CN111320266B - 一种染料厌氧生物脱色体系及方法 - Google Patents

一种染料厌氧生物脱色体系及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低碳源成本的染料生物脱色方法，属于污水处理技术领域。本发明首先将产电微生物MR‑1和褐腐菌G.trabeum接入以淀粉为碳源的脱色培养基中进行厌氧共培养；在培养过程中，产电微生物S.oneidensisMR‑1利用褐腐菌G.trabeum对淀粉分解产物进行厌氧呼吸释放电子，并最终将电子传输给有机污染物，使污染物得到降解；本发明所建立的新型降解体系不但能实现对染料污染物的高效降解，而且碳源成本低廉，甚至可以实现碳源的零成本，大大提高了产电微生物修复环境污染物的实际应用潜能。

Description

一种染料厌氧生物脱色体系及方法
技术领域
本发明涉及一种低碳源成本的染料厌氧生物脱色方法，属于污水处理技术领域。
背景技术
染料废水成分复杂，生物可降解性差，且具有毒性和诱变性，因此未经处理的染料废水若直接排放到环境中将会严重的威胁到人类和水生生物的安全。为了解决染料废水污染问题，当前已经开发了物理法、化学法和生物法处理染料废水，其中物理、化学法处理成本高，尤其是还会产生二次污染，应用受到限制。而生物法因其具有相对成本低、环境友好、处理效果好等优点被认为是最有前景的方法，受到广泛关注。
产电微生物是一类可以利用多种有机物作为碳源，通过自身厌氧呼吸作用，将代谢产生的电子释放到周围环境，直接与胞外电子受体接触，或者通过电子递质的间接作用将电子转移给电子受体，进行异化厌氧呼吸的微生物。模式产电菌Shewanella oneidensis MR-1（MR-1）是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌，不仅能够利用氧气作为电子受体进行有氧呼吸，还能将环境中的众多物质如染料等厌氧还原。而且，它对物质的还原降解不需要特异性降解酶，而是通过细菌表面非特异性释放的电子所致。这种新型的非特异性降解机制使其具有对不同类型环境污染物进行还原降解的独特能力，在环境污染修复领域显示出良好的应用前景。
然而，产电微生物MR-1只能利用乳酸等小分子有机物为碳源，缺乏对大分子有机物如淀粉等的利用能力。由于乳酸成本较高，这在很大程度上制约了其在环境污染物生物修复方面的实际应用。因此，如果能够解决产电微生物降解污染物的碳源成本问题，那么将能够大大增强其在有机污染物生物修复领域的实际应用潜力。
发明内容
本发明旨在提供一种方法或降解体系，来降低产电微生物MR-1对环境污染物厌氧生物修复的碳源成本。
本发明通过将产电微生物MR-1和褐腐菌Gloeophyllum trabeum （G. trabeum）共培养来建立一种新型的协同降解体系，利用淀粉为碳源，既实现了对污染物的高效降解，又达到了降低碳源成本目的，从而建立起一种经济、高效降解污染物的新型技术集成方法。
本发明中，褐腐菌G. trabeum先将体系中的淀粉分解成小分子有机物，产电微生物MR-1再利用淀粉分解产物进行厌氧呼吸代谢，释放出电子，并传递给胞外的电子受体（污染物），从而将污染物还原降解，降解过程见图1。
本发明所述产电微生物为MR-1，所述真菌为褐腐菌G. trabeum，所述污染物为染料。
本发明提供一种低碳源成本的染料厌氧生物脱色方法，具体为产电微生物MR-1和褐腐菌G. trabeum联用降解染料污染物的方法，包括下述步骤：
（1）产电微生物MR-1震荡培养收集菌体，将菌体沉淀用矿物盐培养基重悬，并调菌体浓度至4~6×107 CFU/mL；
具体的，产电微生物MR-1菌体的准备包括：
配制固体平板LB培养基（含有酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，琼脂2%），对MR-1进行活化培养。
将活化的菌体接种于50mL液体LB培养基（配方中没有琼脂）中，（30±0.5）℃、（200±5）rpm下于摇床中过夜震荡培养10h到对数期后期，然后将对数后期菌液7000 rpm离心15min收集菌体；菌体沉淀再用矿物盐培养基重悬，并调菌体浓度为4~6×107 CFU/mL，备用。
所述矿物盐培养基的配方如下：每升培养基含7.5 mmol NaOH、28 mmol NH4Cl、1.3 mmol KCl、4.3 mmol NaH2PO4、100 mmol NaCl、1 mL 的维生素母液，1 mL氨基酸母液以及1 mL微量元素母液。其中维生素母液、氨基酸母液以及微量元素母液的配方参照文献（Bretschger O, Obraztsova A, Sturm C A, et al. Current production and metaloxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(21): 7003-7012）。
