JPWO2008062557A1 - 塩素化、メチルチオ化及びメトキシ化トリアジン系農薬を資化分解可能な新規微生物 - Google Patents

Abstract

農薬などとして多用されているメチルチオ化トリアジン系化合物、特にシメトリン、ジメタメトリン、又はプロメトリン、塩素化トリアジン系化合物、特にシマジン、アトラジン、又はプロパジン、及びメトキシ化トリアジン系化合物、特にシメトン、アトラトン、プロメトン等を分解することが可能な新規微生物と当該微生物を用いたメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物の分解法を提供すること。メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する新規細菌ノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２株、及び、当該細菌を用いてメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解する方法、特にシメトリン、ジメタメトリン、プロメトリン、シマジン、アトラジン、プロパジン、シメトン、アトラトン、及び／又はプロメトンなどを分解する方法。

Description

本発明は、メチルチオ化トリアジン系化合物（シメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、及びテルブトリン）、塩素化トリアジン系化合物（シマジン、アトラジン、プロパジン、及びテルブチラジン）、及びメトキシ化トリアジン系化合物（シメトン、アトラトン、及びプロメトン）からなる群から選ばれる少なくとも１種の物質を分解する能力を有する新規な微生物、より詳細にはノカルディオイデス属に属する微生物に関し、また当該微生物又は当該微生物を含む複合微生物系を用いて上記トリアジン系化合物を分解する方法に関する。

近代農業において農薬は、収量の維持・安定化及び労務軽減、生産コスト削減のために必要不可欠である。しかしながら使用された農薬の一部が河川・湖沼・地下水・用水等に流出している事実が明らかとなり、一般環境中の生物への影響が懸念されている。土壌中には多種多様な微生物が生息しており、これらの中には、農薬等の有機化学物質を分解して無害化する能力を有するものが存在する。しかしこれら分解菌の自然環境中での存在密度は低く、また一様に分布するものでもないため、有機汚染物質の環境中での蓄積や拡散を未然に防ぐまでには至らないのが通常である。そこでこのような分解菌を土壌中から選択的に集積且つ単離した後、農薬等の有機汚染物質を分解する方法、所謂バイオレメディエーション法が有効な手段であると考えられる。

トリアジン系化合物は長年にわたり、農薬や消泡剤、染料等として世界中で多用されてきているが、現在では環境汚染物質として問題となっている。塩素化トリアジン系農薬であるアトラジンに関しては多くの微生物がこれを分解することが知られている（特許文献１）。一方で、シメトリンを始めとしたメチルチオ化トリアジン系農薬、及びシメトンを始めとしたメトキシ化トリアジン系農薬はより難分解性であり、微生物によるメチルチオ化トリアジン及びメトキシ化トリアジンの分解に関する報告は限られている。ＣｏｏｋとＨｕｔｔｅｒは、アメトリンあるいはプロメトリンを硫黄源として与えた合成培地を用いて土壌から分解菌を集積し、最終的に増殖速度の速い３種類の細菌を選抜したことを報告している（非特許文献１）。そのうち２種はアメトリンを、他の１種はアメトリンとプロメトリンを分解して脱メチルチオ化した代謝物を生じさせた。しかしながら、これらの菌株について菌学的な検討は報告されていない。また、Ｓｔｒｏｎｇらは高濃度のアトラジンで汚染したゴミ集積場からアトラジン分解能を有するアルスロバクター アウレッセンス ＴＣ１株を単離し、アルスロバクター アウレッセンス ＴＣ１株がアメトリンあるいはプロメトリンを唯一の窒素源として含む培地にて生育したことを示したことを報告している（非特許文献２）。また、Ｓｈａｐｉｒらはアルスロバクター アウレッセンス ＴＣ１株由来のアトラジン分解酵素遺伝子を大腸菌に組み込み、発現させた酵素を用いてアメトリンの分解を行っている（非特許文献３）。Ｔｏｐｐらはノカルディオイデス ｓｐ． Ｃ１９０株の菌体あるいは菌体抽出物を、シメトリン、アメトリン、プロメトリンあるいはテルブトリンを含む溶液に分散させ、嫌気条件下にて保温静置したところ、これらを分解して脱メチルチオ化した代謝物が認められたことを報告している（非特許文献４）。また、Ｓｅｆｆｅｒｎｉｃｋらはクラビバクター ミシガネンシス ＡＴＺ１株の菌体抽出物でアメトリンを脱メチルチオ化したことを報告している（非特許文献５）。

