CN117165566A - 一种L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体及其在制备L-丙氨酸中的应用 - Google Patents
一种L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体及其在制备L-丙氨酸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶突变体及其在制备L‑丙氨酸中的应用，所述的L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，此突变提高了L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶催化L‑天冬氨酸生成L‑丙氨酸的能力。以表达突变体AjASD‑T175S的湿菌体E.coli BL21(DE3)/pET28a‑AjASD‑T175S为生物催化剂，以500mM L‑天冬氨酸溶液作为底物，以5’‑磷酸吡哆醛作为辅酶构建反应体系，在40℃、150rpm条件下反应22h，L‑丙氨酸得率达到97.44％，与野生型酶相比，得率提高了42.31％。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物催化领域，涉及一种L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S及其催化L-天冬氨酸合成L-丙氨酸中的应用。
(二)背景技术
L-丙氨酸又叫2-氨基丙酸，在自然界中广泛存在，属于氨基酸类有机化合物，其衍生物在日化、工业、食品添加剂等领域用途广阔。在日化方面，L-丙氨酸作为氨基酸表面活性剂的原料，具有高度的生物亲和性、毒性低并且使用广泛。在食品及添加剂方面，因L-丙氨酸具有甜味，可对食品进行提鲜并减少食品本身的苦涩，尤其具有更高的安全性，能够参与体内的氨基代谢循环，因此被国内外广泛应用于食品的调味。郭媛等人探究了L-丙氨酸在食品工业中的各类应用，可添加到酱油、鱼露、鸡精以及腌制品等食品中进行增味和降低腥涩。在工业上，L-丙氨酸是合成依那普利等的重要原料，在医药等领域是不可或缺的一份子，并且它可为转氨酶提供氨基供体,在临床上常添加到输液中。因此，L-丙氨酸的应用十分广泛，与人民的生活息息相关。
目前，合成L-丙氨酸的方法主要有蛋白质水解法、化学合成法以及生物法，生物法又细分为发酵法和酶促法。蛋白质水解法是通过酶解或者酸解丝绢、明胶和蛋白质含量高的玉米等含有大量L-丙氨酸的物质的一类方法，由于产物需进行手性拆分等工序，工作量大且成本较高，不适合工业化应用。在化学合成法中，丙酸氯化法是其中一种最为常见的化学合成法之一，丙酸氯化法中最重要的两个原料即为丙酸和氨水。该法成本高、收率低、产品质量差且容易造成环境污染，而今在工业上基本被舍弃。发酵法属于生物合成法中的一种，在合成L-丙氨酸的应用上，相较于水解法和化学法来说是卓有成效的，是目前生产L-丙氨酸的主要方法。生物催化法是另一种生物合成法，主要是以酶作为催化剂，对底物进行催化从而生成所需产物。这种方法相对于生物发酵法来说，具有体系简单、条件温和以及副产物少等优点，越来越受到关注。目前生物催化法所开发的酶活力还不够高，不足以与发酵法竞争，因而有必要开发更具竞争力的高活力生物催化剂。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体及其催化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸中的应用，本发明选取源自琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)的L-天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD作为研究对象，通过同源建模、分子对接以及引入突变，成功获得突变体AjASD-T175S。L-天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD对L-天冬氨酸的催化活力低，转化500mM底物合成L-丙氨酸的得率仅为68.47％，而改造获得的L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S在催化L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸反应中，L-丙氨酸的得率可达97.44％，得率提高了42.31％。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体(记为AjASD-T175S)，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第175位苏氨酸突变为丝氨酸获得的。所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S的氨基酸序列为SEQ IDNO.4所示。
本发明还提供一种所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。
本发明还涉及一种含所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S编码基因的重组载体及所述载体构建的基因工程菌。所述重组载体以pET28a为基础载体，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。
