CN117757655A - 一种多氯联苯降解菌株tz33及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种多氯联苯降解菌株TZ33及其筛选方法和应用。本发明驯化和分离得到1株能以多氯联苯(PCB31)作为碳源的菌株Arthrobacter sp.TZ33，对其进行鉴定，发现其对多氯联苯PCB31具有良好降解能力，对筛选出能有效降解多氯联苯的菌株具有重要的应用价值和现实意义，并且丰富了PCBs降解菌菌库。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种多氯联苯降解菌株TZ33及其筛选方法和应用。
背景技术
多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)是氯代芳烃类持久性有机污染物，由氯原子取代联苯分子中氢原子而成，根据氯原子的个数及位置不同，可分为209种同系物。20世纪30年代开始，PCBs广泛用于润滑剂、密封剂、耐火增塑剂、电容器和变压器中的绝缘油以及液压油的生产。在20世纪60年代日本的“米糠油事件”后，PCBs对环境的污染和对人体健康的影响引起了人们的广泛关注。1970年后，PCBs在全世界被禁止生产，但现有的PCBs在储存、运输和处理过程中仍因意外泄漏而污染环境。PCBs具有致癌性，可造成人体内脏、皮肤和脑部受损，并影响免疫、神经及生殖系统，严重时可危及生命。由于PCBs对环境和生态的不利影响，《斯德哥尔摩公约》将其列为持久性有机污染物，亟需探索高效降解PCBs的方法。
传统的土壤PCBs物理化学修复技术，如填埋法、热处理法、氧化法和金属还原法等通常成本高昂、治标不治本或环境不可持续。生物修复作为一种绿色经济且前景广阔的修复技术，可以有效弥补物理和化学修复技术的不足。微生物修复是指利用原有或人工培养的微生物，在适宜的环境中提高微生物代谢活性，促进微生物对污染物的降解，进而降低环境中污染物浓度的生物修复技术。与物理化学修复相比，微生物修复具有成本低、效率高、操作简便和无继发污染等特点，已成为修复污染土壤的有效措施。通常情况下，厌氧菌能将6氯以上的PCBs转化为低氯联苯，好氧菌能将5氯及以下的低氯联苯氧化为氯代苯甲酸。脱卤球菌属(Dehalococcus)、脱卤杆菌属(Dehalogenated Bacillus)、脱卤单胞菌属(Dehalogenomonas)和地杆菌属(Geobacterium)能以PCBs为底物进行有机卤化物呼吸，在PCBs厌氧脱氯中发挥作用。大多数微生物对PCBs的好氧氧化是一个以联苯为生长底物的共代谢过程，如伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、红球菌属(Rhodococcus)和假单胞菌属(Pseudomonas)。环境中的大部分微生物都是不可培养的，尤其是具有特定功能的微生物很难通过纯培养的方式分离获得。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种多氯联苯降解菌株TZ33，能够对多氯联苯PCB31起到良好降解效果。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
一种多氯联苯降解菌株TZ33，保藏编号为：GDMCC No：63419。
作为优选，多氯联苯降解菌株TZ33于2023年4月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：63419。
在上述的一种多氯联苯降解菌株TZ33，多氯联苯为PCB31。
本发明还提供了一种上述多氯联苯降解菌株TZ33的筛选方法，所述方法包括如下步骤：将含菌株TZ33的土壤用水稀释后，依次进行富集培养、分离和纯化得到菌株TZ33。
在上述多氯联苯降解菌株TZ33的筛选方法中，筛选过程中无机盐培养基包括：4-5g/L K2HPO4、1.5-2g/L KH2PO4、1.5-2.5g/L NH4Cl、2.5-3.5g/L NaCl、0.01-0.08g/L酵母浸膏、1.5-2.5g/L固体联苯。
本发明还提供了一种降解菌剂，菌剂包括上述多氯联苯降解菌株TZ33。
本发明还提供了一种上述降解菌剂在降解多氯联苯中的应用。
在上述的应用中，降解菌剂在多氯联苯污染的环境中对多氯联苯进行降解。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明本发明从浙江省台州市某电子垃圾拆解厂附近土壤中驯化和分离得到1株能以多氯联苯(PCB31)作为碳源的菌株Arthrobacter sp.TZ33，对其进行鉴定，发现其对多氯联苯PCB31具有良好降解能力，对筛选出能有效降解多氯联苯的菌株具有重要的应用价值和现实意义，并且丰富了PCBs降解菌菌库。
