CN105731657B - 一种微生物絮凝剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物絮凝剂的制备方法，在无菌台上，选择披发戈登氏菌单菌落作为纯种，然后用接种环将单菌接到灭过菌装有50mL液体LB 100mL的锥形瓶中，在摇床中进行发酵培养；将温度设定为30℃，培养72h；72h培养后，获得的发酵液即为微生物絮凝剂。本发明的微生物絮凝剂的制备方法，分离筛选出一种微生物，将其代谢产物制备成高效絮凝剂，并且具有无毒、环保的特点。这种微生物絮凝剂主要由生物活性物质组成，且易生物降解，无二次污染，克服了无机和有机絮凝剂使用时存在的安全与环境污染方面的问题，其对污水中悬浮物的絮凝能力与传统的絮凝剂相当。
Description
技术领域
本发明属于微生物絮凝剂技术领域，具体涉及一种微生物絮凝剂的制备方法。
背景技术
随着经济的高速发展和人口的增长，我国每年的用水量和污水排放量也在增加，污水处理问题日益严峻，给水处理问题也不容忽视。目前，水和废水的处理方法主要有生化、离子交换、吸附、化学氧化、电渗析和絮凝沉淀等多种。其中应用最普遍、成本较低的处理方法是絮凝沉淀法。在絮凝沉淀法处理废水中，絮凝剂的开发选择是其关键技术之一。絮凝剂作为一种用途广泛的水处理试剂，不仅应用于工业废水处理，同时也广泛应用于发酵工业水处理以及化工、食品、医药等领域的固液分离过程。
长期以来用于给水和废水处理常用的絮凝剂主要以铝盐、铁盐及其聚合物为代表的无机絮凝剂和以聚丙烯酰胺为代表的有机高分子絮凝剂。这些絮凝剂虽然有较好的絮凝活性，但是它们的残留物多有害，且存在二次污染问题。同时也危害着人类的健康。
由于应用铝盐絮凝剂法处理后的污泥作为肥料应用于农业，或者填埋后，导致土壤中的铝含量升高，使植物出现铝害，从而影响植物正常生长，甚至死亡；同时伴随着农作物进入食物链，最终影响人类的健康，引起铝性脑病。老年性痴呆症就是铝性脑病的一种。铁性絮凝剂不仅具有强烈的腐蚀性，限制设备的使用，而且容易残留铁离子，而且被处理后的水带有色度。
合成有机高分子絮凝剂最常用的就是聚丙烯酰胺。其虽然本身没有任何毒性，但其难降解性却易造成二次污染，而且聚合物单体的残留不仅具有强烈的神经毒性，而且是强致癌物。因此这类的絮凝剂的使用受到了制约。同时开发无毒、无害、无二次污染，可以生物降解的高效絮凝剂受到研究者越来越多的关注。
微生物絮凝剂（MBF，microbial flocculant）是一类由微生物或其分泌物产生的代谢产物，它是利用微生物技术，通过细菌、真菌等微生物发酵、提取、精制而得的，是具有生物分解性和安全性的高效、无毒、无二次污染的水处理剂。它主要由微生物代谢产生的各种多聚糖类、蛋白质，或是蛋白质和糖类参与形成的高分子化合物。能产生微生物絮凝剂的微生物种类很多，它们大量存在于土壤、活性污泥和沉积物中。
对微生物絮凝剂的研究，最早见报道的是1935年Butterfield从活性污泥中筛选到一株絮凝剂产生菌。随后的研究者在这方面继续进行了研究。70年代J.Nakamura等人从霉菌、细菌、放线菌、酵母菌等214株菌中筛选出19株絮凝剂产生菌株，包括8株霉菌、5株细菌、5株放线菌和1株酵母菌。其中Aspergzllussoda产生的絮凝剂AJ7002效果最好；TakagiH等从土壤中分离到一株对多种微生物细胞和悬浮胶体颗粒具有良好絮凝作用的真菌Paecilomyces sp.；八十年代末Kurane等人从土壤中分离筛选一株R. erythropolis ,制成了命名为NOC-1的微生物絮凝剂。Kurane等人将NOC一1用于畜产废水、膨胀污泥和砖场生产废水等的处理，均取得了很好的效果，被认为是目前发现的最好的微生物絮凝剂。
