BR112019023923A2 - complexo de enzima imobilizada, aparelho biorreator, métodos para conversão enzimática de um substrato a um produto desejado, para produzir um complexo de enzima imobilizada e para usar um biorreator, biorreator, sistema de biorreator multienzimático de fluxo contínuo, sistema de biorreator, aparelhos de conversão de grupo sanguíneo de fluxo contínuo e de reator de múltiplas enzimas de distribuição de fármaco, e, sistema para cicatrização de ferida - Google Patents
complexo de enzima imobilizada, aparelho biorreator, métodos para conversão enzimática de um substrato a um produto desejado, para produzir um complexo de enzima imobilizada e para usar um biorreator, biorreator, sistema de biorreator multienzimático de fluxo contínuo, sistema de biorreator, aparelhos de conversão de grupo sanguíneo de fluxo contínuo e de reator de múltiplas enzimas de distribuição de fármaco, e, sistema para cicatrização de ferida Download PDFInfo
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Abstract
Complexos de enzima imobilizada (IEC) com enzimas que são não covalentemente ligadas a matrizes são providas, junto com métodos para produzir as mesmas. Métodos para usar o IEC para uma ampla variedade de processos enzimáticos industriais são também providos. Métodos para converter biomassa celulósica e métodos para realizar conversões tipo sanguínea com IEC estão dentre os métodos descritos.
Description
[001] O alto custo da enzima tem sido um obstáculo para o sucesso em escala comercial para setores industriais que requerem enzimas em seus processos de fabricação, tais como produção de biocombustíveis, especialidades químicas, produtos farmacêuticos e produtos de cuidado pessoal. Por exemplo, O 2007 U.S. Energy Independence and Security Act designa que o uso anual de biocombustível quase triplica para 36 bilhões de galões por ano (BGY) em 2022 com 21 BGY proveniente de biocombustíveis avançados. Embora a produção avançada de biocombustível celulósico tenha sido demonstrada em uma escala piloto, o alto custo da enzima associado ao processo de sacarificação (a hidrólise enzimática de celulose a açúcares) foi o obstáculo para iniciativas em escala comercial. A produção em escala comercial exigirá ciência de transformação que, pode significativamente agilizar o processo de produção e significativamente diminuir os custos de produção.
[002] Além do mercado de biocombustível, mais de 100 diferentes processos biocatalíticos enzimáticos foram implementados nas indústrias farmacêutica, química, agrícola e de alimentos desde 2000. As vantagens dos processos biológicos “ecológicos” sobre os processos químicos tradicionais incluem menor custo, maior pureza do produto e eliminação dos produtos químicos tóxicos e resíduo no processo de fabricação. O processo enzimático também reduz significativamente o número de etapas sintéticas que seriam necessárias para a síntese convencional. Várias classes de enzimas, incluindo cetoredutases, transaminases, amina oxidases, mono-oxigenases e acil transferases, foram usadas para uma ampla gama de conversões químicas no processo de fabricação dos produtos farmacêuticos e especialidades químicas, tais como Telaprevir (Telavic, INCIVEK'M), Sitagliptina (JANUVIATY), Simvastatina — (Lipovas, — ZOCORT'M), —Atazanavir (REYATAZ'Y), Esomeprazole (NEXIUM'Y), Atorvastatina (LIPITORTM), Montelukast (SINGULAIR!M), Boceprevir (VICTRELISTM), e S-metóxi-isopropilamina. Na indústria de alimentos, as enzimas, tais como amiloglicosidase e amilase glicose isomerases foram usadas para produzir xaropes de frutose (adoçantes) de amido de milho.
[003] As reduções nos custos da enzima podem ser obtidas através da imobilização melhorada de enzimas altamente eficientes. A imobilização das enzimas sobre os polímeros é um campo crescente para melhorar a atividade biocatalítica e estabilidade térmica e química das enzimas [1-4]. Além do mais, ela permite a recuperação e reutilização das enzimas em processos biocatalíticos. A celulase foi imobilizada por vários métodos físicos e químicos, tais como reticulação [5, 6], conjugação [2, 3], copolimerização
[7], ultrafiltração de fibra [8, 9], sistemas bifásicos aquosos [10, 11] e modificação da celulase propriamente dita [12]. A imobilização de complexos de múltiplas enzimas (celulossomas artificiais) por meio de agrupamento de enzima poderia ainda melhorar a estabilidade, propriedades de armazenamento, sinergia da enzima e eficácia catalítica no processo de sacarificação [1, 4]. Entre as plataformas de suporte, as nanopartículas são suportes ideais para a imobilização de celulossomas, devido à sua limitação difusional mínima, área de superfície máxima e carga da enzima eficaz [1]. Estudos recentes mostraram que a imobilização de enzimas melhorou a atividade biocatalítica (hidrólise da celulose) por meio do agrupamento de enzima em 2 a 7 vezes no processo enzimático de sacarificação [1,4].
