CN102858989A - 从木质纤维素生物质水解产物发酵液中生产高固体糖浆 - Google Patents

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Abstract

木质纤维素生物质水解产物发酵液可以被加工以产生具有相对低粘度的高固体糖浆，所述高固体糖浆具有高能量含量并在发酵生产过程中可以被消耗。通过对发酵液或枯竭的发酵液的液体/固体分离，产生具有低悬浮固体的稀釜馏物，在维持低粘度的同时允许蒸发至高固体，获得高固体糖浆。

Description

从木质纤维素生物质水解产物发酵液中生产高固体糖浆
本专利申请要求于2010年4月28日提交的美国临时申请61/328799的权益，其全部内容以引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及发酵工艺技术领域。具体地讲，已经发现具有小于100厘泊的粘度并包含至少约40%的固体的糖浆能够通过加工木质纤维素生物质水解产物发酵液而产生。
发明背景
纤维素的和木质纤维素的原料和废物，如农业残留物、木材、林业废物、来自造纸业的淤渣、以及市政和工业固体废物，为生产有价值的产品如用作燃料的乙醇以及其它化学品提供了潜在地大量可再生原料。纤维素的和木质纤维素的原料与废物（其由碳水化合物多聚体组成）包含纤维素、半纤维素和木质素，一般用多种化学的、机械的和酶学的方法释放主要的己糖和戊糖到水解产物中，这种水解产物能采用生物催化剂发酵生产有用的产品。
除了可代谢糖存在于生物质水解产物中之外，水解产物还包括未消化的木质素和其它生物质成分进入产品分离和下游过程。除了主要产品之外，这些水解产物成分（其混合了生物催化剂和其它发酵液成分）还需要进行处理。尤其是在生产体积非常高的燃料乙醇的生产中，纯粹使用水与使用化石能源一样重要以生产燃料乙醇。为最小化净用水，移除产品的发酵液可被循环到工艺的早期阶段，或固体可从该发酵液中分离并且所述液体流被循环到工艺的早期阶段（被称为逆流）。并且，所述液体流可在循环之前用多种方法纯化。所述包含大比例木质素的固体流作为动物饲料营养价值低，但可用作燃料，其消耗后为整个生产过程提供能量。
对于在玉米粒干燥轧制方法生产乙醇的所有釜馏物中的液体和固体部分的分离，离心是通常使用的，其中使用谷物而不是木质纤维素生物质作为发酵糖源。通常使用的高速水平滗析器在移除悬浮固体方面效率不高。WO2008076716公开了使用阴离子聚合物絮凝剂来提高来自离心机的离心机分离液中的固体附聚以利于后续的固体/液体分离。使用该方法可获得含很少或不含悬浮固体的稀釜馏物。US20080153149公开了离心后将所得液体部分（稀釜馏物）放入真菌生物反应器中的方法。该方法使用所述稀釜馏物作为底物来生产高价值的真菌生物质，并获得可重复使用的加工水。
仍然需要一个高效率低成本的工艺来处理来自发酵液的生产侧流，所述发酵液包括木质纤维素生物质水解产物，尤其是在必须处理大量的液体时，以产生可循环利用的液体流和可用的固体流。
发明概述
本发明提供了从木质纤维素生物质水解产物发酵液处理的糖浆副产品和生产所述糖浆的方法。
因此，本发明提供了包含至少约40重量%的固体并具有小于约100厘泊的粘度的糖浆；其中所述糖浆是液体部分蒸发的产品，所述液体部分来自木质纤维素生物质水解产物发酵液的液体/固体分离。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产糖浆的方法，包括：
a)提供木质纤维素生物质水解产物发酵液；
b)任选地从（a）的木质纤维素生物质水解产物发酵液中移除产品流以产生枯竭的发酵液；
c)将来自（a）的发酵液或（b）的枯竭的发酵液的液体和固体部分分离以产生包含小于约0.1重量%的悬浮固体的稀釜馏物；以及
d)蒸发（c）的稀釜馏物以产生糖浆，所述糖浆具有至少约40重量%的固体和小于约100厘泊的粘度。
在一个另的实施方案中，本发明提供了生产乙醇的方法，包括：
a)提供包含乙醇产品的木质纤维素生物质水解产物发酵液；
b)通过蒸馏从（a）的木质纤维素生物质水解产物发酵液中移除乙醇以产生全釜馏物；
c)将来自（b）的全釜馏物的液体和固体部分分离以产生包含小于约0.1重量%的悬浮固体的稀釜馏物；以及
d)蒸发（c）的稀釜馏物以产生糖浆，所述糖浆具有至少约40重量%的固体和小于约100厘泊的粘度。
在另一个实施方案中，本发明提供了生产丁醇的方法，包括：
a)提供包含丁醇产品的木质纤维素生物质水解产物发酵液；
b)从木质纤维素生物质水解产物发酵液中提取丁醇以产生枯竭的发酵液；
c)将来自（b）的枯竭的发酵液的液体和固体部分分离以产生包含小于约0.1重量%的悬浮固体的稀釜馏物；以及
d)蒸发（c）的稀釜馏物以产生糖浆，所述糖浆具有至少约40重量%的固体和小于约100厘泊的粘度。
序列简述
下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825（“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”），并且与世界知识产权组织（WIPO）标准ST.25（1998）以及EPO和PCT的序列列表要求（规则5.2和49.5（a-bis规则），以及行政指导的208节和附录C）相一致。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。
表1：用于糖化的糖基水解酶的编码区和蛋白质的序列号
Figure BDA00002223587000031
保藏菌株信息
申请人已经按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款进行了以下生物保藏：
  保藏人鉴定参考   国际保藏所命名   保藏日期
  发酵单胞菌属（Zymomonas）ZW658   ATCC No PTA-7858   2006年9月12日
发明详述
当发酵培养基包括木质纤维素生物质水解产物时，来自培养基中由生物催化剂产生的产品发酵液是复杂浆液，其包括产品、细胞、木质素、以及其它生物质成分的混合物。有用的材料的侧流处理对发酵液中产生量相对低的产品的生产尤其重要，如丁醇和乙醇。通过本文所公开的步骤，液体和固体流被高效率处理，包括生产具有至少约40%的固体的糖浆。所述糖浆具有足够高含量的固体以提供能量。在消耗时，所述能量可应用到生产过程。来自糖浆的能量以及循环利用的纯化水为总体生产过程提供效率从而可获得商业可行性。
下列定义和缩写用于解释权利要求和说明书。
如本文所用，术语“包括”（comprises，comprising，includes，including）、“包含”（comprises，comprising）、“具有”（has，having）、“含有”（contains，containing）、或其任何其它变型旨在涵盖非排他性的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另有相反的说明，“或”是指包含性的或而不是指排他性的或。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B：A是真实的（或存在的）且B是虚假的（或不存在的），A是虚假的（或不存在的）且B是真实的（或存在的），以及A和B都是真实的（或存在的）。
在本发明的元件或组分前的不定冠词“一个”和“一种”旨在为有关所述元件或组分的实例（即出现）数量的非限制性。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施方案。
如本文所用，用术语“约”修饰本发明的成分或反应物的数量时是指数值量的变化，它们可能发生在例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等。术语“约”还包括由于相对于由特定起始混合物所得组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”是指在报告数值10%范围内，优选地在报告数值5%范围内。
术语“可发酵糖”是指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。
术语“木质纤维素”是指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维素材料也可包含半纤维素。
术语“纤维素”是指包含纤维素和包括半纤维素在内的附加组分的组合物。
