CN105378097A - 制备含异麦芽酮糖的组合物的优化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由含蔗糖的底物制备含异麦芽酮糖的组合物的方法。

Description

制备含异麦芽酮糖的组合物的优化方法
本发明涉及由含蔗糖的底物制备含异麦芽酮糖的组合物的方法。
众所周知，在生物技术方法中可通过酶促异构化由蔗糖制备异麦芽酮糖(帕拉金糖，6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-果糖)。异麦芽酮糖是一种生理学有价值的糖，其作为蔗糖替代物质在食品和相关产品中的重要性日益增长。异麦芽酮糖是非致龋的并且在与蔗糖能量含量基本相同的情况下具有低的血糖指数。自2005以来，异麦芽酮糖已被允许用于食品中。此外，异麦芽酮糖是用于制备糖醇——异麦芽酮糖醇——的原料，异麦芽酮糖醇是1,6-GPS(6-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-山梨醇)和1,1-GPM(1-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-甘露醇)及其变体的消旋混合物，尤其是富含1,6-GPS或1,1-GPM的混合物。
在已知的生物技术体系中，蔗糖被不完全酶促异构化为异麦芽酮糖。确切地说，其产生其它的异构产物和副产物。一种重要的其它异构产物是海藻糖。
作为蔗糖的另一种重要的异构体，海藻糖(1-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-果糖)存在于自然界中，例如蜂蜜中，并且与异麦芽酮糖一样是非致龋的。
这两种异构体异麦芽酮糖和海藻糖在例如EP1424074A1中作为杂二糖已知，相较于蔗糖，其在人类和动物性取食者的小肠中具有减少的水解产物并因此是有利的食物成分，尤其是作为改善可控地保持血糖水平的那些。
工业上使用固定化的细菌细胞或其片段通过酶促重排来制备异麦芽酮和海藻糖。在此，二糖的单糖单元之间的构成蔗糖的α1-α2-糖苷键在异麦芽酮糖的情况中异构化成α1-α6-键或者在海藻糖的情况中异构化成α1-α1-键。这种由蔗糖生成所述两种非致龋二糖的重排在细菌酶蔗糖异构酶(EC5.4.99.11，同义词：蔗糖变位酶(Sucrosemutase)、蔗糖变位酶(Saccharosemutase)、蔗糖异构酶、异麦芽酮糖合酶)的催化下进行。具有蔗糖异构酶活性并能用于生物技术方法中的微生物尤其是红色精朊杆菌(Protaminobacterrubrum)、大黄欧文氏菌(Erwiniarhapontici)、嗜中酸假单胞菌(Pseudomonasmesoacidophila)、分散泛菌(Pantoeadispersa)和普利茅斯沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)。根据所用的生物体和反应条件，在此反应中得到产物混合物，其除期望的非致龋二糖异麦芽酮糖和海藻糖以外还可能以各种量比包含一定比例的可能不希望的单糖，例如葡萄糖和/或果糖以及低聚物。
EP0483755B1公开了制备含海藻糖和异麦芽酮糖的组合物的方法，其中为此使用了嗜中酸假单胞菌MX-45(FERM-BP3619)或放射形土壤杆菌MX-232(FERM-BP3620)，以获得主要含海藻糖的产物。
由EP0794259B1已知使用来自恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、红色栖热菌(Thermusruber)、粞热水生菌(Thermusaquatica)或脂肪杆菌(Pimelobacter)的酶促活性由含蔗糖的溶液制备主要含海藻糖的组合物。
EP0091063A2和EP0625578A1公开了使用固定的细菌细胞，特别是红色精朊杆菌(CBS574.77)，制备异麦芽酮糖的方法。该公开的方法由含蔗糖的溶液出发，使用固定的细胞将其转化成主要含异麦芽酮糖、但是也含海藻糖的产物。
该公开方法整体上的特点是蔗糖异构酶的活性有限，其中尤其对于工业生产异麦芽酮糖、海藻糖或者这两者而言希望有改进的方法效益，特别是更快的转化速度和/或提高的转化率和/或收率。
因此，作为本发明的基础的技术问题是克服上述缺点，特别是提供这样的方法，其相对于现有技术，在该方法范围内改善由蔗糖生成含异麦芽酮糖和/或海藻糖的产品的转化。本发明的目的尤其是，提供提高的转化速度和/或提高的转化率和/或收率。
本发明通过提供独立权利要求的教导解决了作为其基础的技术问题。
本发明尤其提供下述教导。
本发明尤其涉及根据本发明的由含蔗糖的底物制备含异麦芽酮糖的组合物的方法，包括下述步骤：
a)使含蔗糖的底物与颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质接触，和
b)得到含异麦芽酮糖的组合物，
