JPS58162292A - 固定化酵素，その製法および固定化酵素による甘味料の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はフラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する
微生物菌体をゲル状アルギン酸塩内に包括して固定化し
た、圧縮変形率が０．７０以下のフラクトシルトランス
フェラーゼ活性固定化酵素。

その製造法並びに該固定化酵素による甘味料の製造法に
関する。

本発明に係るフラクトシルトランスフェラーゼ活性固定
化酵素をシュークロースに作用させることによって得ら
れる甘味料は、本発明者らによって見出されたものであ
り、特開昭５６−１５４９６７号、特開昭５７−１２９
７３号、特願昭５６−１３６１３０号などに開示されて
いる。この甘味料は、その構造上の特徴として、組成物
中シュークロース１分子に７ラクトースが１〜４分子結
合したオリゴ糖を主要な成分として含有している。本甘
味料は難う触性であると共に低カロリーであること、肥
満や糖尿病等の原因となり難いこと等が本発明者らによ
゛つて見出されており、食品、医薬等の分野への広い用
途が期待されている。この甘味料は、前述したように、
シュークロースに７ラクトシルトランスフエラーゼを作
用させることによって得られるが、これを工業的に製造
するにはこの酵素を固定化した、所謂固定化酵素を使用
して連続式または回分式によってシュークロースを処理
する方が製造コストの点からも有利である。酵素の固定
化法としては、吸着法、共有結合法、包括法等の手法が
知られているが、一般に共有結合法は活性発現率が低く
、吸着法は連続使用に際して、脱着による酵素の消失が
認められる等の理由により、その工業化に難点がある。

そのため、一般的には、工業的手法として包括法が採用
されている。微生物の生産する酵素を包括法で固定化す
る場合、目的とする酵素が菌体外酵素であり、培養Ｆ液
中に蓄積される場合には、固定化に際し酵素の精製。

濃縮が必要であり、酵素の収率が低下する。しかし、目
的とする酵素が菌体内に蓄積される場合には、固定化に
際し予備精製、濃縮等の工程が不要であり、培養液から
分離して得られた菌体をそのまま酵素として用い、固定
化酵素を製造することができるので、工業的には極めて
有利である。本発明者等は、先に菌体内にフラクトシル
トランスフェラーゼを蓄積する菌株のスクリーニングを
行った結果、オーレオバシデイウム・プルランス・れ、
工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥＢＭＰ−５８８
５として寄託されている菌株がその性状を有することを
見出した（特願昭５６−５１７５８号明細書参照）。本
菌株は酵母様画形を有し、その細胞の大きさはバクテリ
ヤよりも大きく、培養液からの分離も容易であり、更に
又、菌体内にフラクトシルトランスフェラーゼを生産蓄
積するので、この菌体を包括法で固定化すれば、有用な
フラクトシルトランスフェラーゼ固定化酵素を得ること
ができる。

さらに、本発明者等は菌体内にフラクトシルトランスフ
ェラーゼを生産する菌株としてアスベルキ／ｌ／　ス・
ニガー（々用ヅー４λλ主す射Ｈｅ、ｒ−）　ＡＯＥ　
−２−１，ＡＴＯＯ２０６１１株を見出したが、本菌株
も同様に本発明に係る菌株として用いることができる。

本発明の第１は、菌体内にフラクトシルトランスフェラ
ーゼ活性を有する微生物菌体をゲル状アルギン酸塩内に
包括法によって固定化して得られるフラクトシルトラン
スフェラーゼ固定化酵素に係るものである。