术语“糖化”是指由多糖生产可发酵糖。
术语“经预处理的生物质”是指在糖化之前已经经过预处理的生物质。所述预处理可为物理的、热的或化学方法的形式以及它们的组合。
术语“丁醇”是指异丁醇、1-丁醇、2-丁醇、或它们的组合。
术语“木质纤维素生物质”是指任何木质纤维素材料并且包括下述材料，所述材料包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、寡糖、和/或单糖。生物质还包含附加组分，如蛋白质和/或脂类。生物质可来源于单一来源，或生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米芯和玉米秸秆的混合物，或小草和叶片的混合物。木质纤维素生物质包括但不限于生物能源作物、农业残留物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于玉米芯、作物残留物如玉米壳、玉米秸秆、小草、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱植物材料、大豆植物材料、从谷物制粉中获得的组分、树木、枝条、根、叶片、木片、木屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果、以及花。
术语“木质纤维素生物质水解产物”是指木质纤维素生物质糖化产生的产品。生物质也可在糖化前进行预处理或预加工。
术语“木质纤维素生物质水解产物发酵液”是指包含产品的发酵液，所述产品得自木质纤维素生物质水解产物中的生物催化剂生长和生产。所述发酵液包括木质纤维素生物质水解产物的成分，所述成分为没有被生物催化剂消耗的，以及生物催化剂本身和生物催化剂产生的产品。
术语“浆液”指不溶解的材料和液体的混合物。浆液还可包含高水平的溶解固体。浆液的例子包括糖化液、发酵液和釜馏物。
术语“全釜馏物”是指蒸馏的塔底物。所述全釜馏物包含高锅炉和蒸馏进料流的任何固体。全釜馏物是枯竭的发酵液的类型。
术语“稀釜馏物”是指来自全釜馏物、发酵液、或产品枯竭的发酵液的固体/液体分离的液体部分。
本文术语“产品枯竭的发酵液”（“product depleted broth”）或“枯竭的发酵液”(“depleted broth”)是指移除产品流后的木质纤维素生物质水解产物发酵液。
术语“糖浆”指浓缩的产品，其由稀釜馏物移除水而产生，一般来讲为蒸发。
术语“滤饼阻力”或“滤饼比阻”是指量化浆液过滤性的高度具体值。所述数值是独立于浆液浓度、粘度、压力和过滤面积的。所述数值是使用Ruth公式计算的并能用于标度过滤设备。
Ruth公式：dt/dV=（μαavC/Δp）V+μRm/Δp
其中t是过滤时间，V是过滤体积/单位过滤面积（m3/m2），Δp是过滤应用的压力（Pa），μ是液体粘度（kg/ms），μαav是平均比滤饼阻力（m/kg），Rm是过滤器介质阻力（m-1），并且C是成型滤饼质量/滤液单位体积（kg/m3）。参见Yim等人（Korean M.Chem.Eng.，18（5），741，（2001））。
“Xyn3”是来自里氏木霉木聚糖酶GH10家族。当这组酶作用于经预处理的生物质或分离的半纤维素时，通过其能增加在木乙糖酶存在下的木糖单体产量，Xyn3（SEQ ID NO:1；编码SEQ ID NO:5）间接地显示具有木聚糖内切酶活性。
“Fv3A”是来自轮枝镰孢菌GH3家族酶。通过用P-硝基苯基-β-吡喃木糖苷、木乙糖、混合的、来自半纤维素的线性低聚木糖低聚物和支链阿拉伯木聚糖做底物的检测，Fv3A（SEQ ID NO:2；编码SEQ ID NO:6）显示具有β-木糖苷酶活性。
“Fv43D”是来自轮枝镰孢菌GH43家族酶。通过用P-硝基苯基-β-吡喃木糖苷、木乙糖、或混合的、线性低聚木糖低聚物做底物的检测，Fv43D（SEQ ID NO:3；编码SEQ ID NO:7）显示具有β-木乙糖酶活性。
“Fv51A”是来自轮枝镰孢菌GH51家族酶。通过用P-硝基苯基-α-阿拉伯呋喃糖甙的测试以及通过木聚糖内切酶的作用从来自半纤维素的低聚物组中释放阿拉伯糖，Fv51A（SEQ ID NO:4；编码SEQ ID NO:8）显示具有L-α-阿拉伯呋喃糖甙酶活性。
术语“目标产品”是指任何由发酵的微生物生产宿主细胞产生的产品。目标产品可为宿主细胞中遗传工程的酶途径的产品或可由内源途径产生。典型的目标产品包括但不限于酸、醇、烷烃、烯烃、芳烃、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和药物。
低粘度高固体糖浆
本发明涉及处理来自木质纤维素水解产物发酵液的侧流，尤其是用于生产高固体糖浆。通常在从木质纤维素水解产物发酵液中移除产品之后处理所述侧流。移除产品的发酵液为枯竭的发酵液。当其中液体部分为稀釜馏物时，木质纤维素水解产物发酵液或枯竭的发酵液分离为固体和液体部分。该稀釜馏物含悬浮固体量很低。由于稀釜馏物中悬浮固体浓度低，在后续的蒸发过程中它保持了低粘度。在整个蒸发过程所述粘度维持在低于约100厘泊，允许蒸发到至少约40%的固体或大于所得糖浆。蒸发产生为至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%的固体的糖浆。含至少约40%的固体的糖浆能够消耗以提供能量，而含约35%或更低的固体的糖浆不提供比消耗它们更多的能量。
在一个典型的玉米粒干磨乙醇生产方法（该方法中籽粒和非木质纤维素生物质用做可发酵糖源）中，所述稀釜馏物具有高得多的悬浮固体浓度，在蒸发过程中变得粘稠，并且仅能蒸发成为固含量低于40%的糖浆。来自所述干磨方法的稀釜馏物中总悬浮固体通常为约2%-3%。在本发明方法中，来自木质纤维素生物质水解产物发酵液的或枯竭的发酵液的稀釜馏物具有小于1,000ppm或0.1%的悬浮固体。
能将所述稀釜馏物蒸发为含40%或更高的固体的糖浆也允许回收蒸发过程中更多的水，所述水能在整个生产过程中循环利用。可使用本方法循环利用来自木质纤维素生物质水解产物发酵过程的至少约60%的水。所述循环利用的水可为木质纤维素生物质水解产物发酵过程中的至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的水。在木质纤维素生物质水解产物发酵生产乙醇或丁醇中，由于相对高体积必需处理的发酵液/获得产品的体积，并且相对高生产体积不允许一次用水，水的循环利用特别重要。糖浆中的高百分比固体无需附加的干燥步骤，从而降低资本和运营成本。
木质纤维素生物质水解产物发酵液
生物质水解产物
本领域技术人员可用任何已知的方法处理木质纤维素生物质，在水解产物中产生可发酵糖。通常，所述生物质使用物理的、热的和/或化学的处理进行预处理，并酶解糖化。物理的和化学的处理包括但不限于碾磨、铣削、切割、碱处理如用氨或氢氧化钠、以及酸处理。低氨预处理是特别有用的，其中生物质与包含氨的水溶液接触，形成生物质-氨水混合物，其中氨的浓度足够维持生物质-氨水混合物的碱性pH，但相对于生物质的干重小于约12重量%，并且相对于生物质-氨水混合物的重量，生物质的干重至少约15重量%的固体，如共同申请和共同拥有的美国专利申请公布US20070031918A1所公开的，其以引用方式并入本文。在预处理之前还通常减小生物质粒度。
酶解糖化通常使用酶聚生体来降解纤维素和半纤维素以产生水解产物，其包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。糖化酶的综述见Lynd，L.R.等人（Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002）。
