CN109665633A - 一种修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，属于生化环保技术领域，主要包括如下步骤：(1)菌源采样；(2)功能菌群构建；(3)混合发酵；(4)发酵后处理，进而制备一种高效降解酚类污染物的功能菌群，用于酚类污染土壤及地下水的修复。利用本发明制备的功能菌群对各种酚类污染土壤及地下水具有广泛适用性，功能菌群的构建基于原污染环境土著微生物，菌群组成随污染环境动态变化，对所修复的目标环境适应性和针对性强，投加后可快速起效且稳定持久，无需长期持续投加。本发明工艺合理，成本低廉，易于推广实施，具有良好的环境效益、经济效益和社会效益。

Description

一种修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法
技术领域
本发明属于生化环保技术领域，提供了一种修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法。
背景技术
随着石化、焦化、农化等行业的迅速发展，各类工业含酚废弃物的产生也相应增多，含酚废水、废渣排入环境，对土壤及地下水造成严重污染。酚类化合物是一类有毒物质，对几乎所有生物均有毒害作用，因此，酚类污染土壤及地下水的修复工作刻不容缓。
目前，酚类污染土壤及地下水的修复方法主要有热脱附、化学氧化、淋洗和生化处理等。传统的物理、化学方法处理成本较高，易产生二次污染，对某些中间产物降解不彻底。相比之下，生化法具有经济、高效、处理彻底、无二次污染等优点，在酚类污染土壤及地下水修复领域具有良好的发展前景。
生物强化是土壤及地下水生物修复领域中的一类重要技术，通过向土壤和地下水中投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的高效菌种，以去除某一种或某一类有害物质。目前为止，国内外研究热点在于寻找或构建高效降解菌种，通过单一菌种或其相互间的复配制备生物菌剂，用于环境修复。国内外已有较为成熟的生物菌剂产品投入市场，但类似产品均为外源菌种，且菌种组成较为单一，对特定的土壤及地下水环境适应性和针对性较差，在待修复场地中难以成为优势菌种，需长期持续投加，加之高效菌种的分离、构建难度大，研发周期长，因此菌剂产品大多价格昂贵，运行成本高昂，并且外源菌种的投加还有可能因与土著菌种生态位重叠而造成生物安全性问题。另外，依靠目前生物技术仅能分离自然界1％左右的菌种，多数菌种无法分离，因此生态环境中土著微生物对污染物降解的巨大潜力尚未充分发掘。
从已有的研究成果来看，以待修复污染土壤及地下水土著微生物为菌种来源，制备具有针对性的降酚功能菌群，用于原酚类污染场地环境修复的技术方法和工程实例尚不多见。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，本发明提供一种修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，以待修复污染场地的土著微生物为菌源，通过功能菌群构建、菌群混合发酵和适当的后处理措施，定向制备对特定污染场地有针对性的酚类污染物降解功能菌群，用于高效修复酚类污染土壤及地下水。
本发明所述方法制备的功能菌群对各种酚类污染土壤及地下水具有广泛适用性，所构建的功能菌群克服了上述单一菌种和外源菌种存在的不足，功能菌群的构建基于原污染环境土著微生物，菌群组成随污染环境动态变化，对所修复的目标环境适应性和针对性强，投加后可快速起效且稳定持久，无需长期持续投加。本发明工艺合理，成本低廉，易于推广实施，具有良好的环境效益和社会效益。
本发明的主要内容是提供了一套完整的功能菌群制备方法，针对于不同环境下的土著微生物具有极佳的效果，不需对微生物的菌种等条件进行限定，具有广泛的应用价值。
本发明提供一种修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌源采样：在待修复的污染场地采集受酚类物质污染的土壤，即为功能菌群构建的土著微生物菌源；
之所以选择待修复污染场地的酚类污染土壤作为菌源采样点，主要原因在于该土壤中含有大量土著微生物，种类丰富，且已具备一定的耐酚降酚能力，易于强化培养，功能菌群制备完毕后再投加回原污染场地，菌群适应能力强，可快速起效并形成优势菌种，无需长期持续投加，且不会因生态位重叠造成不良影响；
(2)功能菌群构建：
A.配制培养液：培养液配方为：0.1-1.2％w/v基础无机盐培养基、10-60％v/v待修复污染场地的酚类污染地下水、0.2-2％w/v无机载体、余量为自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀，培养液体积为预计总培养体积的30-50％(计划通过本发明方法所要配制的功能菌群溶液的体积)；
