CN115322915B - 一种耐酸锰氧化菌及其在锰矿废水处理中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属涉及一种耐酸锰氧化菌及其在锰矿废水处理中的应用，其中耐酸锰氧化菌Klebsiellasp.Strain M3，已于2021.3.24保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021261；所述耐酸锰氧化菌在酸性含锰培养基中快速生长，并可氧化其中Mn2+，使得溶液中Mn2+的去除率达到40%‑98%，同时生成了锰氧化物固体产物，容易回收。

Description

一种耐酸锰氧化菌及其在锰矿废水处理中的应用
技术领域
本发明属于微生物处理锰矿废水的技术领域，具体涉及一种耐酸锰氧化菌及其在锰矿废水处理中的应用。
背景技术
锰是重要的黑色金属矿产资源，对国民经济的发展具有重要作用。我国锰矿资源十分丰富，居世界第4位，且大多分布在南方地区。广泛的应用导致开采、冶炼与加工过程产生了大量的锰矿废水。当含锰废水进入环境中，可导致受污染水体、土壤中的锰元素通过食物链富集至人体内，使肝脏等器官发生生化改变而坏死，而且导致许多出生缺陷、恶性肿瘤的发生。所以，迫切的希望开发一种能够高效去除锰矿废水的方法。
通常，锰矿废水pH值较低，呈酸性，含有高浓度的Mn(II)离子；与化学除锰相比，生物除锰工艺有着氧化速率高、抗冲击能力强、运行费用低、出水条件好和效果稳定等诸多优点。常见的锰氧化菌主要分布在芽胞杆菌属(Bacillus）、 纤发菌属（Leptothrix）和假单胞菌属 (Pseudomonas putida )等，在pH 为6.5~8.5的范围内，传统的氧化菌能够高效氧化Mn(II)离子产生锰氧化物沉淀，从而去除水体中Mn(II)离子。目前关于生物除锰工艺主要应用于去除地表水、地下水中的Mn(II)离子，20世纪90年代，张杰院士科研团队研发了生物固锰除锰技术，提出了生物滤池工艺去除地下水中的Mn(II)。但是，锰矿废水酸性强、锰浓度高，若采用锰氧化菌氧化去除其中的Mn(II)离子，微生物必须具有优异的耐酸性，耐锰性。
因此，开发一种耐酸锰氧化菌及其在锰矿废水处理中的应用，必将为生物氧化除锰处理锰矿废水提供一种新的方法和途径。
发明内容
本发明的目的之一在于为了解决以上技术问题，提供一种耐酸性锰氧化菌，耐酸锰氧化菌Klebsiellasp. Strain M3，保藏编号为CCTCC M 2021261；已于2021年3月24日保藏在中国典型培养物保藏中心。
本发明的目的之二在于提供一种耐酸性锰氧化菌悬菌液。
优选的，制备耐酸性锰氧化菌悬菌液是将冷藏保存的菌株，按照5%体积比的接种量将其接种到JFM培养基中，振荡培养一段时间，收集菌液进行离心，用PYCM液体培养基重新悬浮，制成悬菌液；
优选的，所述振荡培养18~24小时，使其进入对数期；
优选的，所述离心的速度为8000~10000 转/分钟，时间为10~15分钟；
一种锰矿废水处理方法，采用耐酸性锰氧化菌或耐酸性锰氧化菌悬菌液处理所述锰矿废水。
优选的，所述锰矿废水酸性锰矿废水，所述酸性锰矿废水为锰矿区采选废水；
优选的，包括静置前处理，将所述锰矿废水静置后去除底部沉积物；
优选的，去除底部沉积物的废水pH为4.5~6.5，Mn(II)离子浓度为10~50 mg/L；
优选的，向经过前处理的锰矿废水中投加一定量的柠檬酸，然后将耐酸性锰氧化菌或耐酸性锰氧化菌悬菌液填充到生化反应器中；然后使用蠕动泵自下而上泵入锰矿废水，每隔1天测定出水中Mn(II)离子浓度；
优选的，所述生化反应器为上流式生化反应器，所述为上流式生化反应器有机玻璃制成的圆柱，径高比为1:5~1:6，反应器底部、上部分别设有进水口和出水口；
优选的，锰矿废水中添加柠檬酸的浓度为2~4 g/L；
优选的，处理锰矿废水的水力停留时间为12~18小时；
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供的锰氧化菌的耐酸性、耐锰性较强，能够较快的适应锰矿废水环境，避免了去除反应启动慢的问题；
（2）本发明提供的锰氧化菌，能够耐高浓度Mn2+，能适应在酸性条件下氧化去除水体中Mn2+，为含锰酸性废水处理提供了一种新的微生物处理方法；
（3）采用本发明的菌株可以在酸性含锰培养基中快速生长，并可氧化其中Mn2+，使得溶液中Mn2+的去除率达到40%-98%，同时生成了锰氧化物固体产物，容易回收。
附图说明
图1为耐酸锰氧化菌的透射电镜图；
图2基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树图；
图3为Mn2+浓度为40mg/L、不同pH条件下锰氧化菌对Mn2+氧化去除曲线图；
图4为培养基pH为5.0、不同Mn2+浓度条件下锰氧化菌锰氧化Mn2+性能曲线图；
图5 为酸性含锰培养基接种锰氧化菌后固相产物扫描电镜图；
图6 为酸性含锰培养基接种锰氧化菌后固相产物Mn元素高倍XPS谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”，“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