使用至少一种酶，并且通常使用糖化酶聚生体，其包括一种或更多种糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键，并且存在于广义“水解酶”（EC 3.）的酶分类EC 3.2.1.x（Enzyme Nomenclature 1992，AcademicPress，San Diego，CA，以及增补1（1993）、增补2（1994）、增补3（1995）、增补4（1997）和增补5[分别在Eur.J.Biochem.，223：1-5，1994；Eur.J.Biochem.，232：1-6，1995；Eur.J.Biochem.，237：1-5，1996；Eur.J.Biochem.，250：1-6，1997；和Eur.J.Biochem.，264：610-6501999中]）。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶（例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶）、半纤维素水解糖苷酶（例如木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖醛酸糖苷酶）和淀粉水解糖苷酶（例如淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、异淀粉酶）。此外，它可用于将其它活性加入糖化酶聚生体中，如肽酶（EC 3.4.x.y）、脂肪酶（EC 3.1.1.x和3.1.4.x）、木素酶（EC 1.11.1.x）和阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73），以帮助从生物质的其它组分中释放多糖。本领域熟知生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，如纤维素降解，该活性由若干种酶或一组具有不同底物特异性的酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶，所有酶可有助于纤维素降解的活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂如纤维素酶可包括多种酶。
糖化酶可商购获得，如
Figure BDA00002223587000091
CP纤维素酶、
Figure BDA00002223587000092
木聚糖酶、
Figure BDA00002223587000093
1500、以及
Figure BDA00002223587000094
DUET（Danisco U.S.Inc.，GenencorInternational，Rochester，NY）。此外糖化酶可为未纯化的并以细胞提取物或完整细胞制剂的形式提供。所述酶可使用已经工程化的重组微生物以表达多个糖化酶进行生产。
本发明中有特别价值的为一类糖苷水解酶，如家族GH3、GH39、GH43、GH55、GH10和GH11。GHs是一组酶，其水解两个或更多个碳水化合物间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物基团间的糖苷键。GHs家族基于序列相似性计进行分类，在碳水化合物-活性酶（CAZy）数据库中可提供（Cantarel等人（2009）Nucleic Acids Res.37（Database issue）：D233-238）。这些酶能作用于许多底物并在糖化过程中有效。糖苷水解酶家族3（“GH3”）的酶具有许多活性：β-葡糖苷酶（EC:3.2.1.21）、β-木糖苷酶（EC:3.2.1.37）、N-乙酰β-氨基葡糖苷酶（EC:3.2.1.52）、葡聚糖β-1,3-葡糖苷酶（EC:3.2.1.58）、纤维糊精酶（EC:3.2.1.74）、外-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC:3.2.1）、以及β-半乳醣苷酶（EC 3.2.1.23）。糖苷水解酶家族39（“GH39”）的酶具有α-L-艾杜糖苷酸酶（EC:3.2.1.76）或β-木糖苷酶（EC:3.2.1.37）活性。糖苷水解酶家族43（“GH43”）的酶具有下列酶的活性：L-α-阿拉伯呋喃糖酶（EC 3.2.1.55）、β-木糖苷酶（EC3.2.1.37）、阿拉伯糖内切酶（EC 3.2.1.99）、以及半乳聚糖-1,3-β-半乳醣苷酶（EC 3.2.1.145）。糖苷水解酶家族51（“GH51”）的酶具有L-α-阿拉伯呋喃糖酶（EC 3.2.1.55）或内切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）活性。糖苷水解酶家族10（“GH10”）更全面地描述见Schmidt等人.，1999，Biochemistry 38：2403-2412和Lo Leggio等人，2001，FEBS Lett 509：303-308）而糖苷水解酶家族11（“GH11”）更全面地描述见Hakouvainen等人.，1996，Biochemistty 35：9617-24。
在酶聚生体中尤其有用的是糖苷脱水酶（GH）Xyn3、Fv3A、Fv51A和Fv43D。Xyn3（SEQ ID NO:1）是来自里氏木霉的GH10木聚糖酶家族；Fv3A（SEQ ID NO:2）是来自轮枝镰孢菌GH3酶家族；Fv43D（SEQID NO:3）是来自轮枝镰孢菌GH43酶家族；而Fv51A（SEQ ID NO:4）是来自轮枝镰孢菌GH51酶家族。
这些酶可从它们的天然宿主生物体分离，或表达在工程宿主生物体中而产生。例如，嵌合基因，其包含在目标表达宿主细胞中活性的启动子、编码上面给出的糖苷水解酶的序列、和终止信号，由质粒载体表达或通过本领域技术人员熟知的标准方法整合到目标表达宿主细胞基因组中。所用的编码序列可为针对表达用的特定宿主密码子优化的。通常所用的表达宿主细胞包括细菌如埃希氏菌属（Escherichia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和链霉菌属（Streptomyces），酵母如糖酵母属（Saccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、假丝酵母属（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）、毕赤酵母属（Pichia）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）和法夫酵母属（Phaffia），以及丝状真菌如枝顶孢霉属（Acremonium）、曲霉属（Aspergillus）、短柄霉属（Aureobasidium）、黑管菌属（Bjerkandera）、拟蜡菌属（Ceriporiopsis）、白腐真菌属（Chrysoporium）、鬼伞属（Coprinus）、革盖菌属（Coriolus）、棒囊壳属（Corynascus）、毛壳菌属（Chaertomium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、线黑粉酵母属（Filobasidium）、镰孢属（Fusarium）、赤霉菌属（Gibberella）、腐质菌属（Humicola）、稻瘟菌属（Magnaporthe）、毛霉属（Mucor）、毁丝霉属（Myceliophthora）、毛霉属（Mucor）、瘤胃真菌属（Neocallimastix）、脉孢菌属（Neurospora）、拟青霉属（Paecilomyces）、青霉属（Penicillium）、平革菌属（Phanerochaete）、脉射菌属（Phlebia）、Piromyces、侧耳属（Pleurotus）、Scytaldium、裂褶菌属（Schizophyllum）、孢子丝菌属（Sporotrichum）、踝节菌属（Talaromyces）、热子囊菌属（Thermoascus）、草根霉菌属（Thielavia）、弯颈酶属（Tolypocladium）、栓菌属（Trametes）和木霉属（Trichoderma）。
本领域的技术人员会了解如何确定在聚生体中的有效酶量及调整为最佳酶活性的条件。本领域的技术人员也会了解如何优化在聚生体内所需的酶活的多个类，以在选定的条件下获得一个给定的预处理产品的最佳糖化。糖化的实例描述见US20070031918A1。
在发酵前糖化混合物可通过蒸发而浓缩，例如，增加可发酵糖的浓度。
任选地，在糖化产品中的液体可从分批或连续方法中的固体中分离。任选地，液体或全部糖化产品可在发酵前灭菌。根据发酵中使用的生物催化剂和糖化过程中使用的pH，所述pH可被调整为适宜发酵的。
包含可发酵糖的木质纤维素生物质水解产物通常以百分比包括在发酵培养基中，从而提供所有或部分用于生物催化剂生长和产品生产的碳源。木质纤维素生物质水解产物发酵液中的水解产物，占总体积的至少约25%，并可占至少约25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。US20070031918A1中的实施例9给出了水解产物的使用占到发酵液的40%或80%的实例，其以引用方式并入本文。根据所述水解产物中可发酵糖的浓度，培养基中可加入附加的糖。例如，当含约80克/升葡萄糖和约50克/升木糖的水解产物占发酵液的40%时，可添加附加的葡萄糖和木糖至期望的终糖浓度。如本领域技术人员所熟知，除了水解产物，发酵液可包含其它营养物、盐和因子，这些物质是生长和使用特异性生物催化剂生产产品所必需的。补充剂可包括例如酵母提取物、特定氨基酸、磷酸盐、氮源、盐和痕量元素。也可包括通过特定生物催化剂生产特定产品所需的组分，如用于保留质粒的抗生素或酶催化反应所需的辅因子。在本文所用的发酵液中，水解产物占总体积的90%。