以上の様に、微生物を用いたトリアジン系化合物の分解についてはいくつかの報告がなされてはいるものの、単離株の菌学的検討が十分でない、生菌体での分解または分解速度が示されていない、分解するために他の炭素源を必要とする等、現時点でのバイオレメディエーションに利用できる菌株が存在するとは言えないのが現状である。
特開２００５−２７５３６号 Cook, A.M., Hutter, R. 1982. Appl. Environ. Microbiol. 43, 781-786. Strong, L.C., Rosendahl, C., Johnson, G., Sadowsky, M.J., Wackett, L.P. 2002. Appl Environ Microbiol. 68, 5973-5980. Shapir, N., Rosendahl, C., Johnson, G., Andreina, M., Sadowsky, M.J., Wackett, L.P., 2005. Appl. Environ. Microbiol. 71, 2214-2220. Topp, E., Mulbry, W.M., Zhu, H., Nour, S.M., Cuppels, D. 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66, 3134-3141. Seffernick, J.L., Johnson, G., Sadowsky, M.J., Wackett, L.P. 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4247-4252.

本発明は、シメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、又はテルブトリンなどのメチルチオ化トリアジン系化合物、シマジン、アトラジン、プロパジン、又はテルブチラジンなどの塩素化トリアジン系化合物、及びシメトン、アトラトン、プロメトンなどのメトキシ化トリアジン系化合物を分解することができる新規な微生物、及びこれを用いたメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物の分解方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、土壌から単離したノカルディオイデス属の細菌の中に、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する細菌がいることを見出した。また、この細菌は特徴的な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、菌学的性質からも新規な細菌であることを見出した。さらに、この細菌を用いることにより、従来分解が困難とされていたシメトリンなどのメチルチオ化トリアジン系化合物、メトキシ化トリアジン系化合物に加え、塩素化トリアジン系化合物を単一の菌株によって効率よく分解することができることを見出した。

従って、本発明は以下の[１]〜[１３]にある。
[１] メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有することを特徴とするノカルディオイデス属の細菌。
[２] メチルチオ化トリアジン系化合物が、シメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、及びテルブトリンから選ばれる群のうち１種類以上である[１]に記載の細菌。
[３] 塩素化トリアジン系化合物が、シマジン、アトラジン、プロパジン、及びテルブチラジンから選ばれる群のうち１種類以上である[１]又は[２]に記載の細菌。
[４] メトキシ化トリアジン系化合物が、シメトン、アトラトン、及びプロメトンから選ばれる群のうち１種類以上である[１]〜[３]の何れかに記載の細菌。
[５] 次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ） 配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ） 配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ、
を含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する、ノカルディオイデス属の細菌。
[６] メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する、ノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８９；受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８４９）。
[７] [１]〜[６]の何れかに記載の細菌を使用した、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物の分解方法。
[８] メチルチオ化トリアジンがシメトリン、アメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリン及びプロメトリンから選ばれる群のうち１種類以上である[７]に記載の分解方法。
[９] 塩素化トリアジンがアトラジン、シマジン、プロパジン、及びテルブチラジンから選ばれる群のうち１種類以上である[７]又は[８]に記載の分解方法。
[１０] メトキシ化トリアジンがアトラトン、シメトン、及びプロメトンから選ばれる群のうち１種類以上である[７]〜[９]の何れかに記載の分解方法。
[１１] [１]〜[６]の何れか１項に記載の細菌を使用した、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染された土壌、地下水、及び／又は用水の浄化方法
[１２] [１]〜[６]の何れかに記載の細菌の少なくとも１種、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなる、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解するためのトリアジン系化合物用分解剤。
[１３] [１]〜[６] の何れか１項に記載の細菌の少なくとも１種、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなる、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染された土壌、地下水、及び／又は用水の浄化剤。

即ち、本発明は、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物、好ましくはシメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリン、シマジン、アトラジン、プロパジン、テルブチラジン、シメトン、アトラトン、及びプロメトン分解能を有するノカルディオイデス属の細菌、より詳細には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が、配列表の配列番号１に記載する塩基配列、又はメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物を分解する能力を損なわないことを限度として１個若しくは複数個の塩基が、欠失、置換、若しくは付加することにより配列表の配列番号１に記載された塩基配列と９５％以上の相同性を有する塩基配列を有することを特徴とするメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物、好ましくはシメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリン、シマジン、アトラジン、プロパジン、テルブチラジン、シメトン、アトラトン、及びプロメトン分解能を有するノカルディオイデス属の細菌に関する。当該ノカルディオイデス属に属するトリアジン分解菌の具体例としては、ノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２株（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８９；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８４９）が挙げられる。

