CN106244478B - 地衣芽孢杆菌、由其制备絮凝剂的方法及絮凝剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株地衣芽孢杆菌、由其制备絮凝剂的方法及絮凝剂的应用。该菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ‑1，于2012年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6782。利用本发明的地衣芽孢杆菌LZ‑1和本发明涉及的生产方法，在初始pH值为碱性的条件下，能得到絮凝活性高的发酵液，主要絮凝活性组分为0.8～3.2×107Da的高分子量多糖。本发明的多糖絮凝剂具有絮凝活性高、用量少、生产成本低等优点，对污泥具有絮凝调质作用。地衣芽孢杆菌LZ‑1发酵液或从发酵液提取的含多糖絮凝剂的产品可替代聚丙烯酰胺絮凝剂应用于污泥板框压滤深度脱水，使含水率为96％～98％的污水处理厂浓缩污泥一步脱水至含水率低于60％的泥饼，污泥体积缩小为原来的1/20～1/10。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株地衣芽孢杆菌、由其制备的絮凝剂的方法及絮凝剂的应用。
背景技术
微生物絮凝剂是微生物产生的具有絮凝活性的代谢产物，主要有粘多糖、糖蛋白、蛋白质等高分子化合物，以及具有絮凝活性的菌体等。其中微生物多糖絮凝剂的研究报道较多。微生物絮凝剂是一种具有生物降解性和安全性的新型、高效、无毒水处理剂，可克服无机絮凝剂和合成有机高分子絮凝剂在安全性和环境污染等方面的缺陷，且种类多，来源广，受季节变化的影响小。
现有的产微生物絮凝剂的菌在发酵过程中需氧量大、能耗高，因此造成生产成本高；且目前报道的微生物多糖絮凝剂的分子量大都在0.1～3×106Da，尚未见更高分子量的微生物多糖絮凝剂的报道。絮凝剂的絮凝活性受分子量的影响很大。通常，絮凝剂分子量大，吸附位点多，网捕和卷扫作用明显，絮凝活性高。因此仍有需要开发产出的絮凝剂絮凝活性高、安全环保且发酵生产方法能耗低的菌株。
目前，在污泥处理领域，较高的含水率是限制污泥减量化与资源化的主要因素。因此，污泥处理处置的关键是降低污泥含水率、缩小体积，而实现这一目的的关键是改善污泥的脱水性能。目前应用最多的是采用污泥调质剂改变污泥的脱水性能，然后通过带式压滤、离心、或/和板框压滤降低污泥含水率和污泥体积。我国目前运营的城镇污水处理厂中，污泥脱水方式主要为带式压滤和离心，其市场份额分别为62.5％和21.6％。板框压滤脱水方式的市场占比不足6％。带式压滤和离心脱水仅能将污泥含水率降至80％左右，而板框压滤可以将含水率为96％～98％的浓缩污泥直接深度脱水至含水率60％以下，体积缩小为原来的1/10～1/20。同含水率80％的污泥相比，含水率降至60％，污泥体积将缩小原来的1/2。另外，含水率60％的污泥更符合污泥堆肥化对含水率的要求，粉碎后可直接堆肥处理(现代矿业，2014，541(5):138-139；Haug R.T.,1993,The practical handbook of compostengineering,CRC)。可见，大力推广污泥深度脱水工艺具有良好的环境效益和经济效益。
污泥处理领域常用于污泥调质和脱水的为聚丙烯酰胺(PAM)但是使用PAM脱水的缺点在于：PAM中残留的单体——丙烯酰胺具有神经毒性和致癌性，而且PAM在环境中通过物理化学方式降解也会产生丙烯酰胺单体；另一方面，污泥中PAM含量过高(12～50mg/g绝干污泥)，使污泥硬度变大，不利于后续处理，回田利用会造成土壤板结，土壤透气性差，不利于农作物生长。因此，从水资源和环境的可持续发展来看，应该限制PAM类絮凝剂在污水和污泥处理中的应用，开发绿色环保型水处理絮凝剂和污泥调质剂。
发明内容
本发明的目的是提供一株地衣芽孢杆菌、由其制备絮凝剂的方法及絮凝剂的应用，本发明的地衣芽孢杆菌培养过程耗能少，生产的絮凝剂分子量大，絮凝效果好，可用于污泥调质及脱水领域，无毒无污染。
