CN114908134B - 含有苹果渣酶解液的发酵培养基及生产布拉迪酵母的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含有苹果渣酶解液的发酵培养基及生产布拉迪酵母的方法。通过预处理试验、单因素优化和响应曲面优化酶解条件，将其酶解为葡萄糖进行后续的转化生产，对苹果渣进行高值化和资源化利用，减少苹果渣腐败带来的环境污染问题，为实现苹果渣资源的综合利用奠定基础，具有显著的经济意义和社会价值。将本发明的苹果渣酶解液作为碳源能够生产布拉迪酵母，其可作为饲料添加剂或蛋白质饲料应用于动物生产中，应用前景广阔。

Description

含有苹果渣酶解液的发酵培养基及生产布拉迪酵母的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种含有苹果渣酶解液的发酵培养基及生产布拉迪酵母的方法。
背景技术
2018～2019年，全球苹果总产量已经超过6,860万吨，苹果加工行业每年约排出2,000万吨苹果加工副产品-苹果渣。我国果树起源较早，水果种类较为丰富。苹果树种植面积和苹果总产量为世界总生产水平的三分之一左右，苹果产量位居世界首位，是苹果生产的第一大国。由此可见我国苹果渣产量巨大，目前绝大多数苹果渣被当做废弃物丢弃，仅有少部分作为动物饲料直接饲喂。被遗弃的苹果渣会在短时间内腐败变质，最终造成环境污染和资源浪费。因此，科学、合理地开发利用苹果渣资源至关重要。
苹果渣纤维含量丰富，每千克干物质中含有50～220g可溶性碳水化合物(果糖、葡萄糖和蔗糖等)和380～440g不溶性碳水化合物(纤维素、半纤维素和果胶等)。因此，苹果渣可以作为一种廉价、绿色、可再生的木质纤维素类生物质被利用。
木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。其中纤维素、半纤维素和木质素交联在一起，半纤维素和木质素填充在纤维素大分子所形成的微纤维之间，木质素能够抑制微生物降解其中的纤维素和半纤维素，这种保护作用使酶很难与纤维素表面接触。因此，需要通过物理和化学等方法分离木质纤维素的主要成分，将纤维素和半纤维素水解为葡萄糖等单糖进行后续的转化生产。
葡萄糖是酵母菌发酵培养基的碳源，酵母菌是公认的安全微生物，其中布拉迪酵母作为一种饲料添加剂已经通过欧洲和北美等认证，在人类临床研究中被广泛用于治疗腹泻等疾病。在工业生产中，寻求更为廉价的碳源等原料，以降低生产成本，是生产布拉迪酵母的一个研究方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有苹果渣酶解液的发酵培养基及生产布拉迪酵母的方法。
本发明构思如下：通过筛选预处理方法和优化苹果渣酶解试验条件提高苹果渣葡萄糖的产量，以此酶解液作为碳源生产布拉迪酵母，以降低其生产成本，提高苹果渣的经济价值和社会价值。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种苹果渣酶解液的制备方法，包括以下步骤：
1)向0.5g烘干后的苹果渣中加入10～100％w/v醋酸液50mL，于160℃烘箱中反应20-120min(优选100min)；反应结束后，冷却至室温，进行固液分离，水洗固体成分至中性，烘干，得到预处理后的苹果渣；
2)在反应管中，按料液比18％-20％(优选18.57％)向预处理后的苹果渣中加入pH值为4.8的柠檬酸缓冲液，然后按40-100FPU/g葡聚糖(优选40FPU/g葡聚糖)的量添加纤维素酶，在温度为50℃-60℃(优选59.06℃)、超声功率为100W的条件下进行酶解反应，反应时间为9-10h(优选9.79h)；反应结束后，将反应管放入沸水中灭活酶，离心取上清液即得。
进一步地，步骤1)中醋酸液的pH值为1.9。
进一步地，步骤2)中将反应管放入沸水中煮沸10min将酶灭活。
第二方面，本发明提供按照所述方法制备得到的苹果渣酶解液，其葡萄糖含量高于30g/L。
第三方面，本发明提供所述苹果渣酶解液的以下任一应用：
(1)用于制备培养基；