B.接种：在上述培养液中添加混合酚并混合均匀，使培养液酚浓度达到100-200mg/L，调节pH至6-8，将上述步骤(1)中采集的土著微生物菌源接入培养容器中，使接种后土著微生物菌源浓度以污泥干质量计为3-12g/L；
C.菌群构建：对上述接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：2-4mg/L，温度：15-37℃，每8-24h检测培养液酚含量；酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至200-400mg/L；继续培养至酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至400-800mg/L；继续培养至酚去除率达到90％以上后，将培养液静置，弃去培养液体积10-50％的上层清液，按步骤A所述配方配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充混合酚至400-800mg/L，继续培养；此后酚去除率每达到90％以上，补充混合酚至400-800mg/L，连续培养10-14d，功能菌群构建完成，一般经过上述培养后培养液降酚速率不低于400mg/(L.d)；
其中所述基础无机盐培养基成分组成及相对重量比例份数如下：NH4NO36-14份、K2HPO43-7份、KH2PO43-7份、CaCl20.6-1.4份、NaCl 1.5-2.5份、MgSO40.6-1.4份、MnSO40.02-0.18份、FeSO40.02-0.18份。采用这种组成的基础无机盐培养基可以解决菌群构建过程中使用的污染地下水成分单一的问题，为土著菌群的强化培养提供必要的营养物质，加快功能菌群的构建。
其中所述无机载体为沸石粉、硅藻土、活性炭、碳酸钙等常用无机载体中的一种或几种的组合，当采用多种组合时，相互质量配比没有限制。无机载体的添加可为微生物附着生长提供场所，从而提高菌群浓度。
在构建功能菌群时待修复污染场地的酚类污染地下水的投加为关键步骤，通常情况下待修复场地的污染物组成较为复杂，如果功能菌群的构建脱离原场地环境，则菌群的适应性和有效性难以保证，待修复污染场地的酚类污染地下水的投加可使功能菌群的构建过程始终处于待修复场地环境条件下，使功能菌群对待修复场地保持良好的适应性，有助于定向制备对特定污染场地具有针对性的酚类污染物降解功能菌群，使其分别适应其所对应的应用环境。
在B步骤的接种过程中，需要向培养液中添加混合酚，所述加入的混合酚为重量分数为60-90％苯酚和10-40％待修复场地酚类污染物，所述的待修复场地酚类污染物包括甲苯酚、萘酚、氯酚、二氯酚、三氯酚、硝基苯酚中的一种或几种的组合，当待修复场地酚类污染物为多种组合时，添加的组合污染物的质量配比没有特别规定。经研究，对苯酚有良好降解能力的菌种均可降解绝大多数其他酚类物质，因此，所采用的混合酚以苯酚为主，但为使菌群的构建更有针对性，还应根据待修复场地具体污染特点适量添加待修复场地酚类污染物，包含但不仅限于上述列出的物质以提高本发明所述方法的通用性，使之针对不同性质的酚类污染场地都有很好的适用性。
在步骤C.菌群构建中，采用了酚含量梯度增加的方式进行，目的在于逐步将培养环境转变为高含酚环境，淘汰无法适应高酚环境的杂菌，使能够耐受并降解高含量酚类物质的菌种逐步适应高酚环境，并成为优势菌群，提高适应能力和处理能力；在菌群构建过程中，有弃去培养液体积10-50％的上层清液的步骤，该步骤的原因在于经过长时间的培养，培养液中可能积累了大量对微生物生长有抑制作用的代谢产物，需要将其排出培养液；
对于某一特定污染场地而言，菌群构建的过程其菌种组成随培养时间保持优胜劣汰的动态平衡状态，最终形成相对稳定的对该场地污染土壤及地下水具有良好适应性的高效功能菌群，上述方法的优势还在于，对于传统生物技术无法分离培养的功能菌种，也可随菌群的培养过程优势生长，从而最大程度发挥土著微生物的处理能力，降低菌种培养的成本；
在通过上述方法获得了适合于对应污染场地的功能菌群后，即可利用该功能菌群进行大规模的混合发酵生产，具体步骤如下：
(3)混合发酵：
A.发酵条件准备：对发酵罐进行灭菌，空消灭菌温度120℃，时长25min，之后加入0.1-0.5％w/v速效碳源，0.02-0.2％w/v酵母浸粉和0.1-0.5％w/v基础无机盐培养基，实消灭菌，温度120℃，时长25min；温度降至30℃时，添加苯酚，使初始苯酚含量为200-600mg/L，通气15min；
B.接种发酵：将上述步骤(2)构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，接种量2-8％(v/v)(接种量以制备出来的含有功能菌群的液体量计算)，开始发酵，温度25-35℃，罐内压力0.05Mpa，通气量40-80m3/h；
C.培养基流加：发酵液DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基，速效碳源流加速率为100-400mg/(L.h)，硝酸铵流加速率为10-20mg/(L.h)，苯酚流加速率为10-40mg/(L.h)；
