CN114058548A - 一株新型好氧反硝化菌及其在污水/废水生物脱氮中的应用 - Google Patents

一株新型好氧反硝化菌及其在污水/废水生物脱氮中的应用 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一株新型好氧反硝化菌,微杆菌(Microbacterium sp.)YZ‑25,保藏编号为CGMCC No.23104。还提供其在污水/废水生物脱氮中的应用以及一种将其发酵培养后干燥所得的干粉菌剂。本公开的微杆菌YZ‑25分离于垃圾渗滤液处理厂,可将硝酸盐高效地转化为一氧化二氮后,继续还原为氮气,可在24h时间内将初始浓度为112.67mg/L的硝氮降低到1.31mg/L,去除率达到98.84%。同时,微杆菌YZ‑25可在厌氧、缺氧、微好氧条件下进行,无需严格控制溶解氧条件,还可利用多种碳源进行生长并发挥反硝化作用。

Description

一株新型好氧反硝化菌及其在污水/废水生物脱氮中的应用
技术领域
本公开属于环境微生物技术领域,具体涉及一株新型好氧反硝化菌及其在污水/废水生物脱氮中的应用。
背景技术
生物脱氮是一种应用广泛且经济高效的污水处理工艺。传统的生物脱氮过程是通过自养硝化细菌将氨氮(NH4 +-N)氧化为硝酸盐氮(NO3 --N),然后在缺氧条件下由反硝化细菌逐步将硝酸盐还原为氮气(N2),在反硝化过程中亚硝酸盐(NO2 --N)、一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)为中间产物。因此,有效的脱氮依赖于废水在好氧和缺氧条件下依次暴露,这使得溶解氧很难完全去除以保证反硝化过程所需的缺氧条件。因此,大多数反硝化细菌的反硝化活性受到溶解氧的抑制,导致脱氮效率降低。此外,细菌在交替充氧条件下通过不断硝化反硝化过程也会产生更多的NO和N2O。
近年来,好氧反硝化菌的发现为污水脱氮技术提供了新的思路,它能够同时将氧气和硝酸盐还原,无需严格控制厌氧条件。然而,一般的好氧反硝化细菌只能将硝酸盐部分转化为氮气,而多数以N2O为最终产物。
本发明人经研究新分离得到一株好氧反硝化菌,经16S rRNA鉴定为微杆菌属,命名为微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25,其可高效地将硝酸盐氮和N2O转化为氮气,具有良好的污水/废水生物脱氮潜力。
发明内容
在下文中给出了关于本公开的简要概述,以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解,这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分,也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念,以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
为解决上述技术问题,本公开提供的技术方案是:
第一方面,本公开提供一株新型好氧反硝化菌,为微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25,其保藏编号为CGMCC No.23104。
本公开的微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25分离于垃圾渗滤液处理厂,将微生物样本中的细菌重悬分散,并通过富集培养、涂布平板、划线分离获得纯化的菌株。该好氧反硝化菌可将硝酸盐高效地转化为一氧化二氮后,继续还原为氮气。
第二方面,本公开还提供微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25在污水/废水生物脱氮中的应用。
优选地,上述污水/废水的总氮浓度≤260mg/L,COD≤8000mg/L,pH6-10,温度4-35℃,比如生活污水、养殖废水、工业废水等。
优选地,使用所述微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25的干粉菌剂施与污水/废水中以除氮,所述干粉菌剂为将微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25发酵培养后干燥所得。干燥可采用常规的冷冻干燥或喷雾干燥。
优选地,所述干粉菌剂以每立方污水/废水50-200g的用量投加到生化反应池中。
第三方面,本公开还提供一种用于污水/废水生物脱氮的干粉菌剂,将微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25发酵培养后干燥所得。
优选地,所述发酵培养时所用碳源选自乙醇、乙酸钠、丁二酸钠和葡萄糖中的任何一种及以上。
相比于现有技术,本公开的有益效果包括但不限于:
