JP2013524838A - リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからの高固形分シロップの製造 - Google Patents
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Abstract
Description
a)リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを提供するステップと;
b)場合により、(a)のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスから生成流を取り出して、枯渇ブロスを生成するステップと;
c)(a)のブロスまたは(b)の枯渇ブロスから液体および固体画分を分離して、約0.1質量%未満の懸濁固形分を含んでなる薄い蒸留廃液を生成するステップと;
d)(c)の薄い蒸留廃液を蒸発させて、少なくとも約40質量%の固形分と約100センチポアズ未満の粘度を有するシロップを生成するステップと
を含んでなる、シロップを製造する方法を提供する。
a)エタノール生成物を含んでなるリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを提供するステップと;
b)蒸留によって(a)のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからエタノールを取り出して、全蒸留廃液を生成するステップと;
c)(b)の全蒸留廃液から液体および固体画分を分離して、約0.1質量%未満の懸濁固形分を含んでなる薄い蒸留廃液を生成するステップと;
d)(c)の薄い蒸留廃液を蒸発させて、少なくとも約40質量%の固形分を含んでなる約100センチポアズ未満の粘度を有するシロップを生成するステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法を提供する。
a)ブタノール生成物を含んでなるリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを提供するステップと;
b)(a)のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからブタノールを抽出して、枯渇ブロスを生成するステップと;
c)(b)の枯渇ブロスから液体および固体を分離して、懸濁固形分が約0.1質量%未満の薄い蒸留廃液を生成するステップと;
d)(c)の薄い蒸留廃液を蒸発させて、少なくとも約40質量%の固形分を含んでなる約100センチポアズ未満の粘度を有するシロップを生成するステップと
を含んでなる、ブタノールを製造する方法を提供する。
以下の配列は、37C.F.R.1.821〜1.825(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」)を満たし、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(1998)およびEPOおよびPCTの配列表要件(規則5.2および49.5(aの2)、および実施細則第208号および附属書C)に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、37C.F.R.§1.822で述べられる規則に従う。
出願人らは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物が発酵培地に含まれる場合、培地中の生体触媒による生成物の製造から得られる発酵ブロスは、生成物、細胞、リグニン、およびその他のバイオマス構成成分の混合物を含む複合スラリーである。副流を処理して有用な材料にすることは、ブタノールおよびエタノールなど、発酵ブロス中に比較的少量生じる生成物の製造において特に重要である。本明細書で開示されるステップを通じて、液体および固体ストリームは、固形分が少なくとも約40%であるシロップの製造を含めて、効率的に処理される。シロップは固形分が十分高く、燃焼時にエネルギーを提供し、それは製造工程に適用し得る。シロップからのエネルギー、ならびに再循環される精製水は、製造工程全体に効率を提供し、それによって商業化を達成してもよい。
式中、tは濾過時間(s)であり、Vはフィルター単位面積当たり濾液量(m3/m2)であり、Δpは濾過加圧力(Pa)であり、μは液体粘度(kg/ms)であり、μαavはケーク平均比抵抗m/kg)であり、Rmは濾材抵抗(m-1)であり、Cは濾液単位容積当たりの形成されたケーク質量(kg/m3)である。Yim et al.(Korean M.Chem.Eng.,18(5),741,(2001))を参照されたい。