湖南省湘潭市（河西）污水处理厂曝气池好氧区的活性污泥，称量10g污泥样品，放入含有100mL无菌水的锥形瓶中，震荡30min，使微生物从污泥上充分洗脱下来，静置30min；配置PYCM液体培养基，调节初始pH为5.0~6.0，高压灭菌后冷却备用；取1.0mL污泥上清液接种于酸性PYCM液体培养基中，30℃恒温培养1~2d后，将培养基上清液稀释103倍数，然后取0.1mL涂布在含200mg/LMn(Ⅱ) pH为5.0~6.0 PYCM固体培养基的平板上，放置于30℃恒温的生化培养箱中培养48h后，挑取单菌落在JFM固体培养基进行平板划线分离纯化，获得耐酸锰氧化菌单菌落。
PYCM液体培养基：蛋白胨0.8g，酵母浸膏0.2g，K2HPO40.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.2g，CaCl20.1g，(NH4)2SO40.1g，NaNO30.2g，去离子水1L。
PYCM固体培养基：蛋白胨0.8g，酵母浸膏0.2g，K2HPO40.1g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.2g，CaCl20.1g，(NH4)2SO40.1g，NaNO30.2g，琼脂20g，去离子水1L。
JFM液体培养基：MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO40.5g，NaNO30.5g，CaCl20.2g，K2HPO40.5g，柠檬酸铁铵10g，（MnSO4·H2O 0.5g），去离子水1L。
JFM固体培养基：MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO40.5g，NaNO30.5g，CaCl20.2g，K2HPO40.5g，柠檬酸铁铵10g，（MnSO4·H2O 0.5g），琼脂20g，去离子水1L。
实施例2
筛选获得耐酸环境的一株锰氧化菌，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021261，保藏日期为2021.3.24。
所述的耐酸锰氧化菌在JFM固体培养基中，37℃培养24h后，培养基中呈现棕色不透明的单菌落，表面较干燥有光泽，边缘光滑，直径2-3mm；图1 为菌株细胞的透射电镜图，可见细胞为短杆状，大小为0.5~1μm×1~2μm，无鞭毛，有菌毛，形成了厚荚膜，不产生芽孢。通过利用细菌16SrDNA基因引物对细菌总DNA进行了扩增，然后通过一代测序获得1047bp的保守片段，把测定基因序列提交到GenBank，获得GenBank登录号为MW725160，将GenBank网站上与菌株基因序列相似度、匹配度最高的菌种的序列下载后导入MEGA软件中，对多重基因序列进行比较，最后通过Neighbor-Joining Tree法构建系统发育树，见图2，通过序列比对发现，菌株与克雷伯氏菌Klebsiellasp.具有很高的同源性，高达99%，命名为Klebsiellasp. Strain M3。
实施例3
配置含40mg/L Mn(II)溶液，调节溶液初始pH为4.0、5.0、6.0；将冷藏保存的菌株接种到JFM培养基中活化2d后，按照2%（体积比）的接种量将其接种到500mL含锰溶液中，30℃条件下震荡反应，按照设定的时间间隔，移取2mL 溶液，经过0.45微米滤膜过滤，采用火焰原子吸收测定溶液中残留锰浓度。当含锰培养液中锰离子浓度为40mg/L，初始pH分别为4.0、5.0、6.0时，接种锰氧化菌后，培养液中残留的锰浓度不断降低，反应168小时后，Mn(II)浓度为17.58、11.78、7.18 mg/L，对应的去除率分别为56%、70.5%、82%。从图3可知，当含锰培养液中锰离子浓度为40mg/L，初始pH分别为4.0、5.0、6.0时，接种锰氧化菌后，培养液中残留的锰浓度不断降低。可见筛选的锰氧化菌在酸性低营养培养基中仍然具有较强的氧化Mn2+浓度，适用于处理酸性含锰矿山废水。
实施例4
在培养锰氧化菌氧化酸性环境下Mn2+能力过程中，按照设定的时间间隔，移取2mL溶液，经过0.45微米滤膜过滤，采用火焰原子吸收测定溶液中残留锰浓度，从图4可知，当酸性含锰培养液初始pH为5.0时，接种锰氧化菌后，锰浓度不断降低，当Mn2+初始浓度为10mg/L时，Mn2+的最终氧化去除率能达到95%以上；当Mn2+初始浓度达到50mg/L时，经过7d去除反应后降低到30mg/L以下，氧化去除率高于40%。
实施例5
收集实施列3、4生成的固体产物，110ºC条件下真空干燥，通过扫描电镜（SEM）和X射线衍射（XPS）技术对产物的形貌和锰元素的赋存形态进行测试分析，结果见图5与图6。
从图5可以看出，锰氧化菌在酸性含锰培养基中生长产生了圆形的固相产物，其形态较为规则，粒径小约为 50nm，团聚在一起。图6中XPS谱图中锰峰的出现，表明了溶液中Mn2+被转移到固体产物中，使用XPSPeak软件对Mn2p3/2的特征峰进行分峰处理，其中，电子结合能642.2eV、641.3 eV分别对应Mn(IV)、Mn(III)的特征峰，Mn(IV)与Mn(III)峰面积比约为1.42：1，说明溶液中Mn2+确实有被大量氧化成高价态Mn(III, IV)。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
序列表
<110> 浙江科技学院
<120> 一种耐酸锰氧化菌及其在锰矿废水处理中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> Klebsiella sp.
