de liquefação/hidrólise ou pressacarificação é dependente do tempo para realizar o rendimento desejado, ou seja, o 70/111 rendimento de conversão de celulose em glicose. Tal rendimento é de preferência tão alto quanto possível, de preferência 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, 99,5% ou mesmo mais ou 99,9% ou mais.

[00244] De acordo com a invenção concentrações muito elevadas de açúcar no modo SHF e concentrações muito elevadas de produto (por exemplo, etanol) no modo SSF são realizados. Na operação SHF a concentração de glicose é de 25g/l ou mais, 30 g/l ou mais, 35 g/l ou mais, 40 g/l ou mais, 45 g/l ou mais, 50 g/l ou mais, 55 g/l ou mais, 60 g/l ou mais, 65 g/l ou mais, 70 g/l ou mais, 75 g/l ou mais, 80 g/l ou mais, 85 g/l ou mais, 90 g/l ou mais, 95 g/l ou mais, 100 g/l ou mais, 110 g/l ou mais, 120 g/l ou mais, ou pode, por exemplo, ser g/l-250 g/l, 30 g/l-200 g/l, 40 g/l-200 g/l, 50 g/l-200 g/l, 60 g/l-200 g/l, 70 g/l-200 g/l, 80 g/l-200 g/l, 90 g/l, 80 g/l-200 g/l. Concentração do produto no modo SSF

[00245] Na operação de SSF, a concentração do produto (g/l) é dependente da quantidade de glicose produzida, mas esta não é visível uma vez que os açúcares são convertidos em produto na SSF, e concentrações de produto podem ser relacionadas com a concentração de glicose subjacente através da multiplicação com o rendimento máximo teórico (Yps max no produto em gr por grama de glicose).

[00246] O rendimento teórico máximo (Yps max no produto em gramas por grama de glicose) de um produto de fermentação pode ser derivado a partir de livro de bioquímica. Para o etanol, 1 mol de glicose (180 g) origina de acordo com a via 71/111 normal de fermentação de levedura a glicólise em 2 moles de etanol (= 2x46 = 92 g de etanol. O rendimento máximo teórico de etanol em glicose é portanto 92/180 = 0,51 g etanol/ g de glicose.

[00247] Para butanol (PM 74 g/mol) ou isobutanol, o rendimento máximo teórico é de 1 mol de butanol por mol de glicose. Assim Yps max para isobutanol = 74/180 = 0,41 g de isobutanol/g de glicose.

[00248] Para o ácido láctico o rendimento da fermentação por fermentação homoláctica é de 2 moles de ácido láctico (peso molecular = 90 g/mol) por mol de glicose. De acordo com esta estequiometria, o Yps max = 1 g de ácido láctico/g de glicose.

[00249] Para outros produtos de fermentação um cálculo semelhante pode ser feito. Modo SSF

[00250] Na operação SSF a concentração do produto é de 25 g*Yps g/l/l ou mais, 30*Yps g/l ou mais, 35g*Yps/l ou mais, 40*Yps g/l ou mais, 45*Yps g/l ou mais, 50*Yps g/l ou mais, 55*Yps g/l ou mais, 60*Yps g/l ou mais, 65*Yps g/l ou mais, 70*Yps g/l ou mais, 75*Yps g/l ou mais, 80*Yps g/l ou mais, 85*Yps g/l ou mais, 90*Yps g/l ou mais, 95*Yps g/l ou mais, 100*Yps g/l ou mais, 110*Yps g/l ou mais, 120 g/l*Yps ou mais ou podem, por exemplo, ser de 25* Yps g/l-250*Yps g/l, 30* Yps g/l-200*Yps g/l, 40*Yps g/l-200*Yps g/l, 50*Yps g/l-200* Yps g/l, 60*Yps g/l-200*Yps g/l, 70*Yps g/l-200*Yps g/l, 80* Yps g/l-200*Yps g/l, 90* Yps g/l, 80* Yps g/l-200* Yps g/l.

[00251] Por conseguinte, a invenção proporciona um método para a preparação de um produto de fermentação, em que o método compreende: 72/111 a. degradar lignocelulose utilizando um método tal como aqui descrito; e b. fermentar o material resultante, desse modo, para preparar um produto de fermentação. Produto de fermentação

[00252] O produto de fermentação da presente invenção pode ser qualquer produto útil. Em uma forma de realização, é um produto selecionado a partir do grupo que consiste de etanol, n-butanol, isobutanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi- propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido adípico, um aminoácido, tal como lisina, metionina, triptofano, treonina, e ácido aspártico, 1,3- propanodiol, etileno, glicerol, um antibiótico de β-lactama e uma cefalosporina, vitaminas, medicamentos, suplementos para alimentação animal, produtos químicos especiais, matérias- primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis, incluindo os biocombustíveis e de biogás ou polímeros orgânicos, e uma enzima industrial, tal como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidorredutase, uma transferase ou uma xilanase. Por exemplo, os produtos de fermentação podem ser produzidos por células de acordo com a invenção, na sequência da técnica anterior e métodos de preparação da célula e de processos de fermentação, o que, no entanto, exemplos não devem aqui ser entendidos como limitantes. n-butanol pode ser produzido por células tal como descrito em W02008121701 ou W02008086124; ácido láctico, tal como descrito em US2011053231 ou US2010137551; ácido 3-hidroxi-propiônico tal 73/111 como descrito em W02010010291; ácido acrílico conforme descrito em W02009153047. Recuperação do produto de fermentação

[00253] Para a recuperação do produto de fermentação tecnologias existentes são utilizadas. Para diferentes produtos de fermentação diferentes processos de recuperação são adequados. Os métodos existentes de recuperação de etanol a partir de misturas aquosas geralmente usam técnicas de fracionamento e de adsorção. Por exemplo, uma cerveja pode ainda ser usada para processar um produto fermentado, que contém etanol numa mistura aquosa, para produzir uma mistura enriquecida contendo etanol que é então submetido ao fracionamento (por exemplo, destilação fracionada ou outras técnicas semelhantes). Em seguida, as frações que contêm as concentrações mais elevadas de etanol podem ser passadas através de um adsorvente para remover a maior parte, se não a totalidade, da água residual a partir do etanol.

[00254] Os Exemplos seguintes ilustram a invenção.

EXEMPLOS Técnicas gerais de biologia molecular

[00255] Salvo indicação em contrário, os métodos usados são técnicas bioquímicas convencionais. Exemplos de livros didáticos de metodologia geral adequados incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc. Meio

[00256] O meio utilizado nos experimentos era ou meio YEP (10 g/l de extrato de levedura, 20 g/l de peptona) ou meio YNB sólido (6,7 g/l de levedura base de nitrogênio, 15 g/l de 74/111 ágar), suplementado com açúcares tal como indicado nos exemplos. Para o meio YEP sólido, 15 g/l de ágar foi adicionado ao meio líquido antes da esterilização.