在制备水解产物的替代方案中，将水解产物加入到发酵液，然后启动发酵，同步糖化和发酵（SSF）可用于生产木质纤维素生物质水解产物发酵液。在该方法中，糖从生物质中产生，所述生物质通过生产生物催化剂而代谢。
生物催化剂发酵和目标产品
木质纤维素生物质水解产物发酵培养基中的可发酵糖是通过适宜的生物催化剂代谢以生产目标产品。所述糖分在发酵过程中与生物催化剂接触，其中生物催化剂在通过生物催化剂生产目标产品的条件下生长。根据对应用的特定生物催化剂有用的条件，温度和/或顶空气相可针对发酵进行调整。发酵可以是有氧的或厌氧的。这些和其它的条件，其包括温度和pH，针对使用的特定生物催化剂进行调整。
通常所述生物催化剂被工程化以生产目标产品，但它可天然地生产目标产品。使用生物催化剂通过发酵生产的目标产品包括例如酸、醇、烷烃、烯烃、芳烃、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和药物。醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、赤藓糖、木糖醇、山梨醇和1,3-丙二醇。酸包括但不限于乙酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙基、丁酸、葡糖酸、衣康酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酰丙酸。氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。附加的目标产品包括甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。尤其适宜的产品是乙醇和丁醇，包括异丁醇、2-丁醇和1-丁醇。
糖转化为目标产品的发酵可通过一个或多个合适的生物催化剂在一步或多布发酵过程中进行。生物催化剂可以是选自细菌、丝状真菌和酵母的微生物。生物催化剂可为野生型微生物体或重组微生物体，并且包括例如埃希氏菌属（Escherichia）、发酵单胞菌属（Zymomonas）、糖酵母属（Saccharomyces）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、链霉菌属（Streptomyces）、芽胞杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和梭菌属（Clostridium）。在另一个实施方案中，生物催化剂可以选自重组大肠杆菌（Escherichia coli）、运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）、嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillusstearothermophilus）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、嗜热梭菌（Clostridia thermocellum）、高温产氢菌（Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum）和树干毕赤酵母（Pichia stipitis）。
已描述了许多在发酵中用于生产目标产品的生物催化剂，并且其它的可以通过突变或以重组的方法工程化而发现和生产。任何生物催化剂（其利用木质纤维素生物质水解产物培养基中的可发酵糖）可用于生产已知产生的目标产品，并因此使用本方法加工生产木质纤维素生物质水解产物发酵液。在木质纤维素生物质水解产物发酵培养基中生产的产品尤其有用的是醇产品，其可用作燃料，如丁醇和乙醇。
通过产溶剂梭菌（Clostridia）将碳水化合物转化为丙酮、丁醇和乙醇的发酵（ABE发酵）是众所熟知的（Jones and Woods（1986）Microbiol.Rev.50：484-524）。US 5192673描述了用于使用丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）突变体生产高含量丁醇、丙酮和乙醇的发酵方法。US 6358717描述了用于使用拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）突变体生产高含量丁醇、丙酮和乙醇的方法。通过经基因修饰的酵母生产丁醇已公开，例如US 20070092957A1。基因修饰的大肠杆菌（E.coli）菌株也已被用作乙醇生产的生物催化剂。（Underwood等人.，（2002）Appl.Environ.Microbiol.68：6263-6272）。乙醇由经基因修饰的发酵单胞菌属在木质纤维素生物质水解产物发酵培养基（US 20070031918A1）中产生。经基因修饰的增加乙醇产量的运动发酵单胞菌菌株的描述见US2003/0162271A1和US 2009/0246846A1。
在US 7504250中公开的是生产1,3-丙二醇的重组微生物体。
通过大肠杆菌重组菌株（Zhou等人，（2003）Appl.Environ.Microbiol.69：399-407）、芽孢杆菌属天然菌株（US20050250192）和米根霉（Rhizopus oryzae）（Tay和Yang（2002）Biotechnol.Bioeng.80：1-12）在发酵中生产乳酸。通过大肠杆菌重组菌株作为生物催化剂在发酵中生产1,3-丙二醇（US 6013494，US 6514733）和己二酸（Niu等人，（2002）Biotechnol.Prog.，18：201-211）。使用重组梭菌（Clostridia）（Cheryan等人，（1997）Adv.Appl.Microbiol.43：1-33）和新鉴定的酵母菌株（Freer（2002）World J.Microbiol.Biotechnol.，18：271-275）通过发酵生产乙酸。通过公开于US 6159738的重组大肠杆菌和其它细菌，以及重组大肠杆菌突变体（Lin等人（2005）Metab.Eng.7：116-127）生产琥珀酸。通过光滑球拟（Torulopsis gabrata）酵母突变体（Li等人，（2001）Appl.Microbiol.Technol.55：680-685）和大肠杆菌突变体（Yokota等人，（1994）Biosci.Biotech.Biochem.58：2164-2167）生产丙酮酸。使用大肠杆菌重组菌株作为生物催化剂用于生产对羟基肉桂酸（US20030170834）和奎尼酸（US20060003429）。
在发酵过程中使用丙酸丙酸杆菌（Propionibacterium acidipropionici）突变体（Suwannakham和Yang（2005）Biotechnol.Bioeng.91：325-337）生产丙酸，并且使用酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）（Wu和Yang（2003）Biotechnol.Bioeng.82：93-102）生产丁酸。通过梭菌属（Clostridium sp.）菌株17cr1（Janssen（2004）Arch.Microbiol.182：482-486）发酵从苏氨酸生产丙酸酯和丙醇。使用酵母样普鲁兰出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）（Anantassiadis等人，（2005）Biotechnol.Bioeng.91：494-501），通过黑曲霉（Aspergillis niger）突变体（Singh等人.，（2001）Indian J.Exp.Biol.39：1136-43）生产葡糖酸。通过氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）突变体（Elfari等人，（2005）ApplMicrobiol.Biotech.66：668-674）生产5-酮基-D-葡萄糖酸，通过土曲霉（Aspergillusterreus）突变体（Reddy和Singh（2002）Bioresour.Technol.85：69-71）生产衣康酸，通过黑曲霉（Aspergillusniger）突变体（Ikram-Ul-Haq等人，（2005）Bioresour.Technol.96：645-648）生产柠檬酸，以及通过高里假丝酵母（Candida guilliermondii）FTI 20037（Mussatto andRoberto（2003）J.Appl.Microbiol.95：331-337）生产木糖醇。通过重组红串红球菌（Pseudomonas putida）和富养罗尔斯通氏菌（Ralstoniaeutropha）（Gorenflo等人，（2001）Biomacromolecules 2：45-57）生产包含4-羟基戊酸乙酯和显著量3-羟基丁酸3-羟基戊酸的生物聚酯。通过重组大肠杆菌（Ui等人，（2004）Lett.Appl.Microbiol.39：533-537）生产L-2,3丁二醇。