其特征在于，所述颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质具有100至1300μm，特别是100至900μm的粒径dp。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中所述颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质是球状的。
在特别优选的实施方式中，所述颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质可具有立方体、板、颗粒、纤维、特别是中空纤维、球、空心球或的形式。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中蔗糖异构酶生物质与载体的重量比为10至6份、优选7份蔗糖异构体生物质对6至2份、优选3份载体(各自的干重量)。
在特别优选的实施方式中，蔗糖异构酶生物质与载体的重量比为0.2至0.8，特别是0.3至0.7或优选0.4至0.6。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中所述含异麦芽酮糖的组合物包含海藻糖。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中所述蔗糖异构酶生物质通过吸附、键合、特别是共价键合、交联、封装或包埋固定而被载体-固定化。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中所述载体是藻酸盐-或聚乙烯醇-载体，特别是藻酸钠-载体。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中所述蔗糖异构酶生物质是蔗糖异构酶、具有蔗糖异构酶活性的微生物细胞或具有蔗糖异构酶活性的细胞提取物。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中所述蔗糖异构酶生物质源自下述微生物：埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、拉乌尔菌属(Raoultella)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、泛菌属(Pantoea)、银合欢属(Leucanea)、精朊杆菌属(Protaminobacter)或芽孢杆菌属(Bacillussp.)。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中所述蔗糖异构酶生物质源自红色精朊杆菌(Protaminobacterrubrum)，克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)，特别是菌株LX3或菌株NK33-98-8，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，特别是菌株342；肠杆菌属(Enterobactersp.)，特别是菌株SZ62或菌株FMB1，欧文氏杆菌(Erwiniatasmaniensis)，特别是菌株Et1/99；黑腐果胶杆菌(Pectobacteriumatrosepticum)，特别是菌株SCRI1043；胡萝卜果胶杆菌(Pectobacteriumcarovotum)，特别是巴西亚种(Subspeziesbrasiliensis)，特别是菌株PBR1692，维氏固氮菌(Azotobactervinelandii)，白头银合欢(Leucanealeucocephalia)，大黄欧文氏菌(Erwiniarhapontici)，植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)，嗜中酸假单胞菌(Pseudomonasmesoacidophila)，肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，分散泛菌(Pantoeadispersa)，普利茅斯沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)，粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)或放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中所述方法步骤a)和b)在固定床或搅拌釜中进行。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中对得到的含异麦芽酮糖的组合物进行催化氢化。
根据本发明的方法优选连续进行，但也可以半连续或分批进行。
本发明尤其涉及根据本发明的制备含糖醇的组合物的方法，其中进行根据本发明的由含蔗糖的底物制备含异麦芽酮糖的组合物的方法，随后对得到的含异麦芽酮糖的组合物进行催化氢化，得到含糖醇的组合物。