本発明は、特に高固形分シロップを製造するための、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからの副流の処理に関する。副流は、典型的にはリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからの生成物を除去した後に処理される。生成物が除去されたブロスは枯渇ブロスである。リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスまたは枯渇ブロスは固体および液体画分に分離され、液体画分は薄い蒸留廃液である。この薄い蒸留廃液は懸濁固形分が非常に低い。薄い蒸留廃液の低い懸濁固形分濃度のために、それは引き続く蒸発中に低粘度を保つ。粘度は蒸発全体を通じて約100センチポアズ未満を保つので、少なくとも約40%以上の固形分のシロップに蒸発させることができる。蒸発によって、少なくとも約40%,45%、50%、55%、60%、65%、または70%固形分のシロップが生じる。約35%以下の固形分のシロップが、それらを燃焼させるのに使用される以上のエネルギーを提供しないのに対し、少なくとも約40%固形分のシロップは燃焼してエネルギーを提供し得る。
バイオマス加水分解生成物
リグノセルロース系バイオマスは、加水分解生成物中で発酵性糖類を製造するために当業者に知られているあらゆる方法によって処理してもよい。典型的には、バイオマスは物理的、熱的および/または化学的処理を使用して前処理され、酵素的に糖化される。物理的および化学的処理としては、粉砕、製粉、切断、アンモニアまたはNaOHなどによる塩基処理、および酸処理が挙げられるが、これに限定されるものではない。参照によって本明細書に援用する、同一譲受人の同時係属中の米国特許出願公開第20070031918A1号明細書で開示されるように、特に有用なのは、アンモニアを含んでなる水溶液にバイオマスを接触させてバイオマス−水性アンモニア混合物を形成する低アンモニア前処理であり、アンモニア濃度は、バイオマス−水性アンモニア混合物のアルカリ性pHを保つのに十分であるがバイオマス乾燥質量に対して約12質量%未満であり、バイオマスの乾燥質量はバイオマス−水性アンモニア混合物質量に対して少なくとも約15質量%固形分である。バイオマスはまた、典型的には前処理に先だって粒度が低減される。
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵培地中の発酵性糖類は適切な生体触媒によって代謝されて、標的生成物が生じる。発酵工程中に糖類を生体触媒に接触させて、生体触媒によって作られる標的生成物が生じる条件下で、生体触媒を増殖させる。使用される特定の生体触媒に有用な条件次第で、温度および/またはヘッドスペースガスを発酵のために調節してもよい。発酵は好気性であっても嫌気性であってもよい。これらの条件、および温度とpHをはじめとするその他の条件が、使用される特定の生体触媒について調節される。
生体触媒によって産生される生成物を含有する生成流を除去した後に、リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスから副流が処理される。例えばブタノールが生成物である場合、ガスストリッピングなどによって発酵ブロスを抽出することで、または参照によって本明細書に援用する同一譲受人の同時係属中の国際公開第2009/149270号パンフレットで開示されるように、水非混和性有機抽出剤を使用して水相からブタノール含有有機相を分離することで、ブタノールを発酵ブロスから除去してもよい。生成物を除去して得られたブロスが枯渇ブロスである。エタノールが生成物である場合、ブロスは典型的にはビールカラムを使用して蒸留され、エタノール生成流と枯渇ブロスである全蒸留廃液とが生じる。蒸留は、大気圧または減圧をはじめとする、当業者に知られているあらゆる条件を使用してもよい。代案としては、生成物は分離後に固体または液体画分から除去されてもよい。
糖化酵素
Accellerase(登録商標)1500(A1500)およびMultifect(登録商標)キシラナーゼは、Danisco U.S.Inc.,Genencor,International(Rochester,NY)から得た。
229株:変異誘発と高セルラーゼ産生についての選択とを通じて、RL−P37から誘導されたトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)株(Sheir−Neiss and Montenecourt,1984,Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46−53)をPEG媒介形質転換(Penttila et al.,1987,Gene 61(2):155−64)を使用して、β−グルコシダーゼ発現カセット(cbh1プロモーター、T.リーゼイ(T.reesei)β−グルコシダーゼ遺伝子、cbh1ターミネーター、およびamdSマーカー)β−グルコシダーゼ遺伝子、cbh1ターミネーター、およびamdSマーカー)、エンドキシラナーゼ発現カセット(cbh1プロモーター、T.リーゼイ(T.reesei)xyn3、およびcbh1ターミネーター)を用いて同時形質転換した。多数の形質転換体を単離して、β−グルコシダーゼおよびエンドキシラナーゼ産生について調べた。T.リーゼイ(T.reesei)#229株と称される1形質転換体を本明細書に記載される特定の研究で使用した。