可通过使用棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium）、以及沙雷氏菌（Serratia）的营养缺陷型菌株和氨基酸类似物抗性菌株发酵生产氨基酸。例如，日本专利公布56008596描述了使用组氨酸类似物抗性菌株生产组氨酸，EP 136359描述了使用重组菌株生产组氨酸。日本专利公布47004505和51019037描述了使用色氨酸类似物抗性菌株生产色氨酸。日本专利公布47038995、51006237、54032070描述了使用异亮氨酸类似物抗性菌株生产异亮氨酸。日本专利公布56010035描述了使用苯基丙氨酸类似物抗性菌株生产苯基丙氨酸。已经描述了使用需要苯丙氨酸生长的酪氨酸抗性菌株（Agr.Chem.Soc.Japan 50（1）R79-R87（1976），或重组菌株（EP263515，EP332234）生产酪氨酸，以及使用L-精氨酸类似物抗性菌株生产精氨酸（Agr.Biol.Chem.（1972）36：1675-1684，日本专利公布54037235和57150381）。也通过在大肠杆菌菌株ATCC 31882、31883、和31884中通过发酵生产苯基丙氨酸。US6962805描述了在重组棒状杆菌中生产谷氨酸。通过大肠杆菌的突变体生产苏氨酸的描述见Okamoto and Ikeda（2000）J.Biosci Bioeng.89：87-79。通过百合棒状杆菌（Corynebacterium lilium）突变体（Kumar等人，（2005）Bioresour.Technol.96：287-294）生产甲硫氨酸。
通过生物催化剂也已经制备出有用的肽、酶和其它蛋白质（例如参见US6861237、US6777207、US6228630）。
为生长良好和在木质纤维素生物质水解产物发酵液中有高的产品产量，可选择或工程化生物催化剂以具有对生物质水解液中存在的抑制剂，如乙酸盐，有更高的抗性。例如，提高木糖利用率和在胁迫条件下生产乙醇，如那些由发酵单胞菌属（Zymomonas）在木质纤维素生物质水解发酵液中遇到的，公开在共同拥有的和共同未决的美国专利申请公布US20110014670，其以引用方式并入本文。本文公开的是发酵单胞菌属细胞在包含木糖、乙酸盐、乙酸铵和乙醇的培养基中连续生长，以及分离改良的发酵单胞菌属菌株，如ZW705。
从木质纤维素生物质水解产物发酵液中制备高固体糖浆
在取出了包含由生物催化剂产生的产品的产品流后，处理来自木质纤维素生物质水解产物发酵液的侧流。例如当丁醇为产品时，它可通过提取发酵液从发酵液中取出，如通过气体反萃取、或使用与水不混溶的有机萃取剂并从水相中分离包含丁醇的有机相，如公开在共同拥有的和共同未决的WO 2009/149270，其以引用方式并入本文。所得的移除产品的发酵液为枯竭的发酵液。当乙醇为产品时，发酵液蒸馏，通常使用初馏塔以产生乙醇产品流和全釜馏物，其即枯竭的发酵液。蒸馏可使用本领域技术人员已知的任何条件，包括在常压或减压下。作为另外一种选择，所述产品可在分离后从固体或液体部分取出。
发酵液或枯竭的发酵液，如全釜馏物，分离为固体和液体流，其中被称为稀釜馏物的液体流具有小于约0.1%的悬浮固体。可使用任何产生含小于约0.1%的悬浮固体的稀釜馏物的分离工艺。可使用多种过滤设备，如带束过滤器、压带机、螺杆式压缩机、转筒过滤器、碟式过滤器、滤过器、压力过滤机和离心过滤器。可通过如施用真空、压力或离心力辅助过滤。此外，分离过程的组合可用于实现低悬浮固体浓度，如离心后接小压力过滤以移除离心后残留的悬浮固体。
可再次分离初始分离的液体部分。例如在过滤时，一些初始滤液可再循环回到过滤起始的过滤器进料槽以提高稀釜馏物的质量。初始5%-10%的滤液可具有约0.1%的悬浮固体。然而其余90%-95%的滤液通常具有低得多的悬浮固体，并且因此稀釜馏物平均将为基本上小于0.1%的悬浮固体，即使没有再循环初始滤液。
为了提高过滤的效率可使用热处理，如公开在共同拥有的和共同未决的美国专利申请61/328804，其以引用方式并入本文。在发酵液或枯竭的发酵液如全釜馏物的滤饼阻力降低到低于约20%的条件下，所述木质纤维素生物质水解产物发酵液或枯竭的发酵液如全釜馏物可进行热处理。所述发酵液或枯竭的发酵液如全釜馏物的处理温度在约70℃和约150℃之间，处理时间在约30秒和210分钟之间。较长的时间与范围内较低的温度一起使用，而较短的时间与范围内较高的温度一起使用。例如，在美国专利申请61/328804的实施例2和4中，70℃加热60分钟足够将滤饼阻力降低24%；110℃加热30秒足够将滤饼阻力降低21%；并且145℃加热30秒足够将滤饼阻力降低45%。在约95℃和约150℃之间的温度尤其有用的，其中较短的时间如约30秒和30分钟之间是有效的。来自常压蒸馏的全釜馏物，蒸馏通常在95℃至100℃之间进行，可在此温度下保持约15至30分钟。在这种情况下，如果全釜馏物、或其它枯竭的发酵液、或二者的温度由于前面的工序都处于或超过期望的温度，可以不需要进一步施用加热；通过将全釜馏物或其它枯竭的发酵液、或二者在绝缘容器中保持所需的时间来维持温度。对短的处理，尤其有用的是在约110℃和约150℃之间的温度，持续时间在约30秒和2分钟之间。热处理可在任何能在所需时间内保持温度的系统中进行。例如，加热可在一个热夹套容器中或在换热器中，随后保持在一个容器或环流反应器中。
如美国专利申请61/328804公开的，根据处理的发酵液、枯竭的发酵液或全釜馏物的pH，在给定温度下降低滤饼阻力至少约20%所需时间也有所差异。更多的滤饼阻力减少实现在较低的pH，pH6或更低的尤其有用。根据发酵中使用的生物催化剂，木质纤维素生物质水解产物发酵液的pH可以为pH6或更低。作为另外一种选择，在热处理之前或期间发酵液、枯竭的发酵液或全釜馏物的pH可调节至约6、5、4或3。在pH调节过程中混合或搅拌枯竭的发酵液或全釜馏物对pH调节酸的均匀分布是有用的。此外，在热处理期间可使用混合以均匀控制温度。混合，其可为连续的或非连续的，通常是由一个搅拌器系统进行，如使用叶轮的搅拌器。
对热处理过的木质纤维素生物质水解产物发酵液或枯竭的发酵液进行后续液体/固体分离，固体部分或滤泥饼可以消耗为生产过程提供能量。所述滤泥饼可在消耗前干燥，如空气干燥，以降低水分。
对热处理过的木质纤维素生物质水解产物发酵液进行后续液体/固体分离，取出产品流。例如，液体流可萃取或蒸馏以产生产品流，如蒸馏产生乙醇产品流和剩余液体。
液体/固体分离后，液体流的一部分可回收直接作为涡流使用。作为涡流，所述液体可能添加到过程中需要淡水的任何一点，如在预处理、糖化或生物催化剂种子繁殖中。液体部分的残留物或其全部通过蒸发而进一步纯化以产生能回收的水和糖浆。由于液体部分或稀釜馏物的悬浮固体浓度低，它在随后的蒸发步骤中保持了低粘度。在整个蒸发过程中粘度保持低于约100厘泊，使得蒸发产生了含至少约40%的总固体的糖浆，其为悬浮和溶解固体的组合物。如本文实施例3中表明，粘度与总固体百分比、pH和温度有关。例如，在60℃保持低于100厘泊的粘度蒸发至约67%的固体，pH为5.7；而在40℃保持低于100厘泊的粘度蒸发至约69.5%的固体，pH为4.7。蒸发可在压力下进行，在常压下或在减压下。
含至少约40%的固体的所得糖浆能消耗以提供能量，不需要附加的干燥步骤。通常由玉米粒干磨乙醇方法产生的糖浆具有约35%或更少的固体，无法提供比用于其干燥然后消耗所需更多的能量。