所述基因工程菌由如下方法得到：将L-天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行密码子优化，获得优化后的AjASD基因(核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，对应L-天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)。将密码子优化后的AjASD基因(SEQ ID NO.3)经人工合成后插入pET28a的EcoRⅠ和HindⅢ位点之间，得到重组质粒pET28a-AjASD。以重组质粒pET28a-AjASD为模板，利用带有突变碱基的引物经过反向PCR扩增全质粒，得到的PCR产物经DpnⅠ酶消化甲基化的模板，酶切产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即可得到所述含L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S，其中含重组L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体编码基因的质粒命名为pET28a-AjASD-T175S。
此外，本发明还提供一种所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体在催化L-天冬氨酸合成L-丙氨酸中的应用，所述应用为：将含L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S经诱导表达获得的湿菌体为催化剂，以L-天冬氨酸为底物，以5’-磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶，以pH 4-9的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-50℃、100-300rpm条件下反应(优选40℃、150rpm条件下反应22h)，获得含L-丙氨酸的反应液，反应液分离纯化，获得L-丙氨酸；所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体计40-80g/L，优选60g/L，所述底物L-天冬氨酸加入量为300-800mM，优选500mM，5’-磷酸吡哆醛加入量为1-3mM，优选1.5mM。所述缓冲液为PBS缓冲液(pH为6.0，20mM)。
进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8-12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，24℃、200rpm诱导过夜，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S与原始AjASD相比，催化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸的能力明显提高。以表达突变体AjASD-T175S的湿菌体E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S为生物催化剂，以500mM L-天冬氨酸作为底物、1.5mM 5’-磷酸吡哆醛作为辅酶构建反应体系，在40℃、150rpm条件下反应22h，L-丙氨酸得率可达97.44％，产物得率比野生型提高了42.31％。
(四)附图说明
图1为L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱羧合成L-丙氨酸示意图。
图2为含L-天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD编码基因的重组质粒琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为marker；泳道1为含L-天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD编码基因的重组质粒。
图3为反向PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为2K Plus IIDNA Marker；泳道1-16为突变后的重组线性化载体电泳条带：R38、N133、Y134、P135、T175、Y206、D284、S310、K313、H379、G37、N35、G174、N255、V286、T380。
图4为AjASD突变体诱导表达湿菌体的SDS-PAGE电泳图；泳道M为Marker；泳道0为E.coli空白对照；泳道1-16条带分别为R38、N133、Y134、P135、T175、Y206、D284、S310、K313、H379、G37、N35、G174、N255、V286、T380突变子诱导表达后的湿菌体。
图5为N35位点饱和突变子96孔板的快速筛选；A为96孔板显色照片，B为显色后检测的吸光值。
图6为不同突变子催化能力比较，A1-A16分别为R38、N133、Y134、P135、T175、Y206、D284、S310、K313、H379、G37、N35、G174、N255、V286、T380。
图7为质粒pET28a-AjASD经反向PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图；泳道M为marker；泳道1为质粒反向PCR产物。
图8为L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S的SDS-PAGE图；泳道M为marker；泳道1为未经诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S湿菌体；泳道2为诱导后湿菌体E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S，泳道3为诱导后L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S粗酶液，泳道4为L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S分离纯化所得纯酶液。
图9为L-丙氨酸标样的HPLC检测图谱。
图10为L-丙氨酸的HPLC检测标准曲线。
图11为温度对合成L-丙氨酸的影响。
图12为pH对合成L-丙氨酸的影响。
图13为底物浓度对合成L-丙氨酸的影响。
图14为辅酶浓度对合成L-丙氨酸的影响。