（2）褐腐菌（G. trabeum）震荡培养，将菌体用矿物盐培养基清洗后，再用矿物盐培养基调菌体浓度为20%（V/V）；
具体的，褐腐菌G. trabeum菌体的准备包括：
配制固体平板PDA培养基（含有马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L），对G. trabeum进行30℃下活化培养。将活化后的菌体接种于100mL液体PDB培养基中，（30±0.5）℃、（200±5）rpm下于摇床中震荡培养3d，将菌体沉淀用矿物盐培养基清洗好，备用。
（3）将步骤（1）和步骤（2）获得的菌体分别按体积百分比为6%和9%的接种量接入含有染料污染物的矿物盐培养基中，并通入高纯氮气于溶液中15 min，以驱赶掉氧气，之后密封；
所述含有染料污染物的矿物盐培养基中含染料污染物100mg/L；
所述培养基以淀粉为碳源，若选择市售淀粉，调节其终浓度为2g/L；若以淀粉废水为碳源，则步骤（1）中矿物盐培养基用灭菌的淀粉废水配置，加入染料即可，无需再加碳源。
所述产电微生物MR-1和褐腐菌G. trabeum菌液的用量体积比为2 : 3。
所述染料污染物包括但不限于强极性偶氮染料甲基橙、中极性偶氮染料阳离子红、低极性偶氮染料甲基红、三苯甲烷类染料苯胺蓝、金属复合染料萘酚绿B。
（4）将步骤（3）得到混合溶液放入摇床，在（30±0.5）℃、（200±5）rpm下进行反应。
本发明的有益效果如下：
淀粉作为一种大分子有机物，不仅来源广泛，成本低，而且是一种重要的工农业产品原料。我国是淀粉生产和加工大国，每年淀粉废水的排放量高达2000万吨。目前，国内外淀粉废水处理方法主要有厌氧-好氧联合生物法，Fenton-厌氧法，电絮凝法等，这些方法不仅投资和运行成本高，而且浪费了淀粉资源，使该废水的处理成为企业的大包袱。因此，对淀粉废水的资源化利用也是本领域亟待解决的难题。若能将淀粉废水作为产电微生物降解环境污染物的有机碳源，那么在治理环境污染的同时，实现淀粉废水的资源化处理，以废治废，真正做到低成本治污，可谓一举多得。
褐腐菌G. trabeum是木腐菌的一种，属于异养型真核微生物。褐腐菌可将纤维素和淀粉等大分子物质分解为还原糖，并进一步将还原糖代谢为乙醇等小分子有机物。而产电菌是可以利用这些小分子物质为碳源进行异化厌氧呼吸的。因此，通过构建褐腐菌与产电菌这样的混菌降解体系，就可以实现以淀粉为碳源降解环境污染物的目的，从而降低产电微生物处理污染物的碳源成本（表1，按照实验用所买试剂纯乳酸和淀粉的售价，乳酸碳源成本为淀粉的4.3倍，如果是用淀粉废水，不仅不要碳源成本，还可以因处理了淀粉废水而创收），增强产电微生物在实际环境污染生物修复中的应用潜力，同时为淀粉废水的资源化利用处理提供了一条良好的思路。
总之，本发明结合褐腐菌G. trabeum可以降解大分子有机物及产电微生物能广谱性高效降解污染物的优点，构建了一种经济的产电微生物MR-1和褐腐菌G. trabeum的协同降解体系，既实现了对污染物的高效降解，又大大降低了对污染物的修复成本，解决了产电微生物降解污染物的碳源成本问题，同时还可以达到以废治废的目的。
附图说明
图1是MR-1和G. trabeum混菌体系降解污染物的机理图。
图2是以市售淀粉为碳源的MR-1和G. trabeum协同降解体系对强极性偶氮染料甲基橙的降解效果图。
图3是以市售淀粉为碳源的MR-1和G. trabeum协同降解体系对中极性偶氮染料阳离子红的降解效果图。
图4是以市售淀粉为碳源的MR-1和G. trabeum协同降解体系对低极性偶氮染料甲基红的降解效果图。
图5是以市售淀粉为碳源的MR-1和G. trabeum协同降解体系对三苯甲烷类染料苯胺蓝的降解效果图。
图6是以市售淀粉为碳源的MR-1和G. trabeum协同降解体系对金属复合染料萘酚绿B的降解效果图。
图7是以淀粉废水为碳源的MR-1和G. trabeum协同降解体系对甲基橙的降解效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步解释说明本发明的技术方案，以使本领域技术人员更好的理解，但是本发明的保护范围不限于此。
本发明所述菌株MR-1是一种模式产电微生物，由美国加利福尼亚大学尼尔森教授赠送；该菌保存于美国模式典型物收集中心（ATCC），菌株编号是ATCC700500TM；此菌种可直接从该中心购买。本发明所述菌株G. trabeum是褐腐菌，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。