附图说明
图1是在以联苯为碳源的无机盐固体培养基上生长的TZ33。
图2是TZ33和其相关菌的基于16S rRNA基因序列的系统发生关系构建的系统发育树，构建方法为邻接法，自展值设定重复1000次，比例尺0.002代表每个核苷酸的替换率。
图3是在菌株TZ33降解5天后无机盐培养基中PCB31的浓度。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。这些实施方式是示例性的，本发明公开内容不限于此，且本文中所使用的附图，仅仅是为了更好地说明本发明所公开内容，对保护范围并不具有限制作用。如果无特殊说明，本发明以下具体实施例中所采用的原料均为本领域常用的原料，实施例中所采用的方法，均为本领域的常规方法。
实施例1：
Arthrobacter sp.TZ33的分离
1、材料与方法
1.1土壤样品采集
2021年10月在浙江省台州市某废弃电子拆解厂周边(东经：121°35′83″，北纬：28°47′18″)取表层土(0-20cm)运回实验室。所有肉眼可见的大块杂物，如较大的塑料碎片、木屑、碎石等，均使用镊子清除，过2mm筛。
1.2培养基
1.2.1无机盐培养基
表1：无机盐培养基配方
| 培养基组成 | 含量(g/L) |
| K2HPO4 | 4.4 |
| KH2PO4 | 1.7 |
| NH4Cl | 2.1 |
| NaCl | 3.0 |
| 酵母浸膏 | 0.05 |
| 固体联苯 | 2.0 |
| 基础盐溶液 | 10ml |
表2：基础盐溶液配方
| 组成 | 含量(g/L) |
| MgSO4 | 19.5 |
| MnSO4·H2O | 5.0 |
| FeSO4·H2O | 1.0 |
| CaCl2·H2O | 0.3 |
| 浓H2SO4 | 2-3滴 |
无机盐培养基用于样品中微生物的富集培养和纯菌条件下多氯联苯降解实验。该培养基配方见表1，无机盐培养基(不加基础盐溶液和固体联苯)在121℃、0.106MPa下灭菌20分钟，然后加入过0.22μm水系滤膜的基础盐溶液(表2)，用NaOH溶液调培养基的pH至7.0，最后加入紫外灭菌的固体联苯。
1.2.2营养培养基
营养培养基用于细菌的分离、纯化、保藏、活化等常规微生物的培养。本实验所用的液体营养培养基种类及成分见表3。若实验需要配制固体培养基，仅需在原有培养基配方的基础上增添1.5-2％的琼脂粉。培养基pH均调节至7.0。培养基装入锥形瓶，在121℃、0.106 MPa下灭菌20分钟。
表3：Luria-Bertani培养基(LB)成分
| 培养基组成 | 含量(g/L) |
| 蛋白胨 | 10 |
| 酵母浸膏 | 5 |
| NaCl | 10 |
1.3菌株的筛选、分离和纯化
在50ml无菌水中加入0.5g土壤样品，以200r min-1于振荡器上震荡30min。在100ml无机盐培养基中加入1ml土壤悬浊液，以30℃、150r min-1在恒温振荡培养箱中培养7天，在新的100ml无机盐培养基中加入1ml菌悬液，在相同条件下传代培养3次。
梯度稀释最后一代传代培养基，在LBS平板上涂布200μl 10-5稀释倍数的菌液，在30℃恒温培养箱培养2天以分离菌株。用接种环挑取不同的单菌落在LBS平板上划线纯化，将纯化3次后的纯菌菌株重悬于无菌水中，并涂布于以联苯为碳源的无机盐固体培养基上，在30℃恒温培养箱中培养3-4天，挑选出可利用联苯茁壮生长的菌株作为后续实验菌种。实验中筛选得到1株对联苯有降解性能的菌株，命名为TZ33。挑取纯化后的单菌落到相应液体营养培养基中培养至对数期，将菌液和无菌的甘油混合分装至无菌的2ml冻存管中(甘油浓度为15％)，放置于-80℃长期保存。
实施例2：
Arthrobacter sp.TZ33的鉴定
2.1筛选菌株TZ33形态特征
菌株TZ33是一株从浙江省台州市某电子垃圾拆解厂附近土壤中分离出的细菌，在30℃有氧条件下生长48h后，能形成直径为1.5-2.0mm白色、圆形、表面光滑、向上凸起的、革兰氏染色呈阳性的菌落。其在无机盐上生长的群落图见图1。
2.2筛选菌株TZ33的分子生物学鉴定
分子生物学特性鉴定主要包括测序及系统发育树的构建。提取菌株的基因组DNA，并进行PCR扩增。用于PCR扩增的引物为27F/1492R。扩增体系总体积为20μl，包含10μlAbsolute SYBER Fluorescein Mix(Thermo Scientific，New York，USA)、1ul模板、0.5μl上下引物、8ul ddH2O。扩增条件如下：94℃，5min；94℃，30sec；54℃，30sec；72℃，1.5min，共35个循环；最后72℃保持10min。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并委托上海生工生物工程公司测序。16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，共1473bp。