D.发酵终点控制：发酵时长控制在48h之内，36h后每2h取样测定菌液OD值，如发现连续2次测样OD值下降，立即放罐，否则在48h时放罐；
其中步骤A所述的速效碳源包括葡萄糖、海藻糖、乙酸钠、丁二酸钠、甲醇、糖蜜中的一种或几种的组合，当多种混合时没有比例份数要求。混合发酵阶段的目的是将上述构建完成的功能菌群进行规模化生产，由于酚类物质本身具有一定毒性，不利于微生物快速利用和生长繁殖，因此添加上述速效碳源，使功能菌群快速扩繁，同时添加一定浓度的苯酚，保证功能菌群的降酚能力，同时抑制杂菌生长；
上述步骤C.培养基流加在发酵液DO值降至最低点开始上升后开始，此时初始培养基的营养物质已大量消耗，以速效碳源和苯酚作为碳源、硝酸铵作为氮源进行流加，保证混合发酵所需营养；
上述步骤D.发酵终点控制中，将发酵时长控制在48h之内，原因在于此时菌群浓度已达到最高，降酚活性也达到较高水平，继续培养则进入内源呼吸阶段，菌体浓度不再生长，同时代谢产物的积累开始抑制菌种生长和活性，对功能菌群的构建产生负面作用。对菌液OD值的测定目的也是在于检测菌体浓度，如发现连续2次测样OD值下降，则发酵培养提前进入内源呼吸阶段，达到发酵重点，应立即放罐进行后处理。
(4)发酵后处理：
A.菌体收集：将发酵液注入搅拌罐中，加入15-25g/L硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
B.固体菌粉制备：在收集的菌体中添加与菌体湿重等量的固体保藏载体，同时添加菌体湿重0.2-0.8％w/w的D-海藻糖，充分混合均匀，40℃以下自然风干或低温烘干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
所述的固体保藏载体包括硅藻土、沸石粉、陶土粉中的一种或几种的组合，多种组合时没有比例限制。固体保藏载体能够高效吸附发酵液中的菌体，从而制备高菌种含量的固体功能菌群；所选择的固体保藏载体具有一定的污染物去除功能，功能菌群制备完成后，随菌群一起投加至待修复场地，一方面可吸附污染物，供其表面附着生长的功能菌群降解，另一方面，还可吸附重金属、氨氮等特定污染物，达到处理目的。
在上述步骤B.固体菌粉制备中，D-海藻糖的作用是菌种保护剂，可在干燥过程中降低菌种损失。
与现有技术相比，利用本发明制备用于修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群具有以下优点：
1、采用上述方法制备的功能菌群，有效菌种含量达到10亿/克以上，可直接应用于酚类污染土壤及地下水修复，对酚类物质的耐受浓度达到1400mg/L以上，投加应用后最高降解速率达到800mg/(L.d)，适应性、有效性良好；
2、本发明利用待修复场地土著微生物构建功能菌群，有效菌种浓度高，适应性强，投加后可快速起效且稳定持久，无需长期持续投加，运行成本低廉；
3、本发明功能菌群的构建过程始终处于待修复场地环境条件下，使功能菌群对待修复场地保持良好的适应性，最终定向制备相对稳定的对原污染环境具有良好适应性的高效功能菌群，使其分别适应其所对应的应用环境，工程应用效果显著；
4、本发明的培养方式对于传统生物技术无法分离培养的功能菌种，也可随功能菌群的构建过程和混合发酵过程优势生长，从而最大程度发挥土著微生物的处理能力；
5、本发明充分运用微生物固定化技术、驯化技术、发酵技术、生物强化技术，各工艺步骤设计合理，操作简单，对于不同酚类污染场地的土壤及地下水具有普遍适用性，不需对功能菌群的特定菌种组成进行限定，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为本发明所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群制备方法的工艺流程图。
图2为实施例1污染土壤在处理前的有机物组成；
图3为实施例1污染土壤采用本发明制备的功能菌群进行修复土壤后的土壤有机物组成；
图4为实施例3投加本发明的功能菌群与不投加功能菌群的地下水做对照；
图5为实施例2与对比例1、2所含有效菌种菌落情况的对比；
图6为实施例2与对比例1、2对该场地地下水中酚类污染物的降解曲线。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1某苯酚、甲苯酚复合污染土壤及地下水功能菌群制备及应用
某污染场地土壤及地下水的特征污染物为苯酚、邻甲酚、间甲酚，如图1所示，采用本发明所述工艺制备功能菌群用于场地修复，具体实施情况如下：
(1)在该污染场地采集酚污染土壤，作为功能菌群构建的土著微生物菌源；
(2)功能菌群构建：