[00257] Nos experimentos de AFM, meio mineral foi utilizado. A composição do meio mineral foi descrita por Verduyn et al. (Yeast (1992), volume 8, 501-517) e foi suplementado com 2,325 g/l de ureia e de açúcares, como indicado nos exemplos. Transformação de células de levedura

[00258] Transformação de levedura foi realizada de acordo com o método descrito por Schiestl e Gietz (Current Genetics (1989), Volume 16, 339-346). Colônia PCR

[00259] O DNA genômico foi extraído de colônias individuais de leveduras para PCR de acordo com o método descrito por Lõoke et al. (BioTechniques (2011), Volume 50, 325-328). Procedimento AFM

[00260] O monitor de fermentação alcoólica (AFM; Halotec, Veenendaal, Países Baixos) é um biorreator paralelo de laboratório robusto e fácil de usar que permite comparações precisas das taxas de conversão de carbono e rendimentos para seis fermentações anaeróbias simultâneas.

[00261] A cultura de partida do experimento de AFM continha 50 mg de levedura (peso seco). Para determinar isto, uma curva de calibração foi feita da cepa RN1001 de biomassa versus OD700. Esta curva de calibração foi utilizada no experimento para determinar o volume de cultura da célula necessário para 50 mg de levedura (peso seco).

[00262] Antes do início do experimento AFM, pré-culturas foram cultivadas como indicado nos exemplos. Para cada cepa 75/111

OD700 foi medido e 50 mg de levedura (peso seco) foi inoculado em 400 ml de meio mineral (Verduyn et al. (Yeast (1992), volume 8, 501-517), suplementado com 2,325 g/l de ureia e açúcares, como indicado nos exemplos. Isolamento de RNA

[00263] RNA foi isolado utilizando o kit NucleoSpin RNA II (Machery-Nagel, GmbH & Co. KG, Doren, Alemanha), com o protocolo do fabricante ligeiramente adaptado. Antes do início do protocolo as células de levedura cultivadas de fresco foram tratadas em 0,2 mg de liticase/ml, Sorbitol 1M e tampão de EDTA 0,1M durante 30 minutos a 30°C. Após esta etapa, o protocolo do fabricante foi realizado, com exceção da etapa 6 e 7 (membrana de dessalinização de sílica e o tratamento de DNase). Para remover o DNA genômico, um tratamento DNase foi realizado após a eluição do RNA a partir da coluna. Para esta, 10 µl de solução de RNA foi misturado com 7 µl de DNase e RNase livre de água, 2 µl de tampão 10x e 1 µl de DNase (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot/Alemanha). Esta mistura foi incubada durante 30 minutos a 37ºC. Para inativação da enzima, 1 µl de EDTA 25 mM (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot/Alemanha) foi adicionado e incubado durante 10 minutos a 65°C. Síntese de cDNA

[00264] Síntese de cDNA foi realizada no RNA utilizando o Kit de síntese de cDNA Primeira Cepa RevertAid™ H Minus (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot/Alemanha). Q-PCR

[00265] Para o experimento o kit q-PCR DyNAmo Colorflash SYBR Green (Finnzymes, 01620 Vantaa, Finlândia) foi utilizado. Uma mistura de DNA foi feita com 1 µl de cDNA, 39 76/111 µl de H2O e 10 µl de corante de amostra amarela. Para cada reação 5 µl da mistura de DNA foi utilizada com 10 µl 2x Dynamo mastermix, 7 µl de H2O, 1 µl a 10 µl de iniciador iniciador e 1 µl a 10 µl de iniciador reverso (números de iniciadores são indicados nos exemplos). O Q-PCR foi executado no sistema em tempo real Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), utilizando o programa, tal como indicado na Tabela 3. Tabela 3: Programa Q-PCR

PROGRAMA 95,0ºC para 5:00 95,0ºC para 0:20 67,0ºC para 0:20 72,0ºC para 0:20 +Placa lida GO TO 2,49 mais vezes Curva de fusão 65,0 a 95,0ºC, incremento 0,5ºC,):05 + Placa lida

FINAL Cepas

[00266] As cepas utilizadas nos experimentos são RN1001, RN1041 e RN1216. RN1041 foi descrita em WO 2012067510. Esta cepa tem o seguinte genótipo: Mat A, ura3-52, leu2-112, his3::ǀoxP, gre3::ǀoxP, IoxP- pTPǀ1::TAL1, IoxP-pTPǀ1::RKI1, IoxP-pTPǀ1-TKL1, ǀoxP-pTPǀ1- RPE1, delta::pADH1-XKS1-tCYC1-LEU2, delta::URA3-pTPǀ1-xyǀA- tCYC1; MAT a = tipo de acasalamento a; mutações ura3-52, leu2-112, HIS3::ǀoxP nos genes URA3, LEU2 e HIS3 respectivamente. A mutação ura3-52 é 77/111 complementada pelo gene URA3 no construto de superexpressão xyǀA; a mutação leu2-112 é complementada pelo gene LEU2 no construto de superexpressão XKS1. A deleção do gene HǀS3 provoca uma auxotrofia da histidina. Por esta razão, RN1041 precisa de histidina no meio para crescimento; gre3::ǀoxP é uma deleção do gene GRE3, que codifica a aldose redutase. O local ǀoxP é deixado para trás no genoma após a remoção do marcador; IoxP-pTPǀ1 designa a superexpressão de genes de, nos experimentos aqui descritos, a via de fosfato pentose não- oxidativa por substituição do promotor nativo pelo promotor do gene TPǀ1. O local loxP a montante do promotor forte, constitutivo TPǀ1 permanece no genoma após a remoção do marcador (Kuyper et al., FEMS Yeast Research 5 (2005) 925- 934); delta: significa integração cromossômica do construto após recombinação nas repetições terminais longos de retrotransposon Ty1; cepa RN1001 é da cepa parental da cepa RN1041, ou seja, antes da deleção do gene HIS3. a cepa RN1216 tem o mesmo genótipo que a cepa RN1041. Exemplo 1 Construção de um plasmídeo de superexpressão de glioxalase

[00267] O GL01 ORF foi obtido a partir de CEN.PK113-7D utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 25 e SEQ ID NO 26. Subsequentemente, a PCR amplificado GL01 ORF foi clonado num vetor rombo TOPO, utilizando o kit de clonagem PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e transformado em E. coli quimicamente competente One Shot® TOP10 de (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Isolamentos de miniprep de 78/111

DNA foram realizados em várias colônias. Os plasmídeos obtidos foram verificados por análise de enzimas de restrição. O plasmídeo correto foi chamado pRN935.

