CN104353667A - 石油降解菌群与表面活性剂联合降解水中脱水原油的方法 - Google Patents

石油降解菌群与表面活性剂联合降解水中脱水原油的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及环境生物技术领域，旨在提供一种石油降解菌群与表面活性剂联合降解水中脱水原油的方法。具体步骤如下：(1)取石油污染土壤样品，放入装有石油烃降解菌培养基的三角瓶到前述三角瓶中培养5天；取部分培养液转移至新的培养基中，加入原油继续培养5天；重复进行再培养3次后得到石油烃降解菌群；(2)取培养基和石油烃降解菌群，加入脱水原油后加入表面活性剂，恒温振荡培养以降解所加入的脱水原油。本发明能以彻底、高效、低成本的方式修复顽固脱水原油对环境的危害；本发明中富集菌群的方法简便、快捷，仅使用本发明中得到的菌群即可以在35天把10mg原油降解88％，与仅使用菌群降解相比，降解效率加快一倍。

Description

石油降解菌群与表面活性剂联合降解水中脱水原油的方法
技术领域
本发明属于环境生物技术领域，特别涉及一种微生物与表面活性剂联合降解脱水原油的方法。 
背景技术
石油是现代社会的最主要能源之一，被称作“工业的血液”、“黑色的金子”。原油经过提炼可以制成各种燃料和化工原料，包括天然气、汽油、煤油、挥发油、润滑油、石蜡和沥青等。但在原油的加工、使用及运输过程中不可避免的会造成溢洒及泄漏事故，造成污染。石油是由多种烃类、少量非烃化合物组成的复杂混合物。原油难以被降解，长时间存在于环境中。国内外处理石油污染有物理方法、化学方法、生物方法三类，其中物理方法包括焚烧法、隔离法和换土法等，化学方法主要有萃取法、土壤洗涤法以及化学氧化法等。物理方法及化学方法存在处理成本高、污染物处理不彻底的问题。 
微生物降解原油的方法也存在一定的局限性，比如速率低、周期长等。原油污染物多属于疏水性有机污染物，提高污染物溶解于水中的含量能够提高石油烃降解菌的降解效率。许多石油烃降解菌在降解过程中会产生生物表面活性剂，对疏水污染物起到增溶、乳化的作用。但是微生物自身分解表面活性剂效率较低，所以通过外加表面活性剂的形式促进其降解是一种可行方法。市面上表面活性剂种类庞多，而且大多数表面活性剂对于微生物都有毒性影响。对于本身降解效率很低的微生物方法来说，过低的表面活性剂浓度甚至未达到临界胶束浓度而不能起到促进修复的作用，而过高的表面活性剂浓度又会毒害微生物。所以，研究不同种类、不同浓度的表面活性剂与微生物联合的修复效果具有非常重要的意义。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种微生物与表面活性剂联合降解脱水原油的方法。 
为解决技术问题，本发明的解决方案是： 
提供一种微生物与表面活性剂联合降解脱水原油的方法，具体步骤如下： 
(1)石油烃降解菌群的富集： 
a：将65mg K2HPO4、25.5mg KH2PO4、133.8mg Na2HPO4·12H2O、500mg NH4Cl、82.5mg CaCl2、67.5mg MgSO4·7H2O、0.75mg FeCl3·6H2O和1000mL去离子水进行混 合，调节pH值为7.0；取配制好的溶液100mL加入到1L的三角瓶中，在120℃温度下灭菌20min，得到装有石油烃降解菌培养基的三角瓶； 
b：称取1g石油污染土壤样品，放入到前述三角瓶中；三角瓶放置在恒温振荡箱中，保持温度30℃、转速180r/min，培养5天； 
c：按步骤a中方法获得第二个有石油烃降解菌筛选培养基的三角瓶，吸取10mL步骤b三角瓶中的培养液转移至该第二个三角瓶中，并加入0.01g原油，然后将该第二个三角瓶放置在恒温振荡箱中，保持温度30℃、转速180r/min，培养5天； 
d：吸取10mL步骤c中经5天培养后的培养液，并按照步骤c的方法进行再培养；重复再培养3次后，最终得到的液体为石油烃降解菌群； 
(2)加入表面活性剂对脱水原油进行降解： 
取上述步骤(1)的步骤a中获得的石油烃降解菌培养基10mL，取上述步骤(1)的步骤d中得到的石油烃降解菌群1mL，一并放入到50mL的三角瓶中；然后在该三角瓶中加入脱水原油0.01g；再加入表面活性剂1mL；放置在恒温振荡箱中，保持在温度30℃、转速180r/min条件下进行培养以降解所加入的脱水原油。 
本发明步骤(2)中所述表面活性剂是下述任意一种： 
