CN113817638A - 一种用于降解石油类污染物的复合菌剂及其生态构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于降解石油类污染物的复合菌剂及其生态构建方法，包括如下步骤：S1.石油降解菌源采样；S2.构建单一菌群；S3.构建复合降解菌粉；S4.构建复合菌剂；S5.验证代谢调控。本发明所涉及的生态构建方法，利用现代设备将土壤源/水源内含的石油类污染物的组分进行检测，得到单一且明确的组分，在诱导培养菌时向培养基中加入诱导剂和单一的组分，这样的诱导方式得到的诱导菌更具有针对性，对于某种污染物组分的降解效果更好，随后单一的诱导菌进行混合，得到的复合菌剂也具有更好的活性和具有广泛针对性的降解能力。

Description

一种用于降解石油类污染物的复合菌剂及其生态构建方法
技术领域
本发明是一种用于降解石油类污染物的复合菌剂及其生态构建方法，属于复合菌剂技术领域。
背景技术
随着原油的开采、石油在各行各业内的应用，随之产生的石油类污染物也越来越多，石油类污染物排入环境后对土壤、地下水及海洋造成严重污染。目前，降解石油类污染物的方法较多，其中生物修复技术具有操作简单、绿色安全、长效性好、符合自然规律等优点，在降解石油类污染物领域具有良好的发展前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种用于降解石油类污染物的复合菌剂及其生态构建方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了实现上述第一个目的，即用生态构建的方法制备可降解石油类污染物的复合菌剂，本发明通过如下技术方案实现，包括：
一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，包括如下步骤：
S1.石油降解菌源采样
采集菌源并制作含菌源的菌悬液；
S2.构建单一菌群
使用基础培养液培养步骤S1获得的菌悬液，构建单一菌群；获得单一的可降解石油类污染物某成分的菌种及菌群；
S3.构建复合降解菌粉
将步骤S2构建得到的单一菌群制成菌粉，添加外源菌粉构建复合降解菌粉；一方面添加由步骤S2构建得到的单一菌群可以有针对性的降解石油类污染物的某成分，另一方面添加传统的外源菌粉保证石油类污染物整体的降解率；
S4.构建复合菌剂
选取生物表面活性剂配制成预处理剂，选取步骤S3制得的复合降解菌粉与多种添加剂配制成降解菌剂，存储备用；
S5.验证代谢调控
用复合菌剂充分降解石油类污染物，定义降解时间为M小时，称取定量降解0小时、1/3M小时、2/3M小时、M小时的石油类污染物，检测剩余组分并验证石油类污染物的降解代谢路径及速度。
优选的，步骤S1包括：
S11.取样适量的含石油类污染物的土壤源/水源；
S12.加入等量的蒸馏水混匀得到混合液，吸取1/4-1/3的混合液存入收集管，用于检测该土壤源/水源内含的石油类污染物的组分，定义检测出来的组分数量为O；
S13.离心混合液，得到沉淀和上清液各一份；
S14.选取步骤S13获得的沉淀，加入同体积的蒸馏水，制备成沉淀菌悬液；
S15.选取适量步骤S13获得的上清液，制备成上清菌悬液。
优选的，步骤S2包括：
S21.接种菌源
配制基础无机盐培养基，分别将步骤S14中制得的沉淀菌悬液和步骤S15中制得的上清菌悬液接种在同一批无机盐培养基上，接种沉淀菌悬液和上清菌悬液的培养基数量均设多组平行；
S22.传代培养
将步骤S21接种后的培养基于30℃下培养至生长出完整菌落，挑取菌落形态不同的单一菌落进行传代培养，定义由接种于沉淀菌悬液的培养基内挑取的单一菌落数量为M，定义由接种于上清菌悬液的培养基内挑取的单一菌落数量为N，定义每个菌落传代培养的平行数量为O；
S23.诱导培养