[00268] A superexpressão de GLO1 foi realizada num plasmídeo 2µ. Por conseguinte, um plasmídeo 2µ com o cassete de expressão GLO1 foi construído. A construção do cassete de expressão GL01 com o promotor de PGK1 e terminador PGI1 é mostrado na Figura 1. Os mapas físicos dos plasmídeos contendo estes três elementos, presentes em plasmídeos pRN228, pRN935 e pRN685, são apresentados nas Figuras 2, 3 e 4, respectivamente. Subsequentemente, o cassete de expressão construído GL01 foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 1 (pPGK1-5'-F; Figura 1) e SEQ ID NO 2 (tPGI1-3'-R; figura 1). O produto de PCR foi purificado em coluna usando o kit de extração de gel GeneJET™ (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot/Alemanha), clonado num vetor rombo TOPO, utilizando o kit de clonagem PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e transformado em One Shot TOP10 E. coli quimicamente competente (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Isolamentos de ADN miniprep foram realizados em várias colônias. Os plasmídeos obtidos foram verificados por análise com enzimas de restrição. Dois plasmídeos diferentes foram obtidos, um plasmídeo com o cassete de expressão GL01 inserido na orientação inversa (pRN1048, Figura 5) e um plasmídeo com o cassete de expressão GLO1 inserido na orientação direta (pRN1129, Figura 6). Subsequentemente, o cassete de expressão GLO1, de pRN1048, foi clonado no vetor vaivém de levedura pRN599 (Figura 7) entre os locais KpnI e ApaI. O plasmídeo resultante foi transformado em E. coli quimicamente competente One Shot® TOP10 de (Invitrogen, 79/111

Carlsbad, CA, EUA). Isolamentos de DNA miniprep foram realizados em várias colônias. Os plasmídeos obtidos foram verificados por análise com enzimas de restrição. O plasmídeo correto foi chamado pRN1049 (Figura 8).

[00269] Plasmídeo pRN228 contém os seguintes elementos relevantes: o promotor PGK1 flanqueado por locais de restrição Spel e PstI e um marcador de resistência à canamicina.

[00270] Plasmídeo pRN935 contém os seguintes elementos relevantes: o GLO1 ORF flanqueado por locais de restrição PstI e SaII e um marcador de resistência à canamicina.

[00271] O plasmídeo pRN685 contém os seguintes elementos relevantes: o terminador PGI1 flanqueado por locais de restrição Xhol e HindIII e um marcador de resistência à canamicina.

[00272] Plasmídeo pRN599 contém os seguintes elementos relevantes: uma origem de 2µ de replicação seguido por um marcador kanMX (que consiste de um promotor de Ashbya gossypii TEF1, um gene de resistência KanMX e o TEF1 terminador Ashbya gossypii TEF1) e um marcador de resistência a ampicilina.

[00273] Iniciador da SEQ ID NO 1 é o iniciador direto do promotor de PGK1.

[00274] Iniciador da SEQ ID NO 2 é o iniciador reverso do terminador PGI1.

[00275] Iniciador da SEQ ID NO 25 é o iniciador direto para a amplificação do gene GLO1.

[00276] Iniciador SEQ ID NO 26 é o iniciador reverso para a amplificação do gene GLO1. Exemplo 2 80/111

Transformação da capa de levedura com plasmídeo de superexpressão

[00277] O plasmídeo de superexpressão GLO1 construído pRN1049 foi usado para transformar a cepa da levedura RN1001. Também uma cepa de controle foi criada através da transformação da cepa de levedura RN1001 com o plasmídeo vazio pRN599. Os transformantes corretos foram selecionados em placas de YEP contendo glicose a 2% e 200 µg/ml de G418. A cepa RN1001 contendo pRN1049 é nomeada RN1001GpI. A cepa de controle RN1001 contendo o plasmídeo vazio pRN599 é nomeada RN1001EpI.

[00278] O nível de expressão GLO1 em RN1001Gpl foi determinado com Q-PCR. A cepa de controle RN1001Epl foi utilizada como uma referência. Para este experimento, ambas as cepas foram cultivadas durante a noite em meio YEP contendo glicose a 2% e 200 µg/ml de G418. Subsequentemente, o RNA foi isolado a partir das culturas e foi verificado para a contaminação genômica de DNA por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4. Nenhuma contaminação foi encontrada. Em seguida, uma síntese de cDNA foi realizada no RNA utilizando o kit RevertAid (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot/Alemanha). Em seguida um experimento de Q- PCR foi feito com os iniciadores SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6. Dois genes de manutenção foram usados como uma referência, ALG9 utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 7 e SEQ ID NO 8 e UBC6 utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 9 e SEQ ID NO 10. Os dados de expressão de GLO1 foram normalizados no gene de manutenção com os melhores valores de CT Duplo, neste caso ALG9. A cepa RN1001GpI mostrou uma expressão maior de GLO1 em comparação com RN1001EpI (Figura 9). Tal como indicado na 81/111

Figura 9, o nível de expressão normalizado do gene GLO1 foi cerca de 5 vezes maior na cepa RN1001GpI em comparação com RN1001EpI, enquanto que a expressão normalizada do gene UBC6 foi o mesmo em ambas as cepas.

[00279] Iniciador SEQ ID NO 3 é idêntica a uma sequência do gene ACT1.

[00280] Iniciador da SEQ ID NO: 4 é idêntica a uma sequência do gene ACT1.

[00281] Iniciador da SEQ ID NO 5 é idêntica a uma sequência do gene GLO1.

[00282] Iniciador da SEQ ID NO 6 é idêntica a uma sequência do gene GLO1.

[00283] Iniciador da SEQ ID NO: 7 é idêntica a uma sequência do gene ALG9.

[00284] Iniciador da SEQ ID NO: 8 é idêntica a uma sequência do gene ALG9.

[00285] Iniciador da SEQ ID NO 9 é idêntica a uma sequência do gene UBC6.

[00286] Iniciador da SEQ ID NO 10 é idêntica a uma sequência do gene UBC6. Exemplo 3 Experimentos AFM

[00287] Após verificação da maior expressão GLO1 em RN1001Gpl em comparação com a cepa de controle RN1001Epl por Q-PCR (Exemplo 2), um experimento de AFM foi iniciado para determinar a taxa de conversão dos açúcares apresentados para etanol medindo a produção de CO2 durante o experimento, uma vez que etanol e CO2 estão sendo produzidos em quantidades equimolares. Durante o experimento, as amostras de HPLC das culturas foram tomadas em diferentes pontos de tempo, a fim 82/111 de determinar a taxa de consumo de glicose e xilose e a taxa de produção de etanol.

[00288] Pré-culturas foram feitas em ambas as cepas, por inoculação de um material de célula a partir da placa de ágar em 100 ml de YEP contendo glicose a 2% e 200 µl/ml de G418. No dia seguinte, 400 ml de meio mineral contendo 2% de glicose e 2% de xilose foi inoculado com material de células a partir das pré-culturas. Nenhum G418 foi adicionado ao meio mineral no experimento de AFM.

