KR20160049661A - 유기인계 농약을 분해하는 신규 균주 - Google Patents

유기인계 농약을 분해하는 신규 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주를 제공하고 상기 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 분해용 조성물을 제공한다.

Description

유기인계 농약을 분해하는 신규 균주{Novel strain degrading organophosphorus pesticides}
본 발명은 유기인계 농약을 분해하는 신규 균주에 관한 것이다.
1930년대 슈레더(Schrader)가 살충성의 유기인 화합물을 발견한 이래, 1960년대에 유기염소계 농약의 사용이 금지됨에 따라, 생물학적 역가가 높은 유기인계 농약(organophosphorous pesticide)의 개발이 활발하게 이루어졌다. 유기인계 농약은 인(P) 원자 주위의 구조에 따라, 포스페이트(phosphate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로티올레이트(phosphorothiolate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포네이트(phosphonate), 포스포노티오에이트(phosphonothioate), 포스포노디티오에이트(phosphonodithioate), 포스포로티올로티오네이트(phosphorothiolothinate), 및 피로포스포라미드 (pyrophosphoramide) 류 등으로 분류되고, 현재 사용 중인 농약의 대부분을 차지하고 있다.
유기인계 농약은 지속성이 적기 때문에 많은 양이 사용되므로 이에 따른 지하수 및 토양 침투 문제가 심각한 수준인 것으로 우려되고 있다. 특히, 사람과 가축에 대한 맹독성 약제가 많으며 매년 3백만 명이 유기인계 농약의 독성에 중독되고 있으며 그 중 20만 명이 사망한 것으로 보고된 바 있다(WHO 보고서).
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여 연구한 결과, 토양으로부터 유기인계 농약을 분해하는 신규 균주를 분리 및 동정하였으며 본 발명에 따른 균주가 유기인계 농약에 대한 친환경적이고 단기간 내 탁월한 분해 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
일본 등록 특허 제5160443호
본 발명의 목적은 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주, 이의 배양액으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주, 이의 배양액으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유효성분을 유기인계 농약으로 오염된 환경에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 분해 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주, 이의 배양액으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 나프탈렌 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주를 제공한다.
본 발명은 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주, 이의 배양액으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 분해용 조성물을 제공한다.
상기 ‘배양액’이란, 액체 배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미하며, 상기 배양액에는 본 발명에 따른 균주가 포함되어 있다.
상기 유기인계(organophosphorous) 농약은 대부분 에스터(ester)형이며 비교적 안정성이 낮고 가수분해되기 쉬운 화합물로서 특히 알칼리에 분해가 잘되며 가수분해 정도는 약제에 따라 다르다. 증기압은 낮고 휘발성도 낮은 특성이 있으며, 동식물체 내에서 산화되어 독성이 더욱 강한 옥손화합물로 변하여 살충효과를 증진시키는 것으로 알려진 바 있다.
상기 유기인계 농약은 에토프로포스(Ethoprophos), 카두사포스(Cadusafos), 클로르피리포스(Chlorpyrifos)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 에토프로포스(Ethoprophos)란, ‘모캡(Mocap)’ ‘프로포스(Prophos)’라는 이름으로 개발된 디티오유기인계 살충제로서 한국에서는 ‘에토프’라는 품목명으로 고시되어 있다. 투명한 담황색 액체로서 끓는점은 86~91 ℃/0.2 mmHg이고 물에는 750 mg/ℓ 정도 녹으나 대부분의 유기용매에는 잘 녹는다. 100 ℃까지의 물에는 안정하나 알칼리(25 ℃)에는 급격히 가수분해된다. 비침투성이며 비훈증성 선충방제제로서 또는 토양살충제로서의 효과를 보이며 한국에서는 벼의 심고선충·흰등멸구·벼멸구 방제약제로 쓰이고 있다. 쥐에 대한 급성 경구독성 LD50은 62 mg/kg, 토끼에 대한 급성 경피독성 LD50은 26 mg/kg으로서 포유동물에 대한 독성은 다소 높은 편이며 어패류에 대한 독성도 매우 강하므로 양어장이라든가 또는 하천에 약액에 흘러들어갈 경우 환경에 치명적인 영향을 미친다.
본 발명은 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주, 이의 배양액으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유효성분을 유기인계 농약으로 오염된 환경에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 분해 방법을 제공한다.
상기 유기인계 농약으로 오염된 환경은 농약이 살포된 곳이라면 모두 포함될 수 있으며 특히 토양, 수변일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주, 이의 배양액으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 나프탈렌 분해용 조성물을 제공한다.
