CN106119158B - 一种石油烃降解菌株、石油烃降解菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种石油烃降解菌株、石油烃降解菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供的石油烃降解菌株为威尼斯不动杆菌LCL‑1(Acinetobacter venetianus LCL‑1)，以石油污染的海洋底泥筛选得到海洋土著微生物可适应复杂海洋环境，且能高效降解石油烃，具备良好的商业价值，应用广泛。另外，还提供了一种石油烃降解菌的聚氨酯泡沫制备方法，将聚氨酯泡沫分散于去离子水中，调节pH后加入二乙烯三胺水浴反应，水洗后真空干燥得到胺改性聚氨酯泡沫，将胺改性的聚氨酯泡沫分散于LB培养基中，接种上述菌株交联反应得到石油烃降解菌的聚氨酯泡沫，上述胺改性泡沫，与微生物表面的胞外分泌物发生交联反应，利于微生物的固定附着生长，固定后的微生物能够避免被海水冲散，便于回收。

Description

一种石油烃降解菌株、石油烃降解菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及石油污染治理技术领域，尤其涉及一种石油烃降解菌株、石油烃降解菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
随着社会的不断发展，人类对能源的需求与日俱增。石油作为一种宝贵的能源和化工原料，它的普及使用给人类的生产生活带来了巨大的便利。但与此同时，由于使用不当和日渐频繁的原油泄漏事故的发生，石油，这把双刃剑，在发挥着正面作用的同时，其负面影响也不容忽视。由于井喷、船舶漏油以及输油管道的泄漏等事故造成的海洋石油污染日渐增多，严重影响了生态环境及海洋生物资源。从目前的海洋石油污染事件来看，石油污染大部分集中在海洋和河流入海口附近的水体和沉积物中。全世界范围内的海洋石油污染事件频繁发生，对海洋生态系统造成了严重破坏。另外，石油的主要化学成分是烷烃和苯、甲苯、二甲苯等复杂芳香烃等，不仅有致癌变、致畸变、致突变等作用，并很可能在动植物及人体内富集，危害生物健康。
针对日益严重的石油污染问题，国内外研究人员已经利用物理、化学和生物修复法在该领域取得了一定的进展，但石油污染治理工作仍然任重而道远。物理处理法主要通过物理方法和机械装置回收溢油。主要使用的方法有围油栏、吸油船、磁性分离和吸着材料等。该方法处理海面及海岸带油污的效率最高，但对于厚度小于0.3cm的薄油层和乳化油效果较差，并且设备庞大、耗费高。化学方法主要使用分散剂、凝油剂、集油剂和沉降剂等，但化学方法的本质却是向海洋中投入人工合成的化学污染物。不但成本高，也造成了二次污染。正是由于物理和化学处理法的种种弊端，其应用受到限制。而生物修复方法利用 微生物消除水体表面油膜和分散水中溶解的石油烃类，具有成本低、效率高、对环境友好、不产生二次污染等显著优点，已经成为一种经济效益和环境效益俱佳的、解决石油污染问题的有效方法。
虽然利用微生物对石油污染物进行生物修复具有安全、经济、低毒、无二次污染等特点，具有良好的经济效益和环境效益。尽管近年来，人们研究发现自然界中存在大量具有降解石油能力的微生物，目前已发现的石油烃降解微生物包括细菌、放线菌、霉菌、酵母以及藻类等。但是，这些研究主要针对石油污染的土壤和地下水，关于海洋石油污染生物修复的研究较少。由于海水盐度较高，陆地微生物并不能适应海洋环境，因此，开发海洋环境中具有石油降解能力的土著微生物具有十分重要的实用价值。
此外，海洋是一个开放的水环境，在实际的溢油修复过程中需要考虑到海洋环境的实际情况。直接将游离态的微生物应用到海洋溢油修复过程，可能会因为被冲走、分散从而影响修复效果。而将微生物固定在特殊载体上，一方面可以为微生物生长提供支点，另一方面还提高了细胞密度、增强其抗冲击负荷及抑制性物质能力。因此，实现高效石油降解微生物的固定化，是实现其工业化应用的有力保障。
发明内容
鉴于此，有必要提供一种能够有效降解石油的石油烃降解菌株和石油降解菌剂。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种石油烃降解菌株，所述菌株为威尼斯不动杆菌LCL-1(Acinetobactervenetianus LCL-1)，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2015538，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年9月15日。。
一种石油烃降解菌剂，包括石油烃降解菌株Acinetobacter sp.LCL-1，所述 石油烃降解菌株Acinetobacter sp.LCL-1的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2015538。