向步骤S22扩大培养的培养基中加入诱导剂，并依次向其平行培养基内加入添加量2-5％的单一石油类污染物的组分，进行诱导培养，得到单一诱导菌，定义获得的单一诱导菌数量为P并逐一编号并注明诱导组分；步骤S12中定义检测出来的组分数量为O，步骤S22中将每个菌落的平行数量同样定义为O，本步骤中，向每个菌落的平行培养基内分别加入单一的石油类污染物的组分，目的在于希望该步骤能够针对所有单一组分都能获得诱导培养出的具有较好降解功能的单一菌种；
S24.构建单一菌群
挑取步骤S23诱导得到的菌落于无机盐培养液中进行扩大培养，培养至OD600＞1时吸取一定量的菌液于冻存管中保存备用。
优选的，步骤S21中沉淀菌悬液和上清菌悬液的接种量在4-6％之间。
优选的，步骤S3包括：
S31.将步骤S24获得的扩大培养的菌液冻干获得相对应的单一的菌粉；
S32.将步骤S31获得的菌粉以一定比例配比获得复合土著菌粉；
S33.向步骤S32的复合土著菌粉中添加无色杆菌、产碱杆菌、棒状杆菌得到复合降解菌粉。
优选的，步骤S4包括：
S41.制备预处理剂
预处理剂包括体积比为2-3:2-4:3-5的JFC、SDS和APG的混合溶液；
S42.制备降解菌剂
将步骤S33中制备出的复合降解菌粉与壳聚糖、海藻酸钠、Tween80、水混合，制备出降解菌剂。
优选的，步骤S42中壳聚糖和海藻酸钠的添加量均在0.4-0.9％w/v范围内。
优选的，步骤S5包括：
S51.称取定量的降解0小时、1/3M小时、2/3M小时、M小时的石油类污染物，备用；
S52.对石油类污染物中的组分SAT、PAH的含量进行检测；SAT(饱和烃)和PAH(多环芳烃)作为石油类污染物的主要成分，可以作为检测石油类污染物的降解程度的一个判断标准，具体的，PAH又包括NAP(萘)、ACY(苊烯)、ACE(苊)、FLU(芴)、PHE(菲)等；
S53.根据各时间测得的SAT、PAH含量进行石油类污染物的降解代谢路径及速度的验证。
为了实现第二个目的，采用上述复合菌剂生态构建方法构建得到的复合菌剂，本发明通过下述技术方案实现，包括：
一种用于降解石油类污染物的复合菌剂，由上述复合菌剂生态构建方法制得：
包括预处理剂和降解菌剂；
预处理剂用于活化石油类污染物的表面活性，为由JFC、SDS和APG制得的混合溶液；
降解菌剂用于降解石油类污染物，包括复合降解菌粉、壳聚糖、海藻酸钠、Tween80和水。
为了实现第三个目的，即采用上述本发明制备出的复合菌剂进行石油类污染物的降解，本发明通过下述技术方案实现，包括：
一种降解石油类污染物的方法，使用上述用于降解石油类污染物的复合菌剂：将预处理剂按1-3‰的比例投加至石油类污染物中，反应6-8小时后按0.5-0.8‰的比例投加降解菌剂，进行石油类污染物的降解。
本发明的有益效果：
(1)本发明涉及一种用于降解石油类污染物的复合菌剂的生态构建方法，该方法利用现代设备将土壤源/水源内含的石油类污染物的组分进行检测，得到单一且明确的组分，在诱导培养菌时向培养基中加入诱导剂和单一的组分，这样的诱导方式得到的诱导菌更具有针对性，对于某种污染物组分的降解效果更好，随后单一的诱导菌进行混合，得到的复合菌剂也具有更好的活性、耐受性和具有广泛针对性的降解能力。
(2)本发明涉及一种用于降解石油类污染物的复合菌剂的生态构建方法，该方法在复合菌剂降解石油类污染物的过程中间歇的称取石油类污染物，一方面便于了解石油类污染物的降解程度，及时延长或缩短剩余的降解时间，节约时间成本，另一方面通过分析石油类污染物内各组分的降解程度便于后期降解同类型石油污染物时调节复合菌剂的配比，提高降解效率。
(3)本发明涉及一种采用本发明所述的复合菌剂的生态构建方法制备出的复合菌剂，该复合菌剂包括两部分，即预处理剂和降解菌剂，预处理剂的主要成分为表面活性剂，用于提高石油烃的溶解度，一方面提高后续降解菌剂对各石油类污染物组分的降解能力，另一方面提高降解菌剂在石油类污染物中的耐受时间以及活性。