기존의 유기인계 농약 분해 미생물은 Pseudomonas sp., Flavobacterium sp. ATCC27551, Burkholderia sp., Arthrobacter sp.와 곰팡이류(Penicillin sp., Aspergillus sp.) 및 사상균(Trichoderma sp.)에서 보고된 바 있다. 그러나, 본 발명에서 제공하는 균주는 Sphingobium 속의 신종이며, 에토프로포스를 분해하는 기 보고된 다른 어떤 균주보다 강력한 에토프로포스 분해 효과가 있을 뿐만 아니라(도 4), 나프탈렌 분해 효과를 나타냄을 확인하였다(도 3).
본 발명에 따른 신규 균주인 스핑고비움(Sphingobium) EP60837는 인축의 중추신경계를 파괴하는 유기인계 농약을 신속히 분해하는 효과가 있으며 이와 같은 효과가 1주일 이상 지속되므로, 토양 또는 수변 등에 과다 축적된 유기인계열의 치명적 살충제 및 생화학 독극물질을 제거하는 데 매우 우수한 효과가 있다.
도 1은 토양추출배지에서 스핑고비움 EP60837 균주에 의한 에토프로포스의 시간별 분해 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 스핑고비움 EP60837 균주에 의한 다양한 유기인계 농약의 분해율을 나타낸 도이다.
도 3은 스핑고비움 EP60837 균주에 의한 다환계 방향족 화합물의 분해율을 나타낸 도이다.
도 4는 에토프로포스 과다오염 토양에서 스핑고비움 EP60837 균주에 의한 에토프로포스의 시간별 분해 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 스핑고비움 EP60837 균주의 16S rDNA 분석에 의한 계통분류도이다.
도 6은 스핑고비움 EP60837 균주의 16S rDNA 염기서열이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 유기인계 농약 분해능 균주 선별
유기인계 농약을 분해하는 균주를 선별하기 위하여, 유기인계 농약 중 하나인 에토프로포스 입제를 60g/3.3m2의 농도로(일반 권장량의 10배) 토양에 처리한 후 90일 동안 15일 간격으로 각 토양 시료를 채취하여 멸균 증류수로 현탁한 뒤 R2A배지에 희석 도말하여 그로부터 저 영양미생물을 분리하였다. 확보된 총 350여 주는 16S rRNA분석으로 동정하고, 이의 저 영양 미생물자원으로부터 문헌 검색에 의해 생물복구(Bioremediation)능이 있다고 예상되는 균주 20여 주들과 SEB(soil-extract broth) 및 에토프로포스 100ppm 첨가 액체배지에서 자랄 수 있는 균주 20여 주들을 대상으로 LC분석(liquid chromatography)을 수행하였다. 그 결과, 균을 접종하지 않은 대조구와 비교하여 균 처리 후 60일째 되는 토양에서 에토프로포스의 분해가 우수한 균주 EP60837을 선발하였다.
< 실시예 2> 배지 내 에토프로포스에 대한 분해능 분석
에토프로포스를 분해하는 실질적인 미생물을 선발하기 위한 1차 전제 조건은 연구용 배지가 아닌 토양의 추출액만으로 성장해야 하는 것이며 특히, 과량의 에토프로포스가 첨가된 상황에서도 생존과 성장이 가능하여야 한다. 이와 같은 특성을 구별하여 균주의 에토프로포스 분해능을 분석하기 위하여 토양추출액체배지(soil-extract broth, SEB)를 조제하였다. SEB를 제조하기 위하여, 토양 500g에 증류수 500ml를 혼합하여 멸균한 후, 1000rpm으로 5분 원심분리시켜 상층액을 와트만(Whatman no.4)으로 1차 여과하였다. 이 여액을 다시 0.22um의 밀리포어(Millipore) 일회용 여과기로 제균하고 다시 재멸균하였다. 이를 기본배지로 하여 에토프로포스가 100ppm이 되도록 첨가하였다. 대조구는 균을 접종하지 않았고, 시험구는 하루 전 배양된 EP60837 균주를 10% 접종하여 28℃에서 진탕배양하면서 시간별로 배지를 채취하였다. 채취된 각 배양액은 배양액과 헥세인(Hexane)을 1:2 비율로 분액 깔때기에 넣어 40분 동안 수직 왕복식 진탕기를 이용하여 혼합한 후 정치하여 헥세인층만 분리하고 회전 감압 농축기로 농축하여 아세토나이트릴(Acetonitrile)에 최종 용해하였다. 에토프로포스의 잔류량은 FPLC(Fast protein liquid chromatography, 파마시아 AKTA)로 분석하였다. 사용한 칼럼은 SUPELCOSIL LC-18(25cm×4.6mm, 5um)(SUPELCO)이며 용출 용매는 60% 아세토나이트릴이고 232nm에서 탐지하였다. 분해율은 대조구 에토프로포스 피크(peak)의 보유 시간(retention time)과 면적을 기준으로 계산하여 정량하여 %로 표시하였다.
