CN102533615A - 降解高分子量多环芳烃的海洋菌液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种协同降解高分子量多环芳烃HMW-PAHs的复合海洋菌液及其制备方法。该复合海洋菌液由一株解环菌PY97M和一株海杆菌D15-8W的发酵培养液混合而成，细胞浓度均为107～109CFU/mL。制备方法是将解环菌和海杆菌的种子液分别接入乙酸钠培养基或M8培养基，流加消泡剂消泡的条件下发酵培养，再将各发酵培养液混合即制得复合海洋菌液，再离心制成5倍浓缩液后于4℃保藏。该复合海洋菌液适合于较低环境温度的HMW-PAHs污染生物降解，比单一降解菌的菌液具有更高的降解率，具有明显的协同降解效应。本发明的复合海洋菌液应用于对包括HMW-PAHs在内的POPs污染的海岸线或滩涂的生物修复。

Description

降解高分子量多环芳烃的海洋菌液及其制备方法
技术领域
本发明属于海洋环境生物修复技术领域，具体涉及基于降解高分子量多环芳烃细菌间协同效应的一种复合海洋菌液及其制备方法。
背景技术
持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants，简称POPs)作为一种重要的海洋污染物，可在海洋环境中持久存在、并通过食物链累积、最终对海洋生物及人类健康造成有害影响。而高分子量多环芳烃(High Molecular Weight-Polycyclic AromaticHydrocarbons，简称HMW-PAHs)是其中最常见、最重要的一类POPs，其高毒、持久、生物积累、亲脂憎水、难降解的特点使其具有“三致”效应(致癌，致畸，致突变)和遗传毒性，对海洋生态环境及人类健康的危害极大。
研究表明，微生物降解是海洋环境中去除HM-PAHs的主要途径之一。自20世纪90年代在美国阿拉斯加溢油事故影响的岸滩成功应用生物修复以来，这种环境友好型的修复技术越来越引起科学家和各国政府的重视。
海洋专性解烃菌(the Obligate Hydrocarbonoclastic Bacteria，简称OHCB)是海洋环境中一类非常特殊的微生物，它们具有以下特性：一、高比表面积，可适应寡营养的海洋环境；二、偏好性降解烃类化合物，即以烃类为生长唯一碳源和能源，其中一些菌种甚至不能利用葡萄糖等简单有机碳源；三、高效广谱的催化活性，即对多种不同的烃类化合物具有较高的降解率，包括一些典型HM-PAHs。目前已经报道的这类细菌包括Alcanivorax(食烷菌属)、Cycloclasticus(解环菌属)、Marinobacter(海杆菌属)、Marinobacterium(海细菌属)、Neptunomonas、Oleispira(油螺旋菌属)、Thalassolituus等属的细菌。其中，解环菌属细菌是这类细菌中唯一可以降解HMW-PAHs的菌种，研究发现该细菌与其它菌种间可通过协同效应进一步提高对HMW-PAHs的降解率。因此，解环菌属细菌及其菌群在包括HMW-PAHs在内的POPs污染海洋环境修复中具有良好的应用前景。但解环菌属细菌具有迥异于陆源细菌的生长特性，很难分离到具有高活性的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解高分子量多环芳烃的海洋菌液及其制备方法，即能够降解HM-PAHs等POPs的复合海洋菌液及其制备方法，利用细菌间在降解多环芳烃过程中的协同效应，采用2种海洋细菌制备降解HMW-PAHs的复合海洋菌液，以应用于受损海洋环境的生物修复。
本发明涉及的海洋菌液中的菌种为2株海洋专性解烃菌，其中1株是解环菌属细菌PY97M(Cycloclasticus sp.PY97M)，另外1株是海杆菌属细菌D15-8W(Marinobactersp.)；上述2株细菌已分别于2010年11月30日、2011年12月29日保藏至中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.4339(菌株Cycloclasticus sp.PY97M)、CGMCCNo.5669(菌株Marinobactersp.D15-8W)。