A.配置培养液：配方为：0.8％w/v基础无机盐培养基、10％v/v该场地酚类污染地下水、2％w/v硅藻土、余量为自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀，培养液体积为预计总培养体积的30％；
采用的基础无机盐培养基成分组成及相对重量比例份数为：NH4NO310份、K2HPO43份、KH2PO43份、CaCl21.4份、NaCl 2份、MgSO41.4份、MnSO40.18份、FeSO40.02份。
B.接种：在上述培养液中添加混合酚并混合均匀，使培养液酚浓度达到200mg/L，调节pH至6，将采集的土著微生物菌源接入培养容器中，使接种后土著微生物菌源浓度以污泥干质量计为8g/L；
所加入的混合酚为重量分数为60％苯酚和40％该场地酚类污染物。
C.菌群构建：对接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：4mg/L，温度：25℃，每8h检测培养液酚含量；酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至400mg/L；继续培养至酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至800mg/L；继续培养至酚去除率达到90％以上后，将培养液静置，弃去培养液体积30％的上层清液，按照步骤A的方法配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，并补充混合酚至800mg/L，继续培养；此后酚去除率每达到90％以上，补充混合酚至800mg/L，连续培养10d，培养液降酚速率达到400mg/(L.d)以上，功能菌群构建完成；
(3)混合发酵：
A.发酵条件准备：对发酵罐进行灭菌，空消灭菌温度120℃，时长25min，之后加入0.1％w/v速效碳源乙酸钠，0.2％w/v酵母浸粉和0.3％w/v基础无机盐培养基，实消灭菌，温度120℃，时长25min；温度降至30℃时，添加苯酚，使初始苯酚含量为600mg/L，通气15min；
B.接种发酵：将上述构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，接种量2％，开始发酵，温度30℃，罐内压力0.05Mpa，通气量60m3/h；
C.培养基流加：发酵过程中检测发酵液DO值，DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基，速效碳源乙酸钠流加速率为100mg/(L.h)，硝酸铵流加速率为20mg/(L.h)，苯酚流加速率为10mg/(L.h)；
D.发酵终点控制：发酵36h后每2h取样测定菌液OD值，连续2次测样OD值下降后立即放罐，在40h时放罐；
(4)发酵后处理：
A.菌体收集：将发酵液注入搅拌罐中，加入20g/L硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
B.固体菌粉制备：在收集的菌体中添加与菌体湿重等量的硅藻土，同时添加菌体湿重0.8％w/w的菌体保护剂D-海藻糖，充分混合均匀，40℃以下低温烘干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
经检测，制备的功能菌群有效菌种含量达到40亿/克，功能菌群制备完成后直接应用于该场地酚类污染土壤及地下水修复，投加应用后在地下水修复过程中最高降解速率达到800mg/(L.d)。
经气-质联用检测，该场地污染土壤在处理前的有机物组成如下表1以及图2所示：
表1
化合物编号 相对含量％ 匹配项名称 分子式 分子量 CAS编号
1 2.13 对二甲苯 C<sub>6</sub>H<sub>10</sub> 106.08 106-42-3
2 56.95 苯酚 C<sub>6</sub>H<sub>6</sub>O 94.04 108-95-2
3 11.59 邻甲酚 C<sub>7</sub>H<sub>8</sub>O 108.06 95-48-7
4 22.24 间甲酚 C<sub>7</sub>H<sub>8</sub>O 108.06 108-39-4
5 3.67 柠檬酸三乙酯 C<sub>12</sub>H<sub>20</sub>O<sub>7</sub> 276.12 77-93-0
6 3.42 己二酸二辛酯 C<sub>22</sub>H<sub>42</sub>O<sub>4</sub> 370.31 103-23-1
采用制备的功能菌群修复土壤后，土壤有机物组成如下表2以及图3所示：
表2
化合物编号 物质含量％ 匹配项名称 分子式 分子量 CAS编号
1 95.6 己二酸二辛酯 C<sub>22</sub>H<sub>42</sub>O<sub>4</sub> 370.31 103-23-1
由以上检测数据可知，采用制备的功能菌群对该场地污染土壤修复完成后，原本存在的酚类污染物全部去除，仅存检测中引入的有机物质，功能菌群降酚性能优良。