本发明也涉及根据本发明的制备含糖醇的组合物的方法，其中所述含糖醇的组合物是异麦芽酮糖醇或异麦芽酮糖醇变体。
在本发明的上下文中，将“含蔗糖的底物”理解为含1至100重量％，优选1至99重量％，优选10至95重量％，特别是20至90重量％的蔗糖的组合物(分别基于底物的干物质的重量计)。
在一种实施方式中，所述含蔗糖的底物可仅由蔗糖构成。
在另一种实施方式中，所述含蔗糖的底物除蔗糖之外可含有一种、两种、三种、更多种或许多种其它物质，其特别选自海藻糖、异松三糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、异麦芽糖、三糖和低聚物。
在一种特别优选的实施方式中，所述含蔗糖的底物优选具有的蔗糖含量为优选2重量％至优选85重量％，优选3重量％至优选90重量％，优选4重量％至优选95重量％，优选5重量％至优选96重量％，优选6重量％至优选97重量％，优选7重量％至优选98重量％，优选8重量％至优选99重量％，优选9重量％至优选100重量％，优选10重量％至优选85重量％，优选20重量％至优选90重量％，优选30重量％至优选95重量％，优选40重量％至优选96重量％，优选50重量％至优选97重量％，优选60重量％至优选98重量％，优选70重量％至优选99重量％或优选80重量％优选至100重量％(分别基于底物的干物质的重量计)。
在特别优选的实施方式中，所述含蔗糖的底物具有的蔗糖含量为优选5重量％至优选75重量％，优选10重量％至优选78重量％，优选20重量％至优选85重量％，优选30重量％至优选88重量％，优选40重量％至优选93重量％，优选50重量％至优选94重量％，优选60重量％至优选95重量％，优选65重量％至优选96重量％，优选10重量％至优选97重量％，优选20重量％至优选98重量％，优选30重量％至优选99重量％，优选40重量％至优选100重量％(分别基于底物的干物质的重量计)。
特别优选的是优选60至90重量％，优选70至80重量％，优选30至60重量％，优选40至50重量％的蔗糖含量(分别基于含蔗糖的底物的干物质的重量计)。
在特别优选的实施方式中，该含蔗糖的底物具有90至99重量％，优选90至98重量％，特别是90至97重量％的蔗糖(分别基于底物的干物质的重量计)。
在特别优选的实施方式中，该含蔗糖的底物以液体形式，优选以溶解或悬浮的形式，存在于优选液体介质，特别是水性介质中。在特别优选的实施方式中，所述水性介质是水。在特别优选的实施方式中，该含蔗糖的底物存在于水性介质中，即存在于水性溶液或水性悬浮液中。
在特别优选的实施方式中，该含有含蔗糖底物的水性介质，即例如溶液或悬浮液，具有0.1至80重量％，优选1至70重量％，优选4至60重量％，优选5至50重量％，特别是5至40重量％，特别是5至30重量％，优选35至45重量％，优选20至27％，优选40至75重量％，特别是40至60重量％，特别是10至60重量％，优选20至55重量％的含蔗糖的底物，其中该量的范围与介质(即例如水)的重量加和为100％(重量％，分别基于含有含蔗糖底物的介质的总重量计，相当于介质中含蔗糖底物的干物质含量)。
在特别优选的实施方式中，该含有含蔗糖底物的溶液或悬浮液是糖加工厂的稀汁或稠汁，优选具有5至70％，优选50至70％，特别是55至68％，特别是5至30％，优选20至27％的干物质含量(重量％，分别基于含蔗糖底物的介质的总重量计)。
根据本发明，也可以使用糖蜜或其它不纯的含蔗糖的组合物作为含有含蔗糖底物的介质，特别是溶液或悬浮液。
在另一优选实施方式中，该含有含蔗糖底物的液体介质，特别是含有含蔗糖底物的溶液或悬浮液，具有0.1至80重量％，5至30重量％，20至30重量％，20至60重量％，30至60重量％，35至45重量％，40至75重量％，40至60重量％，10至60重量％或优选20至55重量％的蔗糖含量分别基于含蔗糖的液体介质的总重量计)。
在本发明的上下文中，将“含异麦芽酮糖的组合物”理解为蔗糖异构酶的活性在含蔗糖底物上的异构化产物。本发明的含异麦芽酮糖的组合物含有异麦芽酮糖和海藻糖的混合物，特别是由其构成。在一种实施方式中，优选存在的异麦芽酮糖比海藻糖多，而在另一种实施方式中，优选存在的海藻糖比异麦芽酮糖多。含异麦芽酮糖的组合物的另外的成分可以是异松三糖、果糖、葡萄糖、异麦芽糖、蔗糖、三糖、低聚物或这些糖中的两种或更多种的混合物。
该含异麦芽酮糖的组合物中异麦芽酮糖的比例特别优选为至少80重量％，优选至少81重量％，至少82重量％，至少83重量％，至少84重量％，至少85重量％，优选至少86重量％和尤其是至少87重量％，至少88重量％，至少89重量％，至少90重量％，至少91重量％，至少92重量％或93重量％(各自基于含异麦芽酮糖的组合物的干物质计)。这种含异麦芽酮糖的组合物中的加和至100％的其余成分由海藻糖以及任选的异松三糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、异麦芽糖、三糖、低聚物或者它们中的两种或更多种构成。