(2)用于微生物发酵；
(3)作为饲料添加剂。
第四方面，本发明提供一种发酵培养基，其包含所述的苹果渣酶解液。
进一步地，所述发酵培养基是用所述苹果渣酶解液替代YPD培养基中的碳源得到的。
第五方面，本发明提供所述发酵培养基在微生物发酵中的应用。
进一步地，所述微生物为酵母，优选酿酒酵母，更优选布拉迪酵母。
第六方面，本发明提供一种生产布拉迪酵母的方法，利用所述发酵培养基进行布拉迪酵母的发酵生产。
优选地，以1％-2％接种量接种布拉迪酵母，于30℃-37℃，转速200-220rpm的摇床中进行恒温培养。
更优选地，以1％接种量接种布拉迪酵母，于37℃，转速220rpm的摇床中进行恒温培养。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供了利用废弃物苹果渣的新方法，通过预处理试验、单因素优化和响应曲面优化酶解条件，将其酶解为葡萄糖进行后续的转化生产，对苹果渣进行高值化和资源化利用，减少苹果渣腐败带来的环境污染问题，为实现苹果渣资源的综合利用奠定基础，具有显著的经济意义和社会价值。
(二)将本发明的苹果渣酶解液作为碳源能够生产布拉迪酵母，其可作为饲料添加剂或蛋白质饲料应用于动物生产中，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中预处理液体成分分析。
图2为本发明较佳实施例中酶解预试验结果。
图3为本发明较佳实施例中酶解试验单因素优化结果。
图4为本发明较佳实施例中各因素对葡萄糖产量影响的等高线图和响应曲面图。
图5为本发明较佳实施例中不同碳源对布拉迪酵母OD600值随时间变化的影响。
图6为本发明较佳实施例中不同碳源对布拉迪酵母细胞数目随时间变化的影响。
图7为本发明较佳实施例中液态发酵39h后不同碳源对布拉迪酵母湿菌重的影响。
具体实施方式
一方面，本发明旨在通过筛选预处理方法和优化酶解试验条件以提高苹果渣的葡萄糖产量，充分利用苹果渣富含纤维素和半纤维素的特点，有效对苹果渣资源进行开发利用，生产高附加值产品，在一定程度上解决了可再生资源的利用问题。
另一方面，本发明提供苹果渣酶解液的应用方法，可以将其作为微生物发酵培养基的碳源，生产布拉迪酵母，为开发新的饲料添加剂生产方法提供了可能。
本发明采用如下技术方案：
苹果渣预处理条件的筛选和酶解生产葡萄糖的条件优化，并以此为碳源发酵生产布拉迪酵母。
本发明提供一种苹果渣预处理方法。
本发明提供一种酶解苹果渣葡聚糖的方法，通过单因素优化和响应面优化酶解条件，葡萄糖的产量最终达到32.67g/L，有效转化了苹果渣资源。
本发明提供苹果渣酶解液在微生物生产中的应用。
优选地，微生物为布拉迪酵母mafic-1701。
本发明的苹果渣酶解液中葡萄糖含量高达32.67g/L，能够作为微生物培养基的碳源，能有效培养布拉迪酵母，应用前景广阔。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
以下实施例中使用的纤维素酶购自杰能科生物工程有限公司。
布拉迪酵母mafic-1701可参见文献Administration of Saccharomycesboulardii mafic-1701improves feed conversion ratio,promotes antioxidantcapacity,alleviates intestinal inflammation and modulates gut microbiota inweaned piglets,Wenxiu Zhang,Journal of Animal Science and Biotechnology 202011:112)。菌株mafic-1701由中国农业大学动物科技学院曹云鹤老师课题组提供。
原始YPD培养基的配制如下：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，加水定容至1L，115℃高压灭菌15min，晾凉后使用。
实施例1苹果渣预处理试验