根据第一方面，本发明提供一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1，该菌株已于2012年11月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏号为CGMCC No.6782。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1于2012年筛选分离自河南焦作一木浆制浆污水处理厂活性污泥。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1的菌落形态特征：菌株在固体培养基平板培养2天，菌落扁平，圆形或近圆形，乳白色，不透明，直径约2mm。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1的形态特征：细胞呈杆状(见图1)，大小约1.5～2.0×0.5μm，产芽孢、孢囊稍膨大，无伴孢晶体，革兰氏染色阳性。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1的生理生化特征：菌株LZ-1具有生长温度范围广、耐碱性的特性，可以在28℃-50℃，pH 8-11条件下生长。菌株氧化酶、接触酶活性为阳性，淀粉及酪素水解阳性，明胶液化阳性，甲基化反应及硝酸盐还原阳性，VP反应阳性，能利用葡萄糖、甘露糖、纤维二糖、菊糖、甘油、龙胆二糖、肌醇、L-阿拉伯糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、海藻糖、D-塔格糖、苦杏仁甙、N-乙酰葡萄糖胺、熊果甙、淀粉、D-核糖、D-果糖、七叶灵、D-木糖、水杨苷，D-半乳糖、α-甲基葡萄糖甙、葡萄糖酸盐及糖原且发酵产酸。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1的16S rRNA基因序列经测定，长度为1464bp(见SEQ ID NO：1)，在GenBank中的序列登录号为KP277101。以16S rRNA基因序列为基础，构建菌株LZ-1的系统发育树(见图2)。
根据菌株形态特征和生理生化特征，以及系统发育分析表明，菌株LZ-1属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的成员。
本发明的另一方面，还提供了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1发酵生产多糖絮凝剂方法，包括如下步骤：
在温度为28℃～46℃，空速为0.1～0.6L/L/min，搅拌速率为0～300rpm的条件下发酵地衣芽孢杆菌LZ-1；
优选地，在温度为30℃～40℃，空速为0.2～0.5L/L/min，搅拌速率为50～200rpm的条件下发酵地衣芽孢杆菌LZ-1，测定发酵液粘度，当发酵液粘度不再增加时停止发酵。通常，本发明菌株的总发酵时间为40～72小时。空速是指单位液体体积的通气速率。
发酵生产多糖絮凝剂的培养基没有特殊限制，例如可以为：
蔗糖30g/L，硝酸钠3.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，pH 10。
本发明的又一方面，提供了一种由上述方法生产的多糖絮凝剂，所述多糖絮凝剂的分子量在0.8～3.2×107Da范围内。
本发明的再一方面，提供了一种上述多糖絮凝剂在污泥板框压滤深度脱水中的用途。
本发明的又一方面，提供了一种上述多糖絮凝剂在污泥调质中的用途，所述多糖絮凝剂可起到与聚丙烯酰胺相同的污泥脱水作用。
本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1菌株具有生长温度范围广、耐碱性的特性，可以在28℃～50℃，pH8～11的条件下生长等特性。本发明的菌株生产高分子量多糖絮凝剂的过程所需空速和搅拌速率低，因此生产成本低，而已报道的微生物絮凝剂生产过程绝大多数为好氧过程，通气量大(空速>1L/L/min)，搅拌速度高(>200rpm)，能耗较大。