在特别优选的实施方式中，该含异麦芽酮糖的组合物具有60至98重量％，特别是70至95重量％，优选75至88重量％，特别是75至84重量％的异麦芽酮糖(各自基于含异麦芽酮糖的组合物的干物质计)。
在另一优选实施方式中，该含异麦芽酮糖的组合物可含有1至20重量％，5至20重量％，10至30重量％或20至最多99重量％，优选20至40重量％，优选20至30重量％，优选30至优选最多95重量％，优选45至最多96重量％，优选46至最多97重量％，优选47至最多98重量％，优选48至最多99重量％，优选49至最多99重量％，优选40至最多98重量％，优选50至97重量％，60至96重量％或优选70至最多97重量％，优选80至最多98重量％，优选75至最多98重量％，特别是50至99重量％，特别是60至98重量％，特别是85至最多99重量％和优选95重量％至99重量％，优选96至99重量％，优选97至99重量％，优选98至99重量％的海藻糖(各自基于含异麦芽酮糖的组合物的干物质计)。整个组合物中加和至100重量％的其余成分由异麦芽酮糖以及任选的葡萄糖、果糖、异松三糖、异麦芽糖、蔗糖、三糖、低聚物或它们中的两种或更多种构成。
在特别优选的实施方式中，该含异麦芽酮糖的组合物具有60至90重量％异麦芽酮糖、5至40重量％海藻糖和0至5重量％的至少一种选自下述的另外的物质：异松三糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、异麦芽糖、三糖和低聚物。
在另一优选实施方式中，存在的含异麦芽酮糖的组合物具有60至90重量％海藻糖、5至40重量％异麦芽酮糖和0至5重量％的至少一种选自下述的另外的物质：异松三糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、异麦芽糖、三糖和低聚物。
在另一优选实施方式中，该含异麦芽酮糖的组合物以液体形式，优选以溶解的或悬浮的形式，优选存在于液体介质，特别是水性介质中。在特别优选的实施方式中，该水性介质是水。在特别优选的实施方式中，该含异麦芽酮糖的组合物存在于水性介质中，即水溶液或水性悬浮液中。
在特别优选的实施方式中，该含有含异麦芽酮糖的组合物的水性介质，即例如溶液或悬浮液，具有0.1至80重量％，优选1至70重量％，优选4至60重量％，优选5至50重量％，特别是5至40重量％，特别是5至30重量％，优选35至45重量％，优选20至27％，优选40至75重量％，特别是40至60重量％，特别是10至60重量％，优选20至55重量％的含异麦芽酮糖的组合物，其中该量的范围与介质(即例如水)的重量加和为100％(重量％，各自基于含有含异麦芽酮糖的组合物的介质的总重量计，相当于介质中含异麦芽酮糖的组合物的干物质含量)。
在本发明的上下文中，“蔗糖异构酶生物质”是指一种生物质，特别是细胞、细胞提取物、酶或酶混合物，其中该生物质在合适的条件下将含蔗糖的底物转化成含异麦芽酮糖的组合物，也就是说具有蔗糖异构酶活性。该蔗糖异构酶优选具有α-葡糖基-转移酶或蔗糖-6-葡糖基-变位酶(EC5.4.99.11)活性。
有利地，可用作蔗糖异构酶生物质的细胞可以是活的或死的。在特别优选的实施方式中，用作蔗糖异构酶生物质的细胞是完整的或破碎的，特别是分解的细胞、细胞碎片、细胞裂解物或细胞提取物。在优选的实施方式中，本发明使用的蔗糖异构酶生物质可以被提纯，特别是分离，例如通过常用的提纯方法如溶剂萃取、法压、冻干和/或酶促处理。所使用的蔗糖异构酶生物质可为天然来源的或者其在一个实施方式中可以被基因修饰。
根据本发明提供的使含蔗糖的底物与载体-固定化的蔗糖异构酶生物质接触的方法步骤a)根据本发明优选如此进行，以至于可将含蔗糖的底物转化成含异麦芽酮糖的组合物，优选以转化选择的方式(ineinerUmsatz-optioniertenWeise)转化。
优选所述接触在10至40℃，优选15至40℃，优选10至37℃，优选25至40℃，优选25至30℃，优选30至40℃，优选10至25℃，优选15至30℃，优选18至26℃，优选10至20℃，特别是10至17℃的温度下进行。
在另一优选实施方式中提供，方法步骤a)在5.0至9.0，优选5.0至7.0，优选6.0至7.0的pH值下进行。
在本发明的上下文中，将载体-固定化的蔗糖异构酶生物质理解为是固定在载体上或载体内的蔗糖异构酶生物质。在下文中也将其简称为固定物。该固定化可以以常规方式，例如通过吸附、键合、特别是共价键合、交联、包封或包埋固定来进行。
特别优选地，本发明提供，通过下述方法步骤制备所述颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质：在第一方法步骤x1)中提供生物质，例如通过在发酵罐中制备，在第二方法步骤x2)中将该生物质与藻酸盐溶液混合，并在第三方法步骤x3)中将该生物质-藻酸盐混合物引入到，特别是滴加到钙盐溶液中，特别是氯化钙或乙酸钙溶液中。形成的颗粒凝胶并在第四方法步骤x4)中干燥，例如在流化床干燥器中干燥。
在特别优选的实施方式中可以提供，在与藻酸盐溶液混合前将第一方法步骤x1)中提供的生物质浓缩，即增稠。