[004] A imobilização/agrupamento de enzimas foi demonstrada com sucesso como um método promissor para melhorar a eficácia das reações enzimáticas sequenciais nos processos enzimáticos [5, 13]. Infelizmente, esta estratégia foi economicamente inviável para processamento de biomassa em grande escala, pois 1) as enzimas não podem ser eficientemente recuperadas
[14], 2) os custos associados à purificação da enzima são altos, 3) a especificidade da enzima à plataforma funcionalizada é baixa (e, desta forma, requer purificação da enzima), 4) as plataformas de suporte não podem ser regeneradas ou reutilizadas e 5) os agentes ligantes ou de conjugação usados nos processos são frequentemente de custo altíssimo. Desta forma, é necessária uma abordagem inédita para tornar este processo economicamente viável para a produção em escala comercial. Os avanços recentes no desenvolvimento da síntese de material, processos de funcionalização, química de conjugação e engenharia molecular tornaram possível desenvolver os complexos de enzima imobilizada para superar os desafios técnicos descritos anteriormente.
[005] São providos aqui complexos de enzima imobilizada (IECs) compreendendo matrizes estáveis ao calor que são covalentemente ligadas a moléculas de biotina ou análogos das mesmas com moléculas de ligantes e proteínas de fusão compreendendo os domínios de enzima e domínios de ligação de biotina (BBDs), em que os domínios de ligação de biotina são não covalentemente ligados a moléculas de biotina ou análogos das mesmas. Em certas modalidades, a matriz estável ao calor compreende fibra de carbono, poliestireno, poli(ácido lático), poliuretano, sílica, náilon ou polipropileno. Em certas modalidades, a matriz estável ao calor é selecionada do grupo que consiste em fibra de carbono, poliestireno, poli(ácido lático), poliuretano,
sílica, náilon e polipropileno.
Em certas modalidades, a matriz estável ao calor é pelo menos parcialmente revestida com uma mistura de polietileno glicol (PEG) e polietilenoimina (PEI). Em certas modalidades, a molécula ligante é ligada a moléculas de polietilenoimina (PEL) que revestem a matriz.
Em certas modalidades, uma extremidade ou grupo da molécula ligante é ligada a biotina ou um análogo da mesma e outra extremidade ou grupo de uma molécula ligante é ligada a grupos amina das moléculas de polietilenoimina (PEI) que revestem a matriz.
Em certas modalidades, a molécula ligante compreende um grupo alcano, um grupo alquila, uma amida ou combinação dos mesmos.
Em certas modalidades, biotina ou um análogo da mesma é anexado a uma matriz reagindo uma molécula compreendendo biotina ou um análogo da mesma que é covalentemente ligada a um grupo alquila C2 a C6 que é covalentemente ligado a um grupo sulfo- N- hidroxisuccinimida (NHS) com grupos amina livres da matriz.
Em certas modalidades, a matriz estável ao calor não compreende uma partícula magnética.
Em certas modalidades, o análogo de biotina compreende destiobiotina, 2º-iminobiotina, biotina sulfona, bisnorbiotina, tetranorbiotina, oxibiotina, qualquer derivado dos mesmos ou qualquer derivado de biotina que podem ser ligados pelo BBD.
Em certas modalidades, o domínio da enzima é selecionado do grupo que consiste em um hidrolase, cetoredutase, transaminase, amina oxidase, mono-oxigenase e um domínio de acil transferase.
Em certas modalidades, o domínio da enzima é fundido ao N- terminal do BBD, ao C-terminal do BBD ou tanto ao N-terminal quanto ao C- terminal do BBD.
Em certas modalidades, o domínio da enzima é fundido seja a N-terminal do BBD ou ao C-terminal do BBD.
Em certas modalidades, o domínio da enzima é fundido ao BBD com um ligante de peptídeo.
Em certas modalidades, o domínio da enzima é um domínio de hidrolase de glicosídeo.
Em certas modalidades, a hidrolase de glicosídeo é uma alfa-N- acetilgalactosaminidase, alfa-galactosidase, beta-glicosidase, uma celulase,
uma endoglucanase ou uma exoglucanase.
Em certas modalidades, um domínio amiloglicosidase e/ou amilase glicose isomerase da enzima é usado.
