CN104724807A - 柠檬酸杆菌在利用废藻循环制备生物絮凝剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及柠檬酸杆菌在利用废藻循环制备生物絮凝剂中的应用，属于处理水华的方法。将柠檬酸杆菌经发酵培养得到发酵液，接种量以发酵培养基总重量计为0.5-2%，离心除去菌丝体，得到上清液；将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下12小时，混合液离心后，将得到的沉淀3~5g溶解于100ml的去离子水中，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡3~4小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀；将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml的去离子水，真空干燥，得产品。优点是极大的降低了生物絮凝剂的生产成本，不会带来二次污染；易被微生物降解、无毒无害、安全性高，有利于提高生物絮凝剂的应用推广。

Description

柠檬酸杆菌在利用废藻循环制备生物絮凝剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种处理水华的方法，具体涉及一种通过菌种利用废藻循环制取可絮凝除藻的生物絮凝剂的方法。

背景技术

由于农业化肥的流失、生活污水、养殖业及工业污水的排放、矿物燃料的燃烧，氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体，造成水体的富营养化。在富营养化的淡水水体中，蓝藻在条件适宜的条件下大量繁殖，形成“水华”。藻类的过度繁殖危害严重，已经成为全球性的环境问题。藻类的大规模爆发，使水体溶解氧降低，甚至缺氧厌氧，致使水生生物死亡，严重破坏水生态系统；藻类分泌的藻毒素危害水生物、人畜，具有致癌作用；饮用水源地的蓝藻污染，使水质恶化，提高了制水成本。最新调查数据显示：在我国183个调查湖泊中，富营养状态的湖泊13个，占湖泊数量的7.1%；重富营养状态的湖泊78个，占湖泊数量的42.62%。面对我国湖泊水库富营养化的严峻形势，主要的应对措施还是以预防为主，在蓝藻爆发后，缺少快速、有效、安全的处理办法。而另一方面，已有报道藻类含有丰富的蛋白质和脂类物质，藻类也已经被作为一种资源得到了深入的开发和研究， 但是能够把藻类的资源化和含藻废水的处理有效结合从而达到“以藻治藻”和“废藻资源化”的双重目的实践应用非常缺乏。

在规模化治理含藻废水的实践中，生物絮凝剂已经被发现具有传统应急化学絮凝剂所不具备的优点。已有研究表明聚合氯化铝（PAC）、聚合氯化铁（PFC）、聚丙烯酰胺等被证实存在健康安全隐患，例如铝超标及丙烯酰胺单体能够危害人的神经系统和促发细胞癌变；同时也使水体引入了金属离子和次级污染物质，能够造成二次污染。生物絮凝剂其主要成分为多糖、核酸及蛋白聚糖，因此具有应性强、安全性高、来源广泛的优点。但是在规模化治理含藻水的应用中，需要大量的生物絮凝剂，其生产中需要大量有机碳源，例如葡萄糖、有机及无机氮源如尿素和铵盐、及很多菌株生长必须的矿物质元素，其成本限制了生物絮凝剂的规模治藻的实践应用。

发明内容

本发明提供一种柠檬酸杆菌在利用废藻循环制备生物絮凝剂中的应用，以解决生物絮凝剂成本高，限制规模治藻的问题。

本发明采取的技术方案是：

柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)在利用废藻循环制备生物絮凝剂中的应用。

所述的柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)，其16SrDNA序列如SEQ ID No.1所述。

采用所述柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)制备生物絮凝剂的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(a) 将柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)经发酵培养得到发酵液，所述发酵培养的培养基中含葡萄糖1%-2%，藻细胞湿重为5%-8%，其余为水，pH6.0-8.0；接种量以发酵培养基总重量计为0.5-2%，培养温度为20-35℃，振荡培养，时间为40-120小时，离心除去菌丝体，得到上清液；

 (b) 将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下12小时，混合液离心后，将得到的沉淀3~5g溶解于100ml的去离子水中 ，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡3~4小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml 的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀；