利用本发明的地衣芽孢杆菌LZ-1和本发明涉及的生产方法，在初始pH值为碱性的条件下，能得到絮凝活性高的发酵液，发酵液的主要活性组分为高分子量多糖，其多糖分子量在0.8～3.2×107Da范围内，且具有絮凝活性高、用量少等优点。
本发明的地衣芽孢杆菌LZ-1发酵液及由此所获得的多糖可用于污泥调质及脱水领域，对污泥具有与商用聚丙烯酰胺(PAM)相当的絮凝活性和污泥调质性能，作为污泥调质剂替代PAM絮凝剂，用于污泥板框压滤深度脱水，使含水率为96％～98％的污水处理厂浓缩污泥一步脱水至含水率低于60％的泥饼，污泥体积缩小为原来的1/20～1/10。由于本发明的地衣芽孢杆菌LZ-1所产的絮凝剂无毒无害，不存在污染问题，所得泥饼有利于堆肥或回田利用，因而可替代PAM用于污泥板框压滤深度脱水。
附图说明
以下附图用于更好地理解本发明。
图1为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1的扫描电子显微镜照片；
图2为基于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1与相关菌株的16S rRNA基因序列构建的系统发育进化树；
图3为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1发酵液及PAM对污泥调质脱水性能的影响的对比曲线图。
具体实施方式
以下参考附图并结合实施例对本发明做进一步描述。本领域的普通技术人员应理解，以下实施例仅用于为了更好地理解本发明的方案和优点而作为说明的目的，而不作为对本发明的限制。
实施例1、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1的分离筛选
本发明菌株是2012年从河南焦作一木浆制浆污水处理厂活性污泥中分离纯化得到的。菌株的分离通过将1mL活性污泥稀释10倍后，取0.2mL稀释液在固体培养基平板上涂布分离，37℃培养3天后，挑取单菌落在同样培养基平板上多次划线分离，直至显微镜检测获得纯种。
将分离获得的纯菌株，点种在选择培养基固体平板上，37℃培养2天。在固体平板表面倒入1％甲基红指示试剂，反应30min后，再加入1mol/LNaCl溶液脱色，反应30min后，将液体倒出，观察菌落周围的水解圈，并测定水解圈直径。选择水解圈直径大于7mm的菌株LZ-1作为目标菌株。
基础培养基组成：NH4NO31.0g、K2HPO40.5g、KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl1.0g、CaCl20.1g、酵母粉0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2。
固体培养基：在基础培养基中加入15g/L琼脂。
选择培养基：在基础培养基中加入羧甲基纤维素钠(10g/L)。
实施例2、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1的形态及生理生化特征
(1)菌株形态观察:
菌落形状：将菌株LZ-1的液体培养物在固体培养基平板上稀释涂布培养2天，菌落扁平，圆形或近圆形，乳白色，不透明，直径约2mm。
形态特征：利用光学显微镜和扫描电子显微镜观察菌体细胞的形态。细胞呈杆状(见图1)，大小约1.5～2.0×0.5μm。菌株LZ-1细胞产芽孢、孢囊稍膨大，无伴孢晶体。
(2)菌株生理生化特征：
生长特征：菌株具有生长温度范围广、耐碱性的特性，可以在28℃～50℃，pH 8～11的条件下生长。
革兰氏染色：采用Dussault方法，载玻片上加一滴20％盐水，涂片风干后，用2％乙酸覆盖5min，固定并脱盐，移去多余的乙酸，晾干。单染色直接用蕃红或结晶紫覆盖3min，水洗，晾干后镜检；革兰氏染色用结晶紫染90s，水洗，碘液覆盖，水洗，酒精脱色20s，水洗，蕃红复染90s，水洗后晾干镜检。实验证明菌株LZ-1革兰氏反应呈阳性。