利用Blast软件将测得的序列与GenBank中已知的16S rRNA基因序列进行同源性比对。利用MEGAX64软件的neighbor-joining算法，构建菌株的系统发育树，如图2。
由以上结果可得出本实验所分离的细菌为节杆菌属微生物，命名为Arthrobactersp.TZ33，于2023年4月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：63419。
目前，在环境领域内关于该菌株的应用鲜有报道，得到的多氯联苯降解菌对含PCBs污染水体、底泥和土壤的处理和深度修复有重要的理论和实际意义。
实施例3：
多氯联苯(PCB31)降解实验
将处于2/3对数生长期的TZ33菌液于4℃、3600r min-1离心5min，弃上清液，用pH＝7.2的无菌磷酸盐缓冲液洗涤菌泥，再在相同条件下离心5min，重复3次，最后用无菌磷酸盐缓冲液调节菌悬液OD600＝1。
在玻璃瓶中加入5μl PCB31(100mg l-1)溶液，待溶剂挥发后，加入15ml未加联苯的无机盐培养基，在实验组中加2ml(OD600＝1)菌液，在对照组加2ml热杀菌液，瓶盖用铝箔衬垫。每组样品设3个平行，在30℃、150r·min-1恒温振荡培养箱中避光培养。
向培养5天的样品中加5ml正己烷(农残级)，0.4g硫酸铵(破乳剂)，涡旋振荡5min后静置1h，收集上清液，重复萃取3次。将3次得到的上清液混匀，加入适量无水硫酸钠，氮吹至干，加2ml正己烷后涡旋，取1ml液体样品过0.22μm有机滤膜于色谱样品瓶中，储存在4℃备用。为保证数据有效，用标准品(100mg l-1)检测回收率，平均回收率达83.3％，表明该方法可靠。
用于PCBs定性定量分析的色谱柱为Agilent 19091S-433UI(30m×0.25mm×0.25μm)，利用Agilent 5977A GC-MS进行分析。具体的分析条件为：分流进样，分流比为10:1，分流流量为10ml min-1。柱温采用程序升温方式，初始温度为200℃，保持8min，以40℃min-1的速率升温至280℃，总分析时间为15min，用外标法定量。降解率％＝(对照组浓度-实验组浓度)/对照组浓度×100％。
5天后，不同处理的培养基中PCB31浓度如图3所示，筛选菌对PCB31的降解率如表4所示。菌株TZ33对PCB31的降解率为46.97％，说明菌株TZ33是一种能够降解多氯联苯，且耐受多氯联苯能力很强的菌株。
表4：菌株对PCB31的5天降解率
综上所述，本发明从浙江省台州市某电子垃圾拆解厂附近土壤中富集分离获得1株能以多氯联苯为碳源生长的多氯联苯降解菌TZ33。该菌株为革兰氏阳性菌，能形成直径为1.0-2.0mm、白色、圆形、表面光滑、向上凸起的菌落。根据分子生物学手段分析，可得出本实验所分离的细菌TZ33为节杆菌属微生物。菌株TZ33能够利用多氯联苯作为碳源对其进行降解，在PCB31初始浓度为29ppb的无机盐培养基中培养5天后，降解率可达到46.97％。TZ33是一种能够降解多氯联苯且对多氯联苯具有很强耐受能力的菌株，在生物修复方面具有较好的应用潜力。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (7)
1.一种多氯联苯降解菌株TZ33，其特征在于，保藏编号为：GDMCCNo：63419。
2.根据权利要求1所述多氯联苯降解菌株TZ33，其特征在于，多氯联苯为PCB31。
3.一种如权利要求1所述多氯联苯降解菌株TZ33的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将含菌株TZ33的土壤用水稀释后，依次进行富集培养、分离和纯化得到菌株TZ33。
4.根据权利要求3所述的一种多氯联苯降解菌株TZ33的筛选方法，其特征在于，筛选过程中无机盐培养基包括：4-5g/L K2HPO4、1.5-2g/LKH2PO4、1.5-2.5g/L NH4Cl、2.5-3.5g/LNaCl、0.01-0.08g/L酵母浸膏、1.5-2.5g/L固体联苯。
5.一种降解菌剂，其特征在于，菌剂包括权利要求1所述多氯联苯降解菌株TZ33。
6.一种如权利要求5所述的降解菌剂在降解多氯联苯中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，降解菌剂在多氯联苯污染的环境中对多氯联苯进行降解。
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