CN109851686A - 用于石油凝聚的微生物胞外多糖及其纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能用于石油凝聚的微生物胞外多糖及其纯化方法。本发明采用醇沉法和蛋白酶K‑Sevag法酶解法提取菌株CS07胞外多糖，胞外多糖为浅黄色粉末；分离提取的胞外多糖对石油具有良好的凝聚功能。该微生物多糖的石油凝聚性能解决了石油污染后引起的海洋污染问题，使海洋环境完全恢复，并且为开发微生物修复石油污染产品奠定基础。

Description

用于石油凝聚的微生物胞外多糖及其纯化方法

技术领域

本发明涉及一种能用于石油凝聚的微生物胞外多糖及其纯化方法。

背景技术

随着石油污染问题的加剧，对于石油降解的研究越来越受到人们的关注。尤其水体发生石油污染，包括石油泄漏、油港码头船舶及进入海洋或其他水体中的陆地石油等，因石油密度较小，可漂浮水体表面，随水体流动而快速扩展，造成污染面积的迅速扩大。目前文献报道较多的微生物治理环境石油污染主要集中在利用微生物降解石油，针对海洋漂浮油膜的污染快速扩散问题，利用微生物代谢物对污染油膜进行生物凝聚回收处理则没有报道。因此，开发能凝聚石油的绿色无公害微生物代谢产品已成为当今的主要研究方向。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明提供一种用于石油凝聚的胞外多糖及其纯化方法。

一种用于石油凝聚的胞外多糖的纯化方法，包括以下步骤：

S1.采用醇沉法和蛋白酶K-Sevag法酶解法提取菌株CS07胞外多糖粗提液；

S2.将胞外多糖粗提液采用DEAE-52纤维素离子交换层析梯度洗脱进行分离纯化，然后采用Sephadex G150凝胶渗透层析柱进一步对活性组分分离纯化，得到胞外多糖。

进一步的，步骤S2中洗脱剂为去离子水、0.3mol/LNaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl，依次洗脱每个浓度洗脱3个柱体积，流速为1.2mL/min。

更为具体的，所述步骤S1包括：

(1)取在LB培养基30℃，150r/min摇瓶培养7d的菌株CS07发酵液，121℃高压灭菌1h后，在4℃11000r/min离心1h，取上清，向沉淀中加入无菌水摇匀后，重复上述操作，上清液在100℃加热搅拌，浓缩至70mL；

(2)向浓缩液中加入30mL无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，密封瓶口，放置于4℃静置过夜，将过夜后的溶液在4℃11000r/min离心30min，弃白色沉淀，收集上清液；

(3)向上清液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到80％，密封瓶口，放置于4℃静置24h，醇沉24h后瓶中会有沉淀吸附于瓶底，小心倾倒弃去全部上清液，以无菌水溶解沉淀；

(4)向溶液中加入0.1％(w/v)的蛋白酶K，60℃酶解3h后，加入1/5溶液体积的Sevag试剂，搅拌20min；4℃11000r/min离心20min；小心收集上清液，弃去中间白色层及下层试剂；重复加入Sevag试剂，离心，直至有机层无沉淀出现，收集合并上清液作为胞外多糖粗提液。

所述的菌株CS07拉丁文学名为Marinobactermaritimus.分类命名：近海海杆菌。所述的菌株CS07采集于大连新港石油污染海域海底沉积物，富集分离所得。所述的菌株CS07已提交保藏，具体保藏信息如下：

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年7月6日；

保藏编号：CGMCC No.12739；

所述的菌株CS07的形态及理化特征为：菌株CS07在固体LB培养基上在15℃条件下划线培养至单菌落，观察菌株CS07的菌落形态，菌落表面湿润光滑凸起，边缘整齐，多呈圆形，不透明，浅黄色。菌株CS07菌株呈杆状，无鞭毛，长约0.25-0.56μm，宽约0.13-0.2μm。