本发明另一个方面涉及一种能够协同降解HM-PAHs的复合海洋菌液，包括有上述两株菌的活菌。
其中细菌的细胞浓度为107～109CFU/mL，制备复合菌液的培养基为乙酸钠培养基或M8培养基。
其中，乙酸钠培养基每升含22.79g NaCl，11.18g MgCl2·6H2O，3.98g Na2SO4，1.46gCaCl2·2H2O，1.30g TAPSO，0.72g KCl，0.27g NH4Cl，89.00mg Na2HPO4·7H2O，83.00mgNaBr，31.00mg NaHCO3，27.00mg H3BO3，24.00mg SrCl2·6H2O，2.60mg NaF，2.00mgFeCl2·4H2O，2g乙酸钠，pH7.6；用于菌株PY97M的培养。
M8培养基每升含22.79g NaCl，11.18g MgCl2·6H2O，3.98g Na2SO4，1.46gCaCl2·2H2O，1.30g TAPSO，0.72g KCl，0.27g NH4Cl，89.00mg Na2HPO4·7H2O，83.00mgNaBr，31.00mg NaHCO3，27.00mg H3BO3，24.00mg SrCl2·6H2O，2.60mg NaF，2.00mgFeCl2·4H2O，2g乙酸钠，0.5g蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5g马铃薯浸出粉，0.2g葡萄糖，0.2g蔗糖，0.05g苹果酸钠，0.05g柠檬酸三钠，0.05g酒石酸钾钠，pH7.8；用于菌株D15-8W的培养。
本发明的复合菌液用于降解HM-PAHs。
本发明的复合海洋菌液适合于较低环境温度的HM-PAHs污染生物降解，并且其降解速率较快，在3周后即可降解83.03％初始浓度为20mg/L的荧蒽或75.50％初始浓度为20mg/L的芘；该复合海洋菌液比单一降解菌菌液具有更高的HM-PAHs降解率。
附图说明
图1为本发明以GC-MS测定荧蒽降解率比较示意图。
图2为本发明以GC-MS测定芘降解率比较示意图。
其中：NC，不接种的阴性对照处理；PY97M、D15-8W，分别为单一菌株培养液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
一、菌株的信息
本发明涉及的海洋菌液中的菌种为2株海洋专性解烃菌，其中1株是解环菌属细菌(Cycloclasticus sp.PY97M)，另外1株是海杆菌属细菌(Marinobacter sp.D15-8W)；上述2株细菌已分别于2010年11月30日、2012年12月29日保藏至中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号分别为CGMCC No.4339(菌株Cycloclasticus sp.PY97M)、CGMCCNo.5669(菌株Marinobacter sp.D15-8W)。
1、菌株分离的地理位置信息
菌株PY97M分离自中国黄海沉积物(经纬度为36.6661N 121.9943E)；菌株D15-8W分离自中国南海沉积物(经纬度为19.9770N 111.4210E)。
2、菌株的分离过程
在100mL含有菲的海水培养基(菲浓度为0.2g/L)中加入2g沉积物样品，在25℃、150r/min、避光的条件下摇床培养1个月；然后将该培养物在相同培养基中连续转接2次，各培养2周。将第2次转接的培养物按照10倍系列用无菌海水进行梯度稀释，并且将合适的连续3个梯度涂布于M8培养基平板，于25℃倒置培养。将所有不同形态特征的单菌落用无菌牙签挑取并划线到新鲜的M8平板。重复划线1～2次以获得细菌纯培养。用牙签挑取纯培养单菌落接种到M8液体培养基于25℃过夜培养，获得菌株PY97M及D15-8W的对数生长后期培养物。