浓度22.27mg/L的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(Tw-80)；浓度2500mg/L的十二烷基硫酸钠(SDS)；浓度1000mg/L的十二烷基苯磺酸钠(LAS)； 
聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷基硫酸钠混合液(Tw-80+SDS)，其中聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷基硫酸钠混合液的摩尔比为1∶30，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯的浓度为26.30mg/L； 
聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷基苯磺酸钠的混合液(Tw-80+LAS)，其中聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷基苯磺酸钠的混合液的摩尔比为1∶30，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯的浓度22.27mg/L。 
本发明中所述的所述脱水原油为从井中采出后，经过脱水工艺的油。 
本发明中所述的石油污染土壤样品为在油田采油井50m×50m×20cm范围内的土壤。 
本发明中所述的石油烃降解菌群，保藏于浙江大学紫金港校区农生环组团大楼B座Peen-Lab实验室，保藏编号为PWW1。该菌群已在Genebank提交，其登录号为SRP045724。 
与现有技术相比，本发明的有益效果是： 
(1)本发明中对于油井附近经过脱水工艺的原油的降解有着非常重要的意义，此种原油因其复杂的化学物质组成和难溶性的物理性质而更难以降解，对水体、土壤这有严重而又持久的危害影响，甚至会通过食物链对人体造成危害，本发明中的方法能以彻 底、高效、低成本的方式修复顽固脱水原油对环境的危害；(2)本发明中富集菌群的方法简便、快捷，仅使用本发明中得到的菌群即可以在35天把10mg原油降解88％(附图2)；(3)本发明中石油降解菌群与表面活性剂联合降解之后与仅使用菌群降解相比，降解效率加快一倍，效果最好的处理为表面活性剂Tw-80(浓度22.27mg/L)、SDS(浓度2500mg/L)、LAS(浓度1000mg/L)、Tw-80与SDS混合(比例1：30，Tw-80浓度26.30mg/L)、Tw-80与LAS混合(比例1：30，Tw-80浓度22.27mg/L)，最后降解率分别为97％、88％、98％、88％、98％。 
附图说明
图1本发明中从污染土壤中富集石油烃降解菌群的过程示意图； 
图2本发明中石油烃降解菌群降解脱水原油效果示意图； 
图3本发明中石油降解菌群分别与表面活性剂Tw-80(c1、c2、c3)联合降解脱水原油降解率示意图(c1浓度＝20.00mg/L、c2浓度＝22.27mg/L、c3浓度＝26.30mg/L)； 
图4本发明中石油降解菌群分别与表面活性剂Tw-80、SDS、LAS联合降解脱水原油降解率示意图(浓度分别为26.30mg/L、2500mg/L、1000mg/L)； 
图5石油降解菌群分别与混合表面活性剂(Tw-80+SDS、Tw-80+LAS)联合降解脱水原油降解率示意图。 
具体实施方式
以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。 
实施例1： 
本例用石油烃降解菌群与表面活性剂Tw-80(c1浓度、c2浓度、c3浓度)联合降解脱水原油，具体步骤如下： 
步骤(1)、富集石油烃降解菌群： 
a：称取1g石油污染土壤样品，放入到有石油烃降解菌培养基的1L的三角瓶中； 
b：上述石油烃降解菌培养基配方如下：将65mg K2HPO4、25.5mg KH2PO4、133.8mg Na2HPO4·12H2O、500mg NH4Cl、82.5mg CaCl2、67.5mg MgSO4·7H2O、0.75mgFeCl3·6H2O、1000mL去离子水进行混合，调节pH值为7.0，取上述配制的溶液100mL加入到1L的三角瓶中，在120℃温度下灭菌20min。为实验中所用的有石油烃降解菌培养基的三角瓶； 