在特别优选的实施方式中提供，在方法步骤x3)中，在压力下，尤其借助压缩空气，即以吹气法(Abblasverfahren)，通过滴加将生物质-藻酸盐混合物引入到钙盐溶液中。在另一优选实施方式中，可以在方法步骤x3)中借助静电方法，特别是向钙盐溶液和生物质-藻酸盐混合物施加电压而将生物质-藻酸盐混合物滴加到钙盐溶液中。在另一实施方式中，可通过例如借助活塞(Stempel)使生物质-藻酸盐混合物振动并由此有针对性地将该混合物滴加到钙盐溶液中来进行方法步骤x3)。任选地可以使用升高的压力，例如升高的空气压力。
在另一实施方式中，可以在方法步骤x3)中利用侧面吹气压力(Abblasdruck)将生物质-藻酸盐混合物滴加到钙盐溶液中。在另一优选实施方式中，可以在方法步骤x3)中将生物质-藻酸盐混合物施加到转盘上并由此滴加到钙盐溶液中。在另一优选实施方式中，可以在方法步骤x3)中通过转动喷嘴将生物质-藻酸盐混合物滴加到钙盐溶液中。
在另一优选实施方式中，可以在方法步骤x3)中将生物质-藻酸盐混合物通过射流切割机/Jet-滴加到钙盐溶液中。在另一优选实施方式中，生物质-藻酸盐混合物可在方法步骤x3)中通过多喷嘴系统与带式干燥机和空气干燥的组合，任选使用切割工具，滴加到钙盐溶液中。
上述方法步骤，特别是根据方法步骤x3)的上述固定技术有利地导致提供根据本发明优选的粒径dp。
在本发明的上下文中，将颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质理解为这样的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质，其以颗粒形式存在，即以粒子形式，特别是以固体粒子的形式存在。
在优选实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质在干燥形式下具有的粒径dp为100至1300μm，优选200至1300μm，优选150至1200μm，优选150至1000μm，优选100至900μm，优选150至950μm，优选150至900μm，优选150至850μm，特别是100至800μm，优选200至800μm，特别是200至950μm，特别是250至500μm，特别是300至700μm，优选400至600μm，特别是450至550μm，特别是480至540μm，优选500μm(各自基于干燥的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质计)。
本发明尤其涉及根据本发明的方法，其中颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质具有的粒径dp为400至600μm，特别是100至400μm，特别是100至300μm，特别是200至300μm，优选250至300μm。
在特别优选的实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质具有的粒径dp为250至500μm。
在特别优选的实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质在干燥形式下具有380至570μm范围的体积平均值D[4,3]，特别是380至400μm，450至490μm或530至580μm范围的体积平均值D[4,3]。
在另一优选实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质在干燥形式下具有360至540μm，特别是360至380，430至450或510至530μm范围的D[3,2]-值。
在另一优选实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质在干燥形式下具有0.0100至0.0180，特别是0.0100至0.0118或0.0130至0.0140或0.0150至0.0170m2/g范围的比表面积。
在另一特别优选的实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质在干燥形式下具有0.190至0.210范围的均匀度
在另一优选实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质具有270至400μm，特别是270至290μm，320至340μm或380至400μm范围的d(0.1)值。
在另一优选实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质在干燥形式下具有370至550μm，特别是370至390μm，450至470μm或530至550μm范围的d(0.5)值。
在另一优选实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质在干燥形式下具有510至760μm，特别是510至530μm，610至640μm或730至760μm范围的d(0.9)值。
