CN102994490A - 一种葡萄糖异构酶的固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种葡萄糖异构酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。本发明构建了产葡萄糖异构酶的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)，以该重组菌作为生产菌株，固定化后葡萄糖异构酶的酶活为2579U/g，酶活回收率达到70.5%，添加金属离子后，75℃下半衰期为29h，较不添加金属离子（半衰期为4h）提高了6.3倍；在相同的转化时间内，以50%葡萄糖为底物连续操作10次，其相对转化率为71%。该固定化方法简单易行，固定化成品颗粒的性能优异，为工业化应用提供参考。

Description

一种葡萄糖异构酶的固定化方法
技术领域
本发明涉及一种葡萄糖异构酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
葡萄糖异构酶（GIase），又称木糖异构酶，可以将D-葡萄糖异构化为D-果糖，是食品工业生产上以淀粉为原料制备果葡糖浆的关键酶之一。相对于液态酶制剂的不能重复利用、使用效率低的缺点，通过物理、化学的方法将GIase固定成颗粒状的成品具有高活力、可实现生产的连续化、自动化、可控化，产品易于分离和精制的特点，从而提高产品质量，降低生产成本，有力的推动果葡糖浆生产的发展。丹麦Novo公司是世界上最大的一家酶制剂生产厂商，该公司生产的固定化葡萄糖异构酶占全世界用量的70%。曹龙奎等（曹龙奎等，申请号200910073264.9）利用磁性壳聚糖符合微球制备固定化葡萄糖异构酶；葛玉斌等（葛玉斌等，《吉林大学自然科学学报》，1998，2:66一68）制备多孔球状碱性氨基苯磺酰乙基接枝淀粉载体，采用SESA（β-硫酸酯己砜基苯胺）对载体进行活化，经DEAE(2’-氧乙基二乙胺盐酸盐)修饰作用，采用重氮化方法对葡萄糖异构酶进行了固定化;孔维等（孔维等，《生物化学杂志》，1992,8（2）212-215）用多孔强碱性三乙醇胺基聚苯乙烯树脂作为载体，用CNBr与载体上多轻基作用共价偶联葡萄糖异构酶(GI)。但这些固定化方法的成品较高，难于放大在工业化生产上。
由于长期以来，我国的葡萄糖异构酶制剂市场一直被国外品牌的公司所垄断，造成我国果葡糖浆的生产成本过高，使其在普通消费市场的占有率难以大幅度提高。因此，研究一种成本低、性能优异且可实现工业化生产的固定化方法具有非常重要的现实意义。
发明内容
本发明提供了一种葡萄糖异构酶的固定化方法，技术方案如下：1）在初始培养基中添加适量的Co2+发酵生产葡萄糖异构酶；2）将步骤1）中所述发酵液与壳聚糖溶液混合使菌体絮凝；3）向絮凝物中加入戊二醛进行交联，挤压成型后烘干过夜。
本发明以产葡萄糖异构酶的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)为例，所述重组大肠杆菌是将本研究室前期构建的xylA/pMD18-T（吴敬，陈晟，邓辉，陈坚：一种葡萄糖异构酶突变体及其应用，201110406411.7）和质粒pET24a（+）进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有葡萄糖异构酶基因的重组质粒xylA/pET24a(+),将重组质粒xylA/pET24a(+)导入宿主E.coli BL21(DE3)中，所得的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)作为生产菌种。
本发明具体技术方案如下：
（1）向重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)发酵初始培养基中添加0.5-6mM的Co2+，37℃、200rpm/min的条件下培养至菌体浓度OD600约为9-10，向发酵液中添加0.1-0.8%（m/v）的硅藻土，用20%醋酸溶液调节pH至6.5-7.0。
（2）将处理过的发酵液与0.01-0.1%（m/v）的壳聚糖溶液（0.25%醋酸溶液溶解）在磁力搅拌器充分搅拌下混合1min，静置，使菌体絮凝下来。弃去上清液。
（3）向絮凝物中加入0.2-3%（v/v）戊二醛进行交联，交联一定时间后弃去上清液，挤压成型后30℃烘干过夜即得固定化颗粒。
所述的向培养基中添加金属离子为Co2+，其浓度为0.5-6mM。
发酵培养基为：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，KH2PO4 2.31g/L，K2HPO4·3H2O16.43g/L，Co2+0.5-6mM。
具体实施方式
实施例1
以本实验室构建的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)为生产菌种，发酵培养基中不添加Co2+，固定化方法为：
（1）将本研究室前期构建的xylA/pMD18-T和质粒pET24a（+）进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有葡萄糖异构酶基因的重组质粒xylA/pET24a(+),将重组质粒xylA/pET24a(+)导入宿主E.coli BL21(DE3)中，所得的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)作为生产菌种。
（2）用20%醋酸溶液将培养至菌体浓度OD600约为10的发酵菌悬液调节pH至6.5-7.0。
（3）将处理过的发酵液与0.1%的壳聚糖溶液（0.25%醋酸溶液溶解）在磁力搅拌器充分搅拌下混合1min，静置，使菌体絮凝下来，弃去上清液。
（4）向絮凝物中加入1%戊二醛进行交联，交联一定时间后弃去上清液，挤压成型后30℃烘干过夜即得固定化颗粒。
所得固定化颗粒性能如下：葡萄糖异构酶酶活为1000U/g，固定化酶活回收率为50%，75℃半衰期为4h，颗粒强度为756g。
实施例2
具体过程如下：以本实验室构建的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)为生产菌种，发酵培养基中添加适量Co2+，固定化过程为：