目前，韩国的Kwon G.S.，Seo HyunHyo, Kim Young-Jun等人，德国的P.Reinhard以及以色列的N. Levy等人也对微生物絮凝剂进行了较为全面的研究。[3]至今研究者已经获得了多株具有不同絮凝能力的微生物絮凝剂产生菌，这些微生物絮凝剂在使用过程中具有高效、安全、不污染环境的优点，在食品、化学以及制药等领域具有巨大的潜在应用价值。
我国对于絮凝剂产生菌及微生物絮凝剂的研究起步较晚，从20世纪90年代起，国内有关絮凝剂产生菌及微生物絮凝剂的报道越来越多，特别是近几年来我国的科学工作者已筛选出了一些絮凝剂产生菌，有的还进行了制备和应用方面的研究。但是迄今为止，还没有微生物絮凝剂成品出售，基本上还停留在实验室阶段，并且多数集中在絮凝剂产生菌的筛选研究方面。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种微生物絮凝剂的制备方法，分离筛选出一种微生物，将其代谢产物制备成高效絮凝剂，并且具有无毒、环保的特点。
技术方案：为了上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种微生物絮凝剂的制备方法，在无菌台上，选择披发戈登氏菌单菌落作为纯种，然后用接种环将单菌接到灭过菌装有50mL液体LB 100mL的锥形瓶中，在摇床中进行发酵培养；将温度设定为30℃，培养72h；72h培养后，获得的发酵液即为微生物絮凝剂。
所述的发酵液于6000r/min转速下离心15min，取上清液作为微生物絮凝剂。
所述的微生物絮凝剂的制备方法所获得微生物絮凝剂。
所述的微生物絮凝剂，添加量为10-15mL发酵液/1000mL被絮凝溶液。
有益效果：与现有技术相比，本发明的微生物絮凝剂的制备方法，分离筛选出一种微生物，将其代谢产物制备成高效絮凝剂，并且具有无毒、环保的特点。这种微生物絮凝剂主要由生物活性物质组成，且易生物降解，无二次污染，克服了无机和有机絮凝剂使用时存在的安全与环境污染方面的问题，其对污水中悬浮物的絮凝能力与传统的絮凝剂相当。
附图说明
图1是絮凝剂在发酵液中的活性分布结果图；
图2是絮凝剂与AlCl3的絮凝效果比较结果图；
图3是不同絮凝剂投加量的絮凝效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1 菌种的分离培养
1）取样：取地表以下25cm处土壤30g置于200mL烧杯中粉碎后加蒸馏水溶解、过滤取其上清液；取活性污泥100mL置于100mL烧杯中，充分搅拌后静止20min，取其上清液待用。
2）稀释水样：将1瓶90mL和5管9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次编号。在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取10mL水样置于第一瓶90mL无菌水中，将移液管吹洗3次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样的方法，依次稀释到10-6。
3）平板涂布接种：用1mL无菌移液管从10-1稀释水样中吸取1mL水样分别接入牛肉膏平板培养基、高氏一号平板培养基、查氏平板培养基，涂布均匀。同样的方法，从其他各种稀释水样中吸取1mL水样均匀涂布于对应得各种平板培养基。涂布结束后，用透明胶带封装好放入生化培养箱中，控制温度30℃，培养3天。
4）菌种分离：选取菌种分布均匀的平板，在其上挑出单个菌落转接于装有同样培养基的试管斜面培养基，依次编号后放入生化培养箱，控制温度30℃，进行纯化培养。
5）初步筛选方法：将分离得到的纯种菌株接种到对应的培养液中，控制温度30℃，摇床转速控制150r/min，振荡培养72h。培养液发酵培养后取出，静置20分钟用滴管取上清液2mL，加入50mL4g/L的高岭土悬浊液中，同时加入1mL浓度为1%的CaCl2溶液作为助凝剂，快速振荡1min后，视其絮凝矾花出现的快慢和沉降速度来进行絮凝剂产生菌的初筛。
