CN101070203A - 利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法 - Google Patents

Abstract

利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法，涉及一种生物絮凝剂的制备方法，其工艺如下：A.将奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)转种到斜面培养基上，并保藏在冰箱2～6℃中；B.将保藏的菌种接种到种子培养基中，然后在摇床培养箱中25～30℃培养制备种子液；C.将所得种子液按1～2‰的比例接种到廉价的生产培养基中，然后放入摇床内，25～30℃，120～140r/min，1～2天得到菌种的生产培养基发酵液，将该发酵液通过4000～6000r/min离心机离心分离20～40min，除去沉淀，上清液即为液态生物絮凝剂，测定絮凝率；D.液态生物絮凝剂提取纯化得生物絮凝剂纯品。本发明培养成本低、生产周期短、经测定絮凝效率高达92.88～93.13％、使用后无二次污染、能适应大规模生产及工业化应用，具有很好的推广应用价值。

Description

利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法

技术领域

本发明涉及一种生物絮凝剂的制备方法，具体涉及一种利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法。

背景技术

絮凝剂是一类可使液体中不易沉降的悬浮颗粒凝聚沉淀的物质，广泛应用于工业水处理、生活污水处理以及食品生产和发酵工业等。絮凝剂一般可分为三类：①无机絮凝剂，如硫酸铝、聚合氯化铝、硫酸亚铁和明矾等；②人工合成有机高分子絮凝剂，如聚氧化乙烯、聚苯乙烯磺酸盐、聚丙烯酰胺衍生物和聚乙烯亚胺等；③天然有机高分子絮凝剂，如纤维素、淀粉、聚氨基葡萄糖、藻蛋白酸钠和生物絮凝剂等。许多无机絮凝剂由于其良好的絮凝效果和较低成本而被广泛应用，然而人们已经发现它们在使用过程中存在着较大的不安全性和潜在的二次污染问题。人工合成有机高分子絮凝剂中使用较多的聚丙烯酰胺，因其单体具有强烈的神经毒性和致癌性，所以使用受到了限制。此外，大部分天然有机高分子絮凝剂存在絮凝活性较弱和使用成本较高等缺点。

生物絮凝剂是由微生物产生的可使液体中不易沉降的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体颗粒等凝聚沉淀的特殊高分子物质。生物絮凝剂是通过微生物发酵、分离提取而得到的新型、高效、可生物降解的水处理剂，它能够满足絮凝剂使用安全、絮凝活性高、无二次污染的要求，对改进絮凝沉淀法工艺和絮凝剂产品的生产，保护人类健康和环境都具有很重要的意义。是一种绿色水处理剂，具有广阔的开发与应用前景。

目前已有一些关于生物絮凝剂产生菌的报道，涉及到细菌、真菌和藻类等。1984年，Fattom A.等利用从排水渠内获得的丝状藻青菌(Phormidium J-1)研制出对斑脱土有良好絮凝效果的高分子生物絮凝剂。1986年，Kurane R.等人研究活性污泥法处理酞酚酯废水时发现红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，用特定的培养基和培养条件研制出了微生物絮凝剂NOC-1，该产品可用于畜产废水处理、膨胀污泥的沉降、瓦厂废水及纸浆废水处理。后来，Nakamura J.等又用酱油曲霉(Aspergillus sojae)制备出了生物絮凝剂AJ7002；Takagi H.利用拟青霉属微生物(Paecilomyces sp.I-1)研制出了生物絮凝剂PF101。近几年国内研究者也发现了一些能产生絮凝剂的菌株：陆茂林从土壤和污泥中筛选出两株絮凝活性较高的诺卡氏菌，并对其适宜培养基、培养时间和培养液pH变化与絮凝活性之间的关系进行了研究；宫小燕从污水处理厂活性污泥中分离筛选到1株具有稳定絮凝性状的菌株，经初步鉴定为假单胞菌属(Paseudomonas sp.GX4-1)，对影响该菌所产MBF的絮凝活性条件进行了初步研究；何宁等研究了谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)产生新型蛋白聚糖类生物絮凝剂REA-11的途径。但是，迄今为止，在国内外尚未见有关奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法。该方法工艺简单，易于控制，周期短，无污染，所产生絮凝效具有高效、无二次污染等优点，可广泛应用于水处理和污泥浓缩。