発酵で使用されるザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)株の起源
これらの実施例のようにして処理されるリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスは、代案の生体触媒を使用して作成されてもよい。これらの実施例では例示的な株が使用され、下で説明される。代案として、ATCC PTA−7858として寄託されたZW658株を使用して、処理するリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを生成してもよい。
MRM3は、1リットル当たり以下を含有する:酵母抽出物(10g)、KH2PO4(2g)、およびMgSO40.7H2O(1g)
MRM3G6は、60g/Lグルコースを含有するMRM3である。
MRM3G6.5X4.5NH4Ac12.3は、65g/Lグルコース、45g/Lキシロース、12.3g/L酢酸アンモニウムを含有するMRM3である。
HYAc/YEは、遠心分離によってそれから固形分が除去された穂軸加水分解生成物を含有し、濾過滅菌されて、68g/Lグルコース、46g/Lキシロース、および5g/L酢酸を含有し、6.2g/L酢酸アンモニウム、および0.5%酵母抽出物が添加されて、pH5.8に調節された。
ケーク比抵抗は、ケーク高さ単位当たりの濾過ケークの抵抗性変化を定量化する。それはスラリー濃度、粘度、圧力、および濾過面積から独立している。値は、上述のようにRuthの式から得られる[Yim et al.,Korean M.Chem.Eng.、18(5),741,(2001)を参照されたい]。
完全な温度制御ができるPaarPhysicaMCR300レオメータによって、粘度を測定した。トウモロコシバイオマスサンプルに適用された測定原理は、円錐−円錐または二重ギャップタイプの測定ヘッドを使用した回転原理である。測定は、異なる温度(20℃、40℃、60℃)において、1〜300 1/sの勾配の剪断速度で実施した。報告された粘度は、無限剪断粘度である。
5Lジャケット付き丸底フラスコと連絡した、Syltherm熱伝導流体で充填された再循環加熱槽を含んでなる、実験室規模の蒸発機構を使用した。塔頂留出物冷却のために、二重凝縮器付き短経路蒸留ヘッドを使用した。蒸発では、約1〜2kgの薄い蒸留廃液を使用した。塔頂水および残留シロップ(bottoms syrup)サンプルを一定時間毎に収集した。
以下の市販されるプレパイロット規模のプレスを使用した:
Netzsch 470/SPメンブランフィルタープレスMix Pack Membrane、1.0 Pre Squeeze容量(ANDRITZ AG,Stattegger Strasse18,A-8045 Graz,Austria)。適切な数の供給用バルブ付きManualPiping、コアブロー、ケークブロー、メンブランブローバック、および濾液ブロックが含まれている。
・ フィルター面積:6800cm2
・ チャンバー数:2
・ 最大濾過圧力=7バール(700キロパスカル)
・ 最大操作温度85℃
・ 開閉装置:水圧ラム
・ 材料供給:圧縮空気駆動式ダイヤフラムポンプ
・ 寸法:1300×1500×600mm
・ 質量:およそ250kg
リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスの製造
トウモロコシ穂軸の前処理
発酵バッチFRF6
Jaygo水平パドル反応装置(およそ170L)を使用して、サイズが全て<1/2インチ(1.27cm)である、4バッチの穂軸片を前処理した。穂軸を反応装置に装填し、容器を真空にして0.1バール(10キロパスカル)絶対圧にして、次に水酸化アンモニウム溶液を導入してバイオマス乾燥質量に対して、約4(2バッチ)、6(1バッチ)または8(1バッチ)質量%のNH3とした。蒸気を添加して、温度を約145℃にした。この温度を20分間保った。前処理の終わりに、反応装置を制御された方式で圧抜きして大気圧にし、次に引き続いて真空にして、容器内圧力を約0.1バール(10キロパスカル)絶対圧に戻した。反応装置を出た前処理穂軸片は、約55質量%乾燥バイオマスであった。穂軸片を1.0mmスクリーン付き微粉砕機(モデル番号1SH,シリアル番号10019;Pulverizing Machinery Division of Mikropul Corporation;Summit,NJ)内でサイズを1mm未満に低下させた。
穂軸バッチの前処理のために、容器本体および側面本体周囲に蒸気を通過させるジャケットを有する、水平Littleford Day 130L反応装置容器(Littleford Day,Inc.,Florence,KY)を使用した。各バッチ毎に、容器に穂軸を装填した(サイズ1mm未満)。1.0mmスクリーン付き微粉砕機(モデル番号1SH,シリアル番号10019;Pulverizing Machinery Division of Mikropul Corporation; Summit,NJ)で処理して、穂軸片のサイズを低下させた。異なる前処理バッチで使用した穂軸の%水分を表2に示す。