この固定化酵素の有効性は、粗酵素（菌体）中に共存す
る他の酵素活性を極力抑えること、固定化酵素自体の強
度を向上させ、通液時の圧損等によるカラムの目づまり
を防止することによってさらに向上する。以下に本固定
化酵素の製造方法について詳述する。この製造方法は第
２の本発明である。従来より包括法の手段としては、ア
ルギン酸カルシウム包括法、カラギナン包括法、アセチ
ルセルローズ包括法等が知られているが、微生物の菌体
内フラクトシルトランスフェラーゼの包括手段としては
アルギン酸カルシウムなどのゲル形成性アルギン酸金属
塩を用いた包括法が熱安定性の点から最もすぐれた方法
であることを見出した（試験例］、参照）。次に固定化
酵素を製造するための粗酵素となる微生物菌体、たとえ
ば前記のオーレオバシデイウム・プルランス・バラエテ
ィ・メラニゲナムＡ−ｉ株等は、菌体内にフラクトシル
トランスフェラーゼと併せてインベルターゼをも生産す
る性質を有するため、シュークロースな基質として目的
とする新規甘味料を製造する際に、インベルターゼ自体
はシュークロースなりルコースと７ラクトースに分解す
る。そのため、フラクトシルトランスフェラーゼによる
転移作用を阻害し、目的とする新規甘味料におけるシュ
ークロースにフラクトースが１〜４分子結合したオリゴ
糖の生成量を抑制する結果となり好ましくない。

従って、フラクトシルトランスフェラーゼ活性（’Ｉ’
）とインベルターゼ活性（Ｉ）の比（Ｔ／Ｉ比）はでき
るだけ高い方がよいことが推察できる。発明者等は、粗
酵素（菌体）におけるＴ／Ｉ比を後述の方法で測定し、
この値とこの粗酵素をシュークロースに作用させたとき
反応生成物中に得られるシュークロースに７ラクトース
が１〜４分子分子口ＧＦｎと称する）との関係につき検
討を加えた結果、オーレオバシデイウム・プルランス・
バラエティ・メラニゲナム　ムー８株またはア、λベル
ギルス・ニガーＡＣＥ−２−１，ＡＴＯＯ２０６１１株
をシュークロース１０〜３０％、好ましくは１５〜２０
％、０００１、又はＭｇＯ！、を１〜１０ｍＭ、好まし
くは３〜５ｍＭ濃度に添加した培地を用いて培養すると
、’ｒ／Ｉ比が２．０以上の粗酵素（菌体）が得られる
こと、この酵素を用いてシュークロースを処理する料が
得られることを見出した（試験例２参照）。

なお、７ラクトシルトランスフエラーゼおよびインベル
ターゼの活性測定法ならびに活性表示法は以下の通りで
ある。

Ｍａｃ　ｌ１ｖａｉｎ緩衝液（ｐＨ５，０）　１．５１
１１ｊに菌体を加え、これに２５％（ｖ／ｖ）シューク
ロース溶液１、０−を混合し、４０°Ｃで５時間反応さ
せた後、１５分間沸とう水中で処理して酵素を失活させ
る。

その後、反応液中に生成したフラクトース及びＧＦ、（
シュークロースに７ラクトースが１分子結合したオリゴ
糖）を高速液体クロマトグラフ法で定量し、反応溶液中
に６０分間で１μｍｏｌｅ、のＧＦ。

を生成する酵素量をもってフラクトシルトランスフェラ
ーゼ活性１単位とした。また、インベルターゼ活性は上
記反応において、反応液中に６０分間に１μｍｏｌｅの
７ラクトースを生成する酵素量をもって１単位とした。

第２の本発明はフラクトシルトランスフェラーゼ活性を
有する微生物菌体とアルギン酸塩溶液とを混合してアル
ギン酸塩の最終濃度が２．０〜５．０％（ｗ／ｖ　）と
なるように調製した菌体混合液を、アルギン酸と反応し
ゲルを形成する金属イオンを含む溶液に滴下することを
特徴とする圧縮変形率力０．７０以下の７ラクトシルト
ランスフエラーゼ活性固定化酵素の製造法である。

ここでアルギン酸塩としては特に制限はないが、アルギ
ン酸ソーダが好ましい。アルギン酸ソーダは原料の海藻
の種類に関係なく使用できる。また、アルギン酸と反応
してゲルを形成する金属イオンを含む溶液としては、た
とえば塩化カルシウム。