为达到上述目的，我们从多个污水处理厂的混合活性污泥中筛选出一株具有产生生物絮凝剂功能的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)。该菌种产絮凝剂的制备请参阅发表在“中国给水排水”2007年第9期第24-27页“高效微生物絮凝剂用于污泥脱水及其动力学研究”。采用种子液接种的方法，使奇异变形杆菌能够迅速在生产培养基中开始生长代谢，缩短启动时间。该菌能在我们特制的廉价生产培养基中良好生长，并产生絮凝效率在90％以上的高效生物絮凝剂。其培养温度为25～30℃的常温；摇床转速为120～140r/min，比大部分文献报道的要慢，节省动力费用；培养时间为1～2天，比大部分文献报道的要少近1天的时间。用该菌种制备得到的生物絮凝剂主要成分为酸性多糖和蛋白质，可生物降解。该生物絮凝剂对染料废水脱色率在90％以上，对剩余污泥脱水率达82％，在同等剂量下均优于聚合氯化铝(PAC)和聚丙烯酰胺(PAM)的处理效果。

本发明的具体工艺如下。A、菌种的斜面保藏及转种，保藏菌种的斜面培养基的组成(g/L)：牛肉膏3～5，琼脂15-20，蛋白胨8～12，NaCl4～6，pH7.0～7.2，灭菌(115～121℃，20～30min)。在无菌操作环境中，将菌种接到斜面培养基上，在恒温培养箱中25～30℃下培养1～2天后，在冰箱内2～6℃下保藏。以后每过1个月左右将菌种转移至新鲜的斜面培养基上。B、种子液的制备，将菌种转移至新鲜的斜面培养基上，在恒温培养箱中25～30℃下培养1～2天后，在冰箱内2～6℃下保藏1～2天。在无菌操作环境中，将斜面上的菌种转移至种子培养基(通用发酵培养基)中。种子培养基的组成(g/L)：葡萄糖18～22，尿素0.4～0.6，酵母膏0.4～0.6，K₂HPO₄ 4～6，KH₂PO₄ 1～3，NaCl 0.05～0.2，(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.3，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.3，pH 6.8～7.2，灭菌(115～121℃，20～30min)。将接种后的种子培养基放入摇床培养箱中培养，温度为25～30℃，摇床转速为150～170r/min，时间为2～3天。将种子液保藏在冰箱内2～6℃下1～2天，备用。C、液态生物絮凝剂的制备及絮凝率的测定，在无菌操作环境中，将种子液按1～20‰的比例接种至生产培养基中。将接种后的生产培养基在摇床培养箱中培养，温度为25～30℃，摇床转速为120～140r/min，时间为1～2天。菌种的生产培养基中发酵，通过离心机离心分离(4000～6000r/min，20～40min)，除去沉淀，上清液即为液态生物絮凝剂，在冰箱内2～6℃下保藏。生物絮凝剂絮凝率E检测方法：向100ml比色管中加入0.4g高岭土，3ml的1％CaCl₂溶液和2ml离心上清液，然后加蒸馏水至100ml，盖上磨口塞，将比色管作10个上下的自然翻转，转速以每次翻转时气泡上升完毕为准，翻转结束后，静置5min。取比色管中50ml处的处理液，用岛津UV-1700型紫外可见分光光度计在550nm的波长下测定吸光度(A)。同时以2ml新鲜通用发酵培养基代替离心上清液，其它操作条件完全与离心上清液相同的实验作为对照，测其吸光密度(B)。絮凝率E计算式如下：