3、菌株的生理生化性质
菌株D15-8W为革兰氏阴性细菌，接触酶阳性，氧化酶阳性。其温度生长范围为20℃～35℃(最适为20℃)，NaCl浓度生长范围是0％～15％(最适为0.5％)，pH生长范围为pH5.5～pH9.5(最适为pH5.5)。该菌株可以利用正构烷烃(正十一烷、正十四烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正二十烷、正二十二烷、正二十四烷)作为生长碳源；还可以降解多环芳烃(萘、联苯、苊、芴、氧芴、菲、蒽、二苯并噻吩)，但不能利用2-甲基萘、芘、荧蒽作为生长碳源。
菌株PY97M为革兰氏阴性细菌。能够降解包括萘、2-甲基萘、2，6-二甲基萘、联苯、菲、芘、荧蒽在内的至少7种PAHs。采用GC-MS测定了对典型PAHs菲的降解率，发现它对初始浓度为0.2g/L的菲在10d后的降解率可达到99％。
二、上述的两株菌用于制备复合海洋菌液：
实施例1：协同降解HMW-PAHs的复合海洋菌液的制备步骤：
(1)制备种子液
配制乙酸钠培养基200mL用于菌株PY97M的培养，配制M8培养基200mL用于菌株D15-8W的培养。将超低温保藏的冻存菌种取200μL分别接入上述两种培养基，即菌株PY97M接种到200mL乙酸钠培养基，菌株D15-8W接种到200mL M8培养基，在25℃、150rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，首先活化菌种。
配制乙酸钠培养基10L用于菌株PY97M的培养，配制M8培养基10L用于菌株D15-8W的培养。将活化菌种按照2％的接种量分别接入上述两种培养基，即菌株PY97M接种到10L乙酸钠培养基，菌株D15-8W接种到10L M8培养基，在25℃、150rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，制备种子液。
(2)菌液发酵培养
配制乙酸钠培养基200L用于菌株PY97M的发酵罐培养，配制M8培养基200L用于菌株D15-8W的发酵罐培养；将种子液按照5％的接种量分别接入乙酸钠培养基或M8培养基，即菌株PY97M的种子液接种到200L乙酸钠培养基，菌株D15-8W的种子液接种到200L M8培养基。其发酵条件为通气量0.30m3/h，桨叶搅拌速度150rpm，发酵温度25℃。在消泡电极的控制下采取流加豆油的方式消泡，提高菌体发酵产率，停止发酵时细胞密度为108～109CFU/mL。
(3)将下罐后的2株海洋细菌的培养液均匀混合，以制备约400L降解HMW-PAHs复合海洋菌液；复合海洋菌液中解环菌PY97M，海杆菌D15-8W的细胞密度各自为107～109CFU/mL。用大容量4℃低温离心机在8000rpm、15min的条件下离心以制备5倍浓缩的降解HM-PAHs的复合海洋菌液浓缩液，便于运输和使用。
(4)将上述复合海洋菌液浓缩液置于4℃保藏。
本发明涉及的HM-PAHs降解效果的检验方法为：
(1)配制HM-PAHs降解效果检验培养基：每升含22.79g NaCl，11.18gMgCl2·6H2O，3.98g Na2SO4，1.46g CaCl2·2H2O，1.30g TAPSO，0.72gKCl，0.27gNH4Cl，89.00mg Na2HPO4·7H2O，83.00mg NaBr，31.00mg NaHCO3，27.00mg H3BO3，24.00mgSrCl2·6H2O，2.60mg NaF，2.00mg FeCl2·4H2O，20mg荧蒽或芘，pH7.6。