本公开提供的新型好氧反硝化菌微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25,具有以下优势:
1)该菌种对硝酸氮盐具有高效地还原速率,可在24h时间内将初始浓度为112.67mg/L的硝氮降低到1.31mg/L,去除率达到98.84%;
2)该菌种可在溶解氧浓度达到饱和状态下,将硝酸盐作为电子受体,反硝化得到最终产物氮气;
3)该菌种的硝氮还原过程可在厌氧、缺氧、微好氧好氧条件下进行,无需严格控制溶解氧条件;
4)该菌种可利用多种碳源进行生长并发挥反硝化作用,包括丁二酸钠、乙酸钠、葡萄糖、乙醇等;
5)该菌种同时具有异养硝化效果,可以将水中氨氮进行硝化氧化,同时不积累亚硝氮和硝氮;
6)以该菌种制备的干粉菌剂施用到污水或废水处理系统中,可提升系统硝化反硝化性能,为污水或者废水脱氮工艺提供新的思路。
本公开的微杆菌新菌种保藏日期为2021年08月02日,保藏编号为CGMCCNo.23104,分类命名为:微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25,保藏单位名称为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编为100101。
附图说明
图1为实施例1中微杆菌YZ-25的系统发育树;
图2为实施例2中微杆菌YZ-25在好氧条件下的反硝化能力测试曲线;
图3为实施例2中微杆菌YZ-25在好氧条件下的N2O还原能力测试曲线;
图4为实施例4中微杆菌YZ-25干粉菌剂的脱氮能力曲线。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。再不背立本发明精神和实质的情况下,本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换,属于本发明的范围。
在下文中将结合示范性实施例对本公开的技术方案进行描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25保藏日期为2021年08月02日,保藏编号为CGMCC No.23104。
实施例1微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25的分离、鉴定和保藏
1.菌种富集
使用PBS缓冲液将从垃圾渗滤液处理装置中采集的活性污泥中的细菌重悬分散,并接入盛有100ml富集培养基的锥形瓶中,在30℃,150rpm摇床培养,培养至对数生长期得到菌悬液。
富集培养基配方:1.6g/L K2HPO4,0.1g/L MgSO4·7H2O,0.02g/L CaCl2,0.005g/LFeSO4·7H2O,0.61g/L NaNO3,8.45g/L C4H4Na2O4·6H2O以及0.1ml/L微量元素母液。
微量元素母液配方为每升水中:3.5g EDTA,2.0g ZnSO4·7H2O,1.0g CuSO4·5H2O,2.0g MnSO4·7H2O,0.9g Co(NO3)2·6H2O,1.0g H3BO3,1.0g Na2MoO4
培养基pH值调节到7.5,并在使用前121℃灭菌30min。
2.菌种分离
取0.1mL菌悬液,采用稀释涂布平板法将菌液涂布在选择培养基上,在30℃的恒温培养箱中培养至菌落形成。选择培养基配方:1.6g/L K2HPO4,0.1g/L MgSO4·7H2O,0.02g/LCaCl2,0.005g/L FeSO4·7H2O,0.6g/L NaNO3,8.45g/L C4H4Na2O4·6H2O以及0.1ml/L微量元素母液,1ml/L 1%BTB溶液,20g/L琼脂。
3.菌种测试
选取蓝色菌落并以平板划线法纯化获得单种细菌,一共有三十多株,测试其反硝化性能。将获得的菌种分别接种于装有反硝化测试培养基的密封瓶中,并在30℃,150rpm摇床培养,分别测试其不同接种时间下的硝氮、亚硝氮含量,同时收集相应时间下密封瓶内的气体,用于测定气体中一氧化二氮的含量。从中选择出脱氮效率最高的菌株。
反硝化测试培养基配方:1.6g/L K2HPO4,0.1g/L MgSO4·7H2O,0.02g/L CaCl2,0.005g/L FeSO4·7H2O,0.6g/L NaNO3,3.42g/L无水乙酸钠以及0.1ml/L微量元素母液。
4.菌种鉴定
对上述脱氮效率最高的菌株进行形态学观察:将该脱氮效率最高的菌株在LB培养基稀释涂布,30℃过夜培养后平板上形成菌落,菌落呈圆形,表面光滑、湿润,浅黄色,不透明。LB培养基配方如下:蛋白胨10.0g,酵母粉5.0g,NaCl 10.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1.0L,pH7.0。