上記のように本発明はまずメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有するノカルディオイデス属の細菌にあり、このような細菌として、次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ） 配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ） 配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ、
を含む１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する、ノカルディオイデス属の細菌が好ましい。上記の同一性は９５％以上が好ましく、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上であり、特に９９．５％以上、特に９９．８％以上、特に９９．９％以上の同一性であることが好ましい。このような細菌として、ノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２株（ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８９；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８４９）が挙げられる。

また本発明は、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌を用いてメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解する方法に関する。

さらに本発明は、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなるメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解するための組成物（トリアジン系化合物用分解剤）に関する。

さらに、本発明は、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌を用いてメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を含有する環境を浄化する方法に関する。

本発明において、「環境を浄化する」とは、いわゆるバイオレメディエーションを意味し、分解困難な化学物質を含むことによって汚染された土壌、地下水、及び／又は用水等から、その化学物質を分解除去することをいう。

また、本発明は、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなるメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を含有する環境を浄化するための組成物に関する。

本発明のメチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン及びメトキシ化トリアジン分解菌を使用することにより、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解する事が出来る。更に本発明の細菌を用いると速やかに当該化合物を分解することが可能であり、廃棄農薬や環境中の残留農薬を速やかにかつ効率的に分解することができる。本発明は、トリアジン系化合物による環境汚染に対して、新たな環境浄化の手段、すなわち新たなバイオレメディエーションの手段を提供するものである。

図１は、本発明の分解菌を集積するために用いた装置の模式図である。 図２は、図１に示した装置における、Ａ〜Ｄの各装置の還流液中のシメトリン濃度変化を示すグラフである。 図３は、実施例３における本発明の分解菌ＭＴＤ２２株によるトリアジン系化合物の分解を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について説明する。本発明は、土壌から単離したメチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解菌である。本発明におけるメチルチオ化トリアジンとは、トリアジン骨格にメチルチオ基を有するメチルチオ化トリアジン系化合物である。本発明のメチルチオ化トリアジンの好ましい例としては、例えば、シメトリン（２，４−ビス（エチルアミノ）−６−メチルチオ−ｓ−トリアジン）、ジメタメトリン（２−（１，２−ジメチルプロピルアミノ）−４−エチルアミノ−６−メチルチオ−ｓ−トリアジン）、プロメトリン（２，４−ビス（イソプロピルアミノ）−６−メチルチオ−ｓ−トリアジン）、アメトリン（２−エチルアミノ−４−イソプロピルアミノ−６−メチルチオ−ｓ−トリアジン）、デスメトリン（２−イソプロピルアミノ−４−メチルアミノ−６−メチルチオ−ｓ−トリアジン）、テルブトリン（２−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−４−エチルアミノ−６−メチルチオ−ｓ−トリアジン）、メトプロトリン（２−イソプロピルアミノ−４−（３−メトキシプロピル）−６−メチルチオ−ｓ−トリアジン）等が挙げられる。また、塩素化トリアジンとはトリアジン骨格にクロロ基を有する塩素化トリアジン系化合物である。本発明の塩素化トリアジンの好ましい例としては、例えば、シマジン（２−クロロ−４，６−ビス（エチルアミノ）−ｓ−トリアジン）、アトラジン（２−クロロ−４−エチルアミノ−６−イソプロプルアミノ−ｓ−トリアジン）、プロパジン（２−クロロ−４，６−ビス（イソプロピルアミノ）−ｓ−トリアジン）、テルブチラジン（２−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−４−クロロ−６−エチルアミノ−ｓ−トリアジン）、シアナジン（２−（１−シアノ−１−メチルエチルアミノ）−４−エチルアミノ−６−クロロ−ｓ−トリアジン）、シプラシン（２−クロロ−４−シクロプロピルアミノ−６−イソプロピルアミノ−ｓ−トリアジン）、トリエタジン（２−クロロ−４−ジエチルアミノ−６−エチルアミノ−ｓ−トリアジン）、ノラジン（２−クロロ−４−イソプロピルアミノ−６−メチルアミノ−ｓ−トリアジン）、イパジン（２−クロロ−４−ジエチルアミノ−６−イソプロピルアミノ−ｓ−トリアジン）、プログリナジンエチル（２−クロロ−６−エトキシカルボニルメチルアミノ−４−イソプロピルアミノ−ｓ−トリアジン）、クロラジン（２−クロロ−４，６−ビス（ジエチルアミノ）−ｓ−トリアジン）、セブチラジン（２−ｓｅｃ−ブチルアミノ−４−クロロ−６−エチルアミノ−ｓ−トリアジン）、ＭＰＭＴ（４，６−ビス（３−メトキシプロピルアミノ）−２−メチルチオ−ｓ−トリアジン）、ＳＤ−１５４１７（２−クロロ−４−（１−シアノ−イソプロピルアミノ）−６−メチルアミノ−ｓ−トリアジン）等が挙げられる。また、メトキシ化トリアジンとはトリアジン骨格にメトキシ基を有するメトキシ化トリアジン系化合物である。本発明のメトキシ化トリアジンの好ましい例としては、例えばアトラトン（２−エチルアミノ−４−イソプロピルアミノ−６−メトキシ−ｓ−トリアジン）、シメトン（２，４−ビス（エチルアミノ）−６−メトキシ−ｓ−トリアジン）、イパトン（２−ジエチルアミノ−４−イソプロピルアミノ−６−メトキシ−ｓ−トリアジン）、ノラトン（２−イソプロピルアミノ−４−メチルアミノ−６−メトキシ−ｓ−トリアジン）、プロメトン（２，４−ビス（イソプロピルアミノ）−６−メトキシ−ｓ−トリアジン）、セクブメトン（２−ｓｅｃ−ブチルアミノ−４−エチルアミノ−６−メトキシ−ｓ−トリアジン）、メトメトン（２−メトキシ−４，６−ビス（３−メトキシプロピルアミノ）−ｓ−トリアジン）、テルブメトン（２−ｔｅｒｔ−ブチルアミノ−４−エチルアミノ−６−メトキシ−ｓ−トリアジン）等が挙げられる。