(2)HM-PAHs降解实验：将单一降解菌PY97M、D15-8W的菌液及海洋菌液均按照2％的比例分别接到100mL含有荧蒽或芘的培养基中；不接种微生物的处理作为阴性对照；上述每种处理设3个重复。在150rpm、20℃、避光的条件下培养3周。采用GC-MS分析比较单一降解菌培养液和海洋菌液对HM-PAHs的降解率。
(3)样品前处理：将降解后的样品及阴性对照在10000rpm的条件下离心10min去除细菌细胞，准确量取50mL正己烷萃取其中的残余HM-PAHs。从正己烷相准确量取2mL溶液，先用无水Na2SO4脱水，再用0.22μm耐有机溶剂滤膜过滤，最后移入GC样品瓶中并定容，用于GC-MS对降解后残留的HMW-PAHs进行分析测定。
(4)气相色谱(Agilent HP7890Plus)；质谱检测器(Agilent HP5975)；色谱柱为HP-5MS(30m×0.25mm×0.25 μm)毛细管柱；进样口温度：280℃；离子源温度：230℃。载气为氦气(99.999％)，流速1mL/min。程序升温：70℃保持0min，以20℃/min升至150℃，150℃保持2min，以7℃/min升至300℃，300℃保持2min。扫描模式：SIM模式；选择离子：m/z 202。进样：HP7683自动进样器，不分流进样1μL。数据采集和处理：HP3365化学工作站。
本发明的实验结果如下：
采用GC-MS法测定了生物降解后培养基中荧蒽或芘的残留量，并分别计算其降解率。如图1所示，复合海洋菌液的处理相对于降解菌PY97M菌液、D15-8W菌液的处理具有更高的荧蒽降解率，它们对荧蒽的降解率分别为83.03％、65.21％和3.09％。如图2所示，复合海洋菌液的处理相对于降解菌PY97M菌液、D15-8W菌液的处理具有更高的芘降解率，它们对芘的降解率分别为75.50％、63.43％和6.50％。
综上所述，本发明的协同降解HM-PAHs的复合海洋菌液特别用于对包括HM-PAHs在内的POPs污染的海岸线或滩涂地带进行生物修复。
实施例2：
2010年7月16日，大连新港码头油库发生爆炸事故，从油罐中泄露的大量原油造成了至少50平方公里海域的污染。事故发生后，尽管海上清污工作已在两个星期内基本完成，但部分岸滩油污仍无法彻底清除，给当地海洋生态环境造成严重危害。对溢油样品的气相色谱分析也发现岸滩上的原油虽然已开始风化，但分子量较大组分的风化程度较低，特别是其中有致癌作用的HM-PAHs仍未明显降解。
对于一些HM-PAHs含量较高的原油，需要添加本发明专利中所描述的具有高效HM-PAHs降解能力的复合降解菌液才能够加快其生物降解过程，减少生态毒性。具体实施流程如下：
(1)制备种子液
配制乙酸钠培养基200mL用于菌株PY97M的培养，配制M8培养基200mL用于菌株D15-8W的培养。将超低温保藏的冻存菌种取200μL分别接入上述两种培养基，即菌株PY97M接种到200mL乙酸钠培养基，菌株D15-8W接种到200mL M8培养基，在25℃、150rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，首先活化菌种。
配制乙酸钠培养基10L用于菌株PY97M的培养，配制M8培养基10L用于菌株D15-8W的培养。将活化菌种按照2％的接种量分别接入上述两种培养基，即菌株PY97M接种到10L乙酸钠培养基，菌株D15-8W接种到10L M8培养基，在25℃、150rpm、避光的条件下培养至对数生长后期，制备种子液。
(2)菌液发酵培养
配制乙酸钠培养基200L用于菌株PY97M的发酵罐培养，配制M8培养基200L用于菌株D15-8W的发酵罐培养；将种子液按照5％的接种量分别接入乙酸钠培养基或M8培养基，即菌株PY97M的种子液接种到200L乙酸钠培养基，菌株D15-8W的种子液接种到200L M8培养基。其发酵条件为通气量0.30m3/h，桨叶搅拌速度150rpm，发酵温度25℃。在消泡电极的控制下采取流加豆油的方式消泡，提高菌体发酵产率，停止发酵时细胞密度为108～109CFU/mL。