Em certas modalidades, pelo menos duas proteínas de fusão são imobilizadas na matriz.
Em certas modalidades, as pelo menos duas proteínas de fusão compreendem um domínio da enzima que são um independentemente selecionado do grupo que consiste em uma beta-glicosidase, uma endoglucanase e uma exoglucanase.
Em certas modalidades, a beta- glicosidase, uma endoglucanase e uma exoglucanase são tolerantes ao líquido iônico, termo tolerantes ou ambos.
Em certas modalidades, pelo menos um domínio da enzima compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência para uma beta-glicosidase (SEQ ID NO: 2), uma endoglucanase (SEQ ID NO: 3), uma alfa N-acetilgalactosaminidase (SEQ ID NO: 4), uma alfa-galactosidase de SEQ ID NO: 5-33 ou 34. Em certas modalidades, o BBD compreende um BBD de avidina, BBD de estreptavidina, BBD de tamavidina, BBD de zebavidina, BBD de bradavidina, BBD de rizavidina, BBD de shwanavidina, BBD de xenavidina, uma quimera dos mesmos ou derivados dos mesmos tendo um ou mais inserções, deleções ou substituições de resíduo de aminoácido.
Em certas modalidades, o complexo de enzima imobilizada (IEC) ou matriz é biocompatível.
Em certas modalidades, o domínio da enzima tem atividade proteolítica.
Em certas modalidades, a atividade proteolítica é uma atividade de colagenase.
Em certas modalidades, o domínio da enzima compreende uma cetoredutase, transaminase, amina oxidase, mono-oxigenase ou domínio de acil transferase.
Em certas modalidades, o domínio da enzima: (1) reduz RDX (hexa-hidro- 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina); (11) reduz 2,4,6-trinitrotolueno (TNT); (1ii) reduz cromo 6+ a cromo 3+; ou (iv) tem atividade 2,2',3-tri-hidroxibifenil dioxigenase.
Em certas modalidades, o IEC está contido em um compartimento que é permeável a um substrato e um produto da atividade do domínio da enzima de (1) reduzir RDX (hexa-hidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-
triazina); (11) reduzir 2,4,6-trinitrotolueno (TNT); (11) reduzir cromo 6+ a cromo 3+; ou (iv) 2,2' 3-tri-hidroxibifenil dioxigenase e compreende o domínio da enzima de (i), (11), (11) ou (iv), respectivamente. Em certas modalidades, o domínio da enzima compreende uma ou mais sequências compreendendo domínios de enzima que possibilitam a degradação de atrazina, que são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO:27-31 e
32. Em certas modalidades, uma combinação de domínios de enzima que fornecem degradação de atrazina que são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO:27-31 e 32 é usada. Em certas modalidades, a matriz é fibra de carbono. Em quaisquer das modalidades mencionadas anteriormente, os IECs podem estar contidos nos sistemas de biorreator ou em compartimentos que são permeáveis a substratos e produtos das conversões catalisadas por domínio da enzima dos substratos. Em quaisquer das modalidades mencionadas anteriormente, os IECs podem ser adaptados para aplicação a indivíduos ou objetos em necessidade dos mesmos. Em quaisquer das modalidades mencionadas anteriormente, o IEC pode compreender um adesivo de cicatrização de ferida e o domínio da enzima tem atividade proteolítica.
[006] Também são providos aqui biorreatores compreendendo quaisquer dos complexos de enzima imobilizada (IECs) mencionados anteriormente configurados para passagem de lipídeos compreendendo substratos através do IECs. Em certas modalidades, os aparelhos do biorreator são configurados para fluxo contínuo de lipídeos através dos IECs. Em certas modalidades, os biorreatores são configurados para a recirculação de lipídeos através dos IECs.
[007] São adicionalmente providos aqui métodos de conversão enzimática de substratos aos produtos desejados compreendendo as etapas de expor os substratos a qualquer um dos complexos de enzima imobilizada mencionados anteriormente como aqui descritos em condições em que os substratos são convertidos aos produtos desejados por exposição aos complexos de enzima imobilizada.
Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente a etapa de recuperar o produto.
Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente: (1) remover as proteínas de fusão não covalentemente ligadas da matriz após a conversão do substrato a um produto desejado; e (11) ligar as proteínas de fusão à matriz.
Em certas modalidades, o substrato é amido e um domínio da enzima isomerase de uma amiloglicosidase e/ou uma amilase glicose é usado.
Em certas modalidades, o substrato compreende celulose e em que os domínios de enzima de pelo menos uma proteína de fusão são selecionados do grupo que consiste em uma beta-glicosidase, uma endoglucanase e um domínio de exoglucanase.