$E=\frac{B-A}{B}\×100$

式中E-絮凝率(％)；

A-加离心上清液处理后的高岭土悬液吸光度(A)；

B-对照实验测得的吸光度(B)。

D、生物絮凝剂的提取纯化，向液态生物絮凝剂中加入2～3倍体积的无水乙醇，在冰箱内2～6℃下静置过夜，再用离心机离心分离(1000～4000r/min，20～40min)；倾去上清液，往沉淀中加入再加入2～3倍体积的无水乙醇，重复上面步骤1～3次。将沉淀物重新溶解于去离子水中，加入浓度约为2％十六烷基三甲基溴化铵(CPC)直至无沉淀产生，再经离心分离得沉淀物备用；将沉淀重新溶解于2～3％的NaCl溶液中，加入2～3倍体积的无水乙醇，混合均匀，在冰箱内2～6℃下静置过夜，离心得沉淀物，把沉淀物真空冷冻干燥得生物絮凝剂纯品。

本发明与现有的技术相比，具有以下优点和效果：

1、由于本发明采用多个污水处理厂的混合活性污泥中筛选出一株具有产生生物絮凝剂功能的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，并采用种子液接种的方法，使奇异变形杆菌能够迅速在生产培养基中开始生长代谢，因此与以往直接从斜面将菌接种至产絮凝剂培养基中相比，缩短启动时间。

2、由于本发明的生产培养基中的碳源和氮源分别为葡萄糖和蛋白胨，葡萄糖用量仅为通用发酵培养基中的一半，蛋白胨的市价至少比通用发酵培养基中牛肉膏和酵母膏便宜一半，培养基成本低廉，因此本发明的制备成本低廉。

3、本发明的奇异变形杆菌培养温度为25～30℃的常温；培养时间为1～2天，比大部分文献报道的要少近1天的时间，因此，制备生物絮凝剂发酵周期短。

4、本发明的奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的摇床转速为120～140r/min，比大部分文献报道的要慢，因此，节省了动力费用，降低了成本。

5、本发明的絮凝率E测定时，不依据蒸馏水而以新鲜生产培养基作空白，排除了培养基本身絮凝作用对絮凝活性的影响，更准确地反映了生物絮凝剂的絮凝能力。

6、本发明的奇异变形杆菌能在我们研制的廉价生产培养基中良好生长，并产生絮凝效率在90％以上的高效生物絮凝剂。

7、本发明的奇异变形杆菌所产的生物絮凝剂主要成分为酸性多糖和蛋白质，可生物降解，使用后无二次污染。

8、本发明的奇异变形杆菌所产生物絮凝剂对印染废水脱色率在90％以上，对剩余污泥脱水率达82％，在同等剂量下均优于聚合氯化铝(PAC)和聚丙烯酰胺(PAM)的处理效果，具有良好的推广使用价值。

附图说明

图1为奇异变形杆菌所产的生物絮凝剂提取纯化后的扫描电镜图。

具体实施方式

实施例1

本实施方式按照下面步骤进行：

A、菌种的斜面保藏及转种

保藏菌种的斜面培养基的组成(g/L)是：牛肉膏5，琼脂20，蛋白胨12，NaCl 6，pH7.2，灭菌(121℃，30min)。在无菌操作环境中，将奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)菌种接到斜面培养基上，在恒温培养箱中30℃下培养2天后，在冰箱内6℃下保藏，1天之内用掉。

B、种子液的制备

在无菌操作环境中，将斜面培养基上菌种转移至种子培养基(通用发酵培养基)中。种子培养基的组成(g/L)：葡萄糖22，尿素0.6，酵母膏0.6，K₂HPO₄ 6，KH₂PO₄ 3，NaCl 0.2，(NH₄)₂SO₄ 0.3，MgSO₄·7H₂O 0.3，pH7.2，灭菌(121℃，30min)。将接种后的种子培养基放入摇床培养箱中培养，温度为30℃，摇床转速为170r/min，时间为3天，保藏在冰箱内6℃下，1天之内用掉。

C、液态生物絮凝剂的制备

在无菌操作环境中，将种子液按2‰的比例接种至生产培养基中。生产培养基组成(g/L)：葡萄糖12，蛋白胨1.2，MgSO₄0.3，K₂HPO₄ 6，KH₂PO₄ 3，pH7.0，灭菌(121℃，40min)。将接种后的生产培养基放入摇床培养箱中培养，温度为30℃，摇床转速为140rpm，时间为2天。用离心机将发酵液离心分离(6000r/min，40min)，除去沉淀，上清液即为液态生物絮凝剂。