按体积比为10％的接种量将所述石油烃降解菌株Acinetobacter sp.LCL-1接入到发酵罐的石油降解培养基中，置于150-200rpm的摇床中，在温度为25-35℃、盐度为1-3.5％、pH为6-8的条件下培养3-7d，得到所述石油降解菌剂，其中，所述石油降解培养基的组成为1％(w/v)的KH2PO4、1％(w/v)的K2HPO4、1％(w/v)的NH4NO3、0.2％(w/v)的MgSO4、0.02％(w/v)的CaCl2、0.05％(w/v)的FeCl2，25％(w/v)的NaCl及0.5％(w/v)的石油。
另外，本发明还提供了一种石油烃降解菌株或石油烃降解菌剂在降解石油中的应用。
进一步地，本发明还提供一种石油烃降解菌的聚氨酯泡沫制备方法，包括下述步骤：
将聚氨酯泡沫分散于去离子水中，用氨水调节pH为9-11，加入二乙烯三胺，在25-40℃的水浴条件下反应后水洗，并真空干燥得到胺改性的聚氨酯泡沫；
将所述胺改性的聚氨酯泡沫分散于LB培养基中，接种Acinetobacter sp.LCL-1后，交联反应得到石油烃降解菌的聚氨酯泡沫。
在一些实施例中，所述胺改性的聚氨酯泡沫上固定微生物的量至少为83.5mg/g。
在一些实施例中，所述水浴反应的温度为30℃。
本发明提供的石油烃降解菌株Acinetobacter sp.LCL-1，直接以石油污染的海洋底泥筛选得到海洋土著微生物能够适应复杂的海洋环境，耐受高盐度环境，特别适应于海洋环境，并且能够高效降解石油烃，在海洋石油污染治理中具备良好的商业价值，应用前景广泛。
本发明还提供了一种石油烃降解菌的聚氨酯泡沫制备方法，将聚氨酯泡沫分散于去离子水中，用氨水调节pH为9-11，再加入二乙烯三胺，水浴反应后水洗，并真空干燥得到胺改性的聚氨酯泡沫，再将所述胺改性的聚氨酯泡沫分散于LB培养基中，接种Acinetobacter sp.LCL-1后，交联反应得到石油烃降解菌的聚氨酯泡沫，本发明得到的胺改性泡沫，能够与微生物表面的胞外分泌物发生交联反应，有利于微生物的固定附着生长，且固定后的微生物能够避免被海水冲散，便于回收，具有潜在的实用价值。
附图说明
图1表示为Acinetobacter sp.LCL-15d内对原油中石油烃的降解率分布示意图。
图2中(A)表示为固定有LCL-1胺改性聚氨酯泡沫的扫描电镜图(二乙烯三胺与聚氨酯泡沫的质量百分比为60％)；(B)表示为固定有LCL-1胺改性聚氨酯泡沫的扫描电镜图(二乙烯三胺与聚氨酯泡沫的质量百分比为1.2％)；(C)表示为(A)的局部放大图；(D)表示为(B)的局部放大图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，如下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种石油烃降解菌株，所述菌株为Acinetobacter sp.LCL-1，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2015538。保藏日期为2015年9月21日。保藏单位地址：中国武汉武汉大学。邮编：430072。
具体地，本发明以中国山东蓬莱19-3油田附近海洋底泥为菌源，筛选到一株具有高效石油降解能力的海洋土著细菌，命名为#LCL-1，经鉴定为不动 杆菌属(Acinetobactersp.)，能够耐受一定盐度和pH的变化，在海洋石油污染领域具有潜在的应用价值。
一种石油降解菌剂，包括石油烃降解菌株威尼斯不动杆菌LCL-1(Acinetobactervenetianus LCL-1)，威尼斯不动杆菌LCL-1的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2015538，保藏日期为2015年9月21日。
本发明还提供了一种石油烃降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
按体积比为10％的接种量将所述石油烃降解菌株Acinetobacter sp.LCL-1接入到发酵罐的石油降解培养基中，再置于150-200rpm的摇床中，在温度为25-35℃、盐度为1-3.5％、pH为6-8的条件下培养3-7d，得到所述石油降解菌剂，其中，所述石油降解培养基的组成为1％(w/v)的KH2PO4、1％(w/v)的K2HPO4、1％(w/v)的NH4NO3、0.2％(w/v)的MgSO4、0.02％(w/v)的CaCl2、0.05％(w/v)的FeCl2，25％(w/v)的NaCl及0.5％(w/v)的石油。
上述石油降解菌剂可用于石油的降解。
请参阅图1是Acinetobacter sp.LCL-1 5d内对原油中石油烃的降解率，从图1中可以看出，通过调节上述石油降解培养基的盐度和pH，研究不同NaCl浓度(30-120g/L)和不同pH(4.6-9.6)对LCL-1降解石油烃的影响。