Em certas modalidades, o substrato compreende sangue total ou células vermelhas do sangue e o domínio da enzima de pelo menos uma proteína de fusão é selecionada do grupo que consiste em uma alfa-N-acetilgalactosaminidase, alfa-galactosidase ou uma combinação dos mesmos.
Em certas modalidades, o domínio da enzima: (1) reduz RDX (hexa-hidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina); (11) reduz 2,4,6-trinitrotolueno (TNT); (li) reduz cromo 6+ a cromo 3+; ou (iv) tem atividade 2,2º,3-trichidroxibifenil dioxigenase.
Em certas modalidades, o IEC está contido em um compartimento que é permeável a um substrato e produto do domínio da enzima de (1) reduzir RDX (hexa-hidro- 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina); (11) reduz 2,4,6-trinitrotolueno (TNT); (il) reduz cromo 6+ a cromo 3+; ou (iv) 2,2',3-tri-hidroxibifenil dioxigenase e compreende o domínio da enzima de (1), (11), (iii) ou (iv), respectivamente.
Em certas modalidades, o substrato é atrazina e o domínio da enzima compreende uma ou mais sequências compreendendo domínios de enzima que fornecem a degradação de atrazina que são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO0:27-31 e 32. Em certas modalidades, uma combinação de domínios de enzima que fornece a degradação de atrazina que são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO:27-31 e 32 são usados. Em certas modalidades, o substrato é uma ferida, o IEC compreende um adesivo de cicatrização de ferida e o domínio da enzima tem atividade proteolítica.
[008] Também são providos aqui os métodos de preparar os complexos de enzima imobilizada, compreendendo: (a) covalentemente ligar a biotina ou análogos das mesmas dependentes das matrizes estáveis ao calor selecionadas do grupo que consiste em uma fibra de carbono, poli(ácido lático), poliuretano, poliestireno, sílica, náilon e polipropileno reagindo as ditas matrizes com polietileno glicol (PEG) e polietilenoimina (PEI) a uma razão de 1 parte de PEG para 1,25 partes de PEI a 1 parte de PEG para 3,5 partes de PEI em peso e reagindo as matrizes tratadas com PEG/PEI com N- hidróxi-succinimida ésteres de biotina ou análogos de biotina para obter matrizes funcionalizadas; (b) remover qualquer PEI, PEG e ésteres de biotina ou os análogos de biotina não reagidos das matrizes funcionalizadas; e (c) ligar não covalentemente pelo menos uma proteína de fusão compreendendo um domínio da enzima e um domínio de ligação de biotina (BBD) à biotina ou análogos de biotina que são covalentemente ligadas às matrizes funcionalizadas por meio das moléculas de ligante. Em certas modalidades, os métodos compreendem adicionalmente: (i) remover as proteínas de fusão não covalentemente ligadas da matriz após a conversão do substrato a um produto desejado pela proteína de fusão ligada; e (i1) ligar uma proteína de fusão à matriz. Em certas modalidades, o domínio da enzima de pelo menos uma proteína de fusão é selecionada do grupo que consiste em uma alfa-N- acetilgalactosaminidase ou alfa-galactosidase ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a enzima é selecionada do grupo que consiste em uma hidrolase, cetoredutase, transaminase, amina oxidase, mono- oxigenase e um acil transferase. Em certas modalidades, a cetoredutase, transaminase, amina oxidase, mono-oxigenase ou domínio de acil transferase tem um composto precursor de telaprevir, composto precursor de sitagliptina ou composto precursor de simvastatina como um substrato.
Em certas modalidades, a hidrolase é uma hidrolase de glicosídeo selecionada do grupo que consiste em uma alfa-N-acetilgalactosaminidase, alfa-galactosidase, beta- glicosidase, uma celulase, uma endoglucanase e uma exoglucanase.
Em certas modalidades, o análogo de biotina compreende destiobiotina, 2º -iminobiotina, biotina sulfona, bisnorbiotina, tetranorbiotina, oxibiotina, qualquer derivado dos mesmos ou qualquer derivado de biotina que pode ser ligado pelo BBD.
Em certas modalidades, a molécula ligante compreende um grupo alcano C2 a C6 ou um grupo alquila C2 a C6 e uma grupo amida.
Em certas modalidades, a biotina ou um análogo da mesma é ligada a uma matriz reagindo uma molécula compreendendo biotina ou um análogo da mesma que é covalentemente ligada a um grupo alquila C2 a C6 que é covalentemente ligada a um grupo sulfo- N-hidroxisuccinimida (NHS) com grupos amina livres da matriz.