c：将上述a中三角瓶放置在恒温振荡箱中，温度保持在30℃、转速180r/min，培养5天； 
d：5天后，吸取上述三角瓶中10mL培养液转移到上述b中新的有石油烃降解菌筛选培养基的三角瓶中，并加入0.01g原油，然后将所述培养基放置在恒温振荡箱中，温度保持在30℃、转速180r/min，培养5天； 
e：按照上述d步骤重复3次，最终三角瓶中的液体为石油烃降解菌群； 
步骤(2)、加入不同的表面活性剂与石油烃降解菌群结合，对脱水原油进行降解： 
取上述步骤(1)b中配制的石油烃降解菌培养基10mL，和上述步骤(1)e中得到的石油烃降解菌群1mL，放入到50mL的三角瓶中；然后在上述三角瓶中加入脱水原油0.01g；再加入表面活性剂Tw-80(c1浓度、c2浓度、c3浓度)1mL；放置在恒温振荡箱中，温度保持在30℃、转速180r/min条件下进行培养，以降解其中的原油。 
按上述步骤(2)设置三角瓶，分成三组；三组处理对应加入如下表所设置不同浓度的不同表面活性剂，除加入的表面活性剂不同，其余条件均相同： 
表1c1浓度Tw-80、c2浓度Tw-80、c3浓度Tw-80实验组设计 
实验组 表面活性剂 浓度(mg/L)
1 Tw-80 c1＝20.00
2 Tw-80 c2＝22.27
3 Tw-80 c3＝26.30
培养过程中，每隔几天采用破坏性取样的方式，用称重法测定其原油含量。 
步骤(3)：用称重法测锥形瓶体系中原油含量的变化，并检验其降解效果。向培养的三角瓶中添加三氯甲烷10mL，于分馏烧瓶中萃取2次，合并萃取液，于70℃下水浴加热去除溶剂，重量法测定土壤中石油的含量，计算石油的降解率。初始加入的原油为m0，初始三角瓶重量m1，水浴、蒸干后三角瓶重量m2，则三角瓶体系中的原油重量为m＝m2-m1，石油的降解率为v＝(m0-m)/m0。 
本例中，石油烃降解菌群与Tw-80联合降解原油，使用20.00mg/L、22.27mg/L、26.30mg/L浓度的Tw-80，使用浓度均在该表面活性剂的临界胶束浓度以上。达到的降解效率分别为63％、97％、65％。其中22.27mg/L的Tw-80与菌群联合降解效果最好，降解效率达到97％。 
实施例2： 
本例用石油烃降解菌群分别与表面活性剂Tw-80、SDS、LAS联合降解脱水原油，具体步骤如下： 
步骤(1)、富集石油烃降解菌群： 
步骤(1)与实例1相同； 
步骤(2)、加入不同的表面活性剂与石油烃降解菌群结合，对脱水原油进行降解： 
取上述步骤(1)b中配制的培养液石油烃降解菌培养基10mL，和上述步骤(1)e中得到的石油烃降解菌群1mL，放入到50mL的三角瓶中；然后在上述三角瓶中加入脱水原油0.01g；再加入表面活性剂Tw-80、SDS、LAS1mL；放置在恒温振荡箱中，温度保持在30℃、转速180r/min条件下进行培养，以降解其中的原油。 
按上述步骤(2)设置三角瓶，分成三组；三组处理对应加入如下表所设置不同浓度的不同表面活性剂，除加入的表面活性剂不同，其余条件均相同： 
表2Tw-80、SDS、LAS实验组设计 
培养过程中，每隔几天采用破坏性取样的方式，用称重法测定其原油含量。 
步骤(3)：用称重法测锥形瓶体系中原油含量的变化，并检验其降解效果。步骤(3)与实例1相同。 
本例中，石油烃降解菌群分别与Tw-80、SDS、LAS联合降解原油，使用浓度均在表面活性剂的临界胶束浓度以上。达到的降解效率分别为65％、88％、98％。其中SDS和LAS与菌群联合降解效果最好，降解效率达到88％和98％。 
实施例3： 
本例用石油降解菌群分别与混合表面活性剂(Tw-80+SDS、Tw-80+LAS)联合降解脱水原油，具体步骤如下： 
步骤(1)、富集石油烃降解菌群： 
步骤(1)与实例1相同； 
步骤(2)、加入不同的表面活性剂与石油烃降解菌群结合，对脱水原油进行降解： 
取上述步骤(1)b中配制的培养液石油烃降解菌培养基10mL，和上述步骤(1)e中得到的石油烃降解菌群1mL，放入到50mL的三角瓶中；然后在上述三角瓶中加入脱水原油0.01g；再加入表面活性剂(Tw-80+SDS、Tw-80+LAS)1mL；放置在恒温振荡箱中，温度保持在30℃、转速180r/min条件下进行培养，以降解其中的原油。 
按上述步骤(2)设置三角瓶，分成三组；三组处理对应加入如下表所设置不同浓度的不同表面活性剂，除加入的表面活性剂不同，其余条件均相同： 
表3Tw-80+SDS、Tw-80+LAS实验组设计 