（c）将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml 的去离子水，真空干燥，得产品。

采用所述的生物絮凝剂处理含藻水的方法，包括下列步骤：

（1）在含藻水中加入10%的CaCl₂水溶液助凝剂，搅拌均匀，含藻水与助凝剂的体积比为90：(5-10)；

 （2）加入生物絮凝剂，搅拌均匀，其中步骤1中的含藻水与生物絮凝剂的体积比为90：(5-10)。

所述的采用生物絮凝剂处理含藻水的方法，所述生物絮凝剂除藻的pH值为4-10。

本发明所用柠檬酸杆菌Citrobacter sp. AzoR-1)能够利用絮凝剂回收得到的废藻生物质作为营养源持续制备该絮凝剂，从而实现 “以藻治藻”和“废藻资源化”的双重目的。能将治藻过程中的废藻持续并大量的转化为治藻所需的生物絮凝剂，可以大幅降低生物絮凝剂的生产成本，提高含藻废水的治理效率和生物絮凝剂规模化生产的可行性。

本发明所提供的生物絮凝剂的制备方法可由灭菌的废藻细胞作为主要的生物质营养源，极大的降低了生物絮凝剂的生产成本，有利于提高生物絮凝剂的应用推广。虽然生物絮凝剂在处理含藻水的实践应用还处于探索阶段，其已经具有很大优势，具体表现在：除藻的高效絮凝性：生物絮凝剂对于含藻水的处理表现为用量少，絮凝率高；除藻过程无二次污染：尽管微生物产生的絮凝剂成分随菌种的不同而不同，目前已报到的生物絮凝剂物质多为糖蛋白、粘多糖、纤维素和DNA等物质，但生物絮凝剂都具有可降解性，因而絮凝除藻以后不会带来二次污染；易被微生物降解、无毒无害、安全性高：经小白鼠安全试验证明，生物絮凝剂完全能用于食品、医药等行业；本专利所应用的生物絮凝剂还具有不受温度影响、用量小等特点，在酸性和中性条件下对于含藻水具有良好的絮凝效果。

附图说明

图1是本发明实验例1提供的生物絮凝剂的红外吸收光谱图；

图2是本发明实验例3提供的生物絮凝剂对高岭土和含藻废水的絮凝效率图；

图3是本发明实验例3提供的生物絮凝剂对含藻废水的絮凝效果图，左为含藻水不加絮凝剂的对照，中为含藻水加入枯草芽孢杆菌所产生的絮凝剂，右为本专利所采用的絮凝剂除藻效果。

具体实施方式

柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)在利用废藻循环制备生物絮凝剂中的应用。

所述的柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)，其16SrDNA序列如SEQ ID No.1所述。

以下各实施例中都采用上述柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)。

实施例1

一种柠檬酸杆菌的生物絮凝剂的制备方法，包括下列步骤：

(a) 将柠檬酸杆菌经发酵培养得到发酵液，所述发酵培养的培养基中含葡萄糖1%，藻细胞湿重为5%，其余为水，pH6.0；接种量以发酵培养基总重量计为0.5%，培养温度为20℃，振荡培养，时间为40小时，离心除去菌丝体，得到上清液；

(b) 将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下12小时，混合液离心后，将得到的沉淀3~5g溶解于100ml的去离子水中 ，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡3小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml 的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀；

（c）将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml 的去离子水，真空干燥，得产品。

采用所述的生物絮凝剂处理含藻水的方法，包括下列步骤：

（1）在含藻水中加入10%的CaCl₂水溶液助凝剂，搅拌均匀，含藻水与助凝剂的体积比为90：5；

 （2）加入生物絮凝剂，搅拌均匀，其中步骤1中的含藻水与生物絮凝剂的体积比为90：5；

所述生物絮凝剂除藻的pH值为4-10。

实施例2

采用所述柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)制备生物絮凝剂的方法，包括下列步骤：

(a) 将柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)经发酵培养得到发酵液，所述发酵培养的培养基中含葡萄糖1.5%，藻细胞湿重为6.5%，其余为水，pH7.0；接种量以发酵培养基总重量计为1.2%，培养温度为28℃，振荡培养，时间为80小时，离心除去菌丝体，得到上清液；

 (b) 将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下12小时，混合液离心后，将得到的沉淀4g溶解于100ml的去离子水中 ，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡3.5小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml 的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀；