[00289] As curvas de produção de CO2 (Figura 10) exibem uma mais rápida e maior taxa de produção de CO2 em RN1001Gpl em comparação com RN1001EpI, indicando um consumo de glicose e xilose mais rapidamente na RN1001Gpl em comparação com a cepa de controlo RN1001Epl. Dados de HPLC (Tabelas 4 e 5, e Figura 11) confirmaram as taxas de consumo de xilose mais rapidamente na cepa RN1001Gpl em comparação com a cepa RN1001EpI. A glicose foi já consumida no segundo ponto do tempo (16,5 horas), o que não foi o caso na cepa RN1001Epl. Tabela 4: Dados de HPLC de RN1001GpI Tempo (h) Glicose (g/l) Xilose (g/l) Etanol (g/l) 0 21,4 20,2 0,0 16,5 0,1 8,8 20,0 18,5 0,0 5,2 16,1 21 0,0 1,9 16,6 22,5 0,0 0,8 17,0 24,5 0,0 0,3 17,3 40 0,0 0,0 17,6 Tabela 5: Dados de HPLC de RN1001EpI Tempo (h) Glicose (g/l) Xilose (g/l) Etanol (g/l) 0 21,4 20,3 0,0 83/111

16,5 0,3 13,4 17,7 18,5 0,0 9,1 14,4 21 0,0 4,5 15,8 22,5 0,0 2,0 16,8 24,5 0,0 0,6 17,5 40 0,0 0,1 17,9

[00290] Uma vez que não foi adicionado G418 para o experimento AFM, foi determinado qual o número de células ainda continha seu plasmídeo. Portanto, no fim do último experimento de AFM a mesma quantidade de cultura de células foi vertida em placas de ágar de YEPD e placas de ágar de YEPD contendo G418. Quatro vezes mais colônias foram obtidas nas placas de ágar sem G418. Estes resultados mostraram que aproximadamente 25% das células ainda continham o seu plasmídeo, indicando perda de plasmídeo em ambas RN1001GpI e RN1001EpI. Portanto, novos transformantes foram construídos, que contêm uma cópia extra, constitutivamente expressa do gene GLO1, estavelmente integrada no genoma. Exemplo 4 Construção dos fragmentos integrativos

[00291] Para superar o problema da perda de plasmídeo durante o experimento de AFM, o cassete de expressão GLO1 foi integrado no genoma das cepas de levedura em conjunto com HIS3 para seleção de transformantes corretos. Para este fim, um plasmídeo foi construído contendo o cassete de expressão GLO1 e o cassete de expressão de HIS3. O cassete de expressão de GLO1 (presente em pRN1129) e o cassete de expressão de HIS3 (presente em pRN324) foram extraídos a partir do plasmídeo usando as enzimas de restrição Sphl e PvuII ou 84/111

ApaLI (Figuras 6 e 12). Subsequentemente, ambos os fragmentos foram ligados em conjunto no local PvuII. O fragmento resultante foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 11 e SEQ ID NO 12, clonado num vetor rombo TOPO, utilizando o kit de clonagem PCR Zero Blunt® TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e transformado em E. coli quimicamente competente One Shot® TOP10 de (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Isolamentos de DNA miniprep foram realizados em várias colônias. Os plasmídeos obtidos foram verificados por análise de restrição de enzima. O plasmídeo correto foi chamado pRN1142 (Figura 13).

[00292] Subsequentemente, o GLO1 e fragmento HIS3 foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 11 e SEQ ID NO 12 e pRN1142 como molde. Para criar uma cepa de controle, o cassete de expressão de HIS3 foi amplificado por PCR com os iniciadores SEQ ID NO 11 e SEQ ID NO 13 e pRN324 como molde. Para a integração no genoma, dois flancos de 500 pb necessários para ser obtidos de um local de integração (INT1), um mapa do local de integração é dado na Figura 14 (obtido a partir de http://www.yeastgenome.org/). Um flanco 5' e 3' 500 pb, para a integração INT1, foram amplificados por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 14 e SEQ ID NO para o flanco 5' e iniciadores SEQ ID NO 16 e SEQ ID NO 17 para flanco 3'. Como um modelo de DNA genômico a partir de RN1001 foi usado. Todas as reações de PCR foram purificadas sobre coluna usando o kit de Gel Extraction GeneJET™ (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot/Alemanha). A sequência de nucleotídeos de flanco 5' está incluída como SEQ ID NO 18 e o do flanco 3' como SEQ ID NO 19.

85/111

[00293] O plasmídeo pRN324 contém os seguintes elementos relevantes: o cassete de expressão de HIS3 flanqueado por locais de restrição ApaLI e PvuII, e um marcador de resistência à ampicilina.

[00294] O plasmídeo pRN1129 contém os seguintes elementos relevantes: o cassete de expressão de GLO1 (consistindo do promotor de PGK1, o GLO1 ORF e o terminador PGL1 terminador) flanqueado por locais de restrição Sphl e PvuII, e um marcador de resistência à canamicina.

[00295] Iniciador da SEQ NO 11 é a iniciador direto do cassete HIS3, que consiste de 25 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 3' do 5' do flanco 500 bp INT1.

[00296] Iniciador da SEQ NO 12 é iniciador reverso do cassete de GLO1, que consiste de 25 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 5' a 3' do flanco 500 pb INT1.

[00297] Iniciador da SEQ NO 13 é o iniciador reverso do cassete HIS3, que consiste em 25 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 5' a 3' do flanco 500 pb INT1.

[00298] Iniciador da SEQ ID NO 14 é o iniciador direto de 5' do flanco 500 pb INT1.

[00299] Iniciador da SEQ ID NO 15 é o iniciador reverso da extremidade 5' do flanco 500 pb INT1.

[00300] Iniciador da SEQ ID NO 16 é o iniciador direto da extremidade 3' do flanco 500 pb INT1.

[00301] Iniciador da SEQ ID NO 17 é o iniciador reverso da extremidade 3' do flanco 500 pb INT1.

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[00302] Todas as sequências dos iniciadores mencionados acima também são indicadas na Figura 15. Exemplo 5 Transformação de cepas de levedura com fragmentos integrativos

[00303] O mecanismo de integração dos fragmentos do PCR no genoma é esquematicamente mostrado na Figura 15. Os fragmentos de PCR obtidos (Exemplo 4) foram utilizados para transformar as cepas RN1041 e RN1216, ambos contendo uma auxotrofia para a histidina. Os transformantes corretos foram selecionados em placas de YNB contendo 2% de glicose. Os transformantes foram verificados com a colônia de PCR, utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 14 e SEQ ID NO 17, para a integração dos cassetes de expressão no genoma. A cepa RN1041 contendo os cassetes de expressão de HIS3 e GLO1 é denominada RN1041HG, e a cepa de controle RN1041 contendo o cassete de expressão de HIS3 é chamada RN1041H. A cepa RN1216 contendo os cassetes de expressão HIS3 e GLO1 é denominada RN1216HG, e a cepa de controle RN1216 contendo o cassete de expressão HIS3 é denominada RN1216H.