固体平板LB培养基、矿物盐培养基、固体平板PDA培养基均为本领域常用，均可购买或自行按照常规配方配制。
实施例：
一种低碳源成本的染料厌氧生物脱色体系，褐腐菌G. trabeum先将淀粉水解生成葡萄糖，并进一步将葡萄糖代谢为乙醇等小分子有机物。希瓦氏菌MR-1利用乙醇等进行厌氧呼吸代谢释放电子，并最终将电子传输给染料污染物，实现对污染物的高效降解。
具体实施步骤如下：
（1）将保存在甘油中的MR-1划线于固体平板LB培养基（含有酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，琼脂2%）上，30℃过夜培养。
（2）用移液枪吸取活化好的单菌落，接种于50mL液体LB培养基中，（30±0.5）℃、（200±5）rpm震荡培养10h至对数期后期，然后将对数后期菌液7000 rpm离心15 min收集菌体。菌体沉淀用矿物盐培养基重悬，并用分光光度法将细菌重悬液浓度调成4~6×107 CFU/mL，备用。
所述矿物盐培养基的配方如下：每升培养基含7.5 mmol NaOH、28 mmol NH4Cl、1.3 mmol KCl、4.3 mmol NaH2PO4、100 mmol NaCl、1 mL 的维生素母液，1 mL氨基酸母液以及1 mL微量元素母液。其中维生素母液、氨基酸母液以及微量元素母液的配方参照文献（Bretschger O, Obraztsova A, Sturm C A, et al. Current production and metaloxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(21): 7003-7012）。
（3）配制固体平板PDA培养基（含有马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L、2%的琼脂），对褐腐菌G. trabeum进行30℃下活化培养。
（4）将活化的菌体接种于100mL液体PDA培养基中，（30±0.5）℃、（200±5）rpm震荡培养3 d，将菌体沉淀用矿物盐培养基清洗，备用。
（5）称取0.015 g不同结构的染料污染物（强极性偶氮染料甲基橙、中极性偶氮染料阳离子红、低极性偶氮染料甲基红、三苯甲烷类染料苯胺蓝、金属复合染料萘酚绿B），分别溶于150mL上述不含有机碳源的矿物盐培养基中，然后加入0.3g市售淀粉做碳源。设立实验处理组（同时加MR-1和G. trabeum）、阴性对照组A（只加MR-1）、阴性对照组B（只加G. trabeum），每个组设五个平行。
（6）在实验处理组中加入3 mL步骤（2）中备好的细菌液和4.5 mL步骤（4）中备好的真菌液，在阴性对照组A中只加入3 mL细菌液，对照组B中仅加入4.5 mL真菌液，并均通入高纯氮气于溶液中15 min，之后密封。
（7）将步骤（6）中配制的悬浮液放入摇床，于（30±0.5）℃、（200±5）rpm下振荡培养，对实验组和对照组进行取样（严格要求厌氧），离心后，并用分光光度计测定上清液的吸光度值。
（8）降解率（以脱色率表示）按以下公式计算：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式中，A 0为染料溶液初始吸光度； A t为脱色时间t时染料溶液的吸光度。
（9）在以上脱色效果基础上，进一步考察了实际淀粉废水为碳源的脱色效果。
所用淀粉废水为取自某大学食堂的淘米水（所测淀粉含量为0.805g/L，灭菌处理后备用），所用污染物为模式偶氮染料甲基橙。该实施例中除以上第（5）步（所用矿物盐培养基不用纯水配置，而是用所准备的淀粉废水配置，且不再加淀粉）外，其它步骤都同上。
以市售淀粉做碳源的G. trabeum和MR-1协同降解体系对不同结构的染料污染物，包括强极性偶氮染料甲基橙、中极性偶氮染料阳离子红、低极性偶氮染料甲基红、三苯甲烷类染料苯胺蓝、金属复合染料萘酚绿B的降解效果如图2-6所示；以淀粉废水为碳源的G. trabeum和MR-1协同降解体系对模式偶氮染料污染物的降解效果见图7。
从图2中可以看出，在10h时G. trabeum和MR-1共培养体系对强极性偶氮染料甲基橙的降解率可达95.11%，而阴性对照组A只有40.78%、阴性对照组B仅为11.96%。
从图3中可以看出，在20h时G. trabeum和MR-1共培养体系对中极性偶氮染料阳离子红的降解率可达92.31%，而阴性对照组A只有31.53%、阴性对照组B仅为14.05%。
从图4中可以看出，在25h时G. trabeum和MR-1共培养体系对弱极性偶氮染料甲基红的降解率可以达到93.29%，而阴性对照组A只有32.86%、阴性对照组B仅为14.11%。