蒸发可在任何蒸发系统中进行，如降膜、升膜、压力环流、板式或机械和热蒸汽再压缩系统。蒸发可为连续的或分批的，并可用多效蒸发器。蒸发的水可循环用于木质纤维素生物质水解产物发酵总体过程。
实施例
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。
应该理解，这些实施例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实施例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。
所用缩写的含义如下：“s”是指秒，“min”是指分钟，“hr”的“h”是指小时，“μL”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“m”是指米，“nm”是指纳米，“mm”是指毫米，“cm”是指厘米，“μm”是指微米，“mM”是指毫摩尔每升，“M”是指摩尔每升，“mmol”是指毫摩尔，“μmole”是指微摩尔，“g”是指克，“μg”是指微克，“mg”是指毫克，“kg”是指千克，“rpm”是指每分钟转数，“C”是指摄氏度，“ppm”是指百万分之一，“cP”是指厘泊。
一般方法：
糖化酶
Figure BDA00002223587000191
1500（A1500）和
Figure BDA00002223587000192
木聚糖酶购自Danisco U.S.Inc.，Genencor，International（Rochester，NY）。
纤维素酶和半纤维素酶生产菌株
菌株229：里氏木霉菌株，来源于RL-P37（Sheir-Neiss andMontenecourt，1984，Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53）通过诱变和对高纤维素酶产量的选择，采用PEG介导转化法与β-葡糖苷酶表达盒（cbh1启动子，里氏木霉β-葡糖苷酶1基因，cbh1终止子和amdS标记）和木聚糖内切酶表达盒（cbh1启动子，里氏木霉xyn3和cbh1终止子）共转化（Penttila等人，1987，Gene 61（2）：155-64）。众多的转化子被分离出来并检验β-葡糖苷酶和木聚糖内切酶产量。一个转化子，称为里氏木霉菌株229，被用于本文所述的某些研究中。
菌株H3A：里氏木霉菌株229采用电穿孔法，与β-木糖苷酶Fv3A表达盒（cbh1启动子，Fv3A基因，cbh1终止子和alsR标记）、β-木糖苷酶Fv43D表达盒（egl1启动子，Fv43D基因，原生Fv43D终止子）以及Fv51A α-阿拉伯呋喃糖酶表达盒（egl1启动子，Fv51A基因，Fv51A原生终止子）共转化。转化子在包含氯嘧磺隆的Vogels琼脂平板上选择。许多转化子被分离出来并检验β-木糖苷酶和L-α-阿拉伯呋喃糖酶产量。里氏木霉整合表达菌株H3A，其重组表达里氏木霉β-葡糖苷酶1、里氏木霉xyn3、Fv3A、Fv51A、以及Fv43D，被分离出来。
在菌株H3A发酵期间产生的细胞外蛋白通过离心从细胞群中分离出来，通过经由Millipore 10kD分子截留分子量膜进行的膜超滤进行浓缩，并将pH调节至4.8。使用Weichselbaum和Gornall修改的改性的缩二脲方法测定总蛋白，该方法使用牛血清白蛋白作为校准物（Weichselbaum，1960，Amer.J.Clin.Path.16：40；Gornall等人，1949J.Biol.Chem 177：752）。这种H3A细胞外蛋白制剂本文称为H3A蛋白，它用作组合纤维素酶和半纤维素酶制剂，在SSF期间影响络合碳水化合物水解。
生物催化剂和种菌制剂
运动发酵单胞菌用于发酵的起源
在这些实施例中的木质纤维素生物质水解产物发酵液可采用可供选择的生物催化剂产生。这些实施例中所用的示例性菌株如下所述。作为替代方案，菌株ZW658，保藏号为ATCC#PTA-7858，可用于生产处理用的木质纤维素生物质水解产物发酵液。
运动发酵单胞菌菌株ZW705产自菌株ZW801-4，其采用美国专利申请公布US2011-0014670所述的方法，其以引用方式并入本文，在此简要重述。运动发酵单胞菌菌株ZW801-4的培养物生长在如下的胁迫条件下。ZW801-4是运动发酵单胞菌重组的木糖利用菌株，其描述见US7,741,119，其以引用方式并入本文。菌株ZW801-4来源于菌株ZW800，其来源于菌株ZW658，所有的描述参见US7,741,119。ZW658通过经由序贯转座事件将两个操纵子PgapxylAB和Pgaptaltkt整合到ZW1（ATCC#31821）基因组中，然后通过包含木糖的选择培养基筛选进行构建，所述操纵子包含四个编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的木糖利用基因。ZW658以ATCC#PTA-7858保藏。在ZW658中，使用宿主媒介的基因双交换同源重组和作为选择性标记的奇放线菌素抗性使编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因插入失活以产生ZW800。使用Cre重组酶，通过位点特异性重组移除由loxP位点束缚的奇放线菌素抗性标记以产生ZW801-4。
ZW801-4的连续培养在250ml搅拌的、pH和温度受控的发酵罐（Sixfors；Bottmingen，Switzerland）中进行。发酵基础培养基是5克/升酵母提取物，15mM磷酸铵，1克/升硫酸镁，10mM山梨醇，50克/升木糖和50克/升葡萄糖。通过在97天中逐渐提高加到上述连续培养基中的乙酸铵浓度，同时保持通过特定稀释速率测得的确定生长速率来影响在高浓度乙酸和氨的存在下的适应生长。将乙酸铵浓度提升至160mM。通过加入磷酸铵至在连续培养139天的末期最终总铵离子浓度为210mM来实现铵离子浓度的进一步提高。通过接种单菌落并扩增一个选择的菌落来从适应种群中分离菌株ZW705。
菌株AR37-31产自菌株ZW705，通过进一步改型在玉米芯水解产物培养基中生长，如共同拥有的和共同未决的美国专利申请61/424077所公开的，其以引用方式并入本文。ZW705生长于恒浊器中（US 6,686,194；Heurisko USA，Inc.Newark，DE），其为连续流动培养装置，其中培养物中的细胞浓度通过控制培养基到培养物的流动而保持恒定，使得培养物的浊度保持在在指定的狭窄限制内。培养物在连续培养装置中可利用两种培养基生长，一种为静息培养基（培养基A），一种为挑战培养基（培养基B）。培养物生长在生长室中的静息培养基上到浊度设置点，然后以稀释速率设置进行稀释以维持细胞密度。通过每10分钟加入一次限定体积的培养基来进行稀释。当恒浊器进入培养基挑战模式时，基于在前一次培养基添加后返回设置点的速率选择加入挑战培养基或静息培养基。生长室中培养基的稳态浓度为培养基A和培养基B的混合；根据从各个培养基提取的速率决定两种培养基的比例，其为设置的稀释速率以允许维持设置的细胞密度。代表生长室中种群的细胞样品以每周的间隔从恒浊器外流液中回收（在捕获室）。所述细胞样品在MRM3G6培养基上生长一次并在-80℃作为甘油原液保存。
ZW705生长至一个任意浊度设置点，其表明培养物使用了输入培养基中存在的全部葡萄糖和大约一半的木糖，以在设置稀释速率下满足细胞密度设置点。使用静息培养基，其为50%的HYAc/YE和50%的MRM3G6.5X4.5NH4Ac12.3以及挑战培养基，其为HYAc/YE。3周后分离的菌株用于另一轮恒浊器改型，使用HYAc/YE作为静息培养基以及HYAc/YE加9重量%乙醇作为挑战培养基。菌株AR37-31在2周后分离，在水解产物培养基中鉴定为一个提高木糖和葡萄糖利用率、以及提升乙醇产量的菌株。通过序列分析，发现AR37-31在运动发酵单胞菌基因组开放阅读框中有一个突变，所述开放阅读框编码具有膜转运蛋白性质的蛋白，并注释为编码镰刀菌酸抗性蛋白。
培养基
每升MRM3包含：酵母提取物（10g），KH2PO4（2g）和
MgSO4.7H2O（1g）
MRM3G6包含的是MRM3，其包含60克/升葡萄糖
MRM3G6.5X4.5NH4Ac12.3为MRM3，其包含65克/升葡萄糖，45克/
升木糖，12.3克/升乙酸铵
HYAc/YE包含芯水解产物，其固体通过离心移除并过滤消毒，其包含68克/升葡萄糖，46克/升木糖和5克/升乙酸盐，辅以6.2克/升乙酸铵和0.5%酵母提取物，调节至pH5.8。