[00304] Para ambas as cepas de controle, RN1041H e RN1216H, uma colônia de cada uma foi selecionada para Q-PCR. De RN1041HG e RN1216HG, duas colônias individuais foram selecionadas para cada uma Q-PCR (clone 1 e clone 2).

[00305] A expressão do gene GLO1 nos transformantes foi verificada num experimento Q-PCR. Para o experimento de Q-PCR todas as cepas selecionadas foram crescidas durante a noite no meio de YEP contendo 2% de glicose. Subsequentemente, o RNA foi isolado a partir das culturas e foi verificada a contaminação de DNA genômico por PCR, utilizando os 87/111 iniciadores da SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4. Nenhuma contaminação foi encontrada. Em seguida, uma síntese de cDNA foi realizada no RNA utilizando o kit RevertAid (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot/Alemanha). Em seguida um experimento Q-PCR foi realizado com os iniciadores de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO

6. Dois genes de manutenção foram usados como uma referência, ALG9 utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 7 e SEQ ID NO 8 e UBC6 utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 9 e SEQ ID NO 10. Os dados de expressão GLO1 foram normalizados no gene de manutenção com os melhores valores duplo CT, neste caso UBC6. Todas as quatro cepas contendo HIS3 e GLO1 mostraram uma expressão maior normalizada de GLO1, em comparação com a sua cepa de controle (Figura 16), cerca de 4 a 5 vezes maior no anterior RN1041 em comparação com ALG9 e cerca de 2 a 3 vezes maior no anterior RN1216. Exemplo 6 Experimentos AFM

[00306] Após a verificação da maior expressão de GLO1 em todas as quatro cepas contendo HIS3 e GLO1 em comparação com a sua cepa de controle por Q-PCR (Exemplo 5), um experimento AFM foi iniciado para determinar a taxa de conversão dos açúcares em etanol apresentados pela medição da produção de CO2 durante o experimento, uma vez que etanol e CO2 estão a ser produzidos em quantidades equimolares. Durante o experimento, as amostras de HPLC das culturas foram tomadas em diferentes pontos de tempo, a fim de determinar a taxa de consumo de açúcar e a taxa de produção de etanol. As mesmas 6 cepas foram testadas neste experimento AFM que foram utilizados no experimento de Q-PCR para a determinação da expressão de GLO1.

88/111

[00307] Pré-culturas foram feitas de todas as 3 cepas derivadas de RN1041 (RN1041H, RN1041HG-1 e RN1041HG-2), por inoculação de algum material de células da placa em 100 ml de YEP contendo 2% de glicose. O próximo dia 400 ml de meio mineral contendo 2% de glicose e 2% de xilose foi inoculado com material de células a partir das pré-culturas.

[00308] As curvas de produção de CO2 das cepas derivadas de RN1041 (Figura 17) mostraram taxas mais rápidas e mais elevadas de produção de CO2 em RN1041HG (clones 1 e 2) em comparação com RN1041H, que indica um consumo rápido de glicose e xilose em RN1041HG (clone 1 e 2) em comparação com a cepa de controle RN1041H. Os dados de HPLC (Tabelas 6, 7 e 8, e Figura 18) efetivamente confirmam consumo mais rápido de xilose em RN1041HG (clone 1 e 2) em comparação com a cepa RN1041H, a glicose foi consumida já no segundo ponto de tempo (15 horas). Tabela 6: Dados de HPLC de RN1041H Tempo (h) Glicose (g/l) Xilose (g/l) Etanol (g/l) 0 20,9 20,7 0,0 0,3 16,1 14,2 17 0,0 14,5 12,5 19 0,0 12,3 12,6 21 0,0 9,6 13,4 23 0,0 7,1 14,5 39 0,0 0,5 17,5 Tabela 7: Dados de HPLC de RN1041HG-1 Tempo (h) Glicose (g/l) Xilose (g/l) Etanol (g/l) 0 20,8 20,8 0,0 15 0,6 15,4 14,0 17 0,0 13,4 12,9 89/111

19 0,0 10,6 13,1 21 0,0 7,5 14,2 23 0,0 4,6 15,6 39 0,0 0,4 17,6 Tabela 8: Dados de HPLC de RN1041HG-2 Tempo (h) Glicose (g/l) Xilose (g/l) Etanol (g/l) 0 21,3 21,3 0,0 0,1 15,3 13,3 17 0,0 12,5 13,6 19 0,0 9,4 14,2 21 0,0 6,2 15,6 23 0,0 3,3 16,6 39 0,0 0,2 18,2

[00309] Estes resultados mostraram claramente que a superexpressão do gene GLO1 leva a uma fermentação rápida e mais eficiente dos açúcares da biomassa, conduzindo a uma redução do tempo de fermentação. Isto significa que os açúcares são mais eficientemente a ser convertidos em etanol.

[00310] Um novo experimento AFM foi iniciado com as cepas derivadas de RN1216. Pré-culturas foram feitas de todas as 3 cepas (RN1216H, RN1216HG-1 e RN1216HG-2), através da inoculação de algum material de célula da placa de ágar em 100 ml de YEP contendo 2% de glicose. No dia seguinte, 400 ml de meio mineral contendo 5% de glicose e 5% de xilose foi inoculado com material de células das pré-culturas.

[00311] As curvas de produção de CO2 de RN1216 (Figura 19) mostraram maiores e mais rápidas taxas de produção de C02 em RN1216HG (clone 1 e 2) em comparação com RN1216H, indicando uma glicose mais rápida, mais eficiente e consumo 90/111 de xilose em RN1216HG (clone 1 e 2) conforme comparado com a cepa de controle RN1216H.

Dados de HPLC (Tabelas 9, 10 e 11, e Figura 20) confirmaram um consumo mais rápido de glicose e xilose nas cepas RN1216HG (clone 1 e 2), em comparação com a cepa RN1216H.