그 결과, 도 1과 같이 EP60837 균주는 에토프로포스 100ppm의 SEB에서 배양 후 5시간 이내에 에토프로포스를 95% 이상 분해하여 대조구 또는 스핑고비움 허비시도보런스(Sphingobium herbicidovorans) 종의 표준균주 MH(KACC12333)에 비해 우수한 에토프로포스 분해능을 나타내었다.
< 실시예 3> 농약 및 다환방향족 화합물에 대한 분해능 분석
EP60837 균주가 다양한 유기인계 살충제에 대해서도 분해 효과가 있는지 조사하기 위하여, 실시예 2와 동일한 조건에서 에토프로포스 대신 농약 및 다환방향족 화합물을 투여하여 분해능을 분석하였다.
그 결과, 농약에 대한 분해능은 도 2와 같이 에토프로포스 외에는 현저한 분해 효과가 나타나지 않았으며, 페니트로티온의 경우 배양 1일 후 약 27%정도의 분해율을 보였으나 이후 4일 연장배양 시에는 더 분해되지 않았다. 따라서, 본 발명의 균주는 유기인계 농약 중 에토프로포스에만 선택적으로 분해가 되는 것으로 확인되었고 화학구조상에서 알킬기가 R=CH2 또는 R=CH-CH3인 카두사포스(cadusafos)에는 분해능이 나타날 것으로 예상되나 이외의 농약은 핵심구조가 일부 상이하므로 분해능이 나타나지 않을 것으로 분석되었다.
또한, 다환방향족 화합물에 대한 분해능은 도 3과 같이, 벤젠 링이 3개 이상 결합된 화합물의 경우 그 분해 효과가 미미하였으나, 비교적 구조가 간단한 이환족 나프탈렌에는 4일간 배양 시 90%의 감소효과가 나타나는 것을 확인하였다.
< 실시예 4> 토양 내 에토프로포스에 대한 분해능 분석
<4-1> 토양 전처리 및 균체 배양
실험에 사용된 토양은 10 그물망(mesh)으로 체질하여 그 중 5kg을 칭량하였고, 멸균백에 담아 121℃에서 30분간 멸균한 후 실온에서 냉각하여 사용하였다. EP60837 균주를 멸균된 R2A 배지에 접종하여 흡광도(optical density)가 0.5 이상이 되도록 28℃에서 배양하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 EP60837 균주는 72시간 동안 400mL 배양하였고, 균수는 4.1×1010 CFU/mL로 나타났다. 총 균수는 R2A 아가 플레이트에 균은 102~108까지 희석하여 도말하여 균수를 측정하였다.
<4-2> 에토프로포스 및 균체 토양 처리
멸균된 토양 5kg에 유효농도가 5%인 에토프로포스를 20g 넣고 균일하게 혼합하여 최종 에토프로포스의 농도가 200ppm이 되도록 첨가하였다. 이를 200g씩 5개 칭량하고 각각 화분틀에 담아 시간별로 잔류량 분석 대조구로 하였다. 대조구를 제외한 토양 4kg에 EP60837 균주가 접종된 R2A 배지를 400mL 첨가하고, 추가로 멸균증류수를 200mL 첨가하여 골고루 혼합하였다. 대조구와 동일하게 EP60837 균주가 처리된 토양을 200g씩 5개 칭량하여 시간별 잔류량 분석 시험구로 하였다. 즉시 실험에 사용한 대조구 및 실험구를 제외하고 각각 1일, 3일, 5일, 7일 간격으로 회수하여 에토프로포스의 잔류량을 분석하였다. 잔류량 분석 시료는 3회 반복하여 분석하였으며, 각 시간별로 토양을 회수하여 50g씩 칭량한 후 아세톤(acetone)을 100mL 넣은 상태로 4℃에 보관한 후 실험에 사용하였다.