本発明のメチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジンに対する分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌には、下記の菌学的特徴を有するものが含まれる。

Ａ．形態的性質（使用培地：Ｄｉｆｃｏ製Ｒ２Ａ ａｇａｒ、
培養温度：３０℃、培養時間：４８時間）
（１） 細胞形態：球菌
（２） 大きさ ：直径１．０〜１．２μｍ
（３） 胞子 ：なし
（４） 運動性 ：なし

Ｂ．コロニー形態（使用培地：Ｄｉｆｃｏ製Ｒ２Ａ ａｇａｒ、
培養温度：３０℃、培養時間：４８時間）
（１） コロニー直径：１．０ｍｍ
（２） 色調 ：淡黄色
（３） 形 ：円形
（４） 隆起状態 ：レンズ状
（５） 周縁 ：全縁
（６） 表面の形状 ：スムーズ
（７） 透明度 ：不透明
（８） 粘稠度 ：バター様

Ｃ．生理学的性質
（１） グラム染色 ： ＋
（２） ３７℃における生育 ： −
（３） ２５℃における生育 ： ＋
（４） カタラーゼ ： ＋
（５） オキシダーゼ ： −
（６） グルコースからの酸／ガス産生 ： −／−
（７） Ｏ／Ｆテスト ： −／−

Ｄ．生化学的性状試験（ビオメリュー製ＡＰＩ Ｃｏｒｙｎｅによる）
（１） 硝酸塩還元 ： −
（２） ピラジンアミダーゼ ： ＋
（３） ピロリドニルアリルアミダーゼ ： −
（４） アルカリフォスファターゼ ： −
（５） β−グルクロニダーゼ ： −
（６） β−ガラクトシダーゼ ： −
（７） α−グルコシダーゼ ： ＋
（８） Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ ： −
（９） エスクリン ： ＋
（１０） ウレアーゼ ： −
（１１） ゼラチン加水分解 ： ＋
（１２） グルコース資化性 ： −
（１３） リボース資化性 ： −
（１４） キシロース資化性 ： −
（１５） マンニトール資化性 ： −
（１６） マルトース資化性 ： −
（１７） 乳糖資化性 ： −
（１８） 白糖資化性 ： −
（１９） グリコーゲン資化性 ： −

対象とするメチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解菌の具体的な例として、新規分離菌株であるノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２株がある。ノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に微生物の表示（寄託者が付した識別のための表示）「Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ ＭＴＤ２２」、受託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８９」として平成１８年８月１１日付けで寄託され、さらに平成１９年７月４日付けで国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８４９を付与されている。

本発明者らは、後記する実施例１に記載の方法により、新規なメチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジンを分解できるＭＴＤ２２株を見出した。この微生物が各トリアジン化合物を分解するのに適した培地を表１に示す。