Tabela 9: Dados de HPLC de RN1216H Tempo (h) Glicose (g/l) Xilose (g/l) Etanol (g/l) 0 52,5 51,4 0,0 4 49,8 50,5 0,7 8 45,9 50,3 2,2 12 39,1 49,6 5,1 16 28,5 48,6 10,0 14,7 47,0 16,8 24,5 1,4 44,2 28,5 39,5 0,2 27,5 35,1 43,5 0,0 21,0 36,5 47,5 0,0 16,1 38,5 112 0,0 2,1 45,4 Tabela 10: Dados de HPLC de RN1216HG-1 Tempo (h) Glicose (g/l) Xilose (g/l) Etanol (g/l) 0 52,5 51,3 0,0 4 49,6 50,4 0,7 8 45,5 50,1 2,3 12 38,1 49,4 5,5 16 26,8 48,3 10,8 20 12,0 46,2 18,1 24,5 0,2 42,1 28,9 39,5 0,0 22,7 36,5 43,5 0,0 15,2 38,8

91/111

47,5 0,0 10,4 40,7 112 0,0 1,1 45,5 Tabela 11: Dados de HPLC de RN1216HG-2 Tempo (h) Glicose (g/l) Xilose (g/l) Etanol (g/l) 0 52,5 51,4 0,0 4 49,6 50,4 0,8 8 44,9 50,0 2,6 12 37,2 49,3 6,0 16 25,9 47,9 11,3 11,5 45,8 18,6 24,5 0,2 41,0 29,1 39,5 0,0 17,5 38,5 43,5 0,0 12,4 40,2 47,5 0,0 7,3 42,4 112 0,0 0,8 45,7

[00312] Estes resultados reconfirmaram os resultados anteriores: a superexpressão do gene GL01 leva a uma fermentação mais rápida e mais eficiente dos açúcares de biomassa, nesse caso, xilose e glicose, levando a uma redução do tempo total de fermentação e uma conversão mais eficiente de açúcares acima mencionados em etanol. Exemplo 7 Variantes de GL01

[00313] Homólogos de GL01, a partir de outros organismos do que S. cerevisiae, são expressos na mesma forma como descrito nos exemplos anteriores. Para esse fim, as sequências de genes foram sintetizadas com base nas sequências de proteína listadas como SED ID NO: 20 a SEQ ID NO: 24. A sequência do quadro de leitura aberto foi gerada 92/111 pelo método descrito em WO/2008/000632. As sequências de proteína são derivadas de Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Zygosaccharomyces rouxii, Kluyveromyces lactis e Candida magnoliaee. Como referência, o gene de GL01 do tipo selvagem de S. cerevisiae (ver exemplos anteriores) é usado.

[00314] Os construtos assim obtidos são utilizados para transformar cepa RN1216, como descrito nos exemplos anteriores.

[00315] Todos os transformantes mostraram as taxas de consumo de açúcar aumentadas quando testados em um experimento AFM (ver também o exemplo 10), ambos com base em perfis de dióxido de carbono e concentrações reais de açúcar durante o experimento.

[00316] Em uma modalidade, as seguintes assinaturas, que estão presentes em algumas versões de GL01 ativo, especialmente em termos de melhorar a co-fermentação de substratos de açúcar misturados, são como se segue: Tabela 12: Padrões da assinatura de GL01

[00317] Na tabela 12, X designa um aminoácido (isto é qualquer aminoácido).

[00318] Se os resíduos de dois aminoácidos são mencionados entre parêntesis, qualquer um se aplica (por exemplo, (F, Y)).

[00319] Pequenas letras designam variantes menores, por exemplo (F, i) significa que, na maioria dos casos, o 93/111 aminoácido F é observado, mas em alguns casos aminoácido I (isoleucina). Exemplo 8 Construção dos fragmentos integrativos

[00320] Os homólogos de GL01 foram integrados no genoma da cepa de levedura RN1216 juntamente com HIS3 para seleção de transformantes corretos. Para esse fim, foram construídos plasmídeos, cada um contendo um homólogo de GL01 diferente, juntamente com o promotor de PGK1 e terminador de PGl1. Os plasmídeos foram construídos de acordo com o método descrito em PCT/EP2013/056623. Os plasmídeos foram chamados pDB1175 (Figura 21), pDB1176 (Figura 22), pDB1177 (Figura 23), pDB1178 (Figura 24) e pDB1179 (Figura 25).

[00321] Subsequentemente, os diferentes cassetes de expressão de GL01 foram amplificados por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 28 e SEQ ID NO 29 e pDB1175, pDB1176, pDB1177, pDB1178 e pDB1179 como molde. O cassete de expressão de HIS3 foi amplificado por PCR utilizando SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO 31 e pRN324 (Figura 12) como molde. Para integração no genoma, dois flancos de 500 pb necessários para ser obtidos de um sítio de integração (INT1) (descrito no exemplo 4). Um flanco 5' e 3' de 500 pb, para a integração a INT1, foram amplificados por PCR utilizando os iniciadores da SEQ ID NO 14 e SEQ ID NO 32 para o flanco 5' e os iniciadores da SEQ ID NO 33 e SEQ ID NO 17 para o flanco 3'. Como um molde de DNA genômico de RN1001 foi usado. Todas as reações de PCR foram purificadas sobre coluna usando o kit GeneJET ™ Gel Extraction (Fermentas, 68789 St. Leon-Rot/Alemanha).

[00322] O plasmídeo pDB1175 contém os seguintes elementos relevantes: o cassete de expressão Sc_GL01 (consistindo no 94/111 promotor de PGK1, o par de códons otimizados de GL01 ORF de Saccharomyces cerevisiae e o terminador PGl1), e um marcador de resistência à canamicina.

[00323] O plasmídeo pDB1176 contém os seguintes elementos relevantes: o cassete de expressão Cgla_GL01 (consistindo no promotor de PGK1, o par de códons otimizados de GL01 ORF de Candida glabrata e terminador de PGl1), e um marcador de resistência à canamicina.

[00324] Plasmídeo pDB1177 contém os seguintes elementos relevantes: o cassete de expressão Zrou_GL01 (que consiste no promotor de PGK1, o par de códons otimizados de GL01 ORF de Zygosaccharomyces rouxii e terminador de PGl1), e um marcador de resistência à canamicina.

[00325] Plasmídeo pDB1178 contém os seguintes elementos relevantes: o cassete de expressão de KI_GL01 (que consiste no promotor de PGK1, o par de códons otimizados de GL01 ORF de Kluyveromyces lactis e terminador de PGl1), e um marcador de resistência à canamicina.

[00326] O plasmídeo pOB1179 contém os seguintes elementos relevantes: o cassete de expressão Cmag_GL01 (consistindo no promotor de PGK1, o par de códons otimizados de GL01 ORF de Candida magnoliaee e terminador de PGl1), e um marcador de resistência à canamicina.

[00327] O plasmídeo pRN324: descrito no exemplo 4.

[00328] Iniciador da SEQ ID NO 28 é o iniciador direto dos cassetes de expressão de GL01 homólogo (incluindo o promotor e terminador). Iniciador de SEQ NO 29 é o iniciador reverso dos cassetes de expressão de GLO1 homólogo (incluindo de promotor e terminador).