Em certas modalidades, a razão de PEG para PEI é 1 parte de PEG para 1,5 partes de PEI a 1 parte de PEG para 2,5 partes de PEI em peso.
Em certas modalidades, o domínio da enzima de pelo menos uma proteína de fusão é selecionada do grupo que consiste em uma Dbeta-glicosidase, uma endoglucanase e um domínio de exoglucanase.
Em certas modalidades, a beta-glicosidase, uma endoglucanase e uma exoglucanase são tolerantes ao lipídeo iônico, termo tolerantes ou ambos.
Em certas modalidades, o domínio da enzima tem atividade proteolítica.
Em certas modalidades, a atividade proteolítica é uma atividade de colagenase.
Em certas modalidades, um domínio amiloglicosidase e/ou amilase glicose isomerase da enzima é usado.
Em certas modalidades, o domínio da enzima: (1) reduz RDX (hexa-hidro- 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina); (11) reduz 2,4,6-trinitrotolueno (TNT); (1ii) reduz cromo 6+ a cromo 3+; ou (iv) tem atividade 2,2',3-tri-hidroxibifenil dioxigenase.
Em certas modalidades, o domínio da enzima compreende uma ou mais sequências compreendendo domínios de enzima que fornecem a degradação de atrazina que são selecionados do grupo que consiste em SEQ
ID NO:27-31 e 32. Em certas modalidades, uma combinação de domínios de enzima que fornecem a degradação de atrazina que são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO:27-31 e 32 são usados. Em certas modalidades, pelo menos duas proteínas de fusão são imobilizadas na matriz. Em certas modalidades, as pelo menos duas proteínas de fusão compreendem um domínio da enzima que são cada um independentemente selecionado do grupo que consiste em uma beta-glicosidase, uma endoglucanase e uma exoglucanase. Em certas modalidades, pelo menos um domínio da enzima compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência para uma beta-glicosidase de SEQ ID NO: 2, uma endoglucanase de SEQ ID NO: 3, alfa-N-acetilgalactosaminidase de SEQ ID NO: 4, uma alfa-galactosidase de SEQ ID NO: 5 ou um domínio da enzima de SEQ ID NO:6-33 ou 34. Em certas modalidades, o BBD compreende um BBD de avidina, BBD de estreptavidina, BBD de tamavidina, BBD de zebavidina, BBD de bradavidina, BBD de rizavidina, BBD de shwanavidina, BBD de xenavidina, uma quimera dos mesmos ou derivados dos mesmos tendo um ou mais inserções, deleções ou substituições de resíduo de aminoácido.
[009] Também são providos aqui os complexos de enzima imobilizada preparados por qualquer um dos métodos mencionados aqui descritos. Em certas modalidades, o IEC compreende um adesivo de cicatrização de ferida e o domínio da enzima domínio da enzima tem atividade proteolítica.
[0010] Também são providos aqui biorreatores, compreendendo: uma ou mais proteínas de fusão imobilizadas ligadas a matrizes de fibra de carbono funcionalizadas e biotiniladas para formar uma plataforma regenerativa estável ao calor para enzimas recombinantes, geneticamente fundidas e modificadas. Em certas modalidades, o biorreator compreende adicionalmente uma enzima compreendendo pelo menos uma porção de estreptavidina ou um análogo. Em certas modalidades, as matrizes biotiniladas são propileno ou um análogo do mesmo. Em certas modalidades, as enzimas recombinantes modificadas por engenharia são configuradas tendo uma ou mais construções de vetor de expressão de gene clonadas em um quadro de leitura aberto (ORF) que codifica o domínio de ligação de biotina (BBD) construído no vetor de expressão de proteína (pETstra) regulado por um sistema de expressão T7. Em certas modalidades, as enzimas recombinantes modificadas por engenharia são configuradas como enzimas fundidas a estreptavidina, antígenos, anticorpos ou peptídeos e que são expressas por um sistema de expressão de proteína e ligadas sobre uma superfície funcionalizada. Em certas modalidades, a superfície funcionalizada é um andaime biocompatível. Em certas modalidades, o biorreator é configurado como um sistema de reator de fluxo contínuo e multienzimas. Em certas modalidades, o dispositivo do biorreator é configurado para formar um ou mais agentes terapêuticos.