比滤饼阻力
比滤饼阻力量化滤饼阻力的变化/高度单位滤饼。它依赖于浆液浓度、粘度、压力和过滤面积。所述数值得自Ruth公式如上所述[参见Yim等人，Korean M.Chem.Eng.，18（5），741，（2001）]。
粘度测量的详细信息
粘度是由Paar Physica MCR 300流变仪测定的，其允许全温度控制。应用于玉米生物样品的测量原理是使用锥-锥或双间隙型测量头旋转测量。测量在不同温度下（20℃，40℃，60℃）并且以1-3001/s的剪切速率在滑道上进行。记录的粘度是无限剪切粘度。
蒸发
使用了实验室规模的蒸发设备，其包含填充了Syltherm热传递液的再循环加热水浴，连接到一个5升的带夹套圆底烧瓶上。带双冷凝器的短路径蒸馏头用于塔顶冷却。约1至2公斤的稀釜馏物用于蒸发。在固定的时间间隔收集塔顶水和底部糖浆样品。
过滤-460毫米Netzsch压滤机
使用了下列可商购获得的预试生产标度压滤机：
具有1.0预挤压容量的Netzsch 470/SP膜压滤机混合包装膜（ANDRITZ AG，Stattegger Strasse 18，A-8045Graz，Austria）。手动配管带合适数量的进料阀、砂芯气孔阀、滤饼气孔阀、反冲膜阀和滤液块阀都包括在内。
470毫米压滤机用于液体/固体分离。该设备由两个操作滑道：第一个有两搅拌进料槽和空气泵给压滤机进料，第二个运输车是压滤机本身。
·过滤器面积：6800厘米2
·室的数量：2
·最大过滤压力=7巴（700千帕）
·最高操作温度85℃
·关闭机制：液压顶
·供给源：空气驱动隔膜泵
·量纲：1300×1500×600毫米
·重量：大约250公斤
压滤机在压力下处理液体。浆液进料到压滤机高达100磅/平方英寸（689.5千帕）。液压顶以6,000磅/平方英寸（41.4兆帕）压缩滤板栈。还有一个单独的气缸，提供高达225磅/平方英寸（1551.3千帕）的挤压力给压滤机用于机械压缩。
实施例1
产生木质纤维素生物质水解产物发酵液
玉米芯预处理
FRF 6分批发酵
Jaygo水平桨反应堆（大约170升）用于预处理4批玉米芯片，全尺寸<1/2″（1.27厘米）。反应器装满玉米芯并且真空施用到该容器上至0.1巴（10千帕）绝对先于导入氢氧化铵溶液，以提供相对于生物质干重的大约4（2批）、6（1批）或8（1批）重量%的NH3。添加蒸汽到大约145℃的温度。保持这一温度20分钟。在预处理的结尾，反应器以受控方式减压至常压，然后随后应用真空使容器内压力降至绝对的大约0.1巴（10千帕）。退出反应器的预处理玉米芯片为大约55重量%的干物质。玉米芯片在带1.0毫米筛网的微粒粉磨机中减小至小于1毫米（Model#1SH,Serial#10019；Pulverizing Machinery Division of Mikropul Corporation；Summit，NJ）。
分批发酵FRF 7-10
一个水平的Littleford Day130升反应容器，其包含围绕容器主体传递蒸汽的夹套和测流之一夹克传递船只的身体周围的蒸汽和两侧之一（Littleford Day，Inc.，Florence，KY），用于预处理分批玉米芯。对于每一分批，容器加载了玉米芯（小于1毫米大小）。玉米芯使用1.0mm筛网用微粒粉磨机处理以减小尺寸（Model#1SH，Serial#10019；PulverizingMachinery Division of Mikropul Corporation；Summit，NJ）。表2中给出了用于不同的前处理批次的玉米芯水分%。
应用真空使容器内压力降至0.1atm先于在靠近容器顶部导入28.9重量%的氢氧化铵溶液和水，以提供相对于生物质干重的6重量%的NH3。蒸汽导入到靠近容器的顶部以提升容器内部温度至145℃。保持这一温度20分钟。在预处理末期，通过排气冷凝器将反应器压力降至大气压。随后施用真空（大约小于1atm）15分钟以降低温度至小于60℃。表2给出了每个前处理批次的最终%的固体，连同使用不同前处理批次的发酵批次。
表2：玉米芯，预处理和发酵批次。
  玉米芯水分%   预处理批次   最终固体重量%   发酵批次
  5.9   SSL 9   53.1   7
  5.9   SSL 10   65.7   7
  5.9   SSL 11   71.3   7
  5.9   SSL 12   71.9   7
  5.9   SSL 13   69.8   8
  5.9   SSL 14   67.6   8
  5.9   SSL 15   68.9   8
  5.2   SSL 18   65.1   9
  5.2   SSL 19   68.1   9
  5.2   SSL 20   68.1   9
  8.0   SSL 24   61.1   10
  8.0   SSL 25   66.7   10
  8.0   SSL 26   67.8   10
对FRF 6-10运行糖化
糖化在200升的Sartorius Biostat D200中进行72小时，除了#9是24小时。加载的固体为20%至25%。预处理的玉米芯生物质的pH用H2SO4调节至5.3。添加的酶为A1500、Xyn3、Fv3A、Fv51A和Fv43D的聚生体，对于#6-9其添加至21.3毫克蛋白/克葡聚糖+木聚糖，除了在#6运行中
Figure BDA00002223587000241
木聚糖酶替换了Xyn3，以及在#10运行中H3A提取物（在一般方法中所述）使用量为14毫克/克葡聚糖+木聚糖。糖化在47℃运行。
制备种子培养物
2毫升冰冻菌株ZW705原液（菌株描述见一般方法）生长在MRM3G6中（10克/升BBL酵母提取物，2克/升KH2PO4，1克/升MgSO4*7H2O，60克/升葡萄糖）温度为33℃，不摇动8小时作为复苏培养物。摇瓶包含1升MRM3G10培养基（与MRM3G6相同但还有100克/升葡萄糖）接种20毫升复苏培养物，在33℃摇动孵育13-16小时。生长至OD600在1.5至3.1之间。足够的摇瓶培养物用于接种10升种子发酵罐至初始OD600为0.1（FRF 7-10）或0.35（FRF6）。
种子发酵在MaxSMG20或MaxSGM15中（20克/升酵母提取物，2克/升KH2PO4，5克/升MgSO4*7H2O，10mM山梨醇和200克/升葡萄糖。种子发酵在33℃和pH 5.8（FRF6 & 7）或5.5（FRF8-10）下进行。在首次观察到葡萄糖减少至小于85克/升后收获种子后，使用YSI 2700SELECTM生物化学分析仪（YSI Life Sciences；Yellow Springs，OH）测定葡萄糖。
发酵
表2中所列发酵批次是在200升的Sartorius Biostat D200中运行，其包含180升生物质水解产物和20升ZW705种子培养物。pH用氢氧化钠调节至5.8。维持在30℃-33℃运行80小时（FRF 6，7），90小时（FRF 8，10）或120小时（FRF 9）。
实施例2
来自木质纤维素玉米芯生物质的稀釜馏物的组合物水解产物发酵液
使用实例1中所述的预处理、糖化和发酵过程产生发酵液批次。在如表3给出的不同条件下使用连续精馏塔蒸馏不同发酵批次进料。对于批次10（10-1，10-2）的发酵液样品通过添加98%的硫酸调节至表3给出的较低pH。塔中蒸馏停留时间为约8分钟。
从蒸馏塔收集乙醇流。来自蒸馏塔的全釜馏物在60℃采用一般方法所述过滤器压力进行过滤。热处理应用于如表3给出的一部分批次中。
分析来自过滤的稀釜馏物的总固体（包括溶解的和悬浮的固体）和悬浮的固体。通过在真空中或对流烤箱以80℃24-72小时至干燥来测定总固体。每个干燥样品的重量以样品原始重量百分数来表示。通过下列ASTMD5907-09来测定悬浮固体。对于表3中给出的不同批次，稀釜馏物样品显示含有5-7%的总固体和约100-750ppm的悬浮固体。
表3：对于不同发酵液进料批次的制备细节和结果
Figure BDA00002223587000261
实施例3
稀釜馏物的pH和温度对于后续蒸发为不同固体百分比的糖浆粘度的 影响
如一般方法中所述使用实验室规模蒸发设备从稀釜馏物中蒸发水。如实施例1和2中所述制备的来自发酵液批次7-10的稀釜馏物样品在以表4中给出的不同压力条件下蒸发。稀釜馏物样品通过添加50%的氢氧化钠或98%的硫酸来调节pH至表4中的样本pH。以不同的总固体百分比收集塔顶水和塔底糖浆。在实施例2中稀釜馏物样品的初始总固体百分比在5%和7%之间。在不同的温度（20℃、40℃和60℃）下，在滑道中以1-3001/秒的剪切速率测量糖浆样品的粘度。无穷剪切粘度数值见表4。测定的糖浆样品在表4中显示的温度和浓度下是牛顿的（牛顿液体）。通过在真空炉或对流烤箱中以80℃干燥24至48小时，测定每个样品中的总固体百分数。