硫酸アルミニウム、硫酸第二鉄、硝酸第二鉄などの塩類
を含む溶液がある。これらは０．１〜２モルの範囲の濃
度で用いることが一般的である。また、固定化酵素の強
度を高めるために菌体混合液にカゼイン等の蛋白質を加
えることが望ましく、さらに球状の固定化酵素を得た後
、これをグルタルアルデヒド水溶液中で架橋処理するこ
とにより一層強度を向上させることができる。なお、微
生物菌体とアルギン酸塩溶液を混合して得られる菌体混
合液は、アルギン酸塩の最終濃度が２．０〜５．０％（
ｗ／ｖ　）　、好ましくは４．０〜５−０％（ｗ／ｖ　
）の範囲となるように調製すべきである。アルギン酸塩
の最終濃度がこの範囲外であると、圧縮変形率が０．７
０以下である固定化酵素を得ることができな（１゜ 第２の本発明に用いる微生物菌体としては、前述のＴ／
Ｉ比が２，０以上であるものが好ましい。

本発明によって菌体混合液をカルシウム、鉄などの金属
イオンを含む溶液に滴下すると、ゲル状のアルギン酸金
属塩が得られ、酵素活性を有する微生物菌体は該ゲル内
に包括、固定化される。この場合、金属イオンを含む溶
液は目的とする強度を有するゲル状物が得られるような
条件で用い、たとえば塩化カルシウム溶液の場合は濃度
５〜２５％程度の範囲のものを使用する。菌体混合液を
射出するときの粘度は３５００　ｃｐ以下であることが
必要であり、この粘度はアルギン酸塩の濃度１分子量の
ほか射出時の混合液温度などによって決定される。混合
液の温度は酵素の失活に影響するので、実用的には６０
°Ｃ以下、通常は５０°Ｃ以下、好ましくは２０〜４０
°Ｃとする。このような温度条件下において混合液の粘
度が３５００　ｃｐ以下であるアルギン酸塩濃度の範囲
は分子量が約１０００００のアルギン酸においては２．
３％（ｗ／ｖ　）以下、分子量が約５００００のアルギ
ン酸においては５．０％（ｗ／ｖ　）以下である。また
、菌体混合液を滴下する際、該混合液の温度を５０°Ｃ
以下、好ましくは２０〜４０℃の範囲に保持すべきであ
る。該混合液の滴下は任意の方法で行ない得るが、たと
えば内径がｏ、　ｉ〜２．０鶴、好ましくは０．５〜１
．０闘の射出針、ノズル等を用いて行なうことが望まし
い。

このようにして得られる固定化酵素は、固定化する前の
菌体が保有していた酵素活性を保有している。この固定
化酵素の粒径は滴下方法その他の条件によって異なるが
、通常は粒径が０．５〜２，５籠、好ましくは０．７〜
１．５關である。固定化酵素の活性発現率は粒径が小さ
く、表面積が大きい程高いので、このような粒径範囲が
望ましい。しかしながら、このような粒径な有する固定
化酵素をカラムに充填してシュークロース溶液を通液す
る時は固定化酵素の強度が弱いと圧損による固定化酵素
粒子の崩壊、目づまりが起り、この結果、一定流速での
通液が困難となる。本発明者等は、この点についても検
討を加え、固定化酵素の圧縮変形率が０．７０以下であ
れば、カラムに充填して長期間連続運転を行なっても目
づまりが起らない事を見出した。（試験例３．参照）。

ここで、圧縮変形率は次の方法で測定される。測定には
、不動工業製レオメータ−を用い、その装置に付属する
金属性円盤上に平均粒径Ｒ鰭の固定化酵素を載せ、金属
性円盤の上昇速度を２ｏ＋＋／ｍｉｎ　　としてアクリ
ル製平低円筒状アダプターを該固定化酵素に圧着せしめ
、加重応力の変化をレコーダーに記録し、変形応力５０
０ｇに達する時間（秒）をレコーダーの記録用紙上から
測定し、金属性円盤の送り速度（２ｃｍ／ｍ１ｎ　）か
ら当該酵素の圧縮後の厚み（ｒＩ鶴）を求める。

圧縮変形率は以下の式によって求める。

圧縮変形率−ｒ 凡 圧縮変形率０．７０以下の固定化酵素は、前記の如く菌
体混合液のアルギン酸塩の最終濃度を２０〜５．０％（
ｗ／／ｖ）とすることによって得られる。