200LのSartorius Biostat D200内で72時間にわたり糖化を実施したが、#9だけは24時間糖化した。固体装填率は、20%〜25%であった。前処理穂軸バイオマスのpHをH2SO4で5.3に調節した。添加した酵素は、A1500、Xyn3、Fv3A、Fv51A、およびFv43Dの組合せであり、それを#6〜9では21.3mgタンパク質/gグルカン+キシランで添加したが、実験#6ではMultifect(登録商標)キシラナーゼでXyn3を置換し、実験#10ではH3A抽出物(一般方法に記載される)を14mg/gグルカン+キシランで使用した。糖化は47℃で実施した。
復活培養物として、2mLの凍結ZW705保存株(一般方法に記載される株)をMRM3G6(10g/LのBBL酵母抽出物、2g/LのKH2PO4、1g/LのMgSO4・7H2O、60g/Lのグルコース)中で、振盪せずに33℃で8時間培養した。1LのMRM3G10培地(MRM3G6と同一であるが100g/Lグルコースを添加)を含有する振盪フラスコに、20mLの復活培養物を接種して、33℃で振盪しながら13〜16時間培養した。OD600が1.5〜3.1になるまで増殖させた。十分な振盪フラスコ培養物を使用して、0.1(FRF7〜10)または0.35(FRF6)の初期OD600で、10Lの種発酵槽に接種した。
180Lのバイオマス加水分解生成物と20LのZW705種培養を含有する200L Sartorius BiostatD200内で、表2に列挙する発酵バッチを実施した。pHをNaOHで5.8に調節した。発酵は30℃〜33℃で80時間(FRF6、7)、90時間(FRF8、10)または120時間(FRF9)保った。
リグノセルロース系トウモロコシ穂軸バイオマス加水分解生成物発酵ブロスからの薄い蒸留廃液の組成
実施例1に記載の通り、前処理、糖化、および発酵を使用して発酵ブロスバッチを生成した。連続蒸留塔を使用して、表3に示すように、異なる発酵バッチ供給物を異なる条件下で蒸留した。98%硫酸の添加によって、バッチ10(10−1、10−2)の発酵ブロスサンプルを表3に示すより低いpHに調節した。カラム内の蒸留滞留時間は約8分間であった。
異なる%固形分への蒸発に続くシロップ粘度に対する薄い蒸留廃液のpHおよび温度の影響
一般方法に記載の通り、実験室規模の蒸発機構を使用して、薄い蒸留廃液から水を蒸発させた。実施例1および2に記載されるように調製した発酵ブロスバッチ7〜10からの薄い蒸留廃液サンプルを、表4に示すように異なる圧力条件下で蒸発させた。50%NaOHまたは98%硫酸どちらかの添加によって、薄い蒸留廃液のサンプルをpH調節し、表4のサンプルpH値を得た。塔頂水および残留シロップ(bottom syrup)サンプルを異なる%全固形分で収集した。薄い蒸留廃液サンプルの初期%全固形分は、実施例2と同様に5%〜7%であった。シロップサンプルの粘度は1〜300 1/sの勾配の剪断速度で異なる温度(20℃、40℃、および60℃)において測定した。無限剪断粘度数を表4に報告する。測定されたシロップサンプルは、表4に示す温度および濃度でニュートン流体であった。真空オーブンまたは80℃の対流オーブン内で24〜48時間乾燥させて、各サンプルの%全固形分を測定した。
薄い蒸留廃液の異なる%固形分への蒸発に続くトウモロコシ茎葉加水分解生成物発酵ブロスからのシロップの粘度
サンプルDF1062では、セカンドパストウモロコシ茎葉を3/8インチ(0.95cm)に粉砕した。前処理は、140℃において14%NH3および65%固形分で60分間実施した。糖化は47℃でpH5.3において、7.8mg/gグルカン+キシラン酵素共同体によって96時間実施した。糖化酵素は、一般方法に記載されるH3A株調製品に類似した、RL−P37に由来するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)株中で発現されるセルラーゼとヘミセルラーゼの混合物(Sheir−Neiss and Montenecourt(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46−53)であり、H3A株調製品もまた使用し得る。サンプルDF1065では、セカンドパス細断茎葉を5/64インチ(0.2cm)に粉砕した。前処理は、140℃において、8%NH3および55%固形分で20分間実施した。糖化は47℃でpH5.3において、7.8mg/gグルカン+キシランの同一酵素共同体によって96時間実施した。
薄い蒸留廃液の異なる%固形分への蒸発に続く、スイッチグラス加水分解生成物発酵ブロスからのシロップの粘度