氧化酶活性：在玻璃平皿内铺好滤纸，吸取等体积的1％对二甲基对苯撑二胺水溶液和1％α-萘酚乙醇溶液的混合液润湿滤纸，用玻璃棒刮取菌苔划在滤纸上，菌苔在10s内出现红色者为阳性，10～60s出现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。实验证明菌株LZ-1氧化酶活性为阳性。
接触酶活性：在长有菌苔的固体平板上加1滴5％H2O2覆盖，观察有无气泡产生，有气泡者为阳性，无气泡者为阴性。实验证明菌株LZ-1触酶活性为阳性。
淀粉水解：在含1％(w/v)可溶性淀粉的无机盐基础平板上点接种并培养，待形成明显的菌落后，加Lugol’s碘液铺满平板观察透明圈。菌落周围有透明圈者为阳性，无透明圈者为阴性。实验证明菌株LZ-1淀粉水解阳性。
酪素水解：在相应牛奶-水-琼脂平板上点接种并培养，待形成明显菌落后，观察透明圈，有透明圈的为阳性，无透明圈的为阴性。实验证明菌株LZ-1酪素水解阳性。
利用有机底物产酸：挑取几个新鲜培养的LZ-1菌落，悬浮于梅里埃公司的API50CHB培养基中制成浊度相当于2McFarland的菌悬液，将菌悬液加入API 50CHB试验条，加矿物油，随时观察，确定是否产酸。
实验结果显示：菌株LZ-1能利用葡萄糖、甘露糖、纤维二糖、菊糖、甘油、龙胆二糖、肌醇、L-阿拉伯糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、海藻糖、D-塔格糖、苦杏仁甙、N-乙酰葡萄糖胺、熊果甙、淀粉、D-核糖、D-果糖、七叶灵、D-木糖、水杨苷，D-半乳糖、α-甲基葡萄糖甙、葡萄糖酸盐、糖原等有机底物，且发酵产酸。
实施例3、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis LZ-1的16S rRNA基因序列PCR扩增和序列分析
将菌株LZ-1接种于基础培养基，培养3天后，离心收集菌体，经缓冲液洗涤后，加溶菌酶破碎细胞，利用酚：氯仿抽提法提取获得基因组DNA，以获得的DNA为模板，采用细菌正向引物27-F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1492-R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增菌株LZ-1的16S rRNA基因。PCR反应体系(100μl)：10×Taq酶Buffer 10μl，25mmol/L MgCl26μl，10mmol/L dNTP 2μl，Taq DNA酶2.5U，30pmol/L上、下游引物各2μl，模板DNA 2μg，蒸馏水补至100μl。PCR反应条件为：95℃5min，95℃1min，58℃5min，72℃1.5min，30个循环，72℃10min，4℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后进行柱纯化，与T-easy vector连接并转化到E.coil DH5α中，筛选阳性克隆，提取质粒并测序，测序由美吉测序公司完成。
菌株LZ-1的16S rRNA基因序列长度为1464bp(见SEQ ID NO：1)，在GenBank中的序列登录号为KP277101。以16S rRNA基因序列为基础，构建菌株LZ-1的系统发育树(见图2)。系统发育分析表明，菌株LZ-1属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)属的成员。
实施例4、地衣芽孢杆菌LZ-1生产多糖絮凝剂
采用本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1，发酵生产条件为温度37℃，空速0.5L/L/min，搅拌速率200rpm，采用毛细管粘度计测定发酵液粘度，当发酵液粘度不再增加时停止发酵，总发酵时间为46小时，发酵液中多糖浓度为10g/L。
所用培养基组成为蔗糖30g/L，硝酸钠3.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，pH 10。