また、第３の本発明は上記の如くして得たフラクトシル
トランスフェラーゼ活性を有する微生物菌体をゲル状ア
ルギン酸塩内に包括して固定化した、圧縮変形率が０．
７０以下のフラクトシルトランスフェラーゼ活性固定化
酵素なシュークロースに作用させることによってシュー
クロース１分子に１〜４個のフラクトース分子が結合し
た構造のオリゴ糖を主成分として含有する甘味料を得る
ことを特徴とする固定化酵素による甘味料の製造法であ
る。

本発明の固定化酵素をシュークロースに作用させる場合
、既知の手法を任意に適用できるが、とりわけ固定化酵
素なカラムに充填し、シュークロース溶液を通液する方
法が最も実用的である。その場合、シュークロース溶液
として２０〜７０％（ｉｖ／ｖ　）濃度のものを用い、
温度４０〜６０″Ｃ１ｐＨ６，０〜７．０の条件で通液
することが好ましい。

このようにして処理すると、カラム運転時の目づまりが
なく、目的とする甘味料を効率よく製造することができ
る。

この甘味料はシュークロース１分子に７ラクトースが１
〜４分子結合したオリゴ糖を主要成分として含有してお
り、その詳細は前記した特開昭５６−１５４９６７号な
どに開示されている。本甘味料は難う触性であり、かつ
低カロリーであって肥満や糖尿病等の原因となり難いと
いう性質がある。そのため、食品、医薬等の分野への利
用が期待されている。

次に、試験例、実施例により本発明の詳細な説明する。

試験例１ オーレオバシデイウム・プルランス・パル・メラニゲナ
ム　Ａ−８株の培養菌体を用いて各種包括法により固定
化酵素を調製し、その熱安定性を比較した。

アルギン酸カルシウム包括法は菌体を終濃度１．５％の
アルギン酸ソーダ溶液中に分散し、これを１５％のＣａ
Ｃ７＠溶液に滴下することにより粒径２１１ＩＩの酵素
を調製した。キトサンによる包括菌体は平野等の方法（
Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｅｉｏｅｎｇ、Ｎ’ｏ１．　ＸＸＩ
　。

７１１　Ｆ、１９７９）の方法によった。

アセチルセルローズによる固定化は、菌体４０りをアセ
トン洗浄後集菌し、これをアセチルセルローズのアセト
ン溶液（２５％Ｗ／Ｖ　）　Ｋ混合し、これを水中で脱
溶剤することにより調製した。カラギナンによる固定化
は菌体４０９を生理食塩水に分散し、これに３．６％カ
ラギナン溶液を添加して混合し、冷却後、３′ＩＩｘ角
に裁断したのちへキサメチレンジアミン、グルタルアル
デヒド系で架橋処理を行うことにより調製した。

このようにして得られた固定化酵素を６０％シュークロ
ース溶液存在下で２４〜４８時間、６’０°Ｃで処理し
、残存活性を測定した。結果を表１に示す。表から明ら
かなように、アルギン酸カルシウムゲル包括法による固
定化酵素の熱安定性が最も高かった。

表１．　各種包括法によって得られた固定化フラクトシ
ルトランスフェラーゼの熱安定性の比較試験例２゜ オτレオバシデイウム・プルランス・パル・メラニゲナ
ム　Ａ−８を種々の培養条件で培養し、’Ｉ’／Ｉ此の
異った菌体な得た。シュークロース５０％溶液にＴ／Ｉ
比の異なる菌体な夫々フラクトシルトランスフェラーゼ
活性として３０単位／ｇ　シュークロースの割合で添加
し、ｐＨ６，０、６０°Ｃで４８時間反応させた。

得られた反応物の糖組成を高速液体クロマドグに示す。

図から明らかなようｌ、Ｔ／Ｉ比２．　Ｏ以上試験例３
゜ オーレオハシティラム・プルランス・パル・メラニゲナ
ム　Ａ−８株の菌体を種々の分子量並びに濃度を有する
アルギン酸ソーダ溶液中に分散し、１５％Ｃａ１ｌ官水
溶液中に滴下して、固定化酵素を調製した。この酵素を
直径２．２　ｃｍ　、長さ１５ｃｎ。

カラムに充填し、１　ｍＭの０ａＯ１＠を含むｐＨ６，
０の６０％ｗ／ｖシュークロース溶液を５０″Ｃ，５ｖ
＝０、６で３０日間通液し、カラムの目づまりを観察し
た。結果を表２に示す。圧縮変形率０．７以下の固定化
酵素では、１８日日間上目づまりによる流速の低下は認
められなかった。