预处理试验分为硫酸预处理(H)组和醋酸预处理(C)组，每个处理组的温度均设定在120～160℃，每个温度条件包含4个处理组，调节对应酸液的pH值和反应时间使H组和C组各温度条件下4个处理组的组合严重因子分别在0～0.5、0.5～1.0、1.0～1.5和1.5～2.0之间。
H组反应时间范围为1～30min，硫酸浓度范围为0.25～2％(w/v)，对应pH值范围为0.4～1.6。C组反应时间范围为10～700min，醋酸浓度范围为10～100％(w/v)，对应pH值范围为1.8～2.3。分组设计见表1。
具体技术方案为：称取0.5g烘干后的苹果渣于100mL蓝口瓶中，加入50mL对应酸液，放入烘箱中进行预处理反应。反应结束后，立即冷却至室温。
实施例2预处理后固体成分、液体成分分析
用G3砂芯漏斗抽滤，分离实施例1反应后的固体成分和液体成分。用超纯水冲洗固体成分至中性，50℃烘干至完全干燥，称重，计算固体成分的固形物得率。称取0.5g此固体成分，加入3mL硫酸(72％)，30℃水浴1h，加入84mL超纯水，G3砂芯漏斗抽滤，分离滤液和滤渣。取滤液用0.22μm滤膜过滤后上机进行液相色谱分析，测定固体成分中葡萄糖和木糖含量，计算固体成分中葡聚糖和木聚糖的回收率。取滤渣，用超纯水洗涤至中性，于105℃烘干后，在马弗炉(550℃)中灰化，计算固体成分中木质素的含量。结果见表2和表3。
将液体成分稀释100倍后用0.22μm滤膜过滤后上机进行离子色谱分析，测定液体成分中木聚糖的含量。结果见图1。
以上实验结果表明，H 120-3，H 120-4，H 130-3，H 130-4，H 160-4，C 120-2，C120-3，C 120-4，C 130-2，C 130-3，C 130-4，C 140-3，C 140-4，C 150-4和C 160-4预处理效果较好。
实施例3预处理后固体成分纤维素酶酶解预试验
根据实施例2结果，选取实施例1中15组(H 120-3，H 120-4，H 130-3，H 130-4，H160-4，C 120-2，C 120-3，C 120-4，C 130-2，C 130-3，C 130-4，C 140-3，C 140-4，C 150-4和C 160-4)预处理效果较好的固体成分进行酶解预试验。准确称取0.5g预处理后的样品放入15mL离心管中，加入10mL pH值为4.8的柠檬酸缓冲液，纤维素酶的添加量为50FPU/g葡聚糖，在温度为50℃、功率为100W的条件下进行酶解反应，时间为40min。反应结束后立即将离心管放入沸水中煮沸10min将酶灭活，离心取上清液作为待测液，用0.22μm滤膜过滤待测液后上机进行液相色谱分析，测定产物中葡萄糖的含量，计算葡萄糖产量和葡聚糖消化率。结果见图2。
实施例4苹果渣产葡萄糖酶解条件优化
1.酶解条件单因素优化
根据实施例3结果，确定表1中C 160-4为最佳预处理条件。在此基础上，对预处理后分离的固体成分进行纤维素酶酶解试验。基础酶解条件为：温度50℃、功率200W、缓冲液pH值4.8、纤维素酶添加量100FPU/g葡聚糖、溶质含量5％、酶解时间40min，以葡萄糖产量为指标，对酶解条件进行优化筛选。
1.1不同温度的筛选：在基础酶解条件基础上，称取0.5g预处理后苹果渣加入10mLpH值为4.8的柠檬酸缓冲液，添加100FPU/g葡聚糖的纤维素酶，分别调整酶解温度为30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，反应40min。酶解反应结束后，立即放入沸水中煮沸10min将酶灭活，4,000rpm离心10min收集上清。每组三个重复，按照实施例3的步骤测定上清液中葡萄糖的浓度。结果表明，最佳酶解温度为50℃(图3)。
1.2不同超声功率的筛选：在上一步确定最适温度的基础上，在50℃条件下，分别调整超声功率为100W、200W、300W、400W和500W。按照实施例4的步骤制备酶解液，按照实施例3的步骤测定上清液中葡萄糖的浓度。结果表明，最佳超声功率为100W(图3)。