[0011] Adicionalmente são providos aqui métodos para usar um biorreator, compreendendo as etapas para os métodos de regeneração para a recirculação de um lipídeo através de um complexo de enzima imobilizada. Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente as etapas para: recuperar um produto desejado enzimaticamente convertido de um substrato, expor o substrato ao IEC em condições, remover uma ou mais proteínas de fusão não covalentemente ligadas de uma matriz após a conversão do substrato ao produto desejado e ligar as proteínas de fusão à matriz. Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente uma ou mais etapas para configurar um biofiltro para maximizar a área de superfície exposta ao complexo de enzima imobilizada em que o substrato é convertido ao produto desejado.
[0012] Também são providos aqui sistemas de biorreator de fluxo contínuo e multienzimas compreendendo: uma ou mais enzimas recombinantes modificadas por engenharia, geneticamente fundidas com estreptavidina ou outro BBD, específicas para um sistema de biofiltro regenerado tendo uma ou mais plataformas funcionalizadas incluindo um revestimento selecionado de um grupo que consiste em carbono, agarose, poliestireno, polipropileno, poliuretano, sílica e náilon.
[0013] Também são providos aqui sistemas de biofiltro compreendendo: sistemas de expressão de enzima tendo um ou mais BBD ou enzimas fundidas à estreptavidina imobilizadas em pelo menos meios de suporte biotinilados entrelaçados que são rapidamente regenerados para formar plataformas de polímero funcionalizado, em que o biofiltro é opcionalmente imobilizado com celulases tolerantes ao lipídeo iônico. Em certas modalidades, o Sistema de biofiltro imobilizado com celulases tolerantes ao lipídeo iônico compreende adicionalmente celulose solúvel extraída de matéria-prima de biomassa e um processo de pré-tratamento de lipídeo iônico hidrolizado por uma ou mais enzimas recombinantes termofílicas ligadas a um BBD. Em certas modalidades, a uma ou mais enzimas recombinantes termofílicas são selecionadas do grupo que consiste em endoglucanases, exoglucanases, B-glicosidases de Trichoderma reesei, B- glicosidases de Aspergillus spp., endoglucanase termofílica, Cel5A Tma de Thermotoga maritima, B- 1, 4-endoglucanase (Cel5A) de Thermoanaerobacter tengcongensis MBA, endoglucanase e 1,4-beta-celobiosidase de Paenibacillus spp. Em certas modalidades, o sistema de biofiltro imobilizado com celulases tolerantes ao lipídeo iônico é configurado adicionalmente para converter simultaneamente ácidos graxos livres e triglicerídeo em biodiesel, tendo um sistema de expressão de enzima imobilizado com um ou mais lipases para facilitar a transesterificação enzimática. Em certas modalidades, o sistema de biofiltro imobilizado com celulases tolerantes ao lipídeo iônico compreende adicionalmente meios de suporte biotinilados e entrelaçados e um filtro para hidrolisar uma celulose solúvel extraída de uma matéria-prima de biomassa. Em certas modalidades, um sistema multienzimas é imobilizado com uma ou mais lipases para facilitar o processo de transesterificação enzimática para simultaneamente converter ácidos graxos livres e triglicerídeo em biodiesel e em que as lipases são selecionadas de um grupo que consiste em Rhizopus oryzae e Candida rugosa. Em certas modalidades, as lipases são selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 e SEQID NO: 26. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS
[0014] Figura 1. Projeto do vetor de expressão.
[0015] Figura 2. Diagrama de utilização do complexo de enzima imobilizada (IEC) para conversão ide biomassa.
[0016] Figura 3. Atividades enzimáticas para as endo-celulases modificadas por engenharia fundidas com estreptavidina (fusão de estreptavidina C-e N-terminal referida como “NT” ou “CT” na figura).
[0017] Figura 4. A produção dos açúcares principais e intermediários durante a despolimerização catalítica de celulose.
[0018] Figura 5. PMP-Glicose derivatizada [M+H* = 511] analisada por LC-MS no modo de fon positivo (a). O cronograma iônico de PMP- Glicose [M+H* = 511] (B).
[0019] Figura 6. Atividades enzimáticas para a B-glicosidase modificada por engenharia fundida com estreptavidina.
[0020] Figura 7. Análise Western Blot da produção de endoglucanase (EGII) recombinante. Linhal: controle negativo; Linha2: EGIIO070914; Linha3: EGIIO71414; Linha4: EGIIO71614; Linha5S: EGIIO72814; Linha6: EGIIO80114; Linha7: EGIIO805S14630ºC; Linha8: EGIIO8S0514637ºC; Linha9: Padrões de peso molecular de proteína. As setas azuis indicarão a banda representada EGII fundida pelo ligante 55kDa em cada linha.