<4-3> 토양에서 에토프로포스 추출
토양에서 에토프로포스를 추출하기 위하여, 토양 50g을 300mL 캡이 있는 삼각플라스크에 칭량하고 아세톤 100mL를 가한 뒤 회전진탕기에 1시간 동안 진탕 후 추출하였다. 추출물은 약 5g의 셀라이트(celite) 545가 깔린 bchner 깔때기상에서 감압여과하고 이때 50mL 아세톤으로 용기 및 잔사를 씻어 앞의 여액과 합하였다. 이 여액을 1,000mL 분별깔때기(separatory funnel)에 옮겨 증류수 450mL와 포화식염수 50mL에 가하고 70mL 다이클로로메테인(dichloromethane)으로 2회 분배하였다. 이 다이클로로메테인층을 50g의 무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate)에 통과시켜 탈수하고 40℃ 수조에서 감압농축한 후 5mL n-헥세인 : 아세톤(80:20, v/v)에 재용해하여 정제과정에 사용하였다. 에트로프로포스 정제는 플로리실(Florisil) 5g과 무수황산나트륨(1cm 높이)를 차례로 건식 충전한 후 50mL의 n-헥세인으로 씻어 내렸다. 황산나트륨 층이 노출되기 직전 5mL n-헥세인 : 아세톤(80:20, v/v)에 용해된 시료를 스파이크(spiking)하였다. 이후, 50 mL n-헥세인 : 다이클로로메테인 : 아세토나이트릴(49.65:50:0.35, v/v/v)으로 용출시켜 그 용출액을 흘려 버린 후, 100 mL n-헥세인 : 다이클로로메테인 : 아세토나이트릴(45:50:5, v/v/v)으로 용출시켜 그 용출액을 분취하여 감압농축하였다. 농축 직후 잔사를 아세톤 2mL에 재용해하였다.
<4-4> 에토프로포스 정량분석
상기에서 조제된 시료는 정량분석을 위해 GC분석(Gas chromatography, Agilent 7890A, U.S.A.)를 사용하였고 전자포획검출기(Electron Capture Detector, -ECD)로 탐지하였으며, 사용한 칼럼은 DB-1701(30m(L) 250(I.D.), 0.25(film thickness))이었다. 분석조건은 주입부 온도(Injection port Temp.)가 250℃, 탐지부 온도(Detector block Temp.)가 300℃, 칼럼 오븐 온도(Column oven Temp.)가 순차적으로 150℃, 1분간 10℃, 3분간 210℃, 1분간 20℃, 4분간 250℃이었다. 또한, 유속(Flow rate)에서 운반기체(Carrier gas)인 질소를 1.0mL/min 속도로 흘려주었으며, 모드 분리(Split mode)는 스플리트(split) (10:1), 주입용량(injection volume)은 1μl이었다.
<4-5> 검량선 작성
에토프로포스 기준(99.0%) 50.5mg을 아세톤 50 mL에 용해하여 1,000mg/kg의 저장액(stock solution)을 만들었다. 이 저장액을 아세톤으로 희석하여 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0mg/kg의 상용 표준용액(working standard solution)을 만든 후 각각 1μl씩 GC분석기/전자포획검출기에 주입하여 나타난 크로마토그램상의 피크 면적을 기준으로 검량선을 작성하였다. 기기의 검출한계는 0.1ng(0.004ppm)이었다.
그 결과 도 4와 같이, 에토프로포스를 처리한 대조구 토양의 경우 균 처리를 하지 않았음에도 시간이 지남에 따라 에토프로포스가 자연적으로 분해되었고, 처리 후 7일에는 최종적으로 18%정도 감소하였다. 반면, EP60837 균주를 접종한 토양은 균을 접종한 직후 분석 시에도, 대조구와 비교하여 에토프로포스가 28% 감소하였다. EP60837 균주를 접종 후 1일 경과 시 에토프르포스는 약 62% 감소하였고 3일 경과 시에는 89%로, 3일 동안 에토프로포스가 급격히 감소한 것으로 나타났다. 그 후에도 시간이 지남에 따라 에토프로포스가 계속 감소하여 7일 후에는 98%가 감소한 것을 확인하였다. 이는 에토프로포스로 오염된 토양이나 수변 환경에서 본 발명의 균주 배양액을 살포했을 때 단기간 내에 생분해하는 능력이 실제로 있음을 나타내는 결과이다.