发酵液中多糖浓度测定方法如下：取3mL发酵液，加3mL去离子水稀释，离心(10000rpm，60min)去菌体，取3mL上清液加4倍体积乙醇沉淀产物，轻轻振荡后，4℃过夜，1000g离心15min，弃上清；用75％乙醇清洗沉淀2次，沉淀用去离子水溶解，采用蒽酮-硫酸比色法测定溶液中的多糖浓度为10g/L。
测定发酵液中总糖含量:
取上述发酵液，离心(10000rpm，60min)去除菌体或采用0.2μm微滤膜过滤；在上清液或滤液中加入4倍体积无水乙醇沉淀产物；沉淀用75％乙醇水溶液清洗2次；沉淀重溶于去离子水后，用4倍体积无水乙醇再次沉淀产物；沉淀物用去离子水重溶；重溶液采用Sevage法除蛋白3次；除蛋白后的地衣芽孢杆菌LZ-1多糖溶液采用透析膜(截留分子量100,000Da)于4℃去离子水中透析除盐和小分子；透析液采用4倍无水乙醇沉淀；沉淀物重溶于水，真空冷冻干燥，得地衣芽孢杆菌LZ-1多糖絮凝剂纯品。多糖絮凝剂纯品经蒽酮法测总糖的含量为95-98％。
测定多糖絮凝剂纯品分子量：
采用凝胶渗透色谱(Waters)-激光光散射联用技术(GPC-MALLS)(Wyatt DAWNHELEOS Ⅱ,USA)测量地衣芽孢杆菌LZ-1多糖絮凝剂纯品的分子量(委托北京市理化分析测试中心检测)。分析条件为：Shodex SB-806M HQ凝胶色谱柱，流动相为0.05mol/L硝酸钠与0.02％(w/v)叠氮化钠溶液，流速为0.5mL/min，柱温40℃。检测结果表明，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1生产的多糖絮凝剂的数均分子量Mn为0.8～3.2×107Da，重均分子量Mw为1.03～3.198×107Da，多分散度Mw/Mn为1.006。
测定发酵液的絮凝活性：
发酵液对高岭土悬浮液的絮凝活性测定方法如下：在250mL烧杯中装入100mL高岭土(5g/L)悬浮液，加入1mL CaCl2(0.5mol/L)和不同量发酵液，慢搅3min，倒入100mL量筒中静置5min，在50mL刻度处取5mL絮凝沉淀后的上清液，测定OD550值。以相同体积去离子水替代发酵液，重复前述絮凝过程，所得OD550计为OD550,0，用下述公式计算絮凝率。
发酵液用量为0.01mL，即多糖用量为1mg/L时，絮凝率为98％；当发酵液用量为0.1mL，即多糖用量为10mg/L时，絮凝率为93％。
测定发酵液对污泥的絮凝沉降性能：
试验方法：在100mL量筒中装入100ml污泥，静置沉淀30分钟，所沉降的污泥体积占初始污泥体积的百分数(％)，称为污泥沉降比，记为SV30。
试验例：在250mL烧杯中装入100mL肖家河污水处理厂二沉池污泥(含水率99.6％)，加入0.1mL发酵液，即多糖用量为10mg/L，混合之后倒入100mL量筒，静置沉淀30分钟，SV30为30％。
对比例1：在100mL量筒中装入100ml肖家河污水处理厂二沉池污泥(含水率99.6％)，静置沉淀30分钟，SV30为60％。
对比例2：在250mL烧杯中装入100mL肖家河污水处理厂二沉池污泥(含水率99.6％)，添加0.1mL浓度为1g/L的PAM(江苏江达生态科技有限公司，Mw 7,000-8,000kDa)，混合之后倒入100mL量筒，静置沉淀30分钟，SV30为34.5％。
测定发酵液对污泥的调质性能：
测定方法如下：试验污泥为含水率97％的浓缩污泥。在250mL烧杯中装入100mL污泥，加入3wt％FeCl3和5wt％CaO，缓慢搅拌后，加入3mL地衣芽孢杆菌LZ-1发酵液(简称为FLZ-1)或3mL浓度为1g/L的PAM(江苏江达生态科技有限公司，Mw 7,000-8,000kDa)，缓慢搅拌1min后，采用抽滤法测定絮凝后污泥的过滤性能，以只添加3wt％FeCl3和5wt％CaO，不添加FLZ-1或PAM絮凝剂作为对照，结果见图3。结果显示，FLZ-1提高污泥脱水性能的效果与PAM的效果一致。
发酵液用于污泥板框压滤深度脱水(以绝干污泥重量计算加入量)：
试验例：在含水率为96％的无锡新城污水处理厂浓缩池污泥中加入50％(v/wt)发酵液(折合多糖用量为0.5wt％，与绝干污泥的重量比)和15wt％粉煤灰(无锡惠联热电有限公司)，混合均匀后泵入板框压滤机(杭州兴源过压滤机有限公司)压滤40min，得到含水率为56％的泥饼。