前記の表１中の微量元素溶液は、次の表２に示される組成からなるものである。

前記の表１中の混合ビタミンは、次の表３に示される組成からなるものである。

そして、メチルチオ化トリアジン系化合物としてアメトリン、デスメトリン、ジメタメトリン、プロメトリン、又はシメトリン、塩素化トリアジン系化合物としてアトラジン、プロパジン、テルブチラジン、又はシマジン、又はメトキシ化トリアジン系化合物としてアトラトンをそれぞれ１〜８ｍｇ／Ｌ含む無機培地２０ｍｌにこの微生物を植種し、３０℃、１２０ｒｐｍでロータリー振とう培養を行った。実験開始時と６日目にそれぞれ培養液を１ｍＬ採取し、遠心処理後ＨＰＬＣを用いて培養上清中の各トリアジン系化合物濃度を測定した結果を図３に示す。図３に示されるように６日後には、培養液中の各農薬濃度は検出限界以下となった。このように、本発明の微生物はメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物を顕著に分解する作用を有していることが明らかになった。
また、後記する実施例３に記載の方法により、培養液中のシメトリン濃度を顕著に低下させる株を得た。

本発明のメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解する方法、好ましくはシメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリン、シマジン、アトラジン、プロパジン、テルブチラジン、シメトン、アトラトン、及びプロメトンからなる群から選ばれる少なくとも１種の物質を分解する方法は、本発明のメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物に対する分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌が生育できる条件で、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を含有する材料と接触させることにより行うことができる。これらの微生物が生育できる条件としては、前記した無機培地が好ましいが、これらに限定されるものではなく、これらの微生物による分解を行うことができる条件であればよい。メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を含有する材料としては、これらのトリアジン系化合物を含有する廃棄農薬、土壌、地下水、又は用水などが挙げられる。

本発明のメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、又はメトキシ化トリアジン系化合物、好ましくはシメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリン、シマジン、アトラジン、プロパジン、テルブチラジン、シメトン、アトラトン、及びプロメトンからなる群から選ばれる少なくとも１種の物質を分解するための組成物としては、前記した本発明のトリアジン系化合物分解菌を含有するものである。当該組成物における細菌の生育が許容される担体としては、本発明の微生物が生育できる条件に適した材料であればよく、前記した培地やその改変培地、それを支持する支持体などが挙げられる。このような支持体としては、本発明の微生物を安定に保持することができるものであれば特に制限はないが、多孔質素材、更に具体的には当該細菌又は複合微生物系を集積させた多孔質の木質炭化材料、竹炭材料、又は綿布材料などが挙げられる。より具体的には特開平１０−２２５２８８号（特許第３０３０３７０号公報）、又は特開平１１−３１８４３５号（特許第２９０４４３２号公報）に記載の多孔質材料が挙げられ、これらの公報に記載の内容を本明細書に全て取り込む。
さらに、ＷＯ２０００／０７８９２３号に記載されているような装置を用いて、本発明の微生物をその分解菌保持担体に担持させて使用することもできる。

さらに、本発明のメチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメチルチオ化トリアジン分解菌、及び／又は当該分解菌を含有してなるメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解するための組成物を用いて、シメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリンなどのメチルチオ化トリアジン系化合物、シマジン、アトラジン、プロパジン、テルブチラジンなどの塩素化トリアジン系化合物、及び／又はシメトン、アトラトン、プロメトンなどのメトキシ化トリアジン系化合物が配合された廃棄農薬を無害化し、あるいはメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染されている土壌や、地下水、用水などの水などの環境を浄化することができる。この方法は、本発明のメチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌、又は当該微生物を含有してなる組成物を、これらの微生物が生育できる条件で、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を含む材料と接触させることにより行うことができる。この方法により、シメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリンなどのメチルチオ化トリアジン系化合物、シマジン、アトラジン、プロパジン、テルブチラジンなどの塩素化トリアジン系化合物、及び／又はシメトン、アトラトン、プロメトンなどのメトキシ化トリアジン系化合物が配合された廃棄農薬、あるいはメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染されている土壌や、地下水、用水などの水などの材料中に含有されるメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を本発明の微生物により分解して、これを無害化し、浄化することができる。

また、本発明は、このような環境汚染物質の無害化及び浄化のために適した組成物を提供するものであり、当該組成物は、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解能を有するノカルディオイデス属に属する細菌、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなるものである。当該担体としては、前記したメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解するための組成物における担体と同様なものを使用することができる。