实施例2某二氯酚污染土壤及地下水功能菌群制备及应用
某污染场地土壤及地下水的特征污染物为2,4-二氯酚、2,6-二氯酚，如图1所示，采用本发明所述工艺制备功能菌群用于场地修复，具体实施情况如下：
(1)在该污染场地采集酚污染土壤，作为功能菌群构建的土著微生物菌源；
(2)功能菌群构建：
A.配置培养液，配方为：1.2％w/v基础无机盐培养基、60％v/v该场地酚类污染地下水、0.2％w/v沸石粉、余量为自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀，培养液体积为预计总培养体积的40％；
采用的基础无机盐培养基成分组成及相对重量比例份数为：NH4NO314份、K2HPO47份、KH2PO47份、CaCl21份、NaCl 1.5份、MgSO41份、MnSO40.02份、FeSO40.18份。
B.接种：在上述培养液中添加混合酚并混合均匀，使培养液酚浓度达到100mg/L，调节pH至8，将采集的土著微生物菌源接入培养容器中，使接种后土著微生物菌源浓度以污泥干质量计为12g/L；
所加入的混合酚为重量分数为75％苯酚和25％该场地酚类污染物。
C.菌群构建：对接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：2mg/L，温度：37℃，每16h检测培养液酚含量；酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至200mg/L；继续培养至酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至400mg/L；继续培养至酚去除率达到90％以上后，将培养液静置，弃去培养液体积10％的上层清液，按照步骤A的方法配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充混合酚至400mg/L，继续培养；此后酚去除率每达到90％以上，补充混合酚至400mg/L，连续培养12d，培养液降酚速率达到400mg/(L.d)以上，功能菌群构建完成；
(3)混合发酵：
A.发酵条件准备：对发酵罐进行灭菌，空消灭菌温度120℃，时长25min，之后加入0.5％w/v速效碳源糖蜜，0.02％w/v酵母浸粉和0.5％w/v基础无机盐培养基，实消灭菌，温度120℃，时长25min；温度降至30℃时，添加苯酚，使初始苯酚含量为200mg/L，通气15min；
B.接种发酵：将上述构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，接种量5％，开始发酵，温度35℃，罐内压力0.05Mpa，通气量40m/h；
C.培养基流加：发酵过程中检测发酵液DO值，DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基，速效碳源糖蜜流加速率为400mg/(L.h)，硝酸铵流加速率为10mg/(L.h)，苯酚流加速率为40mg/(L.h)；
D.发酵终点控制：发酵36h后每2h取样测定菌液OD值，连续2次测样OD值下降后立即放罐，在46h时放罐；
(4)发酵后处理：
A.菌体收集：将发酵液注入搅拌罐中，加入25g/L硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
B.固体菌粉制备：在收集的菌体中添加与菌体湿重等量的沸石粉，同时添加菌体湿重0.5％w/w的菌体保护剂D-海藻糖，充分混合均匀，40℃以下自然风干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
经检测，制备的功能菌群有效菌种含量达到10亿/克，功能菌群制备完成后直接应用于该场地酚类污染土壤及地下水修复，投加应用6个月后检测，对地下水中酚类污染物去除率达到99％，对土壤中酚类污染物去除率达到98％，土壤和地下水均修复达标。
实施例3某苯酚、氯酚复合污染土壤及地下水功能菌群制备及应用
某污染场地土壤及地下水的特征污染物为苯酚、2-氯酚，如图1所示，采用本发明所述工艺制备功能菌群用于场地修复，具体实施情况如下：
(1)在该污染场地采集酚污染土壤，作为功能菌群构建的土著微生物菌源；
(2)功能菌群构建：
A.配置培养液，配方为：0.1％w/v基础无机盐培养基、40％v/v该场地酚类污染地下水、1％w/v碳酸钙、余量为自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀，培养液体积为预计总培养体积的50％；
采用的基础无机盐培养基成分组成及相对重量比例份数为：NH4NO36份、K2HPO45份、KH2PO45份、CaCl20.6份、NaCl2.5份、MgSO40.6、份、MnSO40.1份、FeSO40.1份。