表χ　　圧縮変形率と目づまり 実施例１゜ オーレオハシティラム・プルランス・パル・メラニゲナ
ム　Ａ−８株（ＦＥＲＭ−Ｐ　５８８５　）を三角フラ
スコ中のブイヨン２％、シュークロース５％を含む培地
３００　ｍｌに植菌し、２８℃で２４時間培養し、これ
を種母培養液とした。３ｏｌジヤーフアーメニターにシ
ュークロース１５％、ペア’）ン１％、肉エキス０．７
％、　Ｎａｐ／　０．３％、ｃｏｃｌ＋１・６ｕ自ｏｏ
、１％を含む培地２０１を入れ、１２０″Ｃで３０分間
殺菌した後、上記種母培養液３００　ｍｌを植菌し、２
８℃で２４時間培養した。通気攪拌条件は２４Ｏｒｐｍ
、５０ｖ■であった。培養終了後、培養液を遠心分離し
フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する粗酵素菌
体４００ｇを得た。

この菌体のＴ／Ｉ比は５．３であった。

菌体４００ｇを３０％溶液となし、これに１３００９の
８％アルギン酸ソーダ溶液を加えて混合した。

この混合液を温度２５℃で１５％０ａ（ｊｌ、溶液中に
滴下して、粒径１ｕの球状固定化酵素１８００りを得た
。

この固定化酵素を直径５　ｃｍＫ、長さ１２５ＣＩ＋の
ジャケット付カラムに充填し、ｐａ　６．０の６０％ｖ
ｒ７’ｖシュークロース溶液をＳｖ　＝　０．７で通液
した。得られた反応液の糖組成は、フラクトース３％、
グルコース２９％、シュークロース１２襲、　ＧＦ、　
　２９運転が可能であった。

＊ＧＦｓ　：　　シュークロースにフラクトースが１分
子結合したオリゴ糖ｑ巨３　　　　　ｌ　　　　　　〃
　　　　２分子　　　ｆ仔Ｆ４　、　　　　　　　　　
　　　　３分子実施例２゜ 実施例１記載の如くして得られたオーレオハシティラム
・プルランス・パル・メラニゲナムＡ−８の菌体を３０
％溶液となし、この２００１と分子量６０，０００のア
ルギン酸ソーダの４．２％溶液２００ｄとを混合して、
同様に固定化酵素を調製した。

混合液の粘度は２５℃において３５００　ｃｐであった
。本酵素の圧縮変形率は０．７であった。

この酵素をカラムに充填し、５０°Ｃ，１４日間連続運
転を行っても目づまりによる流速の低下は認められず、
目的とする甘味料が得られた。

実施例３゜ アスペルギルス・ニガーＡＯ１ｔ−２−１，１Ｔ００２
０６１１株をブイヨン２％、シュークロース５％の組成
を有する培地１０１１ＬＩＫ１白金耳植菌し、２８°Ｃ
で２４時間培養した。次いで、これを同培地３００ゴに
植菌し、２８℃で２４時間振とう培養したものを種母培
養液とした。

３０／ジヤーフアーメニターにシュークロース１５％、
酵母エキス３．６％、　　ａｏａｔ、・６Ｈ，ＯＯ，１
２％を含む培地２０／を入れ、１２０°Ｃで３０分間殺
菌後、上記種母培養液を３００ｄ植菌１−１２８°Ｃで
、４８時間培養した。通気攪拌条件は２４０ｒｐｍ　、
　　５０　ｖｖｍであった。培養終了後、培養液を遠心
分離し、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する
菌体１ｋｇを得た。この菌体の’Ｉ’／Ｉ比は５、０で
あった。

菌体４００ｇを３０％溶液となし、これに１３０．０９
の８％アルギン酸ソーダ溶液を加えて混合し、この混合
液を温度２５℃で１５％０ａＯｊ＠溶液中に滴下・して
粒径１ｕの固定化酵素１７０（１１を得た。