对上述脱氮效率最高的菌株进行分子系统发育分析:用基因组DNA提取试剂盒从1mL培养液中提取细菌总DNA。用通用引物F27和R1492扩增16S rRNA编码基因,并在中国北京Invitrogen公司测序。在基本局部比对搜索工具(BLAST)中对序列进行分析和比较。最后,利用MEGA 6软件对分离菌株和其他相关菌株的16S rRNA基因序列进行了1000次bootstrap重复和最大复合似然模型构建相邻连接系统发育树,参见图1,通过16SRRNA系统发育树分析,可知该菌株属于微杆菌属,与菌株Microbacterium oxydans的16S rRNA序列相似度最高,达到99.7%。申请人将之命名为微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25,并提交保藏,保藏日期为2021年08月02日,保藏编号为CGMCC No.23104,分类命名为:微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25,保藏单位名称为:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编为100101。
实施例2微杆菌YZ-25性能测试
1.验证微杆菌YZ-25在好氧条件下的反硝化能力。
将菌株YZ-25在LB培养基中培养至对数生长后期,收集5mL细菌悬浊液,无菌水洗涤重悬后接种到装有50mL反硝化测试培养基且用不透气橡胶塞封口的300mL密闭厌氧瓶中,但不替换顶空中的空气,然后在30℃和150rpm条件下震荡培养,每隔一定时间用注射器抽取5mL菌悬液,离心后将上清液测定亚硝氮和硝氮浓度。
参见图2,可以看出,该菌株可在24h时间内将初始浓度为112.67mg/L的硝氮降低到1.31mg/L,去除率达到98.84%,而且该过程中只积累了最高15.68mg/L的亚硝氮,并在随着硝氮的降低而迅速消耗,说明该菌株可在氧气存在的条件下快速的完成反硝化过程。
2.验证微杆菌YZ-25在好氧条件下的N2O还原能力。
将菌株YZ-25在LB培养基中培养至对数生长后期,收集5mL细菌悬浊液,无菌水洗涤重悬后接种到装有50mL反硝化测试培养基且用不透气橡胶塞封口的300mL密闭厌氧瓶中,但不替换顶空中的空气,同时向厌氧瓶顶部空气中注入1.5mL纯N2O气体。然后在30℃和150rpm条件下震荡培养,每隔抽取100μL上部空间气体进行N2O浓度测定。
参见图3,可以看出,在初始N2O浓度6558.90ppm条件下,该菌株可在30h内将99.30%的N2O快速还原为N2,由于初始顶空中为空气,表明该菌株在好氧条件下依然可发挥高效的N2O还原性能,能实现污水处理过程中N2O的减排,具有重要的应用价值。
实施例3微杆菌YZ-25在不同碳源条件下的生长及脱氮情况
将培养到对数生长期的菌株以5%的接种量分别接种至分别以丁二酸钠、乙酸钠、葡萄糖、乙醇为碳源的100mL反硝化测试培养基中,在30℃、150r/min的摇床中恒温振荡培养,每隔一定时间取样测定培养基中硝态氮、亚硝态氮浓度,以及菌体生长量OD600。下表1展示出培养24h时的菌株生长及脱氮情况。
可以看出,在初始总氮为98.00mg/L的情况下,菌株YZ-25可利用丁二酸钠、乙酸钠、葡萄糖为碳源实现95%以上的总氮去除率,利用乙醇实现88.16%的总氮去除率。
表1不同碳源情况下培养24h时的菌株YZ-25生长及脱氮情况
培养基碳源 OD<sub>600</sub> 硝氮mg/L 亚硝氮mg/L 总氮去除率%
乙酸钠 0.62 0.4462 0.006 99.54
丁二酸钠 0.783 2.419 0 97.53
葡萄糖 0.489 3.1438 0 96.79
乙醇 0.331 11.608 0 88.16
实施例4微杆菌YZ-25干粉菌剂制备和使用
将培养至对数生长末期的菌株YZ-25菌液接种于装有扩大培养基的50L发酵罐中,于30℃条件下发酵培养2d,发酵完成后在5000rpm离心机中离心菌体,然后用冷冻干燥设备对菌体进行干燥,最后粉碎制得干粉菌剂。
扩大培养基配方如下:1.6g/L K2HPO4,0.1g/L MgSO4·7H2O,0.02g/L CaCl2,0.005g/LFeSO4·7H2O,0.60g/LNaNO3,0.40g/L NH4Cl,3.42g/L无水乙酸钠以及0.1ml/L微量元素母液;微量元素母液配方同实施例1。
称取干粉菌剂0.02g,投加到100ml反硝化测试培养基中,在30℃、150rpm条件下进行培养,每隔一定时间取样测定培养基中硝态氮、亚硝态氮浓度,结果参见图4。从图中可以看出,该菌剂在经过5h的调整期后开始发挥脱氮作用,培养30h后实现了98.05%的脱氮效率。
最后,还需要说明的是,在本公开中,如有,诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露,但是,应该理解,本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。