（1）将本研究室前期构建的xylA/pMD18-T和质粒pET24a（+）进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有葡萄糖异构酶基因的重组质粒xylA/pET24a(+),将重组质粒xylA/pET24a(+)导入宿主E.coli BL21(DE3)中，所得的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)作为生产菌种。
（2）将大肠杆菌发酵初始培养基中添加5mM的Co2+，37℃、200rpm/min的条件下培养至菌体浓度OD600约为10，用20%醋酸溶液调节pH至6.5-7.0。
（3）将处理过的发酵液与0.1%的壳聚糖溶液（0.25%醋酸溶液溶解）在磁力搅拌器充分搅拌下混合1min，静置，使菌体絮凝下来，弃去上清液。
（4）向絮凝物中加入1%戊二醛进行交联，交联一定时间后弃去上清液，挤压成型后30℃烘干过夜即得固定化颗粒。
所得固定化颗粒性能如下：葡萄糖异构酶酶活为2536U/g，固定化酶活回收率为67.5%，75℃半衰期为29h，颗粒强度为744g。
实施例3
具体过程如下：以本实验室构建的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)为生产菌种，发酵培养基中添加适量Co2+，固定化前向发酵液中添加适量硅藻土，固定化过程为：
（1）将本研究室前期构建的xylA/pMD18-T和质粒pET24a（+）进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有葡萄糖异构酶基因的重组质粒xylA/pET24a(+),将重组质粒xylA/pET24a(+)导入宿主E.coli BL21(DE3)中，所得的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)作为生产菌种。
（2）将大肠杆菌发酵初始培养基中添加0.5mM的Co2+，37℃、200rpm/min的条件下培养至菌体浓度OD600约为10，向发酵液中添加0.5%（m/v）的硅藻土，用20%醋酸溶液调节pH至6.5-7.0。
（3）将处理过的发酵液与0.01%的壳聚糖溶液（0.25%醋酸溶液溶解）在磁力搅拌器充分搅拌下混合1min，静置，使菌体絮凝下来，弃去上清液。
（4）向絮凝物中加入3%戊二醛进行交联，交联一定时间后弃去上清液，挤压成型后30℃烘干过夜即得固定化颗粒。
所得固定化颗粒性能如下：葡萄糖异构酶酶活为2579U/g，固定化酶活回收率为70.5%，75℃半衰期为29h，颗粒强度为1978g,在相同的转化时间内，以50%葡萄糖为底物连续操作10次，其相对转化率为70.5%。
实施例4
具体过程如下：以本实验室构建的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)为生产菌种，发酵培养基中添加适量的Co2+，固定化前向发酵液中添加适量硅藻土，固定化过程为：
（1）将本研究室前期构建的xylA/pMD18-T和质粒pET24a（+）进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有葡萄糖异构酶基因的重组质粒xylA/pET24a(+),将重组质粒xylA/pET24a(+)导入宿主E.coli BL21(DE3)中，所得的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)作为生产菌种。
（2）将大肠杆菌发酵初始培养基中添加6mM的Co2+，37℃、200rpm/min的条件下培养至菌体浓度OD600约为10，向发酵液中添加0.8%（m/v）的硅藻土，用20%醋酸溶液调节pH至6.5-7.0。
（3）将处理过的发酵液与0.05%的壳聚糖溶液（0.25%醋酸溶液溶解）在磁力搅拌器充分搅拌下混合1min，静置，使菌体絮凝下来，弃去上清液。
（4）向絮凝物中加入0.2%戊二醛进行交联，交联一定时间后弃去上清液，挤压成型后30℃烘干过夜即得固定化颗粒。
所得固定化颗粒性能如下：葡萄糖异构酶酶活为2375U/g，固定化酶活回收率为62.5%，75℃半衰期为22h，颗粒强度为1826g,在相同的转化时间内，以50%葡萄糖为底物连续操作10次，其相对转化率为60.8%。

Claims (4)

1.一种葡萄糖异构酶的固定化方法，其特征在于，步骤如下：1）在初始培养基中添加适量的Co2+发酵生产葡萄糖异构酶；2）将步骤1）中所述发酵液与壳聚糖溶液混合使菌体絮凝；3）向絮凝物中加入戊二醛进行交联，挤压成型后烘干过夜。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是将xylA/pMD18-T和质粒pET24a（+）进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有葡萄糖异构酶基因的重组质粒xylA/pET24a(+),将重组质粒xylA/pET24a(+)导入宿主E.coliBL21(DE3)中，所得的重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)作为生产菌种。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：
1）向重组大肠杆菌xylA/pET24a/BL21(DE3)发酵初始培养基中添加0.5-6mM的Co2+，培养至菌体浓度OD600约为9-10；
2）向发酵液中添加0.1-0.8%的硅藻土；
3）将步骤2）得到的发酵液与0.01-0.1%的壳聚糖溶液混合，静置使菌体絮凝；
4）向絮凝物中加入0.2-3%戊二醛进行交联，交联一定时间后弃去上清液，挤压成型后烘干。
4.权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，发酵初始培养基为：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，KH2PO4 2.31g/L，K2HPO4·3H2O 16.43g/L。
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