实验组 表面活性剂 Tw-80浓度(mg/L) 复合表面活性剂比例
1 Tw-80+SDS 26.30 Tw-80：SDS＝1：30
2 Tw-80+LAS 22.27 Tw-80：LAS＝1：30
培养过程中，每隔几天采用破坏性取样的方式，用称重法测定其原油含量。 
步骤(3)：用称重法测锥形瓶体系中原油含量的变化，并检验其降解效果。步骤(3)与实例1相同。 
本例中，石油降解菌群分别与混合表面活性剂(Tw-80+SDS、Tw-80+LAS)联合降解原油，使用浓度均在表面活性剂的临界胶束浓度以上。达到的降解效率分别为88％、98％。其中两种混合表面活性剂与菌群联合降解效果都明显，降解效率达到88％和98％。 
本发明的实际范围不仅包括所公开的实施例，还包括在权利要求书之下实施或者执行本发明的所有等效方案。 

Claims (4)

1.石油降解菌群与表面活性剂联合降解水中脱水原油的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)石油烃降解菌群的富集：
a：将65mg K2HPO4、25.5mg KH2PO4、133.8mg Na2HPO4·12H2O、500mg NH4Cl、82.5mg CaCl2、67.5mg MgSO4·7H2O、0.75mg FeCl3·6H2O和1000mL去离子水进行混合，调节pH值为7.0；取配制好的溶液100mL加入到1L的三角瓶中，在120℃温度下灭菌20min，得到装有石油烃降解菌培养基的三角瓶；
b：称取1g石油污染土壤样品，放入到前述三角瓶中；三角瓶放置在恒温振荡箱中，保持温度30℃、转速180r/min，培养5天；
c：按步骤a中方法获得第二个有石油烃降解菌筛选培养基的三角瓶，吸取10mL步骤b三角瓶中的培养液转移至该第二个三角瓶中，并加入0.01g原油，然后将该第二个三角瓶放置在恒温振荡箱中，保持温度30℃、转速180r/min，培养5天；
d：吸取10mL步骤c中经5天培养后的培养液，并按照步骤c的方法进行再培养；重复再培养3次后，最终得到的液体为石油烃降解菌群；
(2)加入表面活性剂对脱水原油进行降解：
取上述步骤(1)的步骤a中获得的石油烃降解菌培养基10mL，取上述步骤(1)的步骤d中得到的石油烃降解菌群1mL，一并放入到50mL的三角瓶中；然后在该三角瓶中加入脱水原油0.01g；再加入表面活性剂1mL；放置在恒温振荡箱中，保持在温度30℃、转速180r/min条件下进行培养以降解所加入的脱水原油。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述表面活性剂是下述任意一种：
浓度22.27mg/L的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯；浓度2500mg/L的十二烷基硫酸钠；浓度1000mg/L的十二烷基苯磺酸钠；
聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷基硫酸钠混合液，其中聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷基硫酸钠混合液的摩尔比为1∶30，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯的浓度为26.30mg/L；
聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷基苯磺酸钠的混合液，其中聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯与十二烷基苯磺酸钠的混合液的摩尔比为1∶30，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯的浓度22.27mg/L。
3.根据权利要求1中所述的微生物与表面活性剂联合降解脱水原油的生物方法，其特征在于，所述脱水原油为从油井中采出后，经过脱水工艺的油。
4.根据权利要求1中所述的微生物与表面活性剂联合降解脱水原油的生物方法，其特征在于，所述石油污染土壤样品为在油田采油井50m×50m×20cm范围内的土壤。
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