如上述方法分离提纯得到的胞外多糖具有石油凝聚的作用。进一步的，本发明请求保护采用上述胞外多糖进行石油凝聚的方法：取l胞外多糖粗提物水溶液，向其中加入石油，在胞外多糖作用下，石油凝聚成球状。

本发明采用醇沉法蛋白酶K-Sevag法酶解法提取菌株CS07胞外多糖，胞外多糖为浅黄色粉末；分离提取的胞外多糖对石油具有良好的凝聚功能。该微生物多糖的石油凝聚性能解决了石油污染后引起的海洋污染问题，使海洋环境完全恢复，并且为开发微生物修复石油污染产品奠定基础。

附图说明

图1胞外多糖粗提物经DEAE-52阴离子交换柱层析洗脱图；

图2高效液相色谱法对组分EPS1、EPS2的纯度检测；

图3EPS1、EPS2分别经Sephadex G150凝胶层析柱分离后的洗脱图；

图4高效液相色谱法对组分EPS1-1(6)的纯度检测；

图5苯酚-硫酸法测定糖含量的标准曲线图；

图6Folin-酚法测定蛋白含量的标准曲线图；

图7硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白对石油的凝聚情况分析；其中，A为去离子水对照，水体表面形成油膜；B为硫酸铵沉淀蛋白，对石油无凝聚现象；

图8胞外多糖粗提物对石油的凝聚情况。其中，A去离子水对照，形成油膜，无凝聚现象；B为LB培养基对照，形成油膜，无凝聚现象；C为胞外多糖粗提物对石油具有凝聚作用，C1-C4分别为石油加入量为0.1mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL的胞外多糖粗提物；

图9EPS1、EPS2对石油的凝聚情况，其中A为去离子水对照，石油漂浮水面形成油膜；B为EPS1，具有石油凝聚功能，C为EPS2，不具有石油凝聚功能；

图10EPS1-1、EPS2-1对石油的凝聚情况，其中A为去离子水对照；石油漂浮水面形成油膜；B为EPS1-1，具有石油凝聚功能；C为EPS2-1，不具有石油凝聚功能；

图11组分EPS1-1(6)对石油的凝聚情况。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。

实施例1

一种用于石油凝聚的胞外多糖的纯化方法，包括以下步骤：

(1)取在LB培养基30℃，150r/min摇瓶培养7d的菌株CS07发酵液，121℃高压灭菌1h后，在4℃11000r/min离心1h，取上清，向沉淀中加入无菌水摇匀后，重复上述操作，上清液在100℃加热搅拌，浓缩至70mL。其中，上清液在100℃加热使蛋白变性，便于后续沉淀蛋白，去除蛋白。

(2)向浓缩液中加入30mL无水乙醇，使乙醇终浓度为30％(低浓度乙醇主要用于去除杂质及蛋白)；用封口膜密封三角瓶口，放置于4℃冰箱中，静置过夜。将过夜后的溶液在4℃11000r/min离心30min，弃白色沉淀，收集上清液。

(3)向上清液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到80％(高浓度乙醇用于沉淀多糖)，封口膜密封瓶口，放置于4℃冰箱，静置24h。醇沉24h后三角瓶中会有沉淀吸附于瓶底，小心倾倒弃去全部上清液，以无菌水溶解沉淀。

(4)向溶液中加入0.1％的蛋白酶K(w/v)，60℃酶解3h后，加入1/5溶液体积的Sevag试剂，搅拌20min(Sevage法目的是去掉蛋白)；4℃11000r/min离心20min；小心收集上清液，弃去中间白色层及下层试剂；重复加入Sevag试剂，离心，直至有机层无沉淀出现，收集合并上清液作为胞外多糖粗提液。

(5)将胞外多糖粗提液采用DEAE-52纤维素离子交换层析梯度洗脱进行分离纯化，然后采用Sephadex G150凝胶渗透层析柱进一步对活性组分分离纯化，得到胞外多糖。