サンプルDF1102およびDF1119サンプルでは、スイッチグラスを<1mmに粉砕した。12%NH3を用いて、155℃で60分間前処理を実施した。糖化は47℃でpH5.3において、14mg/gグルカン+キシラン酵素共同体によって94時間実施した。糖化酵素は、一般方法に記載されるH3A株調製品に類似した、RL−P37に由来するトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)株中で発現されるセルラーゼとヘミセルラーゼの混合物(Sheir−Neiss and Montenecourt(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol.20:46−53)であり、H3A株調製品もまた使用し得る。発酵では、10mMソルビトールを加水分解生成物に添加して、発酵前にpHを5.8に調節した。DF1102は、10容積%(最終容積)の即時収穫可能AR37−31株種培養と共に、pH5.8および33℃で、21時間後に30℃に移行させて発酵させた。
Claims (15)
- リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスの液体/固体分離からの液体画分の蒸発生成物であるか、または生成物枯渇リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスである、少なくとも約40質量%の固形分を含んでなり約100センチポアズ未満の粘度を有するシロップ。
- リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスが、酸、アルコール、アルカン、アルケン、芳香族、アルデヒド、ケトン、バイオポリマー、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、抗生物質、および医薬品からなる群から選択される標的生成物を含んでなる、請求項1に記載のシロップ。
- 標的化合物が、エタノール、ブタノール、および1,3−プロパンジオールからなる群から選択される、請求項2に記載のシロップ。
- リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスが、スイッチグラス、古紙、製紙業汚泥、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、草、小麦、麦藁、干し草、大麦藁、稲藁、サトウキビバガス、穀類の加工から得られる構成成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、および花卉からなる群から選択されるバイオマスから生成される、請求項1に記載のシロップ。
- 固形分が少なくとも約45%である、請求項1に記載のシロップ。
- 固形分が少なくとも約50%である、請求項1に記載のシロップ。
- a)標的生成物を含んでなるリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスを提供するステップと;
b)蒸留によって、(a)のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスから前記標的生成物を除去し、全蒸留廃液を生成するステップと;
c)(b)の全蒸留廃液から液体および固体画分を分離して、約0.1質量%未満の懸濁固形分を含んでなる薄い蒸留廃液を生成するステップと;
d)(c)の薄い蒸留廃液を蒸発させて、少なくとも約40質量%の固形分を含んでなり約100センチポアズ未満の粘度を有するシロップを製造するステップと
を含んでなる、標的生成物を製造する方法。 - 標的生成物が、エタノール、ブタノール、および1,3−プロパンジオールからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- シロップがさらなる乾燥なしに燃焼される、請求項7に記載の方法。
- 薄い蒸留廃液の蒸発からの水が再循環される、請求項7に記載の方法。
- (a)のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロス、または(b)の枯渇ブロスまたは全蒸留廃液が、約6以下のpHを有する、請求項7に記載の方法。
- (a)のリグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロス、または(b)の枯渇ブロスまたは全蒸留廃液が、約70℃〜約150℃の温度で約30秒間〜約210分間加熱処理され、時間と温度が逆相関する、請求項7に記載の方法。
- リグノセルロース系バイオマス加水分解生成物発酵ブロスが、スイッチグラス、古紙、製紙業汚泥、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、草、小麦、麦藁、干し草、大麦藁、稲藁、サトウキビバガス、穀物加工から得られる構成成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、および花卉からなる群から選択されるバイオマスから生成される、請求項7に記載の方法。
- シロップの固形分が少なくとも約45%である、請求項7に記載の方法。
- シロップの固形分が少なくとも約50%である、請求項7に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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