95/111

[00329] Iniciador da SEQ ID NO: 30 é o iniciador direto do cassete de HIS3, que consiste de 20 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 3' dos cassetes de expressão de GL01 homólogo.

[00330] Iniciador da SEQ ID NO 31 é o iniciador reverso do cassete de HIS3, que consiste de 21 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos de a extremidade 5' do flanco 3' de 500 pb INT1.

[00331] Iniciador SEQ ID NO 32 é iniciador reverso do flanco 5' de 500 pb INT1, que consiste de 23 nucleotídeos e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 5' dos cassetes de expressão de GL01 homólogo.

[00332] Iniciador da SEQ ID NO 33 é o iniciador direto de flanco 3' de 500 pb INT1, que consiste em 24 nucleotídeos, e uma cauda de 50 nucleotídeos na extremidade 5 ', idênticos aos 50 nucleotídeos da extremidade 3' do cassete de expressão de HIS3.

[00333] Todas as sequências dos iniciadores mencionadas acima também são indicadas na Figura 26. Exemplo 9 Transformação da cepa de levedura com fragmentos integrativos

[00334] O mecanismo de integração dos fragmentos de PCR no genoma é esquematicamente mostrado na Figura 26. Os fragmentos de PCR obtidos (Exemplo 8) foram utilizados para transformar a cepa RN1216 que contém uma auxotrofia por histidina. Os transformantes corretos foram selecionados em placas de YNB contendo 2% de glicose. Os transformantes foram verificados com PCR de colônia, utilizando os iniciadores da 96/111

SEQ ID NO 14 e SEQ ID NO 17, para a integração dos cassetes de expressão no genoma. Cepas corretas foram nomeadas como o seguinte: RN1216 ScG_H, RN1216 CglaG_H, RN1216 ZrouG_H, RN1216 KIG_H e RN1216 CmagG_H.

[00335] A cepa RN1216 ScG_H contém o cassete de expressão Sc_GL01 e o cassete de expressão de HIS3. A cepa RN1216 CglaG_H contém o cassete de expressão de Cgla_GL01 e o cassete de expressão HIS3.

[00336] A cepa RN1216 ZrouG H contém o cassete de expressão Zrou GL01 e o cassete de expressão de HIS3.

[00337] A cepa RN1216 KIG_H contém o cassete de expressão de KI_GL01 e o cassete de expressão de HIS3.

[00338] A cepa RN1216 CmagG_H contém o cassete de expressão de Cmag_GL01 e o cassete de expressão de HIS3. Exemplo 10 Experimento AFM

[00339] Um experimento AFM foi iniciado para determinar a taxa de conversão dos açúcares presentes em etanol pela medição da produção de CO2 durante o experimento, uma vez que etanol e CO2 estão sendo produzidos em quantidades equimolares. Durante o experimento, as amostras de HPLC das culturas foram tomadas em diferentes pontos de tempo, a fim de determinar a taxa de consumo de açúcar e a taxa de produção de etanol. As cepas testadas nesse experimento AFM são as 5 cepas construídas descritas no exemplo 9, e como cepa de controle a cepa RN1216H foi utilizada a qual é descrita no exemplo 5.

[00340] Pré-culturas foram feitas de todas as seis cepas, por inoculação de um material celular da placa em 100 ml de YEP contendo 2% de glicose. No dia seguinte, 400 ml de meio 97/111 mineral contendo 5% de glicose e 5% de xilose foi inoculado com material celular das pré-culturas.

As curvas de produção de CO2 das cepas derivadas de RN1216 (Figura 27) mostraram taxas de produção de CO2 maiores e mais rápidas em RN1216 ScG_H, RN1216C glaG_H, RN1216 KIG_H e RN1216 CmagG_H em comparação com RN1216H, indicando um consumo mais rápido de glicose e xilose nestas 4 cepas variantes de GL01 em comparação com a cepa de controle RN1216H.

A cepa RN1216 ZrouG_H mostrou taxas de produção de CO2 e maiores e mais rápidas nas primeiras 20 horas do experimento em comparação com RN1216H, indicando um consumo de xilose mais rápido e mais lento da glicose em comparação com as outras 5 cepas testadas nesse experimento AFM.

Os dados de HPLC (Tabelas 13, 14, 15, 16, 17, 18 e Figuras 28, 29, 30, 31, 32, 33) de fato confirmar consumo rápido de glicose e xilose nas cepas RN1216 ScG_H, RN1216 CglaG_H, RN1216 KIG_H e RN1216 CmagG_H em comparação com a cepa RN1216H.

Os dados HPLC também confirmam o consumo mais rápido de glicose nas cepas RN1216 ZrouG_H em comparação com as outras 5 cepas testadas nesse experimento AFM.

Tabela 13: Dados de HPLC de RN1216 ScG_H Tempo (h) Glicose(g/l) Xilose(g/l) Etanol (g/l) 0 50,2 52,9 0,0 8 46,8 51,5 2,5 12 40,5 52,4 5,5 16 28,5 53,6 10,9 13,0 48,6 17,6 24 3,3 46,2 22,9 28 0,2 40,2 26,0 32 0,0 33,0 28,5

98/111

36 0,0 19,7 35,1 40 0,0 7,9 41,2 44 0,0 2,6 44,0 48 0,0 1,1 44,5 Tabela 14: Dados de HPLC de RN1216 CglaG_H Tempo (h) Glicose(g/l) Xilose(g/l) Etanol (g/l) 0 50,4 53,2 0,0 4 49,6 53,1 1,3 8 49,0 55,1 2,4 16 29,1 53,4 10,5 9,6 46,5 19,5 24 1,2 43,6 24,1 28 0,0 35,2 28,9 32 0,0 24,8 32,7 36 0,0 15,0 37,6 40 0,0 7,7 44,7 44 0,0 3,1 44,1 48 0,0 1,2 44,8 Tabela 15: Dados de HPLC de RN1216 de ZrouG_H Tempo (h) Glicose(g/l) Xilose(g/l) Etanol (g/l) 0 50,3 53,0 0,0 4 48,6 53,1 0,7 12 38,4 51,2 5,1 16 26,1 53,1 11,3 20 3,5 46,8 21,8 24 0,4 44,0 24,1 28 0,0 36,8 28,2 32 0,0 29,4 30,6 36 0,0 21,6 34,5