图15为L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S催化L-天冬氨酸脱羧反应过程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：野生型基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD的构建
将Genbank中源自琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)的天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行密码子优化，密码子优化后的AjASD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，对应脱羧天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，由杭州擎科生物技术有限公司合成。密码子优化后的AjASD编码基因(SEQ IDNO.3)经人工合成后插入pET28a的EcoRⅠ和HindⅢ位点之间，得到重组表达质粒pET28a-AjASD，L-天冬氨酸-β-脱羧酶编码基因AjASD的琼脂糖凝胶电泳图见图2所示。
将合成的重组表达质粒pET28a-AjASD取出10μL加入到100μL E.coli BL21(DE3)感受态中，混匀并冰上放置30min。42℃热击90s，立即置于冰上3-5min。向管中加入1mL LB液体培养基，37℃、200rpm摇床培养1h。将培养液4000rpm离心3min，取出900μL上清。用剩下的培养基将菌体悬浮，取出100μL涂在含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱过夜培养，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD。
LB液体培养基组成：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0～7.5。
实施例2：天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD的定向进化及关键位点确认
1、AjASD突变位点的筛选
利用AutoDock vina进行分子对接，选取催化中心及其附近氨基酸位点改造，以此来提高AjASD的催化活力。其中，确定催化中心及附近的氨基酸突变位点有：R38、N133、Y134、P135、T175、Y206、D284、S310、K313、H379、G37、N35、G174、N255、V286、T380共16个氨基酸。
2、AjASD定点饱和突变
以质粒pET28a-AjASD为模板，利用反向PCR技术，采用表1引物，按照表2反应体系对以上催化中心及附近的共16个氨基酸位点进行点饱和突变。
表1突变库构建全质粒PCR引物
注：引物划线部分代表突变位点，NNN代表氨基酸编码密码子。
表2全质粒扩增的PCR体系
PCR反应程序，预变性：95℃，5min；完全变性：95℃，15s；退火：62℃，15s；延伸：72℃，90S；30次循环；再次延伸：72℃，5min；降至4℃保温。
吸取适量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。电泳完成后放在紫外光下观察可见8000bp处有明亮条带，且与质粒理论值相符合，如图3所示。随即加入Dpn I限制性内切酶1μL反应1h除去甲基化模板，体系如表3所示。
表3 PCR产物中甲基化模板的消化体系
3、突变体诱导表达及催化能力筛选
(1)诱导表达
将上述PCR产物转入E.coli BL21(DE3)感受态，接种于含终浓度100μg/mL的Kan抗性的LB平板，于37℃培养箱培养12-14h。选取部分单菌落进行基因测序，确认在所选位点引入了各种突变。挑取LB/Kan抗性平板上的单菌落接种于LB液体培养基中(Kan终浓度100μg/mL)，置于37℃、200rpm的摇床内培养8-12h。取3mL菌液加入150mL LB液体培养基(Kan终浓度100μg/mL)中，在37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600在0.6，向培养物中加入终浓度为0.2mM的IPTG，在24℃、150rpm摇床内继续培养14h。诱导后的菌液在4℃，8000rpm下离心8min，然后用磷酸盐缓冲液(pH 6.0、20mM)重悬湿菌体，于4℃，8000rpm下离心10min，弃去上清液，所得沉淀即为湿菌体。湿菌体置于-20℃冰箱中保存待用。
取1mL的未经过诱导表达的E.coli BL21(DE3)-pET28a-AjASD菌液(OD600在0.6)为空白对照，和R38、N133、Y134、P135、T175、Y206、D284、S310、K313、H379、G37、N35、G174、N255、V286、T380共16个突变子经过上述诱导表达后的湿菌体进行SDS-PAGE凝胶电泳验证表达，验证结果如图4所示。由图4中可以看到，未经过诱导表达的菌液在SDS-PAGE中并无明显加粗，而R38、N133、Y134、P135、T175、Y206、D284、S310、K313、H379、G37、N35、G174、N255、V286、T380突变子诱导表达后的蛋白条带有着明显加粗。
(2)各个位点优势突变体的显色筛选
以位点R38为例，将第38位精氨酸突变为其他19种氨基酸，将步骤(1)空白对照、突变子诱导表达后获得湿菌体，利用96孔板进行快速筛选。AjASD催化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸和CO2，使得体系中的pH升高。通过酸碱性的变化以溴甲酚紫显色剂为辅，来监测各突变子的催化能力强弱。0.32％含量的溴甲酚紫溶液的pH显色范围为5.2-6.8，颜色变化从黄到紫。显色结果见图5中A所示，显色后的吸光值见图5中B所示。