对比例：在含水率为96％的无锡新城污水处理厂浓缩池污泥中加入0.1wt％PAM(与绝干污泥的重量比)(无锡，阳离子型，分子量6,400kDa)和15wt％粉煤灰(无锡惠联热电有限公司)，混合均匀后泵入板框压滤机(杭州兴源过压滤机有限公司)压滤40min，得到含水率为55％的泥饼。
实施例5、地衣芽孢杆菌LZ-1生产多糖絮凝剂
发酵培养基组成同实施例4。
本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1发酵生产条件为温度40℃，空速0.4L/L/min，搅拌速率为100rpm，采用毛细管粘度计测定发酵液粘度，当发酵液粘度不再增加时停止发酵，总发酵时间为42小时。采用与实施例4相同的多糖浓度测定方法，测得发酵液中多糖浓度为8g/L。
发酵液对高岭土悬浮液的絮凝活性：
测定方法如下：在250mL烧杯中装入100mL高岭土(5g/L)悬浮液，加入1mL CaCl2(0.5mol/L)和1mL絮凝剂样品，慢搅3min，倒入100mL量筒中静置5min，在50mL刻度处取5mL絮凝沉淀后的上清液，测定OD550值。以相同体积去离子水替代絮凝剂样品，重复前述絮凝过程，所得OD550计为OD550,0，用下述公式计算絮凝率。当絮凝剂样品为稀释100倍的发酵液时，絮凝率为95％。
实施例6、地衣芽孢杆菌LZ-1生产多糖絮凝剂
发酵培养基组成同实施例4。
本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1发酵生产条件为：温度30℃，空速0.6L/L/min，搅拌速率80rpm，采用毛细管粘度计测定发酵液粘度，当发酵液粘度不再增加时停止发酵，总发酵时间为60小时。采用与实施例4相同的多糖浓度测定方法，测得发酵液中多糖浓度为9g/L。
采用与实施例5相同的对高岭土悬浮液的絮凝活性测定方法，当絮凝剂样品为稀释100倍的发酵液时，絮凝率为96％。
实施例7、地衣芽孢杆菌LZ-1提高搅拌速率后生产多糖絮凝剂
发酵培养基组成同实施例4。
本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1发酵生产条件为：温度37℃，空速0.5L/L/min，搅拌速率300rpm，采用毛细管粘度计测定发酵液粘度，当发酵液粘度不再增加时停止发酵，总发酵时间为60小时。采用与实施例4相同的多糖浓度测定方法，测得发酵液中多糖浓度为9g/L。
采用与实施例5相同的对高岭土悬浮液的絮凝活性测定方法，当絮凝剂样品为稀释100倍的发酵液时，絮凝率仅为46％。说明提高搅拌速率后降低了发酵液的絮凝效率。
实施例8、地衣芽孢杆菌LZ-1提高空速后生产多糖絮凝剂
发酵培养基组成同实施例4。
本发明提供的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LZ-1发酵生产条件为：温度37℃，空速1.0L/L/min，搅拌速率200rpm，采用毛细管粘度计测定发酵液粘度，当发酵液粘度不再增加时停止发酵，总发酵时间为45小时。采用与实施例4相同的多糖浓度测定方法，测得发酵液中多糖浓度为7g/L。
采用与实施例5相同的对高岭土悬浮液的絮凝活性测定方法，当絮凝剂样品为稀释100倍的发酵液时，絮凝率仅为55％。说明提高空速后降低了发酵液的絮凝效率。
实施例9、地衣芽孢杆菌LZ-1发酵液用于污泥板框压滤深度脱水
试验例：在含水率为98％的无锡新城污水处理厂浓缩池污泥中加入50％(v/wt)实施例6所得菌株LZ-1的发酵液(折合多糖用量为0.5wt％，与绝干污泥重量比)和15wt％粉煤灰，混合均匀后泵入板框压滤机(杭州兴源过压滤机有限公司)压滤40min，得到含水率为58％的泥饼。
对比例：在含水率为98％的无锡新城污水处理厂浓缩池污泥中加入0.1wt％PAM(与绝干污泥的重量比)(无锡，阳离子型，分子量6,400kDa)和15wt％粉煤灰(无锡惠联热电有限公司)，混合均匀后泵入板框压滤机(杭州兴源过压滤机有限公司)压滤40min，得到含水率为56％的泥饼。