（c）将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml 的去离子水，真空干燥，得产品。

采用所述的生物絮凝剂处理含藻水的方法，包括下列步骤：

（1）在含藻水中加入10%的CaCl₂水溶液助凝剂，搅拌均匀，含藻水与助凝剂的体积比为90：7.5；

 （2）加入生物絮凝剂，搅拌均匀，其中步骤1中的含藻水与生物絮凝剂的体积比为90：7.5；

所述生物絮凝剂除藻的pH值为7。

实施例3

采用所述柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)制备生物絮凝剂的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(a) 将柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)经发酵培养得到发酵液，所述发酵培养的培养基中含葡萄糖2%，藻细胞湿重为8%，其余为水，pH8.0；接种量以发酵培养基总重量计为2%，培养温度为35℃，振荡培养，时间为120小时，离心除去菌丝体，得到上清液；

 (b) 将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下12小时，混合液离心后，将得到的沉淀5g溶解于100ml的去离子水中 ，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡4小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml 的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀；

（c）将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml 的去离子水，真空干燥，得产品。

采用所述的生物絮凝剂处理含藻水的方法，包括下列步骤：

（1）在含藻水中加入10%的CaCl₂水溶液助凝剂，搅拌均匀，含藻水与助凝剂的体积比为90：10；

 （2）加入生物絮凝剂，搅拌均匀，其中步骤1中的含藻水与生物絮凝剂的体积比为90：10；

所述生物絮凝剂除藻的pH值为10。

实施例4

采用所述柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)制备生物絮凝剂的方法，包括下列步骤：

(a) 将柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)经发酵培养得到发酵液，所述发酵培养的培养基中含葡萄糖1%，藻细胞湿重为5%，其余为水，pH6.5；接种量以发酵培养基总重量计为0.8%，培养温度为25℃，振荡培养，时间为80小时，离心除去菌丝体，得到上清液；

 (b) 将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下12小时，混合液离心后，将得到的沉淀3g溶解于100ml的去离子水中 ，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡3小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml 的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀；

（c）将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml 的去离子水，真空干燥，得产品。

采用所述的生物絮凝剂处理含藻水的方法，包括下列步骤：

（1）在含藻水中加入10%的CaCl₂水溶液助凝剂，搅拌均匀，含藻水与助凝剂的体积比为90：5；

 （2）加入生物絮凝剂，搅拌均匀，其中步骤1中的含藻水与生物絮凝剂的体积比为90：5。

所述生物絮凝剂除藻的pH值为4。

实施例5

采用所述柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)制备生物絮凝剂的方法，包括下列步骤：

(a) 将柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)经发酵培养得到发酵液，所述发酵培养的培养基中含葡萄糖1.5%，藻细胞湿重为6.5%，其余为水，pH7.0；接种量以发酵培养基总重量计为1.1%，培养温度为27℃，振荡培养，时间为90小时，离心除去菌丝体，得到上清液；

 (b) 将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下12小时，混合液离心后，将得到的沉淀4g溶解于100ml的去离子水中 ，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡3.5小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml 的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀；

（c）将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml 的去离子水，真空干燥，得产品。

采用所述的生物絮凝剂处理含藻水的方法，包括下列步骤：

（1）在含藻水中加入10%的CaCl₂水溶液助凝剂，搅拌均匀，含藻水与助凝剂的体积比为90：7.5；

 （2）加入生物絮凝剂，搅拌均匀，其中步骤1中的含藻水与生物絮凝剂的体积比为90：7.5；

所述生物絮凝剂除藻的pH值为7。

实施例6

采用所述柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)制备生物絮凝剂的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(a) 将柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)经发酵培养得到发酵液，所述发酵培养的培养基中含葡萄糖2%，藻细胞湿重为8%，其余为水，pH7.5；接种量以发酵培养基总重量计为1.5%，培养温度为30℃，振荡培养，时间为100小时，离心除去菌丝体，得到上清液；

 (b) 将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下12小时，混合液离心后，将得到的沉淀5g溶解于100ml的去离子水中 ，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡4小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml 的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀；