只要在本发明的教导中没有另外说明，所有为表征颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质给出的参数如比表面积、粒径、体积平均值或d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)值均针对在干燥形式下测量的颗粒。
在一种特别优选的实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质在干燥形式下具有的粒径dp为100至500，特别是100至450，特别是100至400，特别是100至300，特别是200至300，优选250至300μm。
在本发明的上下文中，将术语“d(0.5)值”或术语“粒径d(0.5)”理解为基于质量分布或体积分布计的粒度分布的中位值，其中d(0.5)表示50％的颗粒量小于各给出的值或者。
类似地，将术语d(0.1)或d(0.9)理解为10或90％的颗粒量小于各给出的值。
所述粒度分布是体积粒度分布。
在特别优选的实施方式中，所制备的颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质的粒度分布的测量借助激光衍射，特别是根据本申请实施例1中的方法进行。
在特别优选的实施方式中，颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质是球形的。
在优选实施方式中，载体-固定化的颗粒蔗糖异构酶生物质具有<1.2的均匀系数
根据下式计算均匀系数。
在特别优选的实施方式中，载体-固定化的颗粒蔗糖异构酶生物质具有至少400单位/g干物质(TS)，优选至少450单位/gTS，优选至少500单位/gTS，特别是至少600单位/gTS，特别是至少700单位/gTS，优选至少800单位/gTS的比活性。
在本发明的上下文中，尤其将本发明的方法理解为根据上述方法步骤a)和b)以获得含异麦芽酮糖的组合物的方法，其中颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质具有上述表征的本发明性质的粒径dp，特别是100至1300μm，特别是150至1300μm，优选100至900μm的粒径dp(各自在干燥形式下测量)。本发明的方法也是这种方法的特别有利的实施方式，其中本发明方法的不同具体实施方式也可彼此组合，只要该组合在技术上可行。
本发明另外有利的实施方式由从属权利要求给出。
借助实施例和附图进一步说明本发明。
附图示出：
图1示出根据本发明的第一种颗粒制剂(粗颗粒)的尺寸分布，
图2示出根据本发明的第二种颗粒制剂(正常颗粒)的尺寸分布，和
图3示出根据本发明的第三种颗粒制剂(细颗粒)的尺寸分布。
实施例1
借助激光衍射用Mastersizer2000，Fa.MALVERN干测量测定固定化的生物催化剂的粒度分布
实施方式
借助激光衍射测量得到根据本发明制备的生物催化剂(固定物)的粒度分布。参数d0.1、d0.5、d0.9和均匀度用于描述尺寸分布。
简述
测量原则基于根据ISO13320的散射光/激光衍射光谱。离散的颗粒以低浓度被引入到激光束中。颗粒的这种引入通过将干燥的生物催化剂试样吸入到测量细胞中进行(“干测量”)。取决于颗粒的直径，产生激光的衍射，其作为散射的辐射被检测器接收。测量结果首先以检测器测量的光强度的形式存在，并且必须将其换算成粒度分布。这借助常用的评估软件对这里给出的颗粒>1μm通过约瑟夫·冯·弗劳恩霍夫近似(1814)来实现。
仪器/助剂
-分析筛，直径200mm，根据DINISO3310-1的筛孔尺寸为1.25mm
-分析筛的收集底盘和盖
-MalvernMastersizer2000，带有干分散单元Scirocco2000(A)，包括相关的控制和评估软件，MalvernInstrumentsLtd。
试样准备
-所有称重进行至±0.01g(读取精度)。
-得出筛和收集底盘的空白值(皮重)
-组合收集底盘和筛
-得出各生物催化剂批次的总的生物催化剂试样(通常在250-mL瓶中)的重量。
-定量地将试样转移到筛上，盖上盖并手工过筛
-过筛后，称重带有残余物的筛和具有通过物(Durchgang)的收集底盘(毛重)
-评价/计算：由筛余物确定生物催化剂试样的百分比粗比例
-弃去筛余物，并将收集底盘中的通过物放回最初的试样瓶中
用MalvernMastersizer2000测量
试样的计量加入/给料
试样的计量加入经由带有可调节缝隙宽度的振动料斗进行。使用带有多个球的粗筛作为过筛部件(Siebeinsatz)。
该计量加入(缝隙宽度)必须根据产物来调整，以达到测量浓度(绿色范围)。
分散介质
使用带有一定压力的空气作为分散介质。
测量的施行用Mastersizer2000，分散装置Scirocco2000(A)进行。
实施例2：
A.制备生物催化剂