또한 에토프로포스를 처리한 토양의 총 균수를 측정한 결과, EP60837 균주를 접종한 토양은 접종 직후 균수가 2.3×108 CFU/g으로 나타났으며, 7일 경과 후에도 1.7×108 CFU/g으로 별다른 감소가 관찰되지 않았다. EP60837 균주를 접종하지 않은 대조구 토양의 경우 초기 균수는 5.4×105 CFU/g이었고, 시간이 지남에 따라 균 밀도의 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
< 실시예 5> 균주의 분자생물학적 동정 및 16S rDNA 에 의한 근연관계 분석
선별된 EP60837 균주를 동정하기 위해 분자생물학적 방법과 생화학적 분석을 병행하여 실시하였다. 구체적으로, 우선 분자생물학적 분류, 동정을 위해 선발 균주의 총 DNA를 분리하였으며, 이로부터 16S rDNA 유전자(서열번호 1, 도 6)를 증폭하기 위하여 fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3': 서열번호 2) 및 rP2(5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3': 서열번호 3) 프라이머를 이용하여(Zhu et al. 1993, Nucleic Acids Res 21: 5279-5280) 94℃에서 5분간 변성시킨 뒤 94℃에서 1분, 30℃에서 1분 30초, 72℃에서 2분의 순서에 따른 34 사이클로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물 중 1.5 ~ 1.6kb에 해당하는 단편을 0.8% 아가로즈겔, 0.5×TAE 버퍼에서 100V로 30분간 전기영동 후 브롬화 에티듐(ethidium bromide, EtBr)용액에서 15분간 염색하여 UV 램프에서 확인하고 Qiagen PCR 정제 키트(Purification Kit)(Qiagen)로 정제하였다. 분리된 DNA는 사용자 설명서에 따라 PCR 2.1 Topo TA 벡터 시스템(Vector system)(Invitrogen)에 서브클로닝(subcloning)하였다. 염기서열 분석은 ABI 3700(Perkin Elmer, Co.) 기기를 이용하였으며, 준비된 클론(clone)으로부터 주형벡터(template vector) 내부에 포함된 M13 정방향 프라이머(5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3': 서열번호 4), M13 역방향 프라이머(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3': 서열번호 5)를 제작한 뒤, Big Dye 2, 5x 완충액 1, 프라이머(1.6pmol/) 1, 주형 (250~500ng) 6을 PCR 튜브에 넣고 혼합한 후 PCR(ABI9700)하였다. PCR은 95℃에서 10분간 정치 후 96℃에서 10초간 변성(denaturation), 50℃에서 5초간 어닐링(annealing), 60℃에서 4분간 연장(extension)하는 조건으로 25 사이클을 수행하고, 72℃에서 10분간 추가 연장 후, 4℃에 보관하였다. 상기 반응물 중 10μl를 1.5 EP튜브에 옮기고 3M 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 7.6) 1μl 와 얼음냉각 한 100% 에탄올 25μl를 넣고 얼음에 20분간 방치 후, 13,000rpm에서 15분 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 상등액을 버리고 70% 냉 에탄올 100μl로 두 번 세척한 후 상온에서 건조시켰다. 이후 TSR(template suppression reagent) 20~25μl로 재현탁하여 95℃에서 2분간 반응시키고 얼음에서 식힌 뒤, 자동염기서열분석을 수행하였다.
염기서열의 상동성을 비교하고 계통분류도를 작성하기 위하여 비교염기서열을 EzTaxon-e(Kim et al. 2012 Int J Syst Evol Microbiol 62: 716721) 및 DDBJ/NCBI/GenBank DB로부터 얻었다. 비교균주들과의 염기서열의 상동성은 EzTaxon-e 프로그램을 이용하여 산출하였다. 얻어진 염기서열들은 SINA 프로그램을 이용하여(Pruesse et al. 2012 Bioinformatics 28: 1823-1829)을 이용하여 병렬로 정렬하였고, MEGA version 5.0(Tamura et al. 2011 Mol Biol Evol 28: 2731-2739)의 maximum likelihood 알고리즘(Felsenstein. 1981 J Mol Evol 17: 368-376)에 의거하여 본 발명 균주의 계통분류학적 위치를 결정하였다.