(4)本发明涉及一种应用本发明所述的复合菌剂进行石油类污染物的降解的方法，该降解方法具有较高的石油类污染物的降解效果以及在高浓度石油类污染物中较好的菌种存活率。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，包括如下步骤：
S11.取样适量的含石油类污染物的土壤源/水源；
S12.加入等量的蒸馏水混匀得到混合液，吸取1/3的混合液存入收集管，用于检测该土壤源/水源内含的石油类污染物的组分，定义检测出来的组分数量为O；
S13.离心混合液，得到沉淀和上清液各一份；
S14.选取步骤S13获得的沉淀，加入同体积的蒸馏水，制备成沉淀菌悬液；
S15.选取适量步骤S13获得的上清液，制备成上清菌悬液。
S21.接种菌源
配制基础无机盐培养基，分别将步骤S14中制得的沉淀菌悬液和步骤S15中制得的上清菌悬液以4％的接种量接种在同一批无机盐培养基上，接种沉淀菌悬液和上清菌悬液的培养基数量均设多组平行；
S22.传代培养
将步骤S21接种后的培养基于30℃下培养至生长出完整菌落，挑取菌落形态不同的单一菌落进行传代培养，定义由接种于沉淀菌悬液的培养基内挑取的单一菌落数量为M，定义由接种于上清菌悬液的培养基内挑取的单一菌落数量为N，定义每个菌落传代培养的平行数量为O；
S23.诱导培养
向步骤S22扩大培养的培养基中加入诱导剂，并依次向其平行培养基内加入添加量2％的单一石油类污染物的组分，进行诱导培养，诱导底物的浓度以50-100mg/L为佳，pH控制在6-8范围内，诱导培养后得到单一诱导菌，定义获得的单一诱导菌数量为P并逐一编号并注明诱导组分；
S24.构建单一菌群
挑取步骤S23诱导得到的菌落于无机盐培养液中进行扩大培养，培养至OD600＞1时吸取一定量的菌液于冻存管中保存备用。
S31.将步骤S24获得的扩大培养的菌液冻干获得相对应的单一的菌粉；
S32.将步骤S31获得的菌粉以一定比例配比获得复合土著菌粉；
S33.向步骤S32的复合土著菌粉中添加无色杆菌、产碱杆菌、棒状杆菌得到复合降解菌粉，土著菌粉和添加的外源菌粉的质量比可以为1-3:2，本实施例中土著菌粉和外源菌粉的质量比为1:1，无色杆菌、产碱杆菌、棒状杆菌的质量比为1:1:1。
S41.制备预处理剂
预处理剂包括体积比为2:3:4的JFC、SDS和APG的混合溶液；
S42.制备降解菌剂
将步骤S33中制备出的复合降解菌粉与壳聚糖、海藻酸钠、Tween80、水混合，壳聚糖和海藻酸钠的添加量均为0.5％w/v，制备出降解菌剂。
S51.定义加入复合菌剂进行降解的整体时间为M小时，称取定量的降解0小时、1/3M小时、2/3M小时、M小时的石油类污染物，备用；
S52.对石油类污染物中的组分SAT、PAH的含量进行检测；
S53.根据各时间测得的SAT、PAH含量进行石油类污染物的降解代谢路径及速度的验证。
实施例2
一种用于降解石油类污染物的复合菌剂，由上述复合菌剂生态构建方法制得：
包括预处理剂和降解菌剂；
预处理剂用于活化石油类污染物的表面活性，为由JFC、SDS和APG制得的混合溶液；
降解菌剂用于降解石油类污染物，包括复合降解菌粉、壳聚糖、海藻酸钠、Tween80和水。
实施例3
一种降解石油类污染物的方法，使用上述用于降解石油类污染物的复合菌剂：将预处理剂按2‰的比例投加至某处土壤源的石油类污染物中，该处石油类污染物中石油烃(C10-C40)在土壤源中的最高浓度为12245mg/kg，反应8小时后按0.8‰的比例投加降解菌剂，进行石油类污染物的降解，降解过程中，每隔12小时进行一次温度、石油烃(C6-C40)含量的检测，以及石油类污染物中的组分SAT、PAH含量的检测，进行石油类污染物的降解代谢路径及速度的验证。
实施例4
一种降解石油类污染物的方法，使用上述用于降解石油类污染物的复合菌剂：将预处理剂按2‰的比例投加至某处水源的石油类污染物中，该处石油类污染物中石油烃(C10-C32)在水源中的最高浓度为1578mg/L，反应8小时后按0.8‰的比例投加降解菌剂，进行石油类污染物的降解，降解过程中，每隔12小时进行一次温度、石油烃(C6-C40)含量的检测，以及石油类污染物中的组分SAT、PAH含量的检测，进行石油类污染物的降解代谢路径及速度的验证。