从图5中可以看出，在90h时G. trabeum和MR-1共培养体系对三本甲烷类染料苯胺蓝的降解率可达92.29%，而阴性对照组A只有31.23%、阴性对照组B仅为14.72%。
从图6中可以看出，在25h时G. trabeum和MR-1共培养体系对金属复合染料萘酚绿B的降解率可达94.99%，而阴性对照组A只有31.25%、阴性对照组B仅为14.05%。
因此，图2-6的结果表明通过G. trabeum和MR-1的共同培养，成功实现了产电微生物利用淀粉来降解环境中染料污染物，而且该体系对偶氮染料的降解速率比三苯甲烷染料快，特别适合处理偶氮染料废水。此外，图7的结果（G. trabeum和MR-1共培养体系12小时的甲基橙脱色率高达97.33%，远远高于单菌体系39.09%和7.49%的脱色率）进一步表明淀粉废水也可以作为该混菌体系的碳源，成功实现了以废治废。
本发明还针对MR-1常用碳源乳酸，与本协同降解体系所用淀粉碳源（市售淀粉和淀粉废水）进行了碳源成本比较，结果见表1。由表1可知，将产电菌MR-1降解污染物的碳源由乳酸改为市售淀粉，处理单位污染物的碳源成本将降为原来的23.3%；如果用的是淀粉废水，则碳源成本可降为零，而且根据所用淀粉废水的浓度（0.805kg/m3），换算得到降解1kg污染物所需淀粉废水量25000L，即同时还可以处理比染料废水量更多的淀粉废水，创造收益。
表1 不同碳源的经济性比较
Figure DEST_PATH_IMAGE002
注：1、表中乳酸和淀粉的单价均来自于本实验室的购买价格。
2、淀粉废水浓度为所用淘米水的实测浓度0.805kg/m3。
综上可知，不管是对不同极性的偶氮染料废水，还是对三苯甲烷染料、金属复合染料废水，以淀粉为碳源的MR-1和G. trabeum协同降解体系均显示出好的处理效果（脱色率在92%以上）。因此，本发明的协同降解体系是一个高效（不仅脱色率高，而且对不同类型的染料均适用）脱色体系；同时本体系大大降低了产电菌修复环境污染物的碳源成本，通过以废治废还可以使碳源成本降为零，甚至创造收益。
因此，通过本发明构建的新型共培养协同降解体系既实现了对不同结构的染料污染物的高效降解，对染料污染物的降解具有广谱性，又降低了污染物的修复成本，具有极大的现实意义。因此，本发明提出的降解染料污染物的方法是完全可行的。

Claims (8)

1. 一种染料厌氧生物脱色体系，其特征在于，以淀粉为碳源，将产电微生物与真菌共培养构建；所述产电微生物为MR-1，所述真菌为褐腐菌G. trabeum。
2.一种染料厌氧生物脱色方法，其特征在于，包括：
产电微生物MR-1震荡培养收集菌体，将菌体沉淀用矿物盐培养基重悬，并调菌体浓度；
褐腐菌G. trabeum震荡培养，将菌体用矿物盐培养基清洗并调菌体浓度；
将获得的产电微生物MR-1和褐腐菌G. trabeum菌体接入含有染料污染物的矿物盐培养基中，并通入高纯氮气于溶液中驱除氧气后密封；所述含有染料污染物的矿物盐培养基以淀粉为碳源；
将密封的混合溶液放入摇床进行反应；
所述染料污染物是强极性偶氮染料甲基橙、中极性偶氮染料阳离子红、低极性偶氮染料甲基红、三苯甲烷类染料苯胺蓝、金属复合染料萘酚绿B。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述产电微生物MR-1重悬后调节菌体浓度至4~6×107 CFU/mL。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述褐腐菌G. trabeum浓度调节为20%（V/V）。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述产电微生物MR-1和褐腐菌G. trabeum按照体积百分比分别为6%和9%的接入量接入至脱色培养基中。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有染料污染物的矿物盐培养基中含染料污染物100mg/L。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述含有染料污染物的培养基的碳源若选择市售淀粉，调节其终浓度为2g/L；若碳源为淀粉废水，则所述的矿物盐培养基用灭菌的淀粉废水配置。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述密封的混合溶液摇床反应的条件为在30±0.5℃、200±5rpm下进行反应。
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