(5.1)DEAE-52纤维素离子交换层析

①DEAE-52纤维素的预处理：取DEAE-52纤维素2.5g，加入到40mL0.5mol/LHCl中，用玻璃棒轻轻搅拌后浸泡30min。加入60mL去离子水，用玻璃棒轻轻搅拌后浸泡10min。倒出上层液体，加入60mL去离子水，搅拌静置后弃上清，重复上述步骤1-2次，然后倾入有100目尼龙滤布的漏斗中。用去离子水充分洗涤，直到流出液pH>4。然后加入40mL 0.5mol/LNaOH浸泡30min后，倾倒上清，用去离子水充分洗涤，直到流出液pH≤3。之后加入100mL0.01mol/L Na₂HPO₄浸泡并搅拌，倾去上层液体，重复上述操作，直到溶液pH＝8。

②装柱：将层析柱(1.2cm×30cm)固定于铁架台上，柱的底部用脱脂棉垫底，将柱子垂直安装好，先加入1/3柱体积去离子水，接着将处理好的DEAE-52纤维素边搅匀边连续装入，使其在柱内自然沉降，打开下口将去离子水流出。装柱后DEAE-52纤维素必须均匀，不能有气泡，若有气泡需倒出重装。装好柱子后，用0.3mol/LNaCl平衡2-3个柱体积即可上样。

③上样：加样前，需将柱内DEAE-52纤维素上面多余的液体放出，直到柱内液面与纤维素表面相齐为止。样品上样前需过0.45μm滤膜，上样量为4mL，上样后打开下口开始洗脱。

④洗脱：洗脱剂为去离子水、0.3mol/LNaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl，依次洗脱每个浓度洗脱3个柱体积，流速为1.2mL/min，每5mL收集一管，洗脱效果最好。

⑤洗脱曲线绘制：采用苯酚-硫酸法进行检测，以管号为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，收集含糖组分。将含糖组分用截留分子量为3500Da的透析袋透析脱盐，第一次隔3h换一次去离子水，之后每隔6h换一次去离子水，重复3～4次。

如图1所示，胞外多糖粗提物经过DEAE-52阴离子交换柱层析分离后，由去离子水、0.3mol/LNaCl洗脱分别得到2个组分，命名为EPS1和EPS2。EPS1、EPS2的高效液相色谱图如图2所示。组分EPS1和EPS2未达到对称的单一峰，且EPS2两峰之间未达到较好分离，说明EPS1、EPS2经离子交换层析后并未达到预期的纯度，因此，对这两种胞外多糖还需进行进一步的分离纯化。

(5.2)凝胶渗透层析

①Sephadex G150的预处理：取Sephadex G150凝胶粉8g加入到400mL去离子水中，沸水浴4h，冷却至室温，用去离子水洗涤几次去除杂质，超声脱气。

②装柱：将层析柱(1.2cm×30cm)固定于铁架台上，柱的底部用脱脂棉垫底，将柱子垂直安装好，先加入1/3柱体积去离子水，接着将处理好的凝胶边搅匀边连续装入，使其在柱内自然沉降，打开下口将去离子水流出。装柱后凝胶必须均匀，不能有气泡，若有气泡需倒出重装。装好柱子后，用NH₄HCO₃平衡2-3个柱体积即可上样。

③上样：加样前，需将柱内凝胶上面多余的液体放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐为止。取(5.1)分离得到的活性组分过0.45μm滤膜后，上样，上样量为2mL，上样后打开下口开始洗脱。

④洗脱：流动相为0.2mol/LNH₄HCO₃，流速0.2mL/min，每3mL收集一管。

⑤洗脱曲线绘制：采用苯酚-硫酸法进行检测，以管号为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，收集含糖组分。将含糖组分旋转蒸发出NH₄HCO₃并浓缩冻干。如图3所示，EPS1经Sephadex G150凝胶渗透层析柱分离后，得到一个组分峰，命名为EPS1-1。EPS2经Sephadex G150凝胶渗透层析柱分离后，得到一个组分峰，命名为EPS2-1。