実施例
以下、本発明分解菌の単離培養、分類同定、更に本発明分解菌を用いたメチルチオ化トリアジン系、塩素化トリアジン系、及びメトキシ化トリアジン系化合物分解の実験例を示して、本発明を更に詳細かつ具体的に説明するが、本出願発明は以下の実施例に限定されるものではない。

ＭＴＤ２２株の単離
発明者らは、以下の様にして、本発明に係わる新規メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及びメトキシ化トリアジン分解菌ノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２株を単離した。図１に示すように、土壌層タンク１に土壌を３０〜５０ｇ入れて集積用土壌層２を形成した。そして、適量のシメトリンを炭素源及び窒素源として加えた滅菌済の無機塩培地２００ｍｌを還流液３として貯液タンク４からポンプを用いて集積用土壌層２に還流させた。用いた無機塩培地の組成は次の表４の通りである。

図１に示した装置を４台用意し、還流開始後、それぞれの還流液中のシメトリン濃度をＨＰＬＣで測定した。結果を図２に示す。図２のグラフの縦軸は還流液中のシメトリン濃度（新鮮な還流液中のシメトリン濃度を１としたときの相対値）を示し、横軸は還流時間（日）を示す。図２の矢印は還流液を全量、新鮮なものと交換した時点を示す。図２で認められるように装置Ｃ（図２のグラフにおいて白丸（○）で示す）において、還流液中のシメトリン濃度が急激に低下した。
そこで、別途図１に示した装置で土壌層タンクに木質炭化素材を２．２ｇ添加したものを更に２台用意し、装置Ｃより土壌約１ｇを移植した。１ヶ月程度運転を行い木質炭化素材にシメトリン分解菌が集積してきたと考えられた時点で装置より炭を一粒取り出し、表４の組成の培地が２００ｍＬ入った５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、３０℃で振とう培養を行ったところ、徐々にではあるがシメトリンの分解が認められた。そこで、培養液中に存在する細菌種を少なくすることを目的として、培養液を限界希釈法により約１年程度継代培養を行った。すなわち、培養液の１部を９倍量の無機培地で希釈し、さらにその希釈された培養液の１部を９倍量の無機培地で希釈するといった操作で概ね１０の８乗倍まで希釈した各希釈系列から０．５ｍＬを新しい培地に植種し、３０℃で振とう培養を行い、適宜ＨＰＬＣを用いて培養液中のシメトリンの濃度を測定し、シメトリンの分解が認められた最も高い希釈系列を植種した培養液から培養液の１部を採取し同様の操作で希釈後植え継ぎを行う操作を１週間から１ヶ月おきに繰り返した。
この継代培養操作を約１年程度繰り返すことにより、高次希釈の継代培養液においても２０ｍｇ／Ｌ程度のシメトリンであれば１週間程度で完全に分解することができるようになったことから、培養液中に存在する細菌の構成種が単純化し、シメトリン分解菌が優占するようになったと考えられたため、分解菌の単離作業を実施した。
上記培養液のうち、最も高い希釈系列を植種した培養液を１０μＬのループを用いてＲ２Ａ寒天培地上に画線し、この寒天培地を３０℃で静置培養した。ここで生じた単コロニーをニードルで釣菌、及び再度新しいＲ２Ａ培地に画線して３０℃で静置培養した。１００ｍＬ容三角フラスコにシメトリン２５ｍｇ／Ｌを含む無機培地２０ｍＬを入れ、Ｒ２Ａ寒天培地上に生じた菌体をループでかきとって植種し、３０℃で振とう培養を行った。ＨＰＬＣを用いて経時的に培地中のシメトリン濃度変化を追ったところ、２日間でシメトリンの完全分解が認められた。しかし、まだシメトリン分解菌の単離が不十分であると考えられたため、この培養液の１部を採取し無機培地を用いて前述の方法で１０の８乗倍まで希釈し、各希釈系列から１００μＬをＲ２Ａ寒天培地に塗布して３０℃で静置培養した。この培地上に生じた単コロニーをループで釣菌し、さらに別のＲ２Ａ培地に画線して３０℃で静置培養した。１００ｍＬ容三角フラスコにシメトリン２５ｍｇ／Ｌを含む無機培地２０ｍＬを入れ、Ｒ２Ａ寒天培地上に生じた菌体をループでかきとって植種し、３０℃で振とう培養を行った。ＨＰＬＣを用いて経時的に培地中のシメトリン濃度の変化を追うことにより、シメトリンを分解できる単離株１種を特定し、この株をＭＴＤ２２株と命名した。