도 5의 계통분류도에 따르면, 본 발명의 균주는 스핑고비움 속으로 분류되지만 이미 보고된 스핑고비움 속의 다른 종들과는 뚜렷이 구분되는 독립적인 위치를 차지한다. 특히 1996년 스위스 연방기술연구소 지퍼 박사팀(Appl. Environ. Microbiol. 62: 4318-4322)이 최초로 보고한 후에 2001년 일본발효연구소 타케우치 박사팀이 재명명(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 51: 1405-1417)한 스핑고비움 허비시도보런스(Sphingobium herbicidovorans) 종의 표준균주 Sphingobium herbicidovorans MH(KACC12333)와 가장 높은 16S rRNA 염기서열 상동성을 나타내었다. 염기서열 상동성과 계통분류도를 종합하여 볼 때 본 발명에 따른 균주는 스핑고비움 속의 새로운 종이거나 동일 종에 속한다 할지라도 유전적으로는 매우 다른 균주인 것으로 판단되었다.
이들 균주들의 생리생화학적 특성비교를 위해 EP60837 균주 및 스핑고비움 허비시도보런스(Sphingobium herbicidovorans) 종의 표준균주 Sphingobium herbicidovorans MH(KACC12333)에 대해 API 키트(bioMrieux) 실험을 수행하였다.
그 결과, 표 1과 같이 EP60837 균주와 비교균주인 Sphingobium herbicidovorans MH(KACC12333)는 질산환원능, 탄소원 기질의 이용성, 효소생산능 등에서 많은 차이를 나타내어, 생리생화학 특성에 있어서도 뚜렷이 구분됨을 확인하였다. 따라서 이를 국립농업과학원 미생물자원센터(KACC)에 2014년 6월 13일자로 기탁하고 기탁번호 KACC91959P를 부여받았다.
Figure pat00001
국립농업과학원 미생물자원센터 KACC91959 20140613
<110> Republic of Korea <120> Novel strain degrading organophosphorus pesticides <130> P14R12D0960 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1308 <212> DNA <213> 16S rDNA sequence of Sphingobium EP60837 <400> 1 ctggctcaga acgaacgctg gcggcatgcc taatacatgc aagtcgaacg agatcttcgg 60 atctagtggc gcacgggtgc gtaacgcgtg ggaatctgcc cttgggttcg gaataacagt 120 tggaaacgac tgctaatacc ggatgatgac gtaagtccaa agatttatcg cccaaggatg 180 agcccgcgta ggattagcta gttggtaagg taaaggctta ccaaggcgac gatccttagc 240 tggtctgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300 gcagcagtag ggaatattgg acaatggggg caaccctgat ccagcaatgc cgcgtgagtg 360 atgaaggcct tagggttgta aagctctttt acccgggatg ataatgacag taccgggaga 420 ataagccccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggggc tagcgttgtt 480 cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg cggcgattta agtcagaggt gaaagcccgg 540 ggctcaaccc cggaatagcc tttgagactg gattgcttga acatcggaga ggtgagtgga 600 attccgagtg tagaggtgaa attcgtagat attcggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 660 tcactggacg attgttgacg ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 720 cctggtagtc cacgccgtaa acgatgataa ctagctgctg gggtgcatgg catttcagtg 780 gcgcagctaa cgcattaagt tatccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa 840 ggaattgacg ggggcctgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca 900 gaaccttacc aacgtttgac atccctatcg cggatcgtgg agacactttc cttcagttcg 960 gctggatagg tgacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1020 aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgcctt tagttgccat catttagttg ggtactctaa 1080 aggaaccgcc ggtgataagc cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcct catggccctt 1140 acgcgttggg ctacacacgt gctacaatgg cgactacagt gggcagcgac catgcgagtg 1200 gaagctaatc tccaaaagtc gtctcagttc ggatcgttct ctgcaactcg agagcgtgaa 1260 ggcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcgggt gaatacgt 1308 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> fD1 primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> rP2 primer <400> 3 ggctaccttg ttacgactt 19 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> M13 primer_forward <400> 4 gttttcccag tcacgac 17 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> M13 primer_reverse <400> 5 caggaaacag ctatgac 17

Claims (6)

  1. 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주.
  2. 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주, 이의 배양액으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 분해용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유기인계 농약은 에토프로포스인 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 분해용 조성물.
  4. 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주, 이의 배양액으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유효성분을 유기인계 농약으로 오염된 환경에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 분해 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유기인계 농약으로 오염된 환경은 토양, 수변으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 유기인계 농약 분해 방법.
  6. 기탁번호 KACC91959P로 기탁된 스핑고비움(Sphingobium) EP60837 균주, 이의 배양액으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 나프탈렌 분해용 조성물.
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