组分峰EPS1经Sephadex G150凝胶渗透层析分离后得到组分EPS1-1(6)，采用高效凝胶渗透色谱法对其进行纯度检测，EPS1-1(6)的高效液相色谱图如图4所示，可看出EPS1-1(6)峰型单一且较对称，无杂峰出现，纯度较高。

实施例2硫酸-苯酚法测定胞外多糖糖含量

分别取500μL浓度为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的标准葡萄糖溶液，加入200μL 6％苯酚(现配)和1.0mL浓硫酸，混匀后在沸水浴中反应15min，冷却至室温，在490nm测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

将菌株CS07胞外多糖配制成浓度为20mg/mL的溶液，取50μL胞外多糖溶液，补水至500μL，按上述方法测定其吸光值，并根据标准曲线计算其总糖含量。以葡萄糖浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，建立总糖测定标准曲线。得回归方程为Y＝0.5699x-0.0141，R²＝0.9944。由图5可知，葡萄糖的浓度与吸光值在0.2mg/mL～1.2mg/mL之间有良好的线性关系。根据线性回归方程，得到上述提取液中胞外多糖糖含量为47％。

实施例3Folin-酚法测定荚膜粗多糖蛋白含量

分别取500μL浓度为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL的标准牛血清白蛋白溶液，加入试剂甲2.5mL(试剂甲为按50:1混合的NaOH-Na₂CO₃溶液和酒石酸钾钠-CuSO₄溶液，其中NaOH-Na₂CO₃溶液为0.2mol/LNaOH与4％Na₂CO₃等体积混合配制成；酒石酸钾钠-CuSO₄溶液为2％酒石酸钾钠与1％CuSO₄等体积混合配制成)，漩涡振荡后室温放置10min，然后加入试剂乙250μL(试剂乙为稀释一倍的Folin-酚试剂)，再次振荡后并静置1h，在750nm测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，牛血清白蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。

将菌株CS07胞外多糖配制成浓度为1mg/mL的溶液，按上述方法测定其吸光值，并根据标准曲线计算其蛋白含量。以牛血清白蛋白浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，建立蛋白测定标准曲线(图6)。得回归方程为Y＝0.0034x+0.0186，R²＝0.9946。由图6可知，蛋白质的浓度与吸光值在20μg/mL～160μg/mL之间有良好的线性关系。根据线性回归方程，得到胞外多糖经蛋白酶K-Sevag法酶解前后的蛋白含量，分别为41.18％和26.88％，蛋白去除率为65.27％。

实施例4

由于蛋白酶K-Sevag法无法将蛋白彻底去除，因此，为排除蛋白杂质对石油凝聚的影响，本实施例测定蛋白杂质对石油的凝聚效果。

(1)取在LB培养基30℃，150r/min培养7d的菌株CS07发酵液，4℃11000r/min离心30min，收集上清液并记录体积；

(2)边搅拌边缓慢加入等体积的60％饱和硫酸铵溶液到上清液中；

(3)将溶液放在磁力搅拌器上搅拌4h，使蛋白质充分沉淀；

(4)将上述溶液与4℃11000r/min离心30min，弃上清，用无菌水溶解沉淀，制备硫酸铵蛋白沉淀物以测定其对石油的凝聚效果。

以60％饱和浓度硫酸铵沉淀物作为分析样品，测定其对石油的凝聚效果。其对石油凝聚的结果如图7所示，A为去离子水对照，水体表面形成油膜；B为硫酸铵沉淀蛋白对石油无凝聚现象，二者均未出现凝聚现象，说明硫酸铵蛋白沉淀物(包括其中的少量多糖)不能使石油凝聚。