对于所有样品的粘度，其包括含约70%的固体的样品，在60℃保持低于100厘泊。随着降低pH，含高达约70%的固体的样品在40℃的粘度低于100厘泊。
表4：来自稀釜馏物蒸发至不同百分比固含量的糖浆样品的粘度
Figure BDA00002223587000271
Figure BDA00002223587000281
nd*=未测定
实施例4
来自玉米秸秆水解产物发酵液后续蒸发稀釜馏物至不同固体百分比的 糖浆的粘度
对于样品DF1062，第二轮玉米秸秆被磨至3/8"（0.95厘米）。在140℃用14%的NH3和65%的固体进行预处理60分钟。在47℃、pH 5.3，含7.8毫克/克葡聚糖+木聚糖酶聚生体进行糖化96小时。糖化酶是纤维素酶和半纤维素酶的混合物，其在来源于RL-P37的里氏木霉菌株中表达（Sheir-Neiss and Montenecourt（1984）Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53），与一般方法中所述菌株H3A的制备类似，其也能使用。对于样品DF1065，第二轮玉米秸秆被磨至5/64"（0.2厘米）。在140℃用8%的NH3和55%的固体进行预处理20分钟。在47℃、pH 5.3，含7.8毫克/克葡聚糖+木聚糖酶聚生体进行糖化96小时。
对于发酵，10毫摩尔每升山梨醇加到水解产物中，并且在发酵前将pH调节到5.8。使用10体积%（终体积）准备收获的ZW705种子，在pH5.8、33℃发酵DF1062和DF1065，23.5小时后转为30℃。在33℃，pH5.5，所述种子生长于halfYEMaxSMG15培养基（10克/升酵母提取物，2克/升KH2PO4，5克/升MgSO4*7H2O，10毫摩尔每升山梨醇，150克/升葡萄糖），允许125克/升葡萄糖的消耗。不同发酵批次在实验室蒸馏装置中以1个大气压蒸馏3小时。所述来自蒸馏塔的全釜馏物使用实验室规模的过滤装置进行过滤。实验室规模的蒸发设备用于在一个大气压下从稀釜馏物蒸发水。以不同的总固体百分比收集塔顶水和底部糖浆样品。在不同的温度（20℃、40℃和60℃）下，在滑道中以1-3001/秒的剪切速率测量糖浆样品的粘度。在表5中报道的粘度是在1001/s剪切速率。如实施例2测定悬浮固体百分比。用mettler设备测定总固体百分比。所述样品在30秒内加热到105℃。当经过105℃240秒后平均重量损失不超过1毫克时记录总固体百分比。对于稀釜馏物测定的总悬浮固体量很低（处于检出限）。两种稀釜馏物样品pH为5.7。
表5：来自稀釜馏物蒸发至不同百分比固含量的糖浆样品的粘度
Figure BDA00002223587000291
实施例5
来自柳枝稷水解产物发酵液后续蒸发稀釜馏物至不同固体百分比的糖 浆的粘度
对于样品DF1102和DF1119样品，将柳枝稷磨至<1毫摩尔每升。在155℃用12%的NH3预处理60分钟。在47℃、pH 5.3，含14毫克/克葡聚糖+木聚糖酶聚生体进行糖化94小时。糖化酶是纤维素酶和半纤维素酶的混合物，其在来源于RL-P37的里氏木霉菌株中表达糖化（Sheir-Neiss andMontenecourt（1984）Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46-53），与一般方法中所述菌株H3A的制备类似，其也能使用。对于发酵，10毫摩尔每升山梨醇加到水解产物中，并且在发酵前将pH调节到5.8。使用10体积%（终体积）准备收获的AR37-31种子，在pH 5.8、33℃发酵DF1102，21小时后转为30℃。
在33℃，pH5.5下，所述种子生长于halfYEMaxSMG15培养基（10克/升酵母提取物，2克/升KH2PO4，5克/升MgSO4*7H2O，10毫摩尔每升山梨醇，150克/升葡萄糖）允许约125克/升葡萄糖的消耗。不同发酵批次在实验室蒸馏装置中以1个大气压蒸馏3小时。所述来自蒸馏塔的全釜馏物使用实验室规模的过滤装置进行过滤。实验室规模的蒸发设备用于在一个大气压下从稀釜馏物蒸发水。以不同的总固体百分比收集塔顶水和塔底糖浆样品。在不同的温度（20℃、40℃和60℃）下，在滑道中以1-3001/秒的剪切速率测量糖浆样品的粘度。表6中报道的粘度是在1001/s剪切速率。对于稀釜馏物测定的总悬浮固体为0.26%。测定的悬浮的和总固体百分数见实施例4。样品具有pH 5.7。
表6：来自稀釜馏物蒸发至不同百分比的固含量的糖浆样品的粘度
Figure IDA00002223587500011
Figure IDA00002223587500021
Figure IDA00002223587500031
Figure IDA00002223587500041
Figure IDA00002223587500071
Figure IDA00002223587500081
Figure IDA00002223587500091
Figure IDA00002223587500101
Figure IDA00002223587500111
Figure IDA00002223587500121
Figure IDA00002223587500131
Figure IDA00002223587500141
Figure IDA00002223587500151

Claims (15)

1.糖浆，包含至少约40重量％的固体并具有小于约100厘泊的粘度；其中所述糖浆是液体部分蒸发的产品，所述液体部分来自木质纤维素生物质水解产物发酵液或产品枯竭的木质纤维素生物质水解产物发酵液的液体/固体分离。
2.权利要求1的糖浆，其中所述木质纤维素生物质水解产物发酵液包含目标产品，所述目标产品选自酸、醇、烷烃、烯烃、芳烃、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和药物。
3.权利要求2的糖浆，其中所述目标化合物选自乙醇、丁醇和1，3-丙二醇。
4.权利要求1的糖浆，其中所述木质纤维素生物质水解产物发酵液是由生物质产生的，所述生物质选自柳枝稷、废纸、来自造纸业的淤渣、玉米芯、玉米壳、玉米秸秆、小草、小麦、小麦秸秆、干草、大麦秸秆、稻秆、甘蔗渣、从谷物的加工中获得的组分、树木、枝条、根、叶片、木片、木屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果以及花。
5.权利要求1的糖浆，其中所述固体百分数为至少约45％。
6.权利要求1的糖浆，其中所述固体百分数为至少约50％。
7.生产目标产品的方法，包括：
a)提供包含目标产品的木质纤维素生物质水解产物发酵液；
b)通过蒸馏从(a)的木质纤维素生物质水解产物发酵液中移除所述目标产品以产生全釜馏物；
c)将来自(b)的全釜馏物的液体和固体部分分离以产生包含小于约0.1重量％的悬浮固体的稀釜馏物；以及
d)蒸发(c)的稀釜馏物以产生糖浆，所述糖浆包含至少约40重量％的固体并具有小于约100厘泊的粘度。
8.权利要求7的方法，其中所述目标产品选自乙醇、丁醇和1，3-丙二醇。
9.权利要求7的方法，其中所述糖浆被消耗而无需进一步干燥。
10.权利要求7的方法，其中来自蒸发所述稀釜馏物的水是循环利用的。
11.权利要求7的方法，其中(a)的木质纤维素生物质水解产物发酵液、或所述枯竭的发酵液、或(b)的全釜馏物具有约6或更低的pH。
12.权利要求7的方法，其中在约70℃和约150℃之间的温度下，在约30秒和约210分钟之间，对(a)的木质纤维素生物质水解产物发酵液、或所述枯竭的发酵液、或(b)的全釜馏物进行热处理，所述热处理的时间和温度是负相关的。
13.权利要求7的方法，其中所述木质纤维素生物质水解产物发酵液是由生物质产生的，所述生物质选自柳枝稷、废纸、来自造纸业的淤渣、玉米芯、玉米壳、玉米秸秆、小草、小麦、小麦秸秆、干草、大麦秸秆、稻秆、甘蔗渣、从谷物的加工中获得的组分、树木、枝条、根、叶片、木片、木屑、灌木和灌丛、蔬菜、水果以及花。
14.权利要求7的方法，其中所述糖浆的固体百分数为至少约45％。
15.权利要求7的方法，其中所述糖浆的固体百分数为至少约50％。
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