如图5中A为位点R38饱和突变子的加入显色剂后的显色反应结果，颜色为黄色说明此孔内的突变子并无催化效果，颜色为紫色说明催化效果良好，根据颜色变化能够直观判别催化能力，颜色越偏紫色催化能力越强。图5中B为图5中A的96孔板每孔对应的吸光值，该值大小与突变子催化L-天冬氨酸的能力呈正相关。结合图5中A和B的信息，可以获得催化L-天冬氨酸效果最好的R38突变子，记为A1，保存菌种用于后续催化能力的检测。类似地，对位点N133、Y134、P135、T175、Y206、D284、S310、K313、H379、G37、N35、G174、N255、V286和T380通过定向进化，利用显色法筛选获得该位点的优势突变子，依次记为A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15和A16，突变子保存后用于后续催化能力复筛。
(3)优势突变体催化能力的检测
待全部突变子定向进化结束后，比较定向进化中选出的优势突变子A1-A16的催化能力：在反应体系中加入终浓度60g/L的湿菌体、终浓度400mM的L-天冬氨酸，5'-磷酸吡哆醛终浓度2.0mM，最后添加PBS缓冲液(pH为6.0，20mM)补充至10mL，在45℃和150rpm条件下反应22h，采用实施例5方法检测L-丙氨酸得率，结果如图6所示。以未改造的AjASD湿菌体为空白对照，L-丙氨酸得率为71.32％。A1-A16突变子对L-丙氨酸的得率分别为46.30％、0.00％、36.29％、32.60％、97.80％、21.69％、21.27％、20.68％、19.40％、22.00％、51.30％、76.04％、72.88％、0.00％、63.73％、57.96％。由此可得出A5的L-丙氨酸得率是AjASD的1.37倍，大幅提高。对A5进行基因测序验证，AjASD的175位氨基酸由T变为了S。分析两者的催化结果，175位点对于AjASD催化能力有关键作用。
实施例3：重组表达质粒pET28a-AjASD-T175S与基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S的构建
1、重组表达质粒pET28a-AjASD-T175S
以实施例1制备的质粒pET28a-AjASD为模板，设计引物，进行关键位点氨基酸(T175S)的单点突变。利用反向PCR技术克隆出全质粒，转化于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。提取质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为1599bp的开放阅读框，得到第175位苏氨酸成功变为丝氨酸的突变质粒。再将突变质粒转化于大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，提取质粒测序，成功得到突变质粒pET28a-AjASD-T175S，突变体AjASD-T175S的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
引物如下：
F：5’-GAAGGCGGTagcGCAGCAATGGCATATATTTT-3’；
R：5’-CATTGCTGCgctACCGCCTTCAACTGCAAA-3’。
反向PCR扩增体系见表4所示。
表4 PCR扩增反应体系
PCR反应进程为：预变性：95℃，5min；完全变性：95℃，15s；退火：62℃，15s；延伸：72℃，90S；30次循环；再次延伸：72℃，5min；降至4℃保温。吸取适量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。如图7所示，电泳完成后放在紫外光下观察可见8000bp处有明亮条带，且与质粒理论值相符合。
2、基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S
PCR产物经37℃酶切1h去除甲基化的模板，酶切体系如表5所示。
表5 PCR产物中甲基化模板的消化体系
DpnⅠ酶切后的PCR产物(质粒所携带的突变体基因AjASD-T175S的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)，直接转化表达宿主菌大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，得到大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S。转化子经菌落PCR验证后接入含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，离心收集菌体，提取质粒，送去测序。测序结果经软件分析氨基酸序列，第175位苏氨酸成功变为丝氨酸。
实施例4：L-天冬氨酸-β-脱羧酶AjASD及其突变体AjASD-T175S的诱导表达及分离纯化
摇瓶培养获得湿菌体：将含L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8-12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，24℃、200rpm诱导过夜，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
将上述湿菌体按1g湿菌体加20mL PBS缓冲液(pH 6.0)的比例加入适量PBS缓冲液(pH 6.0)，在650W功率下超声破碎2h(工作1s，间歇3s)后，破碎液于4℃和8000rpm下离心10min，重复离心三次后得到的上清即为粗酶液。
按照Ni-NTA金属螯合亲和层析(购自Bio-Rad公司，简称Ni2+柱，柱内径1.6cm，柱高15cm)使用说明，取粗酶液15mL上样至预平衡Ni2+柱中，再依次用含5mM咪唑、50mM咪唑、100mM咪唑、200mM咪唑、500mM咪唑的洗脱液(洗脱液组成：相应浓度的咪唑、300mM的氯化钠，溶剂为20mM的PBS缓冲液，pH 6.0)洗脱杂蛋白和目的蛋白，洗脱速度均为2.0mL/min，每个浓度洗脱液洗脱3个柱体积，收集含100mM咪唑的洗脱液对应的流出液，并用截留分子量为10kDa的超滤管在4℃和5000rpm下离心30min进行脱盐浓缩，取截留液即AjASD-T175S纯酶液，存于-20℃备用。