用10ml无菌营养底物由菌株红色精朊杆菌(CBS574.77)的再次培养物冲洗掉细胞，所述营养底物由8kg糖厂稠汁(干物质含量＝65％)、2kg玉米浆、0.1kg(NH4)2HPO4和89.9kg蒸馏水构成，按需调节至pH7.2。该悬浮液在含有上述组合物的200ml营养液的1升烧瓶中充当用于摇床预培养的接种物。
在29℃下30小时的孵育时间后，在30升发酵罐中用每10个烧瓶(总容量2升)接种18升上述组合物的营养液，并在29℃下用20升空气/分钟和350转/分钟的转速发酵。
在细菌(Keim)数达到超过5x109个细菌/ml后，停止发酵；通过离心从发酵溶液中收获细胞并将其悬浮在2％的藻酸钠溶液中。
通过使用旋转固定、射流切割法或脉动滴注法，特别是使用静电法、吹气法(Abblasverfahren)或振动法，特别是使用侧面吹气压力(Abblasdruck)、旋转盘或旋转喷嘴，将所述悬浮液滴加到2％的氯化钙溶液中并提供根据本发明优选的粒径和粒度分布，特别是250-500μm的粒径dp(基于干颗粒)。也在使用带式干燥器的同时采用多喷嘴系统。
表1是三种示例性得到的生物催化剂制剂获得的表征参数，更确切地说用于第一制剂，称为粗颗粒，第二制剂，称为正常颗粒和第三制剂，称为细颗粒。
表1
将所产生的固定物球用水洗涤。该生物催化剂可在+4℃下储存数周。
B.制备含异麦芽酮糖的组合物
将如A所得到的固定化的细胞填充在可调温的柱反应器中，调温至25至30℃，并连续通入TS含量为35至45％的蔗糖溶液。在此，如此设定流速，以使至少97％的所用蔗糖重排(umgelagert)。
表2
表2示出在100ml固定床中表1的不同粒径的固定物的催化剂活性。
由柱反应器中排出的含异麦芽酮糖的组合物的HPLC分析得到下列组成：
表3
果糖 葡萄糖 蔗糖 异麦芽酮糖 海藻糖 异麦芽糖 DP-3 异松三糖 残余蔗糖
2.7 2.0 0.9 85.1 8.0 0.8 0.3 0.3 <0.1
2.7 2.0 0.9 85.2 8.0 0.7 0.2 0.2 <0.1
2.7 2.0 0.9 85.3 7.8 0.8 0.2 0.3 <0.1
表2的产物谱(粗颗粒、正常颗粒、细颗粒)(以g/100g干物质给出)。
D.氢化含异麦芽酮糖的组合物
将各除去残余蔗糖的含异麦芽酮糖的组合物的剩余物在阮内镍(Raney-Nickel)上在80℃下用氢气在约10MPa的压力下连续氢化。在分离镍并通过离子交换纯化后，该在中性条件下氢化的含异麦芽酮糖的组合物的剩余物大致具有下述组成：
表4
甘露醇 1.5％作为干物质
山梨糖醇 4.0％作为干物质
1,6-GPS 44.4％作为干物质
1,1-GPS 3.8％作为干物质
1,1-GPM 45.3％作为干物质
氢化的和未氢化的低聚物 1.0％作为干物质
实施例3：
为了制备该生物催化剂，用10ml无菌营养底物由菌株嗜中酸假单胞菌MX-45(Ferm11808)的再次培养物冲洗掉细胞，所述营养底物由8kg糖厂稠汁(干物质含量＝65％)、2kg玉米浆、0.1kg(NH4)2HPO4和89.9kg蒸馏水构成，按需调节至pH7.2。该悬浮液在含具有200ml营养液的1升烧瓶中充当用于摇床预培养的接种物。
在29℃下30小时的孵育时间后，在30升发酵罐中用每10个烧瓶(总容量2升)接种18升上述组合物的营养液，并在29℃下用20升空气/分钟和350转/分钟的转速发酵。
在细菌数达到超过5x109个细菌/ml后，停止发酵；通过离心从发酵溶液中收获细胞并将其悬浮在2％的藻酸钠溶液中。
通过使用旋转固定、射流切割法或脉动滴注法，特别是使用静电法、吹气法或振动法，特别是使用侧面吹气压力、旋转盘或旋转喷嘴，将所述悬浮液滴加到2％的氯化钙溶液中并提供根据本发明优选的粒径和粒度分布，特别是表1的粒径dp(基于干颗粒)。也在使用带式干燥器的同时采用多喷嘴系统。
将所产生的固定物球用水洗涤。该生物催化剂可在+4℃下储存数周。
为了制备含异麦芽酮糖的组合物，将这样得到的嗜中酸假单胞菌MX-45(Ferm11808)的固定化的细胞填充在可调温的柱反应器中，调温至25至30℃，并连续通入TS含量为35至45％的蔗糖溶液。在此，如此设定流速，以使至少97％的所用蔗糖重排。
由柱反应器中排出的含异麦芽酮糖的组合物的HPLC分析得到下列组成：
表5
果糖 0.2％作为干物质
葡萄糖 0.2％作为干物质
蔗糖 1.0％作为干物质
异麦芽酮糖 12.5％作为干物质
异麦芽糖 0.2％作为干物质
海藻糖 85.7％作为干物质
低聚物(DP>3) 0.2％作为干物质
将这样制备的含异麦芽酮糖的组合物除去残余蔗糖并在阮内镍上在约80℃下用氢气在8至12MPa的压力下连续氢化。
在分离镍并通过离子交换纯化后，该在中性条件下氢化的含异麦芽酮糖的组合物具有下述组成：
表6
甘露醇 0.4％作为干物质
山梨糖醇 1.0％作为干物质
1,1-GPM 57.7％作为干物质
1,1-GPS 34.4％作为干物质
1,6-GPS 6.4％作为干物质
氢化的和未氢化的低聚物 0.2％作为干物质
为通过色谱分离从产物中除去氢化和未氢化的低聚物以及山梨醇，在氢化后用装载有钠-或钾离子的强酸性阳离子交换树脂进行色谱分离。

Claims (14)

1.由含蔗糖的底物制备含异麦芽酮糖的组合物的方法，包括下述步骤：