この固定化酵素を直径５　ｃｘ　、長さ１２５ｃｍのジ
ャケット付カラムに充填し、ｐＨ６，０の６０％Ｗ／Ｖ
のシュークロース液を温度５０℃で、８ｖ＝Ｏ−５で通
液した。得られた反応液の糖組成はフック）−ス４％、
グルコース３０％、シュークロース１４％、ＧＦＱ２４
％、　ＯＦ、　２１％、　ＧＦ４５％、　０Ｆ−２％で
あった。この固定化酵素カラムは３０日間連続運転可能
であった。

＊ＧＦ、：シュークロースに７ラクトースが４分子結合
したオリゴ糖

【図面の簡単な説明】 特許出願人　　明治製菓株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生
   物菌体をゲル状アルギン酸塩内に包括して固定化した、
   圧縮変形率が０．７０以下のフラクトシルトランスフェ
   ラーゼ活性固定化酵素。 ２、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生
   物菌体が７２クトシルトランスフエラーゼ活性（Ｔ）と
   インベルターゼ活性（Ｉ）との比（Ｔ／Ｉ　）が２．０
   以上を示すものである特許請求の範囲第１項記載の固定
   化酵素。 ３、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生
   物菌体がオーレオバシデイウム・プルランＰ−５８８５
   ）である特許請求の範囲第２項記載の固定化酵素。 ４、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生
   物菌体がアスペルギルス・ニガー（Ａ８ｐｅ−ｒｇｉｌ
   ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）　ＡＣＥ　−２−１株（ＡＴＯ
   Ｃ２０６１１）である特許請求の範囲第２項記載の固定
   化酵素。 ５、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生
   物菌体とアルギン酸塩溶液とを混合してアルギン酸塩の
   最終濃度が２．０〜５．０％（ｗ／ｖ）となるように調
   製した菌体混合液を、アルギン酸と反応しゲルを形成す
   る金属イオンを含む溶液に滴下することを特徴とする圧
   縮変形率が０．７０以下のフラクトシルトランスフェラ
   ーゼ活性固定化酵素の製造法。 ６、アルギン酸塩がアルギン酸ソーダである特許請求の
   範囲第５項記載の固定化酵素の製造法。 ７、金属イオンを含む溶液が塩化カルシウム、硫酸アル
   ミニウム、硫酸第二鉄および硝酸第二鉄の中から選択さ
   れた塩類を含む溶液である特許請求の範囲第５項記載の
   固定化酵素の製造法。 ８．７ラクトシルトランスフエラーゼ活性を有する微生
   物菌体がフラクトシルトランスフェラーゼ活性（’Ｉ’
   ）とインベルターゼ活性（Ｉ）との比（’Ｉ’／Ｉ）が
   ２．０以上を示すものである特許請求の範囲第５項記載
   の固定化酵素の製造法。 ９、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微生
   物菌体がオーレオバシデイウム・プルランＰ−５８８５
   ）である特許請求の範囲第８項記載の固定化酵素の製造
   法。 １０、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微
   生物菌体がアスペルギルス・ニカー（ムｓｐｅ−ｒｇｉ
   ｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）　ＡＣＥ　−２−１株（ＡＴ
   ＯＯ２０６１１）である特許請求の範囲第８項記載の固
   定化酵素の製造法。 ＩＪ菌体混合液を金属イオンを含む溶液に滴下するとき
   の温度が２０〜４０°Ｃである特許請求の範囲第５項記
   載の固定化酵素の製造法。 １２、フラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する微
   生物菌体をゲル状アルギン酸塩内に包括して固定化した
   、圧縮変形率が０．７０以下のフラクトシルトランスフ
   ェラーゼ活性固定化酵素をシュークロースに作用させる
   ことによってシュークロース１分子に１〜４個のフラク
   トース分子が結合した構造のオリゴ糖を主成分として含
   有する甘味料を得ることを特徴とする固定化酵素による
   甘味料の製造法。 １３、固定化酵素をカラムに充填し、２０〜７０％（ｖ
   ／ｖ）濃度のシュークロース溶液を通すことにより行な
   う特許請求の範囲第１２項記載の固定化酵素による甘味
   料の製造法。 １４．７ユークロース溶液を４０〜６０℃、ｐｎ　６．
   ０〜７．０の条件下に通液する特許請求の範囲第１３項
   記載の固定化酵素による甘味料の製造法。