（c）将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml 的去离子水，真空干燥，得产品。

采用所述的生物絮凝剂处理含藻水的方法，包括下列步骤：

（1）在含藻水中加入10%的CaCl₂水溶液助凝剂，搅拌均匀，含藻水与助凝剂的体积比为90：10；

 （2）加入生物絮凝剂，搅拌均匀，其中步骤1中的含藻水与生物絮凝剂的体积比为90：10；

所述生物絮凝剂除藻的pH值为10。

实验例1、本发明生物絮凝剂的组分鉴定

将冷冻干燥得到的絮凝剂取少量配成5g/L的溶液，将其进行紫外扫描，并做糖的鉴定实验，同时用KBr压片法对絮凝剂干粉进行红外扫描，结果见图1：

从紫外吸收光谱可以看出，MBF-N22在260nm和280nm处均未发现吸收峰，而260nm和280nm分别是核酸和蛋白质的特征吸收峰，因此，可以推断MBF-N22中不含有核酸和蛋白成分。

本絮凝剂的的红外光谱图是一个典型的多糖红外光谱图，特别是在3431. 7cm^-1和1739. 9cm^-1处具有较强的吸收，强度为35-45%，表明该多糖絮凝剂具有较多的羟基和羧基基团。

从紫外扫描、红外扫描以及显色反应来看，絮凝剂的主要成分是多糖，不含核酸与蛋白质类物质，进一步用苯酚硫酸法测得其多糖含量为80~95%。

本生物絮凝剂的相对分子质量为9×10⁴-3×10⁵Da。

实验例2、絮凝菌株的筛选

 (1)菌种筛选方法：

种子培养基(gl^-1)：

①牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10，牛肉膏3.0，NaCl 5.0，琼脂15-20，pH7.0-7.2，

②查氏培养基：蔗糖30，NaN0₃ 2，KCl 0.5，K₂HP0₄ 1，MgS0₄· 7H₂0  0.5．FeS0₄  0.01，

发酵培养基(gl^-1)：葡萄糖20，藻细胞生物质（湿重）40，其余为水，pH7.0，

以上培养基均在121℃，0.1MPa灭菌30min。

培养条件：将菌株接种于液体发酵培养基，150rpm，30℃振荡培养3天，检测发酵液的絮凝活性。

初筛方法：取0.1ml发酵液加至装有9ml高岭土悬浊液和0.4m12%CaCl₂的10ml试管中，加蒸馏水定容至刻度，上下混匀后，静置片刻，目测高岭土溶液的絮凝状况，将其中絮凝活性高的菌株作为复筛菌株。

复筛方法：将初筛得到的高絮凝活性菌株的发酵液取1ml加至装有90ml高岭土溶液和1ml 2% CaCl₂，的100ml量筒中，加去离子水定容至刻度100ml，振荡后静置5min，取上清于紫外分光光度计550nm处测吸光度值，对照用水代替发酵液。

 (2)筛选结果

从活性污泥中分离得到的118多株细菌与20多株真菌中，筛选得到十余株细菌和1株真菌的发酵液具有较好的絮凝活性，其中一株编号为N22的细菌的絮凝活性最高，达到95%以上，因此将其作为目标菌。

(3)目标菌种特征

为革兰氏阴性杆菌，为较短粗的杆菌，大小0.5～0.8×1～2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。

根据菌株的形态学特征以及16SrDNA序列分析，确定该菌株为柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)

实验例3本发明生物絮凝剂的应用

将本发明培养得到的发酵液离心除去菌丝体，保留上清作为絮凝剂。在100ml量筒中加入90ml待絮凝溶液（如高岭土悬浊液、含藻废水等），5mL (CaCl₂，)=1%的水溶液，按照不同的投加量(%，V/V)加入培养基液体，加蒸馏水至100mL，调节pH至8.0，倒入150mL烧杯中，混合，搅拌3min，静置5min，吸取上清液于紫外分光光度计550nm处测定吸光度(A)，以不加絮凝剂的吸光度(A₀)为对照来确定絮凝剂的絮凝活性，以絮凝率表示：