<400> 1
gcgtatcaag tggtagcgcc ctcccgaagg ttaagctacc tacttctttt gcaacccact 60
cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgt agcattctga 120
tctacgatta ctagcgattc cgacttcatg gagtcgagtt gcagactcca atccggacta 180
cgacatactt tatgaggtcc gcttgctctc gcgaggtcgc ttctctttgt atatgccatt 240
gtagcacgtg tgtagccctg gtcgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcat ccccaccttc 300
ctccagttta tcactggcag tctcctttga gttcccggcc taaccgctgg caacaaagga 360
taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatttca caacacgagc tgacgacagc 420
catgcagcac ctgtctcaca gttcccgaag gcaccaaagc atctctgcta agttctgtgg 480
atgtcaagac caggtaaggt tcttcgcgtt gcatcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 540
tgtgcgggcc cccgtcaatt catttgagtt ttaaccttgc ggccgtactc cccaggcggt 600
cgatttaacg cgttagctcc ggaagccacg cctcaagggc acaacctcca aatcgacatc 660
gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctg 720
agcgtcagtc tttgtccagg gggccgcctt cgccaccggt attcctccag atctctacgc 780
atttcaccgc tacacctgga attctacccc cctctacaag actctagcct gccagtttcg 840
aatgcagttc ccacgttgag cccggggatt tcacatccga cttgacagac cgcctgcgtg 900
cgctttacgc ccagtaattc cgattaacgc ttgcaccctc cgtattaccg cggctgctgg 960
cacggagtta gcccggtgct tcttctgcgg gtaacgtcaa tcgacgatgg ttattaacca 1020
tcatcgcctt cctccccgct gaaagtactt tac 1053

Claims (9)

1.一种耐酸性锰氧化菌，其特征在于，所述耐酸性锰氧化菌为Klebsiella sp.StrainM3，保藏编号为CCTCC M 2021261。
2.一种耐酸性锰氧化菌悬菌液，其特征在于，所述耐酸性锰氧化菌悬菌液包括权利要求1所述的耐酸性锰氧化菌。
3.根据权利要求2所述的耐酸性锰氧化菌悬菌液，其特征在于，将一定量所述耐酸性锰氧化菌接种到JFM培养基中，振荡培养一段时间，收集菌液进行离心，用PYCM液体培养基重新悬浮，制成悬菌液。
4.根据权利要求3所述的耐酸性锰氧化菌悬菌液，其特征在于，所述振荡培养18～24小时，使其进入对数期，所述离心的速度为8000～10000转/分钟，时间为10～15分钟。
5.一种锰矿废水处理方法，采用权利要求1所述的耐酸性锰氧化菌或权利要求2-4之一所述的耐酸性锰氧化菌悬菌液处理所述锰矿废水，所述锰矿废水为酸性锰矿废水，所述酸性锰矿废水为锰矿区采选废水。
6.根据权利要求5所述的锰矿废水处理方法，其特征在于，包括静置前处理，将所述锰矿废水静置后去除底部沉积物。
7.根据权利要求5所述的锰矿废水处理方法，其特征在于，去除底部沉积物的废水pH为4.5～6.5，Mn(II)离子浓度为10～50mg/L。
8.根据权利要求7所述的锰矿废水处理方法，其特征在于，向经过前处理的锰矿废水中投加一定量的柠檬酸，然后向所述反应器中加入耐酸性锰氧化菌或耐酸性锰氧化菌悬菌液。
9.根据权利要求8所述的锰矿废水处理方法，其特征在于，锰矿废水中添加柠檬酸的浓度为2～4g/L，处理锰矿废水的水力停留时间为12～18小时。
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