1.3不同酶解时间的筛选：在上一步确定最适温度和超声功率的基础上，在温度为50℃、超声功率为100W的条件下，分别调整酶解时间为0.5h、2h、8h、32h和128h。按照实施例4的步骤制备酶解液，按照实施例3的步骤测定上清液中葡萄糖的浓度。结果表明，最佳酶解时间为8h(图3)。
1.4不同纤维素酶添加量的筛选：在上一步确定最适温度、超声功率和酶解时间的基础上，在温度为50℃、超声功率为100W、酶解时间为8h的条件下，分别调整纤维素酶添加量为20FPU/g葡聚糖、40FPU/g葡聚糖、60FPU/g葡聚糖、80FPU/g葡聚糖和100FPU/g葡聚糖。按照实施例4的步骤制备酶解液，按照实施例3的步骤测定上清液中葡萄糖的浓度。结果表明，最佳纤维素酶添加量为40FPU/g葡聚糖(图3)。
1.5不同溶质含量的筛选：在以上试验的基础上，在温度为50℃、超声功率为100W、酶解时间为8h、纤维素酶添加量为40FPU/g葡聚糖的条件下，分别称取溶质含量(终体积为10mL)为5％、10％、15％、20％、25％和30％预处理后的苹果渣。按照实施例4的步骤制备酶解液，按照实施例3的步骤测定上清液中葡萄糖的浓度。结果表明，最佳溶质含量为20％(图3)。
小结：单因素优化结果表明，酶解试验最佳温度为50℃、最佳超声功率为100W、最佳酶解时间为8h、最佳纤维素酶添加量为40FPU/g葡聚糖、最佳溶质含量为20％。
2.酶解条件响应曲面优化
2.1Plackett-Burman试验：在单因素优化基础上，继续用软件Design-Expert 8.0设计Plackett-Burman试验，分别选取酶解温度、超声功率、酶解时间、纤维素酶添加量和溶质含量为葡萄糖产量影响因素。每种影响因素包含两水平，以葡萄糖产量为响应值，筛选出对葡萄糖浓度有显著影响的因素。试验设计及结果见表4。显著性分析结果表明(表5)，在五个因素中时间(C)和溶质含量(E)P值小于0.5，差异显著。表明时间和溶质含量为影响葡萄糖产量的显著因素，此外选择酶解温度(A)为第三个因素，即选择酶解时间、溶质添加量和酶解温度为响应曲面优化因子。
2.2最陡爬坡试验：根据Plackett-Burman试验方差分析结果及单因素优化试验结果筛选出酶解温度、酶解时间和溶质添加量3个影响葡萄糖产量的关键因素，其中酶解温度、溶质添加量与葡萄糖产量的相关回归系数分别为-0.62和-2.64，即酶解温度和溶质添加量对葡萄糖产量的影响为负相关，而酶解时间与葡萄糖产量的相关回归系数为1.63，即酶解时间对葡萄糖产量的影响为正相关。因此在爬坡试验中酶解温度和溶质添加量为负效应，酶解时间为正效应。由此确定最陡爬坡试验中各个关键因素的步长和方向。表6试验结果表明，在酶解温度为50℃、溶质含量为15％、酶解时间为7h时葡萄糖产量最大，由此判断葡萄糖产量最高时各条件的取值应在此附近。
2.3中心组合设计试验：根据Plackett-Burman试验结果和最陡爬坡试验结果设计中心复合设计试验对葡萄糖产量进行进一步优化，试验设计，试验结果结果见表7，方差分析结果见表8。用Design-Expert 8.0软件对试验数据进行分析，得到葡萄糖产量(Y)对酶解温度(A)、酶解时间(B)和溶质添加量(C)的二次多项回归方程为：
Y＝31.65+1.20A+0.67B+1.83C–0.29AB–0.5AC–0.32BC–0.66A2–0.21B2–0.97C2
表8结果表明，回归模型差异显著(P<0.01)，一项式均表现显著(P<0.01)，二次项均表现显著(P<0.01)，回归模型R-square＝0.9960，失拟项不显著，表明该方程拟合效果良好，可以用于分析和预测葡萄糖产量。
由等高线图和3D响应曲面图可知(图4)，一个因素固定为零水平时另外两个因素对葡萄糖产量的影响：当温度固定不变，料液比为15％时，葡萄糖的产量随处理时间的增长而升高，但此时坡度变化较小，当时间固定不变时，葡萄糖的产量随温度的升高而增大，坡度变化较大。当温度固定不变，处理时间为7h时，葡萄糖的产量随料液比的增大而增大，当固定料液比不变时，葡萄糖产量随温度的升高而增大，两种因素的相互作用对葡萄糖的产量影响较大；当时间固定不变，温度为50℃时，葡萄糖的产量随料液比的增大而增大，且此时料液比的变化对葡萄糖产量影响较大，当固定料液比不变时，葡萄糖的产量随时间的变化不明显，但两种因素的相互作用对葡萄糖的产量影响较大。