6）复选方法：在100mL量筒中加入100mL 4g/L高岭土悬浊液，2mL发酵液上清液（培养液静置20分钟后用移液管吸取，下同），2mL浓度为1%的CaCl2助凝剂，调节pH值至7.0，用玻璃棒快速搅拌1min，慢速搅拌2min，静止10min。同时以不加发酵液上清液的高岭土悬浊液作为对照液。取同一高度（40mL处）高岭土悬浊液上清液10mL于浊度计比色管中，通过测其浊度来衡量其絮凝率。絮凝率的计算方法如下：
式中，A——对照上清液的浊度值；B——样品上清液的浊度值。
选中其中一株絮凝率最高的菌株。
7）菌种的鉴定：对删选出的菌株提取DNA，并进行测序，与美国NCBI数据库进行比对，鉴定出微生物的种类，结果表明为披发戈登氏菌（Gordonia hirsuta），与现有的披发戈登氏菌相同。
实施例2
在无菌台上，选择披发戈登氏菌（实施例1筛选的或现有的披发戈登氏菌）单菌落作为纯种，然后用接种环将单菌接到灭过菌装有50mL液体LB 100mL的锥形瓶中，在摇床中进行发酵培养。将温度设定为30℃，培养72h。72h培养后，发酵液于6000r/min转速下离心15min，取上清液作为微生物絮凝剂。
准备1000mL的烧杯倒入配好的高岭土悬浊液（4g/L），加入25mL 1%CaCl2溶液，加入高岭土悬浊液至500mL用Ca（OH）2或HCl调pH至8，加入10mL发酵液，180r/min快搅30s，80r/min慢搅5min，静置5min。在721型分光光度计 550nm 处测定上层清液吸光度。以不加发酵液的样品作对照（CK）。用絮凝率表示絮凝活性，其计算公式如下：
式中，A——对照上清液的浊度值；B——样品上清液的浊度值。
结果显示絮凝率为95.70%。
实施例3
对实施例2制备的发酵液进行了如下处理：将发酵液离心6000r/min，15min，取上清液作为1号样品，取菌体洗涤，配成悬浊液作为3号样品，以未处理的发酵液作为2号样品，测定它们对高岭土悬浊液的絮凝活性，结果如图1所示。
从图1可以看出，披发戈登氏菌悬液的絮凝活性仅为38.68%，去菌体的发酵液和未除菌的发酵液的絮凝活性维持在较高水平，分别为 87.58%和 93.88%，可见起絮凝作用的主要物质存在于发酵液中，是由微生物产生并分泌到胞外的。因此，在由披发戈登氏菌生的微生物絮凝剂的实际应用中，不需去除菌体可以直接使用，从而更利于该微生物絮凝剂的实际应用。
实施例4
取容器倒入配好的高岭土悬浊液（4g/L），加入25mL 1%CaCl2溶液，加入高岭土悬浊液至500mL用Ca（OH）2调节pH 至 8，分别加入5、10、15、20mL的发酵液、5%AlCl3溶液和10%AlCl3溶液，180r/min 快搅 30s，80r/min 慢搅 5min，静置 5 min。在 721型分光光度计550nm 处测定上层清液吸光度。算出絮凝活性，结果如图2所示，可以看出披发戈登氏菌发酵液的絮凝率明显比5%AlCl3溶液和10%AlCl3溶液的絮凝率高，披发戈登氏菌发酵液的絮凝率平均在80%以上，而5%AlCl3溶液和10%AlCl3溶液的絮凝率在40%左右，可见披发戈登氏菌微生物絮凝可以有很大的应用空间。
不同絮凝剂投加量的絮凝效果如图3所示，可以看出投加量为15mL的时候，絮凝率最好为92.52%，而投加量为10mL时絮凝率为91.38%，继续增加絮凝剂的量絮凝率会保持稳定或下降。所以投加量在10-15mL之间最好。
Claims (4)
1.一种微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)菌种的分离培养