99/111

40 0,0 15,4 37,9 44 0,0 10,3 40,7 48 0,0 6,7 42,3 Tabela 16: Dados de HPLC de RN1216 KIG_H Tempo (h) Glicose(g/l) Xilose(g/l) Etanol (g/l) 0 50,5 53,0 0,0 8 47,8 53,8 1,7 16 30,8 53,3 9,6 11,8 45,5 18,5 24 1,1 41,0 24,6 28 0,2 33,9 25,6 32 0,0 27,7 31,0 36 0,0 15,8 37,4 40 0,0 7,9 41,6 44 0,0 3,3 44,3 48 0,0 1,4 44,8 Tabela 17: Dados de HPLC de RN1216 CmagG_H Tempo (h) Glicose(g/l) Xilose(g/l) Etanol (g/l) 0 50,5 52,8 0,0 4 46,5 50,3 3,2 8 40,4 49,4 7,1 12 33,3 49,6 9,0 16 31,0 52,3 9,9 24 2,3 43,6 23,8 28 0,0 35,4 28,9 32 0,0 24,6 32,7 36 0,0 14,5 37,8 40 0,0 6,8 41,6 44 0,0 2,5 44,1

100/111

48 0,0 0,9 44,8 Tabela 18: Dados de HPLC de RN1216H Tempo (h) Glicose(g/l) Xilose(g/l) Etanol (g/l) 0 50,5 52,9 0,0 8 45,7 51,1 4,2 12 34,6 51,0 7,1 16 27,8 50,0 9,9 16,3 50,7 15,8 24 6,8 47,8 20,7 28 1,1 44,6 24,1 32 0,0 39,2 25,8 36 0,0 28,0 31,6 40 0,0 12,8 30,8 44 0,0 8,9 41,5 48 0,0 5,3 42,7

[00341] Estes resultados mostram que a superexpressão do gene GL01 derivadas das cepas de S. cerevisiae, C.glabrata, K. lactis ou C. magnoliaee leva a uma fermentação mais rápida e mais eficiente dos açúcares de biomassa, nesse caso, xilose e glicose, levando à redução do tempo da fermentação total e conversão mais eficiente dos açúcares acima mencionados em etanol. Uma exceção é a superexpressão do gene GL01 derivado da cepa Z. rouxii, que mostra um consumo mais rápido da glicose em comparação com as outras cepas testadas nesse experimento, mas o desempenho completo dessa cepa é pior.

101/111

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula, caracterizada pelo fato de que é capaz de converter um ou mais açúcares de pentose e um ou mais açúcares de hexose em produto de fermentação que expressam constitutivamente um ou mais polipeptídeos heterólogos ou homólogos tendo a sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO:20 ou um polipeptídeo variante da mesma, tendo pelo menos 45% de identidade com a SEQ ID NO 20.

2. Célula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo heterólogo tem atividade de glioxalase, preferivelmente, atividade de glioxalase I.

3. Célula, caracterizada pelo fato de que é capaz de converter um ou mais açúcares de pentose e ou um ou mais açúcares de hexose em produto de fermentação compreendendo um polinucleotídeo heterólogo ou homólogo constitutivamente expresso que compreende: (a) a sequência de nucleotídeos como definida na SEQ ID NO: 27; (b) uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 27; (c) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos como definida em (a), (b) ou (c) tendo pelo menos 100 nucleotídeos; (d) uma sequência que é degenerada como resultado do código genético para uma sequência definida em qualquer um de (a), (b), ou (c); (e) uma sequência de nucleotídeos que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeos definida em (a), (b), (c), ou (d).

102/111

4. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase.

5. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a célula compreende uma ou mais modificações genéticas resultantes em: (a) aumento do transporte de xilose na célula; (b) um aumento na atividade da xilulose quinase; (c) um aumento no fluxo através da via da pentose fosfato; (d) uma diminuição na atividade da aldose redutase; (e) uma diminuição na sensibilidade à repressão catabólica; (f) um aumento da tolerância ao etanol, osmolaridade ou ácidos orgânicos; ou (g) uma produção reduzida de subprodutos.

6. Célula de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que uma ou mais modificações genéticas resultam na superexpressão de pelo menos um gene que codifica uma enzima da parte não-oxidativo da via da pentose fosfato.

7. Célula de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o gene é um gene que codifica uma ribulose- 5- fosfato isomerase, uma ribulose-5-fosfato epimerase, uma transcetolase ou uma transaldolase.

8. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 7, caracterizada pelo fato de que uma ou mais modificações genéticas resultam na superexpressão de um gene que codifica uma xilulose quinase.

9. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 8, caracterizada pelo fato de que uma ou mais modificações 103/111 genéticas resultam em uma diminuição da atividade da aldose redutase na célula.

10. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 9, caracterizada pelo fato de que tem a capacidade de utilizar L-arabinose, em que os genes TAL1, TKL1, RPE1 e RK/1 são superexpressos.

11. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a região de codificação do gene GRE3 é inativada por substituição da região de codificação com uma sequência de nucleotídeos compreendendo os genes TAL1, TKL1, RPE1 e RK/1.

12. Célula de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que os genes araA, araB e araD são expressos.

13. Célula de acordo com a reivindicação qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que um ou mais genes constitutivamente expressos ou constitutivamente superexpressos são integrados de forma estável no genoma da célula.

14. Processo para a produção de um produto da fermentação, caracterizado pelo fato de que o processo compreende a fermentação de um meio contendo uma fonte de xilose e/ou arabinose com uma célula definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, de tal modo que a célula fermenta xilose e/ou o produto da fermentação.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o produto da fermentação é escolhido da lista que inclui etanol, butanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, 104/111 ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, uma β-lactama e uma cefalosporina.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o produto da fermentação é etanol.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o processo é anaeróbio.

18. Vetor de clonagem ou expressão, caracterizado pelo fato de que compreende (a) a sequência de nucleotídeos como definida na SEQ ID NO: 27; (b) uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 27; (c) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos como definida em (a), (b) ou (c) tendo pelo menos 100 nucleotídeos; (d) uma sequência que é degenerada como resultado do código genético para uma sequência definida em qualquer um de (a), (b), ou (c); (e) uma sequência de nucleotídeos que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeos definida em (a), (b), (c), ou (d).

19. Constructo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a sequência de nucleotídeos como definida na SEQ ID NO: 27; 105/111

(b) uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 27; (c) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos como definida em (a), (b) ou (c) tendo pelo menos 100 nucleotídeos; (d) uma sequência que é degenerada como resultado do código genético para uma sequência definida em qualquer um de (a), (b), ou (c); (e) uma sequência de nucleotídeos que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeos definida em (a), (b), (c), ou (d).

20. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que (a) a sequência de nucleotídeos como definida em qualquer uma das SEQ ID NO: 34 a 38; (b) uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 34 a 38; (c) um fragmento de uma sequência de nucleotídeos como definida em (a), (b) ou (c) tendo pelo menos 100 nucleotídeos; (d) uma sequência que é degenerada como resultado do código genético para uma sequência definida em qualquer um de (a), (b), ou (c); (e) uma sequência de nucleotídeos que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeos definida em (a), (b), (c), ou (d).

21. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 34 a 38 e suas degenerações que codificam o mesmo polipeptídeo.

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