B.接种：在上述培养液中添加混合酚并混合均匀，使培养液酚浓度达到150mg/L，调节pH至7，将采集的土著微生物菌源接入培养容器中，使接种后土著微生物菌源浓度以污泥干质量计为3g/L；
所加入的混合酚为重量分数为90％苯酚和10％该场地酚类污染物。
C.菌群构建：对接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：3mg/L，温度：15℃，每24h检测培养液酚含量；酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至300mg/L；继续培养至酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至600mg/L；继续培养至酚去除率达到90％以上后，将培养液静置，弃去培养液体积50％的上层清液，按照步骤A的方法配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充混合酚至600mg/L，继续培养；此后酚去除率每达到90％以上，补充混合酚至600mg/L，连续培养14d，培养液降酚速率达到400mg/(L.d)以上，功能菌群构建完成；
(3)混合发酵：
A.发酵条件准备：对发酵罐进行灭菌，空消灭菌温度120℃，时长25min，之后加入0.3％w/v速效碳源丁二酸钠，0.1％w/v酵母浸粉和0.1％w/v基础无机盐培养基，实消灭菌，温度120℃，时长25min；温度降至30℃时，添加苯酚，使初始苯酚含量为400mg/L，通气15min；
B.接种发酵：将上述构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，接种量8％，开始发酵，温度25℃，罐内压力0.05Mpa，通气量80m/h；
C.培养基流加：发酵过程中检测发酵液DO值，DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基，速效碳源丁二酸钠流加速率为250mg/(L.h)，硝酸铵流加速率为15mg/(L.h)，苯酚流加速率为25mg/(L.h)；
D.发酵终点控制：发酵36h后每2h取样测定菌液OD值，未检测到连续2次OD值下降的情况，故在发酵至48h时放罐；
(4)发酵后处理：
A.菌体收集：将发酵液注入搅拌罐中，加入15g/L硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
B.固体菌粉制备：在收集的菌体中添加与菌体湿重等量的陶土粉，同时添加菌体湿重0.2％w/w的菌体保护剂D-海藻糖，充分混合均匀，40℃以下自然风干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
经检测，制备的功能菌群有效菌种含量达到26亿/克，功能菌群制备完成后直接应用于该场地酚类污染土壤及地下水修复，投加应用5个月后检测，对地下水中酚类污染物去除率达到99％，对土壤中酚类污染物去除率达到97％，土壤和地下水均修复达标。
同时，与不投加功能菌群的地下水做对照，投加菌群的实验组(菌剂组)地下水处理过程中酚类物质降解曲线如图4所示，从图中可以看出，投加本发明的功能菌群，使得酚含量得到了有效的控制。
对比例
以实施例2为基础，设置对比例1和对比例2，其中对比例1在混合发酵过程中不加速效碳源，对比例2在功能菌群构建过程中只添加苯酚不添加该场地其他酚类污染物。经检测，所制备的功能菌群有效菌种含量及菌落情况如下表3以及图5所示：
表3
编号 组别 有效菌种含量(亿/克)
1# 对比例1 3.5
2# 对比例2 8.2
3# 实施例2 10
各组别对该场地地下水中酚类污染物的降解曲线如图6所示。
由对比例1可知，混合发酵过程中不加速效碳源对功能菌群有效菌种含量具有显著不利影响；
由对比例2可知，在功能菌群构建过程中只添加苯酚不添加该场地其他酚类污染物，所构建的功能菌群有效性和适应性较差，酚类污染物降解速率较低；
与对比例相比，实施例2制备的功能菌群在有效菌种含量和酚类污染物降解速率方面均为最佳，采用本发明所提出的技术方案的参数和范围才能够取得较好的应用效果。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：以待修复污染场地的土著微生物为菌源，通过构建原场地污染条件下的功能菌群、菌群混合发酵和后处理措施，定向制备对特定污染场地有针对性的酚类污染物降解用功能菌群。
2.根据权利要求1所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)菌源采样：在待修复的污染场地采集受酚类物质污染的土壤，即为功能菌群构建的土著微生物菌源；
(2)功能菌群构建：
A.配制培养液；
B.接种；
C.菌群构建；
(3)混合发酵：
A.发酵条件准备；
B.接种发酵；
C.培养基流加；
D.发酵终点控制；
(4)发酵后处理：
A.菌体收集；
B.固体菌粉制备。