ＭＴＤ２２株の菌学的検討
実施例１にて単離したＭＴＤ２２株の菌学的位置付けを行うために、ＭＴＤ２２株の形態的性質、培地における生育の様相、生理学的性質、生化学的性状についてエヌシーアイエムビー・ジャパンにて分析を行った。その結果、次の菌学的性質が認められた。
Ａ．形態的性質（使用培地：Ｄｉｆｃｏ製Ｒ２Ａ ａｇａｒ、
培養温度：３０℃、培養時間：４８時間）
（１） 細胞形態 ：球菌
（２） 大きさ ：１．０〜１．２μｍ
（３） 胞子 ：なし
（４） 運動性 ：なし

Ｂ．コロニー形態（使用培地：Ｄｉｆｃｏ製Ｒ２Ａ ａｇａｒ、
培養温度：３０℃、培養時間：４８時間）
（５） コロニー直径 ：１．０ｍｍ
（６） 色調 ：淡黄色
（７） 形 ：円形
（８） 隆起状態 ：レンズ状
（９） 周縁 ：全縁
（１０） 表面の形状 ：スムーズ
（１１） 透明度 ：不透明
（１２） 粘稠度 ：バター様

Ｃ．生理学的性質
（１３） グラム染色 ： ＋
（１４） ３７℃における生育 ： −
（１５） ２５℃における生育 ： ＋
（１６） カタラーゼ ： ＋
（１７） オキシダーゼ ： −
（１８） グルコースからの酸／ガス産生 ： −／−
（１９） Ｏ／Ｆテスト ： −／−

Ｄ．生化学的性状試験（ビオメリュー製ＡＰＩ Ｃｏｒｙｎｅによる）
（２０） 硝酸塩還元 ： −
（２１） ピラジンアミダーゼ ： ＋
（２２） ピロリドニルアリルアミダーゼ ： −
（２３） アルカリフォスファターゼ ： −
（２４） β−グルクロニダーゼ ： −
（２５） β−ガラクトシダーゼ ： −
（２６） α−グルコシダーゼ ： ＋
（２７） Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ ： −
（２８） エスクリン ： ＋
（２９） ウレアーゼ ： −
（３０） ゼラチン加水分解 ： ＋
（３１） グルコース資化性 ： −
（３２） リボース資化性 ： −
（３３） キシロース資化性 ： −
（３４） マンニトール資化性 ： −
（３５） マルトース資化性 ： −
（３６） 乳糖資化性 ： −
（３７） 白糖資化性 ： −
（３８） グリコーゲン資化性 ： −

結果をバージーのマニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２（１９８４））に従って同定を行ったところ、本発明のＭＴＤ２２株はコリネ型細菌の一種であると推定された。コリネ型細菌は多様な細菌群で、上記の菌学的性質の試験結果のみから本株を分類同定することは困難であった。そこで以下の手順に則り、ＭＴＤ２２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいた遺伝子分類学的な検討を行った。

（１）ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ (キアゲン製)を用いてＭＴＤ２２株の菌体からＤＮＡを調製した。
（２）上記ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、公知のユーバクテリア１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用プライマーを用いてＰＣＲ法によりＭＴＤ２２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を増幅し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(キアゲン製)を用いてＤＮＡを精製した。
（３）上記精製ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして蛍光ラベルした公知のユーバクテリア１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析用プライマーを用いてサイクルシーケンス反応を行い、ＤＮＡシーケンサＳＱ５５００Ｅ（日立製）により塩基配列を決定した。

以上の操作により決定されたＭＴＤ２２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列、１，４７７塩基を配列番号１に示す。ジェネティクスＰＤＢ（ジェネティクス製）を用いて、配列番号１に示したＭＴＤ２２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の部分塩基配列と、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録された他の微生物の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列をＦＡＳＴＡ法により相同性比較を行った。その結果、ＭＴＤ２２株はマルモリコラ オーランティアカスと９７．４％の、またマルモリコラ Ｓｐ． ＣＮＪ８７２ ＰＬ０４株と９７．１％の相同性を示した。しかし、ＭＴＤ２２株とマルモリコラ オーランティアカスは、コロニーの色やカゼイン分解性等の表現形質に不一致があり、むしろノカルディオイデス属細菌と類似していた。以上の結果から、発明者らは本菌株を新規なノカルディオイデス ｓｐ．ＭＴＤ２２株と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に平成１８年８月１１日付けで受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８９として寄託した。この株は、さらに、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）において、平成１９年７月４日付けで国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８４９を付与されている。