[0021] Figura 8. A atividade enzimática ligada ao material de matriz diferente: poliestireno A, B, C, D, material de nanocarbono de parede única
(SWCNT 0,7-1,3 nm), contas de sílica, material de nanocarbono multiparedes (MWCNT-F, 0,5 a 10 um), material de nanocarbono multiparedes (MWCNT- G, 5a 9 um), material de nanocarbono multiparedes (MWCNT-H, 2,5 a 20 um) e agarose. Entre estas matrizes, o material de carbono mostrou a melhor capacidade para esta enzima recombinante.
[0022] Figura 9. As concentrações de biotina na superfície de cada matriz. Material de nanocarbono de parede única (SWCNT 0,7 a 1,3 nm), material de nanocarbono multiparedes (MWCNT-F, 0,5 a 10 um), material de nanocarbono multiparedes (MWCNT-G, 5 a 9 um), material de nanocarbono multiparedes (MWCNT-H, 2,5 a 20 um).
[0023] Figura 10. As celulases imobilizadas na agarose funcionalizada (conjugada, círculos sólidos) mostraram maior estabilidade térmica para a produção de açúcares.
[0024] Figura 11. As celulases imobilizadas em agarose funcionalizada (imobilizada, barra aberta) mostraram maior meia-vida (8 dias) em comparação a celulases livres (barra sólida 4 dias e 8 dias) para a produção de açúcares.
[0025] Figura 12. A meia-vida de fB-glicosidase imobilizada no material de nanocarbono multiparedes (imobilizada, preto) apresentaram atividade até 8 dias, mas a glicosidase livre (padrão de tiras) não apresentou nenhuma além de 4 dias.
[0026] Figura 13. As celulases imobilizadas em sílica funcionalizada (conjugada, diamantes) apresentaram melhores estabilidades enzimáticas em comparação a celulases livres (livre, quadrados) para a produção de açúcares: glicose (a) e celobiose (B).
[0027] Figura 14. As celulases imobilizadas em agarose funcionalizada (imobilizada, quadrado fechado) apresentaram melhores estabilidades enzimáticas em comparação a celulases livres (livre, círculo aberto) para a produção de açúcares: celobiose (a) e celotriose (B).
[0028] Figura 15. A imobiliziçção de múltiplas enzimas (endoglucanase EGII e fB-glicosidases BGL1) nas matrizes funcionalizadas mostrou maior produção de açúcares e glicose totais que a classe única de enzima somente. À celulose é mostrada como seção superior da barra e glicose é mostrada como seção inferior da barra.
[0029] Figura 16. Efeitos dos ciclos de regeneração na proporção de enzima imobilizada na agarose biotinilada (preto) a enzima não ligada (branco). 86,17% da enzima recombinante poderia ser imobilizada no material de agarose após a primeira rodada de regeneração. A atividade de enzima ligada foi mantida acima de 72% nas rodadas 2 a 4 e então é diminuída abaixo de 50% na 6º regeneração. O experimento de regeneração foi interrompido devido à agarose degradada após a 6º desanexação térmica.
[0030] Figura 17. Efeitos dos ciclos de regeneração na proporção de enzima imobilizado no material de carbono biotinilado (preto) na enzima não ligada (branco). A maior enzima ligada às partículas de carbono foi 91,5% na 2º rodada. A atividade de enzima ligada foi mantida acima de 50% até seis rodadas, semelhante aos resultados com contas de agarose. A matriz de carbono apresenta boas características de estabilidade térmica.
[0031] Figura 18. Reusabilidade das enzimas (O ensaio de estabilidade de B-Glicosidase imobilizado SWCNT) - 62,5 mg de B- glicosidase imobilizada SWCNT foram utilizados no ensaio de atividade enzimática com 10 mM de substrato pNPG, incubados a 50ºC por 30 min. À medição de ODs4o é na função da produção de pNP e uma curva padrão de concentração de pNP a ODsao foi aplicada para o cálculo de atividade enzimática (U mL' min'). A B-glicosidase imobilizada SWCNT foi recuperada no final das incubações, lavada com PBS e reutilizada na próxima execução do mesmo ensaio. O ensaio de atividade enzimática foi repetido 4 vezes com o lite de amostras recuperado em duplicata.
[0032] Figura 19. Produção de pNP (umol) como a função de proteína
BGLI recombinante ligada na fibra de carbono (gm) funcionalizada por várias razões de PEG:PEL A reação enzimática é no substrato pNPG 10 mM a 50ºC por 15 min. O teste foi para descobrir a melhor razão de PEG:PEI para a funcionalização que forneceria o máximo da anexação da proteína da enzima. A produção de pNP é o indicador para a quantidade de proteína anexada.