(3)将下罐后的2株海洋细菌的培养液均匀混合，以制备约400L降解HMW-PAHs复合海洋菌液；复合海洋菌液中解环菌PY97M，海杆菌D15-8W的细胞密度各自为107～109CFU/mL。用大容量4℃低温离心机在8000rpm、15min的条件下离心以制备5倍浓缩的降解HMW-PAHs的复合海洋菌液浓缩液80L，便于运输和使用。
(4)将上述复合海洋菌液浓缩液置于4℃保藏。
(5)喷洒复苏菌粉溶液及营养盐
在大连湾内一处溢油污染砾石质岸滩(其周边海域为养殖区，禁止使用化学消油剂)开展生物修复工作，现场实验区域约为100m2(平均每m2溢油污染岸滩喷洒2L～10L复合海洋菌液)。每天退潮后，将复合海洋菌液用喷雾器喷洒到岸滩潮间带及潮上带的油污砾石表面，然后用喷壶将含有氮、磷的营养盐溶液喷洒到相同区域，并施用一定剂量的缓释肥。生物修复处理的周期为2个月，频率为第一个月每周一次，第二个月每两周一次，每次连续喷洒2天。
(6)采样及生物修复效果评价
需采集岸滩砾石样品进行GC-MS分析以判定生物修复效果。采样在每次生物修复处理后进行。取岸滩砾石样品，使用锡箔纸包裹，低温保存。样品经前处理后，萃取砾石样品中的残留油污，用GC-MS测定生物修复过程中HMW-PAHs等石油烃组分随时间的变化情况，对复合海洋菌液的生物修复效果进行评价。经连续2个月的生物修复处理后，复合海洋菌液的处理相对于自然风化处理对芘、荧蒽等HMW-PAHs的降解率预计可以提高20.00％～60.00％。
结果表明本发明筛选的菌株和复合菌液具有很好的降解HMW-PAHs的功效。

Claims (9)

1.一株解环菌属细菌Cycloclasticus sp.，其保藏编号为CGMCC No.4339。
2.一株海杆菌属细菌Marinobacter sp.，其保藏编号为CGMCC No.5669。
3.一种复合菌液，包括有权利要求1和权利要求2所述菌株的活菌。
4.如权利要求3所述的复合菌液，其特征在于所述菌的细胞浓度为107～109CFU/mL。
5.权利要求3所述的复合菌液，其特征在于，制备该菌液所用的培养基为乙酸钠培养基或M8培养基。
6.如权利要求5所述的复合菌液，其特征在于，所述的乙酸钠培养基每升含如下组分：
22.79g NaCl，11.18g MgCl2·6H2O，3.98g Na2SO4，1.46g CaCl2·2H2O，1.30gTAPSO，0.72g KCl，0.27g NH4Cl，89.00mg Na2HPO4·7H2O，83.00mg NaBr，31.00mg NaHCO3，27.00mg H3BO3，24.00mg SrCl2·6H2O，2.60mg NaF，2.00mgFeCl2·4H2O，2g乙酸钠，pH7.6。
7.如权利要求5所述的复合菌液，其特征在于，所述的M8培养基每升含如下组分：
22.79g NaCl，11.18g MgCl2·6H2O，3.98g Na2SO4，1.46g CaCl2·2H2O，1.30gTAPSO，0.72g KCl，0.27g NH4Cl，89.00mg Na2HPO4·7H2O，83.00mg NaBr，31.00mg NaHCO3，27.00mg H3BO3，24.00mg SrCl2·6H2O，2.60mg NaF，2.00mgFeCl2·4H2O，2g乙酸钠，0.5g蛋白胨，0.5g酵母提取物，0.5g马铃薯浸出粉，0.2g葡萄糖，0.2g蔗糖，0.05g苹果酸钠，0.05g柠檬酸三钠，0.05g酒石酸钾钠，pH7.8。
8.权利要求3所述的复合菌液用于降解高分子量多环芳烃。
9.如权利要求8所述的降解高分子量多环芳烃，是对海岸线或滩涂地带的高分子量多环芳烃进行降解。
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