总结：通过以上单因素优化试验和响应曲面优化试验，得到预处理后苹果渣的最适酶解条件如下：温度为59.06℃、时间为9.79h、溶质添加量为18.57％、超声功率100W、纤维素酶添加量40FPU/g葡聚糖，响应曲面存在葡萄糖产量的最大值：32.67g/L。
实施例5布拉迪酵母发酵生产工艺
布拉迪酵母mafic-1701的活化：在超净工作台中进行无菌操作，用接种环挑取mafic-1701，在YPD琼脂培养基上划线，于37℃培养箱中培养。用接种环挑取一环酵母菌接入装有10/50mL的YPD液体培养基中，于37℃摇床220rpm培养16h后，OD600值达到0.6，作为种子液备用。
按照实施例3、4得到的最佳预处理条件和最佳酶解条件制备苹果渣酶解液，冷冻干燥获得粉末状产品。以YPD培养基为基础培养基，分别替换YPD培养基中的碳源为麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖和苹果渣酶解液的冻干粉末。121℃灭菌15min，冷却至室温，以1％接种量接种布拉迪酵母(摇瓶发酵，500mL锥形瓶加液量100mL)，置于37℃，转速220rpm的摇床中进行恒温培养，每3h取样，分别测定菌液OD600值(图5)和每毫升菌液中所含的细胞数(图6)。培养至39h，取出菌液，5,000rpm离心20min，弃上清，计算湿菌重，以g/L表示。结果见图7。
以上实验结果表明，布拉迪酵母mafic-1701不能利用乳糖生长，可以利用蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖和苹果渣发酵液进行生长繁殖。摇瓶发酵39h后，布拉迪酵母mafic-1701在碳源为葡萄糖、麦芽糖和苹果渣发酵液中的湿菌重无显著差异(P>0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (9)

1.苹果渣酶解液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)向0.5g烘干后的苹果渣中加入10～100％w/v醋酸液50mL，于160℃烘箱中反应120min；反应结束后，冷却至室温，进行固液分离，水洗固体成分至中性，烘干，得到预处理后的苹果渣；
2)在反应管中，按料液比18.57％向预处理后的苹果渣中加入pH值为4.8的柠檬酸缓冲液，然后按40FPU/g葡聚糖的量添加纤维素酶，在温度为59.06℃、超声功率为100W的条件下进行酶解反应，反应时间为9.79h；反应结束后，将反应管放入沸水中灭活酶，离心取上清液即得；
步骤1)中醋酸液的pH值为1.9。
2.按照权利要求1所述方法制备得到的苹果渣酶解液。
3.根据权利要求2所述的苹果渣酶解液，其特征在于，苹果渣酶解液中葡萄糖的含量高于30g/L。
4.权利要求2或3所述苹果渣酶解液的以下任一应用：
(1)用于制备培养基；
(2)用于微生物发酵；
(3)作为饲料添加剂。
5.发酵培养基，其特征在于，其包含权利要求2或3所述的苹果渣酶解液。
6.根据权利要求5所述的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基是用所述苹果渣酶解液替代YPD培养基中的碳源得到的。
7.权利要求5或6所述发酵培养基在微生物发酵中的应用。
8.生产布拉迪酵母的方法，其特征在于，利用权利要求5或6所述发酵培养基进行布拉迪酵母的发酵生产。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以1％-2％接种量接种布拉迪酵母，于30℃-37℃，转速200-220rpm的摇床中进行恒温培养。
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