a)使所述含蔗糖的底物与颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质接触，和
b)得到所述含异麦芽酮糖的组合物，
其特征在于，所述颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质具有100至900μm的粒径dp。
2.根据权利要求1的方法，其中所述颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质具有100至400μm的粒径dp。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述颗粒状的载体-固定化的蔗糖异构酶生物质是球状的。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中蔗糖异构酶生物质与载体的重量比为10至6份蔗糖异构酶生物质对6至2份载体(各自的干重量)。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述含异麦芽酮糖的组合物包含海藻糖。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蔗糖异构酶生物质通过键合、交联或包埋固定而被载体-固定化。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述载体是藻酸盐-或聚乙烯醇-载体。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蔗糖异构酶生物质是蔗糖异构酶、具有蔗糖异构酶活性的微生物细胞或具有蔗糖异构酶活性的细胞提取物。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蔗糖异构酶生物质源自下述微生物：埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、拉乌尔菌属(Raoultella)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、泛菌属(Pantoea)、银合欢属(Leucanea)、精朊杆菌属(Protaminobacter)或芽孢杆菌属(Bacillussp.)。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述蔗糖异构酶生物质源自红色精朊杆菌(Protaminobacterrubrum)，克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)，特别是菌株LX3或菌株NK33-98-8，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，特别是菌株342；肠杆菌属(Enterobactersp.)，特别是菌株SZ62或菌株FMB1，欧文氏杆菌(Erwiniatasmaniensis)，特别是菌株Et1/99；黑腐果胶杆菌(Pectobacteriumatrosepticum)，特别是菌株SCRI1043；胡萝卜果胶杆菌(Pectobacteriumcarovotum)，特别是巴西亚种(Subspeziesbrasiliensis)，特别是菌株PBR1692，维氏固氮菌(Azotobactervinelandii)，白头银合欢(Leucanealeucocephalia)，大黄欧文氏菌(Erwiniarhapontici)，植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)，嗜中酸假单胞菌(Pseudomonasmesoacidophila)，肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，分散泛菌(Pantoeadispersa)，普利茅斯沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)，粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)或放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法步骤a)和b)在固定床或搅拌釜中进行。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中对得到的含异麦芽酮糖的组合物进行催化氢化。
13.制备含糖醇的组合物的方法，其中进行根据权利要求1至12中任一项的方法，随后对得到的含异麦芽酮糖的组合物进行催化氢化并得到含糖醇的组合物。
14.根据权利要求13的方法，其中所述含糖醇的组合物是异麦芽酮糖醇或异麦芽酮糖醇变体。
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