生物絮凝剂絮凝率E检测方法：向100ml比色管中加入0.4g高岭土，3ml的1％CaCl₂溶液和2ml离心上清液，然后加蒸馏水至100ml，盖上磨口塞，将比色管作10个上下的自然翻转，转速以每次翻转时气泡上升完毕为准，翻转结束后，静置5min。取比色管中50ml处的处理液，用岛津UV-1700型紫外可见分光光度计在550nm的波长下测定吸光度(A)。同时以2ml新鲜通用发酵培养基代替离心上清液，其它操作条件完全相同的实验作为对照，测其吸光密度(B)。絮凝率E计算式如下：

$E=\frac{B-A}{B}\×100$

式中  E-絮凝率(％)；

A-加离心上清液处理后的高岭土悬液吸光度(A)；

B-对照实验测得的吸光度(B)。

测得液态生物絮凝剂的絮凝率为93.13％。

D、生物絮凝剂的提取纯化

向液态生物絮凝剂中加入3倍体积的无水乙醇，冰箱内4℃静置过夜，再用离心机离心分离(4000r/min，40min)；倾去上清液，往沉淀中加入3倍体积的无水乙醇，重复上面步骤3次。将沉淀物重新溶解于去离子水中，加入浓度为2％十六烷基三甲基溴化铵(CPC)直至无沉淀产生，再经离心分离得沉淀物；将沉淀重新溶解于3％的NaCl溶液中，加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀，在冰箱内4℃静置过夜，离心得沉淀物，把沉淀物真空冷冻干燥得生物絮凝剂纯品。经电镜扫描，见图1，本发明的生物絮凝剂主要形态为杆状的，相互之间空隙小，有利于水中悬浮颗粒的沉降，因此絮凝效率高达93.13％。

实施例2

A、菌种的斜面保藏及转种

保藏菌种的斜面培养基的组成(g/L)：牛肉膏3，琼脂15，蛋白胨8，NaCl 4，pH7.0，灭菌(115℃，20min)。在无菌操作环境中，将奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)菌种接到斜面培养基上，在恒温培养箱中25℃下培养1天后，在冰箱内2℃下保藏，1天之内用掉。

B、种子液的制备

在无菌操作环境中，将斜面培养基上菌种转移至种子培养基(通用发酵培养基)中。种子培养基的组成(g/L)：葡萄糖18，尿素0.4，酵母膏0.4，K₂HPO₄ 4，KH₂PO₄ 1，NaCl 0.05，(NH₄)₂SO₄ 0.1，MgSO₄·7H₂O 0.1，pH 6.8，灭菌(115℃，20min)。将接种后的种子培养基放入摇床培养箱中培养，温度为20℃，摇床转速为150r/min，时间为2天，保藏在冰箱内2℃下，1天之内用掉。

C、液态生物絮凝剂的制备

在无菌操作环境中，将种子液按1‰的比例接种至生产培养基中。生产培养基组成(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨0.8，MgSO₄0.2，K₂HPO₄ 4，KH₂PO₄ 1，pH6.8，灭菌(115℃，20min)。将接种后的生产培养基放入摇床培养箱中培养，温度为20℃，摇床转速为150rpm，时间为2天。用离心机将发酵液离心分离(4000r/min，20min)，除去沉淀，上清液即为液态生物絮凝剂。生物絮凝剂絮凝率E检测方法同实施例1相同，测得液态生物絮凝剂的絮凝率为92.88％。

D、生物絮凝剂的提取纯化

向液态生物絮凝剂中加入2倍体积的无水乙醇，冰箱内2℃静置过夜，再用离心机离心分离(1000r/min，20min)；倾去上清液，往沉淀中加入2倍体积的无水乙醇，重复上面步骤1次。将沉淀物重新溶解于去离子水中，加入浓度为2％十六烷基三甲基溴化铵(CPC)直至无沉淀产生，再经离心分离得沉淀物；将沉淀重新溶解于2％的NaCl溶液中，加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀，在冰箱内2℃静置过夜，离心得沉淀物，把沉淀物真空冷冻干燥得生物絮凝剂纯品。经电镜扫描，见图1，本发明的生物絮凝剂主要形态为杆状的，相互之间空隙小，有利于水中悬浮颗粒的沉降，因此絮凝效率高达92.88％。