3.根据权利要求2所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：所述(2)功能菌群构建具体为：
A.配制培养液：所述培养液配方为：0.1-1.2％w/v基础无机盐培养基、10-60％v/v待修复污染场地的酚类污染地下水、0.2-2％w/v无机载体、余量为自来水；将以上成分在布有曝气设施的培养容器中混合均匀，培养液体积为预计总培养体积的30-50％；
B.接种：在培养液中添加混合酚并混合均匀，使培养液中酚浓度达到100-200mg/L，调节pH至6-8，将采集的土著微生物菌源接入培养容器中，使接种后土著微生物菌源浓度以污泥干质量计为3-12g/L；
C.菌群构建：对接种后的培养液进行曝气培养，控制DO：2-4mg/L，温度：15-37℃，每8-24h检测培养液酚含量，酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至200-400mg/L，继续培养至酚去除率达到90％以上后，补充混合酚至400-800mg/L，继续培养至酚去除率达到90％以上后，将培养液静置，弃去培养液体积10-50％的上层清液，配制新鲜培养液并补充到培养容器中，使培养液体积达到预计总体积，补充混合酚至400-800mg/L，继续培养；此后酚去除率每达到90％以上，补充混合酚至400-800mg/L，连续培养10-14d，功能菌群构建完成。
4.根据权利要求3所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：所述无机载体为沸石粉、硅藻土、活性炭、碳酸钙等常用无机载体中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求3所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：所述混合酚为重量分数为60-90％苯酚和10-40％待修复场地酚类污染物，所述的待修复场地酚类污染物包括甲苯酚、萘酚、氯酚、二氯酚、三氯酚、硝基苯酚中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求2所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)混合发酵具体为：
A.发酵条件准备：对发酵罐进行灭菌，空消灭菌温度120℃，时长25min，之后加入0.1-0.5％w/v速效碳源，0.02-0.2％w/v酵母浸粉和0.1-0.5％w/v基础无机盐培养基，实消灭菌，温度120℃，时长25min；温度降至30℃时，添加苯酚，使初始苯酚含量为200-600mg/L，通气15min；
B.接种发酵：将构建完成的功能菌群作为菌种接入发酵罐中，接种量2-8％，开始发酵，温度25-35℃，罐内压力0.05Mpa，通气量40-80m3/；
C.培养基流加：发酵液DO值降至最低点后开始上升时，开始流加培养基，速效碳源流加速率为100-400mg/(L.h)，硝酸铵流加速率为10-20mg/(L.h)，苯酚流加速率为10-40mg/(L.h)；
D.发酵终点控制：发酵时长控制在48h之内，36h后每2h取样测定菌液OD值，如发现连续2次测样OD值下降，立即放罐，否则在48h时放罐。
7.根据权利要求3和6所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)和步骤(3)中基础无机盐培养基成分组成及相对重量比例份数如下：NH4NO36-14份、K2HPO43-7份、KH2PO43-7份、CaCl20.6-1.4份、NaCl1.5-2.5份、MgSO40.6-1.4份、MnSO40.02-0.18份、FeSO40.02-0.18份。
8.根据权利要求6所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：所述速效碳源包括葡萄糖、海藻糖、乙酸钠、丁二酸钠、甲醇、糖蜜中的一种或几种的组合。
9.根据权利要求2所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)发酵后处理具体为：
A.菌体收集：将发酵液注入搅拌罐中，加入15-25g/L硅藻土，搅拌均匀，采用离心机离心，收集菌体；
B.固体菌粉制备：在收集的菌体中添加与菌体湿重等量的固体保藏载体，同时添加菌体湿重0.2-0.8％w/w的D-海藻糖，充分混合均匀，40℃以下自然风干或低温烘干，粉碎即得固体菌粉，功能菌群制备完成。
10.根据权利要求9所述修复酚类污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法，其特征在于：所述固体保藏载体包括硅藻土、沸石粉、陶土粉中的一种或几种的组合。
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