实施例5
一种降解石油类污染物的方法，使用上述用于降解石油类污染物的复合菌剂：将预处理剂按2‰的比例投加至某处土壤源的石油类污染物中，该处石油类污染物中石油烃(C8-C40)在土壤源中的最高浓度为16700mg/kg，反应8小时后按0.5‰的比例投加降解菌剂，进行石油类污染物的降解，降解过程中，每隔12小时进行一次温度、石油烃(C6-C40)含量的检测，以及石油类污染物中的组分SAT、PAH含量的检测，进行石油类污染物的降解代谢路径及速度的验证。
对比例1
一种降解石油类污染物的方法，使用现有降解石油类污染物的手段：将市售处理菌剂直接加入至土壤源的石油类污染物中，该处石油类污染物中石油烃(C8-C40)在土壤源中的最高浓度在12000-18000mg/kg区间范围内，进行石油类污染物的降解，降解过程中，每隔12小时进行一次温度、石油烃(C6-C40)含量的检测。
对比例2
一种降解石油类污染物的方法，使用现有降解石油类污染物的手段：将市售处理菌剂直接加入至水源的石油类污染物中，该处石油类污染物中石油烃(C8-C40)在水源中的最高浓度在1000-2000mg/kg区间范围内，进行石油类污染物的降解，降解过程中，每隔12小时进行一次温度、石油烃(C6-C40)含量的检测。
试验例1
对上述实施例和对比例进行初始时有效菌种的含量的测定、降解24小时后的石油烃降解量、降解48小时后的石油烃降解量、降解48小时后菌种的存活量的测定，测定结果如表1所示。
表1 复合菌剂降解效率的测定结果
Figure BDA0003275064790000091
由上述试验中可看出，采用本发明的方法降解石油类污染物具有较好的效果，说明复合菌剂的生态构建方法能够成功构建具有较高针对性的降解菌；且降解48小时后菌种的整体存活量依然很高，说明复合菌剂的生态构建方法和预处理剂的使用在不同程度上发挥作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.石油降解菌源采样
采集菌源并制作含菌源的菌悬液；
S2.构建单一菌群
使用基础培养液培养步骤S1获得的菌悬液，构建单一菌群；
S3.构建复合降解菌粉
将步骤S2构建得到的单一菌群制成菌粉，添加外源菌粉构建复合降解菌粉；
S4.构建复合菌剂
选取生物表面活性剂配制成预处理剂，选取步骤S3制得的复合降解菌粉与多种添加剂配制成降解菌剂，存储备用；
S5.验证代谢调控
用复合菌剂充分降解石油类污染物，定义降解时间为M小时，称取定量降解0小时、1/3M小时、2/3M小时、M小时的石油类污染物，检测剩余组分并验证石油类污染物的降解代谢路径及速度。
2.根据权利要求1所述的一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，其特征在于，步骤S1包括：
S11.取样适量的含石油类污染物的土壤源/水源；
S12.加入等量的蒸馏水混匀得到混合液，吸取1/4-1/3的混合液存入收集管，用于检测该土壤源/水源内含的石油类污染物的组分，定义检测出来的组分数量为O；
S13.离心混合液，得到沉淀和上清液各一份；
S14.选取步骤S13获得的沉淀，加入同体积的蒸馏水，制备成沉淀菌悬液；
S15.选取适量步骤S13获得的上清液，制备成上清菌悬液。
3.根据权利要求2所述的一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，其特征在于，步骤S2包括：
S21.接种菌源
配制基础无机盐培养基，分别将步骤S14中制得的沉淀菌悬液和步骤S15中制得的上清菌悬液接种在同一批无机盐培养基上，接种沉淀菌悬液和上清菌悬液的培养基数量均设多组平行；
S22.传代培养