Claims (2)

1、利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于：

A、菌种的斜面保藏及转种

先配置保藏菌种用的斜面培养基，其组分和含量g/L为：牛肉膏3～5，琼脂15-20，蛋白胨8～12，NaCl4～6；将pH调整为7.0～7.2，并在115～121℃下灭菌20～30min；然后在无菌操作环境中，将奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)接到斜面培养基上，在恒温培养箱中25～30℃下培养1～2天后，在冰箱内2～6℃下保藏；以后每过1个月将菌种转移至新鲜配置的斜面培养基上；

B、种子液的制备

从冰箱中取出A步得到的新鲜配置的斜面培养基和转移在培养基上的菌种，移到恒温培养箱中25～30℃下培养1～2天后，再回冰箱内2～6℃下保藏，1～2天内取出，在无菌操作环境中，将斜面上的菌种转移至种子培养基中，种子培养基的组分和含量(g/L)为：葡萄糖18～22，尿素0.4～0.6，酵母膏0.4～0.6，K₂HPO₄ 4～6，KH₂PO₄ 1～3，NaCl 0.05～0.2，(NH₄)₂SO₄ 0.1～0.3，MgSO₄·7H₂O0.1～0.3，pH 6.8～7.2；115～121℃下灭菌20～30min；将接种了菌种后的种子培养基放入摇床培养箱中培养，温度为25～30℃，摇床转速为150～170r/min，时间为2～3天，然后将其保藏在冰箱内，2～6℃下1～2天，备用；

C、液态生物絮凝剂的制备及絮凝率的测定

在无菌操作环境中，将种子液按1～2‰的比例接种至生产培养基中；生产培养基的组分和含量(g/L)为：葡萄糖8～12，蛋白胨0.8～1.2，MgSO₄ 0.2～0.3，K₂HPO₄ 4～6，KH₂PO₄ 1～3，其pH为6.8～7.2，并在115～121℃下灭菌20～40min；然后将接种后的生产培养基放入摇床培养箱中发酵，温度为25～30℃，摇床转速为120～140r/min，时间为1～2天得到菌种的生产培养基发酵液，该发酵液通过4000～6000r/min离心机离心分离20～40min，除去沉淀，上清液即为液态生物絮凝剂，测定其絮凝率后将其保藏在冰箱内2～6℃下，备用；

D、生物絮凝剂的提取纯化

向液态生物絮凝剂中加入2～3倍体积的无水乙醇，在冰箱内2～6℃静置过夜，再用1000～4000r/min离心机分离20～40min；倾去上清液，往沉淀中加入2～3倍体积的无水乙醇，重复上面步骤1～3次；将沉淀物重新溶解于去离子水中，加入浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵，直至无沉淀产生，再经离心分离得沉淀物备用；将沉淀重新溶解于2～3％的NaCl溶液中，加入2～3倍体积的无水乙醇，混合均匀，在冰箱内2～6℃静置过夜，离心得沉淀物，把沉淀物真空冷冻干燥得纯化的生物絮凝剂。

2、根据权利要求1所述的利用奇异变形杆菌制备生物絮凝剂的方法，其特征在于：所述的测定絮凝率是，向100ml比色管中加入0.4g高岭土，3ml的1％CaCl₂溶液和2ml离心上清液，然后加蒸馏水至100ml，盖上磨口塞，将比色管作10个上下的自然翻转，转速以每次翻转时气泡上升完毕为准，翻转结束后，静置5min，取比色管中50m1处的加入离心上清液处理后的高岭土悬液，用岛津UV-1700型紫外可见分光光度计在550nm的波长下测定吸光度A，同时以2ml新鲜的生产培养基代替离心上清液，进行与上述完全相同的操作，测其吸光密度B，实验作为对照，最后按常规的絮凝率E计算公式计算得到本发明的生物絮凝剂的絮凝率E(％)。