序列表
<110> 东方绿水(北京)环境科技有限公司
<120> 一株新型好氧反硝化菌及其在污水/废水生物脱氮中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1162
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
actggatatg tgacgtgacc gcatggtctg cgtctggaaa gaatttcggt tggggatggg 60
ctcgcggcct atcagcttgt tggtgaggta atggctcacc aaggcgtcga cgggtagccg 120
gcctgagagg gtgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 180
agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agcaacgccg cgtgagggac 240
gacggccttc gggttgtaaa cctcttttag cagggaagaa gcgaaagtga cggtacctgc 300
agaaaaagcg ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg cgcaagcgtt 360
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ggaattcctg gtgtagcggt ggaatgcgca gatatcagga ggaacaccga tggcgaaggc 540
agatctctgg gccgtaactg acgctgagga gcgaaagggt ggggagcaaa caggcttaga 600
taccctggta gtccaccccg taaacgttgg gaactagttg tggggtccat tccacggatt 660
ccgtgacgca gctaacgcat taagttcccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac 720
tcaaaggaat tgacggggac ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac 780
gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacatata cgagaacggg ccagaaatgg tcaactcttt 840
ggacactcgt aaacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 900
aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgttct atgttgccag cacgtaatgg tgggaactca 960
tgggatactg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1020
ttatgtcttg ggcttcacgc atgctacaat ggccggtaca aagggctgca ataccgcgag 1080
gtggagcgaa tcccaaaaag ccggtcccag ttcggattga ggtctgcaac tcgacctcat 1140
gaagtcggag tcgctagtaa tc 1162

Claims (7)

1.一株新型好氧反硝化菌,为微杆菌(Microbacterium sp.)YZ-25,其保藏编号为CGMCC No.23104。
2.根据权利要求1所述的微杆菌YZ-25在污水/废水生物脱氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述污水/废水的总氮浓度≤260mg/L,COD≤8000mg/L,pH6-10,温度4-35℃。
4.根据权利要求2或3所述的应用,其特征在于,使用所述微杆菌YZ-25的干粉菌剂施与污水/废水中以脱氮,所述干粉菌剂为将微杆菌YZ-25发酵培养后干燥所得。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述干粉菌剂以每立方污水/废水50-200g的用量投加使用。
6.一种用于污水/废水生物脱氮的干粉菌剂,其特征在于,将如权利要求1所述的微杆菌YZ-25发酵培养后干燥所得。
7.如权利要求6所述的干粉菌剂,其特征在于,所述发酵培养时所用碳源选自乙醇、乙酸钠、丁二酸钠和葡萄糖中的任何一种及以上。
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