实施例10、从芽孢杆菌LZ-1发酵液提取多糖絮凝剂并用于污泥脱水
多糖絮凝剂的提取：取LZ-1发酵液，离心(10000rpm，60min)去除菌体；在上清液中加入4倍体积无水乙醇沉淀产物，50℃干燥，得LZ-1多糖絮凝剂粗产品。粗产品中多糖采用硫酸-蒽酮比色法测定，含量为85wt％。
取实施例4所得地衣芽孢杆菌LZ-1发酵液，按照上述方法制备地衣芽孢杆菌LZ-1多糖絮凝剂粗产品，配成浓度为1wt％的多糖溶液。采用与实施例5相同的对高岭土悬浮液絮凝活性相同的测定方法，当絮凝剂样品为稀释100倍的1wt％多糖溶液(或多糖用量为1mg/L)时，絮凝率为97％。
取实施例4所得地衣芽孢杆菌LZ-1发酵液，按照上述方法制备地衣芽孢杆菌LZ-1多糖絮凝剂粗产品，配成浓度为1wt％的多糖溶液，用于污泥板框压滤深度脱水。
试验例：在含水率为98％的无锡新城污水处理厂浓缩池污泥中加入0.5wt％上述多糖絮凝剂溶液和15wt％粉煤灰(无锡惠联热电有限公司)，混合均匀后泵入板框压滤机(杭州兴源过压滤机有限公司)压滤40min，得到含水率为59％的泥饼。
对比例：在含水率为98％的无锡新城污水处理厂浓缩池污泥中加入0.1wt％PAM(无锡，阳离子型，分子量6,400kDa)和15wt％粉煤灰(无锡惠联热电有限公司)，混合均匀后泵入板框压滤机(杭州兴源过压滤机有限公司)压滤40min，得到含水率为58％的泥饼。
实施例11、地衣芽孢杆菌LZ-1生产的多糖絮凝剂的分子量分析
LZ-1多糖絮凝剂纯产品制备方法：取实施例4所得LZ-1发酵液，离心(10000rpm，60min)去除菌体；在上清液中加入4倍体积无水乙醇沉淀产物；沉淀用75％乙醇水溶液清洗2次；沉淀重溶于去离子水后，用4倍体积无水乙醇再次沉淀产物；沉淀物用去离子水重溶；重溶液采用Sevage法除蛋白3次；除蛋白后的LZ-1多糖溶液采用透析膜(截留分子量100,000Da)于4℃去离子水中透析除盐和小分子；透析液采用4倍无水乙醇沉淀；沉淀物重溶于水，真空冷冻干燥，得LZ-1多糖絮凝剂纯品。纯品中多糖采用硫酸-蒽酮比色法测定，多糖含量为96wt％。
将上述多糖絮凝剂纯品配制成浓度为1wt％的多糖溶液。采用与实施例5相同的对高岭土悬浮液絮凝活性相同的测定方法，当絮凝剂样品为稀释100倍的1wt％多糖溶液(或多糖用量为1mg/L)时，对高岭土悬浮液的絮凝率为95％。
分子量测定方法：采用凝胶渗透色谱(Waters)-激光光散射联用技术(GPC-MALLS)(Wyatt DAWN HELEOS Ⅱ,USA)测量(委托北京市理化分析测试中心测量)。分析条件为：Shodex SB-806M HQ凝胶色谱柱，流动相为0.05mol/L硝酸钠与0.02％(w/v)叠氮化钠溶液，流速为0.5mL/min，柱温40℃。检测结果表明，芽孢杆菌(Bacillus sp.)LZ-1CGMCC No.6782生产的多糖絮凝剂的数均分子量Mn为0.8～3.2×107Da，重均分子量Mw为1.03～3.198×107Da，多分散度Mw/Mn为1.006～1.227。
Claims (3)
1.地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis LZ-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.6782。
2.一种利用权利要求1所述的地衣芽孢杆菌生产多糖絮凝剂的方法，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌在温度为28℃～46℃，空速为0.1～0.6L/L/min，搅拌速率为0～300rpm的条件下进行发酵，当发酵液粘度不再增加时停止发酵。
3.根据权利要求2所述的生产多糖絮凝剂的方法，其特征在于，在温度为30℃～40℃，空速为0.2～0.5 L/L/min，搅拌速率为50～200rpm的条件下进行发酵。
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