结果表明：NaCl浓度为90g/L时，饱和烃降解率仍可达70％，当NaCl浓度超过120g/L时，饱和烃降解率低于6％；pH 5.6-8.6范围内，饱和烃降解率保持在60％以上。
本发明还提供了一种石油烃降解菌的聚氨酯泡沫制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
步骤S110：将聚氨酯泡沫分散于去离子水中，用氨水调节pH为9-11，加入二乙烯三胺，水浴反应后进行水洗，并真空干燥得到胺改性的聚氨酯泡沫；
优选地，所述水浴反应的温度为30℃。
步骤S120：将所述胺改性的聚氨酯泡沫分散于LB培养基中，接种Acinetobactersp.LCL-1后，交联反应得到石油烃降解菌的聚氨酯泡沫。
可以理解，本发明中描述的方法得到的胺改性泡沫，能够与微生物表面的胞外分泌物发生交联反应，有利于微生物的固定附着生长，且所述胺改性的聚氨酯泡沫上固定微生物的量至少为83.5mg/g，固定后的微生物能够避免被海水冲散，便于回收，具有潜在的实用价值。
下面为具体实施例部分。
实施例1-胺改性的聚氨酯泡沫的制备：
将聚氨酯泡沫剪成1cm×1cm的小块，取五块(0.5901g)分散于99mL去离子水中，加入～1.4mL氨水调节pH为～10，升温至30℃时加入1mL二乙烯三胺(质量比～59％)，搅拌反应6h，真空干燥得含有氨基的石墨烯；LCL-1的固定化：在100mL LB培养基中加入五块胺改性的聚氨酯泡沫，按V/V比1％接入LCL-1种子液后，置于30℃、180rpm条件下交联反应72h。此时的微生物固定量约为83.55mg/g(见图2A和C)。
实施例2-胺改性的聚氨酯泡沫的制备：
将聚氨酯泡沫剪成1cm×1cm的小块，取五块(0.6033g)分散于50mL去离子水中，加入～0.7mL氨水调节pH为～10，升温至30℃时加入50mL二乙烯三胺(质量比～1.2％)，搅拌反应6h，真空干燥得含有氨基的石墨烯；②LCL-1的固定化：在100mL LB培养基中加入五块胺改性的聚氨酯泡沫，按V/V比1％接入LCL-1种子液后，置`30℃、180rpm条件下交联反应72h。此时的微生物固定量约为130.8mg/g(见图2B和D)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种石油烃降解菌剂，其特征在于，包括石油烃降解菌株威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus) LCL-1，所述石油烃降解菌株威尼斯不动杆菌LCL-1的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2015538。
2.一种如权利要求1所述的石油烃降解菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
按体积比为10％的接种量将所述石油烃降解菌株威尼斯不动杆菌LCL-1接入到石油降解培养基中，再置于150-200rpm的摇床中，在温度为25-35℃、盐度为1-3.5％、pH为6-8的条件下培养3-7d，得到所述石油降解菌剂，其中，所述石油降解培养基的组成为1％(w/v)的KH2PO4、1％(w/v)的K2HPO4、1％(w/v)的NH4NO3、0.2％(w/v)的MgSO4、0.02％(w/v)的CaCl2、0.05％(w/v)的FeCl2，25％(w/v)的NaCl及0.5％(w/v)的石油。
3.如权利要求1所述的石油烃降解菌剂在降解石油中的应用。
4.一种固定有权利要求1所述的石油烃降解菌剂的聚氨酯泡沫的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
将聚氨酯泡沫分散于去离子水中，用氨水调节pH为9-11，加入二乙烯三胺，水浴反应后进行水洗，并真空干燥得到胺改性的聚氨酯泡沫；
将所述胺改性的聚氨酯泡沫分散于LB培养基中，接种威尼斯不动杆菌LCL-1后，交联反应得到石油烃降解菌的聚氨酯泡沫；
所述胺改性的聚氨酯泡沫上固定微生物的量至少为83.5mg/g。
5.如权利要求4所述的固定有权利要求1所述的石油烃降解菌剂的聚氨酯泡沫的制备方法，其特征在于，所述水浴反应的温度为30℃。
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水性聚氨酯的合成及改性研究;张武英 等;《广东化工》;20050325(第3期);摘要 *
环境条件对海洋石油降解菌Y9中AlkB基因表达的影响;侯登勇 等;《全国第九届海洋生物技术与创新药物学术会议摘要集》;20140806;第104页 *

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