实施例5胞外多糖对石油的凝聚作用

取15mL实施例1步骤(4)制备的胞外多糖粗提物水溶液，同时设定对照，分别向无菌水、LB培养基以及荚膜粗提物水溶液中加入30μL石油，观察石油的凝聚情况。

图8中，A为去离子水对照，形成油膜，无凝聚现象；B为LB培养基对照，形成油膜，无凝聚现象；C为胞外多糖粗提物对石油具有凝聚作用(C1石油加入量为0.1mL，C2石油加入量为0.5mL，C3石油加入量为1.0mL，C4石油加入量为1.5mL)；石油凝聚成球状，且石油加入量从0.1mL增至1.5mL，石油凝聚成球数量也逐渐增加，没有出现随着石油量的增加而成膜的现象。因此，该多糖是引起石油凝聚的主要原因。

取实施例1步骤(4)制备的胞外多糖粗提物EPS1-1、EPS2-1、EPS1-1(6)同时设定去离子水为对照，分别向上述含有胞外多糖粗提物的试管中加入30μL石油混合，观察石油漂浮成膜还是凝聚成球。

图9是EPS1、EPS2对石油的凝聚情况，其中A为去离子水对照，石油漂浮水面形成油膜，无凝聚现象；B为EPS1，具有石油凝聚功能，C为EPS2石油成膜，不具有石油凝聚功能。

图10是EPS1-1、EPS2-1对石油凝聚情况，其中A为去离子水对照；石油漂浮水面形成油膜，无凝聚现象；B为EPS1-1，具有石油凝聚功能；C为EPS2-1，不具有石油凝聚功能。

如图11所示，组分EPS1-1(6)对石油的凝聚效果最好。

综上，采用DEAE-52纤维素离子交换层析梯度洗脱对菌株CS07胞外多糖进行分离纯化得到两个组分，其中EPS1可使石油凝聚成球状，为主要活性组分。采用Sephadex G150凝胶渗透层析柱进一步进行分离纯化，EPS1-1(6)具有石油凝聚活性。采用高效液相色谱法检测EPS1-1(6)纯度，结果显示其峰型单一且较对称，无杂峰出现，分离纯度较高，且具有明显的凝聚效果。因此，本发明方法可以获得无杂峰，纯度高的对石油有凝聚效果的胞外多糖。

以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于石油凝聚的胞外多糖的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.采用醇沉法和蛋白酶K-Sevag法酶解法提取菌株CS07胞外多糖粗提液；

S2.将胞外多糖粗提液采用DEAE-52纤维素离子交换层析梯度洗脱进行分离纯化，然后采用Sephadex G150凝胶渗透层析柱进一步对活性组分分离纯化，得到胞外多糖；

所述的菌株CS07保藏编号为CGMCC No.12739。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中洗脱剂为去离子水、0.3mol/LNaCl、0.6mol/LNaCl、0.9mol/LNaCl，依次洗脱每个浓度洗脱3个柱体积，流速为1.2mL/min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：

(1)取在LB培养基30℃，150r/min摇瓶培养7d的菌株CS07发酵液，121℃高压灭菌1h后，在4℃11000r/min离心1h，取上清，向沉淀中加入无菌水摇匀后，重复上述操作，上清液在100℃加热搅拌，浓缩至70mL；

(2)向浓缩液中加入30mL无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，密封瓶口，放置于4℃静置过夜，将过夜后的溶液在4℃11000r/min离心30min，弃白色沉淀，收集上清液；

(3)向上清液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度达到80％，密封瓶口，放置于4℃静置24h，醇沉24h后瓶中会有沉淀吸附于瓶底，小心倾倒弃去全部上清液，以无菌水溶解沉淀；

(4)向溶液中加入0.1w/v％的蛋白酶K，60℃酶解3h后，加入1/5溶液体积的Sevag试剂，搅拌20min；4℃11000r/min离心20min；小心收集上清液，弃去中间白色层及下层试剂；重复加入Sevag试剂，离心，直至有机层无沉淀出现，收集合并上清液作为胞外多糖粗提液。

4.如权利要求1所述方法制备的胞外多糖粗提液在石油凝聚上的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，取浓度为100mg/ml胞外多糖粗提物水溶液，向其中加入石油，胞外多糖粗提物水溶液与石油的体积比为(500-1000)：1。