L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S纯酶液的纯度经SDS-PAGE凝胶电泳验证，SDS-PAGE电泳结果如图8所示。L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S经SDS-PAGE电泳后为单一条带。L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S的亚基理论大小为59.95kDa左右，其在SDS-PAGE电泳上的表观大小符合理论分子量。
类似的，按照实施例4的操作流程可获得诱导表达AjASD的湿菌体E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD的湿菌体，用作整细胞催化反应时的对照。
实施例5：酶法催化L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸反应液中L-丙氨酸的HPLC分析
流动相配制：A相：称取2.05g无水乙酸钠，移取1.5mL冰醋酸，加入1L超纯水搅拌溶解后，过0.22μm水系滤膜抽滤。B相：准确量取1L液相级甲醇，过0.45μm有机系滤膜抽滤。A、B两相按(v：v)1:1混匀后，于超声波清洗仪中超声30min进行脱气处理，即为流动相。
HPLC检测条件：色谱柱为C18(250×4.6/5μm)柱；流动相流速为1mL/min；检测波长为360nm；检测温度设置为40℃。根据不同浓度的L-丙氨酸标样出峰时间，确定出L-丙氨酸的保留时间为6.675min，衍生化试剂的保留时间为4.448min(图9)。保留时间为2.469、3.618、4.997、7.988、9.349min均为衍生化反应带来的副产物峰。
配制0.3mM、0.6mM、0.9mM、1.2mM和1.5mM的L-丙氨酸水溶液，分别取100μL于1.5mLEP管中，加入100μL的Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.0)，100μL体积浓度1％2,4-二硝基氟苯-乙腈水溶液，于60℃金属浴中避光反应1h后加入700μL的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液(pH 7.0)。12000rpm离心5min，取上清液用0.22μm滤膜过滤入棕色液相瓶中，用HPLC检测，确定L-丙氨酸出峰时间和各浓度对应的峰面积。将L-丙氨酸浓度与对应的峰面积作图，得到L-丙氨酸浓度与峰面积的标准曲线，如图10所示。L-丙氨酸标准曲线方程为y＝1390596.30x+1130378.70，R2＝0.99，线性关系良好。
将酶法催化L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸的反应液于12000rpm离心10min。取100μL上清液加入900μL超纯水，重复一次，共稀释100倍。取100μL稀释后的反应液于1.5mL EP管中，加入100μL的Na2CO3/NaHCO3缓冲液(pH 9.0)，100μL体积浓度1％2,4-二硝基氟苯-乙腈水溶液，于60℃金属浴中避光反应1h后加入700μL的NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液(pH 7.0)。12000rpm离心5min，取上清液用0.22μm滤膜过滤入棕色液相瓶中，HPLC检测L-丙氨酸的峰面积，根据L-丙氨酸标准曲线获得L-丙氨酸浓度，从而进行催化能力比较。
实施例6：反应温度对催化合成L-丙氨酸的影响
为了研究温度对酶催化反应的影响，需要探究酶在不同温度反应过程中的催化效果。构建反应体系为10mL，底物L-天冬氨酸终浓度400mM，实施例4方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S湿菌体终浓度60g/L，5’-磷酸吡哆醛终浓度2.0mM，最后添加PBS缓冲液(pH为6.0，20mM)补充至10mL。在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，150rpm下反应11h终止反应，采用实施例5方法检测L-丙氨酸含量，结果如图11所示。当催化温度为30℃时，L-丙氨酸得率为65.50％，当温度进一步上升时，产物得率随之上升，当催化温度达到40℃时，产物的转化率达到最佳，此时产物的转化率为73.29％。而随着温度继续上升，得率开始出现下降趋势，当温度为50℃时，得率降至温度梯度中的最低转化率，此时产物得率仅剩54.90％。
实施例7：反应pH对催化合成L-丙氨酸的影响
为了探究酶在不同pH下的反应速率，设置了不同的pH来检测反应的产物得率。构建反应体系为10mL，底物L-天冬氨酸终浓度400mM，实施例4方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S湿菌体终浓度60g/L，5’-磷酸吡哆醛终浓度2.0mM，最后添加PBS缓冲液(pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，20mM)补充至10mL。在温度为40℃，150rpm下反应11h终止反应，采用实施例5方法检测L-丙氨酸含量，结果如图12所示。在pH为4.0时，L-丙氨酸得率为73.55％，当pH上升时，酶的催化速率上升，产物得率随之上升，当pH达到6.0时，产物的转化率达到最佳为76.61％，而随着pH继续上升，产物得率开始出现下降趋势，当pH为9.0时，得率为71.81％。根据结果得出最适pH为6.0。
实施例8：底物浓度对催化合成L-丙氨酸的影响
为了探究底物浓度对酶的催化活力的影响，搭建不同底物浓度的反应体系。构建反应体系为10mL，设置底物浓度为：300mM、400mM、500mM、600mM，实施例4方法制备的E.coliBL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S湿菌体终浓度60g/L，5'-磷酸吡哆醛终浓度2.0mM，最后添加PBS缓冲液(pH为6.0，20mM)补充至10mL。在温度为40℃，150rpm下反应24h终止反应，并且在反应4h、8h、10h、20h、22h、24h分别取样。采用实施例5方法检测L-丙氨酸含量，结果如图13所示。由图中结果可知，随着底物浓度的逐渐升高，产物得率也随之上升，300mM和400mM的底物几乎能够全部转化为L-丙氨酸。当底物浓度达到500mM时，产物的转化率达到最大为97.92％，随着底物浓度再次增加到600mM时，产物的转化率不再升高，且受到一定程度的底物抑制。