取样：取地表以下25cm处土壤30g置于200mL烧杯中粉碎后加蒸馏水溶解、过滤取其上清液；
稀释水样：将1瓶90mL和5管9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次编号；在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取10mL上清液置于第一瓶90mL无菌水中，将移液管吹洗3次，摇匀即为10-1浓度菌液；取10-1浓度菌液1mL加入编号为10-2管，混匀获得10-2浓度菌液；取10-2浓度菌液1mL加入编号为10-3管，混匀获得10-3浓度菌液；取10-3浓度菌液1mL加入编号为10-4管，混匀获得10-4浓度菌液；取10-4浓度菌液1mL加入编号为10-5管，混匀获得10-5浓度菌液；取10-5浓度菌液1mL加入编号为10-6管，混匀获得10-6浓度菌液；
平板涂布接种：用1mL无菌移液管从10-1稀释水样中吸取1mL水样分别接入牛肉膏平板培养基、高氏一号平板培养基、查氏平板培养基，涂布均匀；同样的方法，从其他各种稀释水样中吸取1mL水样均匀涂布于对应得各种平板培养基；涂布结束后，用透明胶带封装好放入生化培养箱中，控制温度30℃，培养3天；
菌种分离：选取菌种分布均匀的平板，在其上挑出单个菌落转接于装有同样培养基的试管斜面培养基，依次编号后放入生化培养箱，控制温度30℃，进行纯化培养；
初步筛选方法：将分离得到的纯种菌株接种到对应的培养液中，控制温度30℃，摇床转速控制150r/min，振荡培养72h；培养液发酵培养后取出，静置20分钟用滴管取上清液2mL，加入50mL4g/L的高岭土悬浊液中，同时加入1mL浓度为1％的CaCl2溶液作为助凝剂，快速振荡1min后，视其絮凝矾花出现的快慢和沉降速度来进行絮凝剂产生菌的初筛；
复选方法：在100mL量筒中加入100mL 4g/L高岭土悬浊液，2mL发酵液上清液，培养液静置20分钟后用移液管吸取，下同，2mL浓度为1％的CaCl2助凝剂，调节pH值至7.0，用玻璃棒快速搅拌1min，慢速搅拌2min，静止10min；同时以不加发酵液上清液的高岭土悬浊液作为对照液；取同一高度40mL处高岭土悬浊液上清液10mL于浊度计比色管中，通过测其浊度来衡量其絮凝率；絮凝率的计算方法如下：
式中，A——对照上清液的浊度值；B——样品上清液的浊度值；
选中其中一株絮凝率最高的菌株；
菌种的鉴定：对筛选出的菌株提取DNA，并进行测序，与美国NCBI数据库进行比对，鉴定出微生物的种类，结果表明为披发戈登氏菌；
2)在无菌台上，选择筛选出的披发戈登氏菌单菌落作为纯种，然后用接种环将单菌接到灭过菌装有50mL液体LB 100mL的锥形瓶中，在摇床中进行发酵培养；将温度设定为30℃，培养72h；72h培养后，获得的发酵液即为微生物絮凝剂。
2.根据权利要求1所述的微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，所述的发酵液于6000r/min转速下离心15min，取上清液作为微生物絮凝剂。
3.权利要求1所述的微生物絮凝剂的制备方法所获得微生物絮凝剂。
4.根据权利要求3所述的微生物絮凝剂，其特征在于，添加量为10-15mL发酵液/1000mL被絮凝溶液。
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| 高效微生物絮凝剂的研究及应用;魏炜，霍石磊，李佳等;《沈阳建筑大学学报(自然科学版)》;20110331;第27卷(第2期);第351页左栏第一段至第354页第3节，第355-356页第4.1-5节 |
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