将步骤S21接种后的培养基于30℃下培养至生长出完整菌落，挑取菌落形态不同的单一菌落进行传代培养，定义由接种于沉淀菌悬液的培养基内挑取的单一菌落数量为M，定义由接种于上清菌悬液的培养基内挑取的单一菌落数量为N，定义每个菌落传代培养的平行数量为O；
S23.诱导培养
向步骤S22扩大培养的培养基中加入诱导剂，并依次向其平行培养基内加入添加量2-5％的单一石油类污染物的组分，进行诱导培养，得到单一诱导菌，定义获得的单一诱导菌数量为P并逐一编号并注明诱导组分；
S24.构建单一菌群
挑取步骤S23诱导得到的菌落于无机盐培养液中进行扩大培养，培养至OD600＞1时吸取一定量的菌液于冻存管中保存备用。
4.根据权利要求3所述的一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，其特征在于：步骤S21中沉淀菌悬液和上清菌悬液的接种量在4-6％之间。
5.根据权利要求4所述的一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，其特征在于，步骤S3包括：
S31.将步骤S24获得的扩大培养的菌液冻干获得相对应的单一的菌粉；
S32.将步骤S31获得的菌粉以一定比例配比获得复合土著菌粉；
S33.向步骤S32的复合土著菌粉中添加无色杆菌、产碱杆菌、棒状杆菌得到复合降解菌粉。
6.根据权利要求5所述的一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，其特征在于，步骤S4包括：
S41.制备预处理剂
预处理剂包括体积比为2-3:2-4:3-5的JFC、SDS和APG的混合溶液；
S42.制备降解菌剂
将步骤S33中制备出的复合降解菌粉与壳聚糖、海藻酸钠、Tween80、水混合，制备出降解菌剂。
7.根据权利要求6所述的一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，其特征在于：步骤S42中壳聚糖和海藻酸钠的添加量均在0.4-0.9％w/v范围内。
8.根据权利要求7所述的一种用于降解石油类污染物的复合菌剂生态构建方法，其特征在于，步骤S5包括：
S51.称取定量的降解0小时、1/3M小时、2/3M小时、M小时的石油类污染物，备用；
S52.对石油类污染物中的组分SAT、PAH的含量进行检测；
S53.根据各时间测得的SAT、PAH含量进行石油类污染物的降解代谢路径及速度的验证。
9.一种用于降解石油类污染物的复合菌剂，由上述权利要求1-8任一项所述的复合菌剂生态构建方法制得，其特征在于：
包括预处理剂和降解菌剂；
预处理剂用于活化石油类污染物的表面活性，为由JFC、SDS和APG制得的混合溶液；
降解菌剂用于降解石油类污染物，包括复合降解菌粉、壳聚糖、海藻酸钠、Tween80和水。
10.一种降解石油类污染物的方法，使用上述权利要求9所述的复合菌剂，其特征在于：将预处理剂按1-3‰的比例投加至石油类污染物中，反应6-8小时后按0.5-0.8‰的比例投加降解菌剂，进行石油类污染物的降解。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107129940A (zh) * 2017-04-07 2017-09-05 陕西省微生物研究所 修复石油污染土壤的复合菌群、菌剂及培养、固定化方法和应用
CN109207413A (zh) * 2018-11-15 2019-01-15 山东省科学院生态研究所 一种高效石油降解复合菌剂及其制备方法与应用
CN110283772A (zh) * 2019-07-25 2019-09-27 北京高能时代环境技术股份有限公司 一种修复石油烃污染土壤及地下水的功能菌群的制备方法

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Title
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