实施例9：辅酶浓度对催化合成L-丙氨酸的影响
5'-磷酸吡哆醛作为脱羧酶的辅因子参与L-天冬氨酸-β-脱羧酶的催化反应，辅酶PLP的浓度对反应效率影响极大。为了探究辅酶浓度对反应催化的影响，搭建不同辅酶浓度的反应体系。构建反应体系为10mL，底物L-天冬氨酸终浓度400mM，实施例4方法制备的E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S湿菌体终浓度60g/L，设置辅酶5'-磷酸吡哆醛(PLP)浓度为：0.0mM、0.3mM、0.6mM、0.9mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM和2.0mM，最后添加PBS缓冲液(pH为6.0，20mM)补充至10mL。在温度为40℃，150rpm下反应24h终止反应，采用实施例5方法检测L-丙氨酸含量，结果如图14所示。当PLP浓度为0.0mM时，L-丙氨酸的得率为55.55％，这是由于大肠杆菌内本身含有少量的辅酶PLP。随着辅酶浓度增加，产物的转化率持续上升，当辅酶浓度为1.2mM时，产物的转化率达到95.34％，开始趋于平稳，当辅酶浓度为1.5mM时，得率为96.78％，与浓度1.2mM相差不大，即选取辅酶浓度1.5mM催化反应即可达到最大转化率。
实施例10：L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体AjASD-T175S催化L-天冬氨酸脱羧合成L-丙氨酸反应进程
将实施例4制备的含L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD-T175S经诱导表达获得的湿菌体作为催化剂，催化剂用量为60g/L，加入底物L-天冬氨酸500mM、辅酶5’-磷酸吡哆醛1.5mM，加PBS缓冲液(pH为6.0，20mM)补足反应体系至10mL。于40℃，150rpm的水浴摇床中反应，每隔一段时间取10μL反应液用PBS缓冲液(pH为6.0，20mM)稀释100倍，采用实施例5所述HPLC检测L-丙氨酸的含量，根据标准曲线计算出L-丙氨酸浓度，进一步计算出产物得率。以E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD经诱导表达获得的湿菌体为对照。
产物得率与反应时间的关系如图15所示，在10mL反应体系中，反应温度为40℃时，L-丙氨酸的得率在22h可达到97.44％，对应产物浓度为487.20mM。同样条件下，将实施例4方法制备的含L-天冬氨酸-β-脱羧酶编码基因的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AjASD经诱导表达获得的湿菌体作为对照，其反应液中检测到L-丙氨酸生成得率仅为68.47％。结果表明经过分子改造之后，AjASD的催化效率得到有效的提升，是未改造前的1.42倍，明显提高了其催化底物L-天冬氨酸的能力。
Claims (9)
1.一种L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体，其特征在于，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第175位苏氨酸突变为丝氨酸获得的。
2.一种权利要求1所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体的编码基因。
3.一种含权利要求2所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体编码基因的重组载体。
4.一种由权利要求3所述重组载体构建的基因工程菌。
5.一种权利要求1所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体在催化L-天冬氨酸制备L-丙氨酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为：将含L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体编码基因的工程菌经诱导表达获得的湿菌体作为催化剂，以L-天冬氨酸为底物，以5’-磷酸吡哆醛为辅酶，以pH 4-9的缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-50℃、100-300rpm条件下反应，获得含L-丙氨酸的反应液。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体计40-80g/L，所述L-天冬氨酸浓度为300-800mM，所述5’-磷酸吡哆醛浓度为1-3mM。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反应介质为pH为6.0，20mM的PBS缓冲液。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含L-天冬氨酸-β-脱羧酶突变体编码基因的工程菌，接种至含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8-12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为0.6～0.8，再加入终浓度为0.2mM的IPTG，24℃、200rpm诱导过夜，获得诱导培养液，再将诱导培养液于4℃和8000rpm下离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
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