ＭＴＤ２２株によるメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解
ＭＴＤ２２株のトリアジン系化合物の分解能を検討した。メチルチオ化トリアジン系化合物としてアメトリン、デスメトリン、ジメタメトリン、プロメトリン又はシメトリン、塩素化トリアジン系化合物としてアトラジン、シマジン、プロパジン又はテルブチラジン、メトキシ化トリアジン系化合物としてアトラトンを１〜８ｍｇ／Ｌ程度含む無機液体培地をそれぞれ調製し、これらの液体培地を１００ｍＬ容三角フラスコに２０ｍＬずつ分注した。別途Ｒ２Ａ寒天培地を用いてＭＴＤ２２株を３０℃で静置培養し、コロニーが成長したところをループでかきとり無機培地１．５ｍＬに懸濁した後、１００μＬずつ各培地に植種して３０℃、１２０ｒｐｍでロータリー振とう培養を行った。実験開始時（０日目）と６日目の各トリアジン系化合物の濃度をＨＰＬＣにて測定した。
その結果を図３に示す。図３の縦軸は各トリアジン系化合物の濃度を、横軸は供試したトリアジン系化合物と時間経過を示している。図中の黒丸（●）は実験開始時及び６日後の各農薬濃度を示している。
図３で示されるように各培養液中のトリアジン系化合物は、ＭＴＤ２２株によって６日後には完全に分解されていることがわかった。このことから、ＭＴＤ２２株はメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物を速やかに分解する能力を持つ微生物であることが判明した。

本発明は、農薬などとして多用されているメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物を分解する新規な細菌、それを含有してなる組成物、細菌及びそれを用いたメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物を分解する方法を提供するものであり、廃棄農薬や環境中に残留している過剰のメチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物を分解して無害化し、環境の浄化に寄与するものであり、残留物を除去してきれいな土壌や水を提供することを可能とするものである。

配列番号１：本発明の分解菌ＭＴＤ２２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の１４７７塩基。

Claims (13)

1. メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有することを特徴とするノカルディオイデス属の細菌。
2. メチルチオ化トリアジン系化合物が、シメトリン、アメトリン、プロメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、及びテルブトリンから選ばれる群のうち１種類以上である請求の範囲第１項に記載の細菌。
3. 塩素化トリアジン系化合物が、シマジン、アトラジン、プロパジン、及びテルブチラジンから選ばれる群のうち１種類以上である請求の範囲第１項又は第２項に記載の細菌。
4. メトキシ化トリアジン系化合物が、シメトン、アトラトン、及びプロメトンから選ばれる群のうち１種類以上である請求の範囲第１項〜第３項の何れか１項に記載の細菌。
5. 次の（Ａ）又は（Ｂ）：
   （Ａ） 配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
   （Ｂ） 配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ、
   を含む１６Ｓ rＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する、ノカルディオイデス属の細菌。
6. メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及びメトキシ化トリアジン系化合物の分解能を有する、ノカルディオイデス ｓｐ． ＭＴＤ２２株（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０９８９； 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８４９）。
7. 請求の範囲第１項〜第６項の何れか１項に記載の細菌を使用した、メチルチオ化トリアジン系化合物、塩素化トリアジン系化合物、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物の分解方法。
8. メチルチオ化トリアジンがシメトリン、アメトリン、ジメタメトリン、デスメトリン、テルブトリン及びプロメトリンから選ばれる群のうち１種類以上である請求の範囲第７項に記載の分解方法。
9. 塩素化トリアジンがアトラジン、シマジン、プロパジン、及びテルブチラジンから選ばれる群のうち１種類以上である請求の範囲第７項又は第８項に記載の分解方法。
10. メトキシ化トリアジンがアトラトン、シメトン、及びプロメトンから選ばれる群のうち１種類以上である請求の範囲第７項〜第９項の何れか１項に記載の分解方法。
11. 請求の範囲第１項〜第６項の何れか１項に記載の細菌を使用した、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染された土壌、地下水、及び／又は用水の浄化方法
12. 請求の範囲第１項〜第６項の何れか１項に記載の細菌の少なくとも１種、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなる、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物を分解するためのトリアジン系化合物用分解剤。
13. 請求の範囲第１項〜第６項の何れか１項に記載の細菌の少なくとも１種、及び当該細菌の生育が許容される担体を含有してなる、メチルチオ化トリアジン、塩素化トリアジン、及び／又はメトキシ化トリアジン系化合物で汚染された土壌、地下水、及び／又は用水の浄化剤。

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