絮凝率(%)=(A₀-A)/A₀× 100%

结果见图2

图2，MBF-N22对高岭土悬浊液的絮凝效果

A₅₅₀：高岭土悬浊液在550nm处的吸光度值

絮凝率(%) = (A₅₅₀投加前 –A₅₅₀投加后)/ A₅₅₀投加前× 100% 

图2，MBF-N22对含藻废水的絮凝效果

A₇₅₀：含藻废水在750nm处的吸光度值

絮凝率(%) = (A₇₅₀投加前 –A₇₅₀投加后)/ A₇₅₀投加前× 100%

结果表明，本发明提供的生物絮凝剂在加量为l‰-1% (v/v)的范围内，含藻废水均具有良好的絮凝效果，特别是在处理含藻废水中，絮凝效果可以达到90%以上。

本发明的生物絮凝剂具有广泛的应用，例如但不限于，处理含藻废水；改善污泥的沉降性能；去除废水中的悬浮颗粒；处理含有高悬浮物的建筑材料加工废水；处理养殖厂废水；对还有色度的废水如墨水、糖蜜废水、造纸黑液、颜料废水等进行处理，上清液呈无色透明；对乳化液的油水分离；鞣革工业废水的处理；取代发酵工业和食品工业传统工艺中的离心和过滤分离细胞、回收发酵废液中有用的产品等以及城市污水的处理等。

序列表

<110>  东北师范大学

 <120>  柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)在利用废藻循环制备生物絮凝剂中的应用

<130>  nenuhmy-201501

<160>  1

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1427

<212>  DNA

<213>  柠檬酸杆菌

<400>  1

gcagtcgaac ggtagcacag aggagcttgc tccttgggtg acgagtggcg gacgggtgag     60

taatgtctgg gaaactgccc gatggagggg gataactact ggaaacggta gctaataccg    120

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                               序列表

<110>  东北师范大学

 <120>  柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)在利用废藻循环制备生物絮凝剂中的应用

<130>  nenuhmy-201501

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1427

<212>  DNA

<213>  柠檬酸杆菌

 

<400>  1

gcagtcgaac ggtagcacag aggagcttgc tccttgggtg acgagtggcg gacgggtgag     60

taatgtctgg gaaactgccc gatggagggg gataactact ggaaacggta gctaataccg    120

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Claims (8)

1.柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)在利用废藻循环制备生物絮凝剂中的应用。

2.如权利要求1所述的柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)，其16SrDNA序列如SEQ ID No.1所述。

3.一种采用如权利要求1或2所述柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1) 制备生物絮凝剂的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(a) 将柠檬酸杆菌(Citrobacter sp. AzoR-1)经发酵培养得到发酵液，所述发酵培养的培养基中含葡萄糖1%-2%，藻细胞湿重为5%-8%，其余为水，pH6.0-8.0；接种量以发酵培养基总重量计为0.5-2%，培养温度为20-35℃，振荡培养，时间为40-120小时，离心除去菌丝体，得到上清液；

(b) 将上清液加2倍体积乙醇于4℃条件下12小时，混合液离心后，将得到的沉淀3~5g溶解于100ml的去离子水中 ，同时加入50ml的2%的氯化十六烷吡啶，震荡3~4小时，之后，收集沉淀并溶解于100ml 的0.5M的NaCl溶液，再加2倍体积的乙醇，离心并收集沉淀；

(c)将收集的沉淀用乙醇洗脱，并溶于5ml 的去离子水，真空干燥，得产品。

4.根据权利要求3所述的生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，发酵培养pH6.5-7.5。

5.根据权利要求3所述的生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，接种量以发酵培养基总重量计为0.8-1.5%。

6.根据权利要求3所述的生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，发酵培养的培养温度为25-30℃，培养时间为80-100小时。

7.一种采用权利要求3所述的生物絮凝剂处理含藻水的方法，其特征在于包括下列步骤：

（1）在含藻水中加入10%的CaCl₂水溶液助凝剂，搅拌均匀，含藻水与助凝剂的体积比为90：(5-10)；

 （2）加入生物絮凝剂，搅拌均匀，其中步骤1中的含藻水与生物絮凝剂的体积比为90：(5-10)。

8.根据权利要求7所述的采用生物絮凝剂处理含藻水的方法，其特征在于所述生物絮凝剂除藻的pH值为4-10。