[0033] Figura 20. Ensaio para a atividade de proteína AagÃA imobilizada - Atividade enzimática como uma função de proteína (mg) do extrato bruto de cultura que expressa proteína AagA fundida a estreptavidina. Uma diluição em série de extrato bruto foi feita para amostras de proteína no ensaio de atividade enzimática com substrato pNP-NAG seja com 1 mM ou 2,5 MM. A reação foi incubada a 37ºC por 15 min.
[0034] Figura 21. Biocatalisador magnético - Atividade enzimática como uma função de partícula de carbono-ferro imobilizada em BGLI — Uma série de diluições de partícula de carbono-ferro imobilizada em BGLI e partícula de carbono-ferro não enzima foi feita para as amostras em duplicata para o ensaio de atividade enzimática com 10 mM de substrato pNPG. As reações foram incubadas a 50ºC por 15 min. A medição de ODs4, é na função da produção de pNP e uma curva padrão de concentração de pNP a ODsa4, foi aplicada para o cálculo de atividade enzimática (U mL! min'!). Os resultados mostraram que a partícula carbono-ferro pode ser funcionalizada para a imobilização da enzima fundida ao ligante como outros materiais da plataforma testados com a vantagem que eles podem ser recuperados por força magnética das reações.
[0035] Figura 22. Produção de açúcares foi aumentada em cerca de dez vezes quando a B-glicosidase (BGLI) foi imobilizada nas plataformas de fibra de carbono em comparação à enzima livre.
[0036] Os complexos de enzima imobilizada (IECs) compreendendo proteínas de fusão com domínios de enzima que são não covalentemente ligados a várias matrizes, métodos para preparar os IECs e métodos para usar os IECs são providos aqui. Tais IECs são adequados para uma ampla gama de processos industriais incluindo, entre outros, conversão de biomassas, produção de produto alimentício, produção de produto farmacêutico, conversões de tipo de sangue, degradação de poluentes e semelhantes. As vantagens dos IECs providos aqui podem incluir, entre outras, melhor estabilidade da enzima em comparação a enzimas não imobilizadas, purificação eficiente e/ou de baixo custo das enzimas e fabricação das IECs e regeneração eficiente e/ou de baixo custo dos IECs com enzima(s) nova(s) e/ou diferente(s).
[0037] As matrizes adequadas para uso nos IECs incluem, entre outros, matrizes que são estáveis termicamente. Como aqui utilizada, a frase “estável ao calor”, quando usada em referência a uma matriz, se refere a uma matriz que é covalentemente ligada a uma molécula de biotina ou análogo da mesma que retém sua capacidade de se ligar não covalentemente à proteína de fusão compreendendo o domínio da enzima após a exposição em água, um lipídeo aquoso ou água gasosa a uma temperatura de pelo menos 80ºC. Em certas modalidades, as matrizes providas aqui são estáveis ao calor a uma temperatura de pelo menos 90ºC ou 95ºC. Em certas modalidades, as matrizes aqui providas são estáveis ao calor a uma temperatura de 90ºC ou 95ºC a 100ºC, 110ºC, 122ºC, 130ºC ou mais. Os exemplos não limitantes de matrizes estáveis ao calor que podem ser usadas incluem, entre outros, carbono, fibras de carbono (por exemplo, nanotubos de carbono de parede única (SWCNT), nanotubos de carbono de múltiplas paredes (MWCNT), poliestireno, poli(ácido lático), poliuretano, sílica, náilon ou polipropileno. Em certas modalidades, as matrizes de carbono serão estáveis ao calor a temperaturas de 80ºC a 100ºC ou menos que 104ºC. Em certas modalidades, as matrizes de fibra de carbono, polipropileno ou poliuretano serão estáveis ao calor a temperaturas de 80ºC a 100ºC, 110ºC, 122ºC, 130ºC ou mais. Em certas modalidades, as matrizes de fibra de carbono, polipropileno ou poliuretano serão estáveis ao calor a temperaturas de 80ºC a 100ºC, 110ºC, 122ºC, 130ºC ou mais a pressão elevada, tal como é alcançada em uma autoclave (por exemplo, 100 kPa (14,5 psi) ou mais.
Em certas modalidades, tais matrizes estáveis ao calor podem prover IECs que pode ser usado a temperaturas de 80ºC em conjunto com enzimas estáveis ao calor (por exemplo, enzimas modificadas por engenharia e/ou enzimas obtidas de organismos hipertermofílicos). Em certas modalidades, tais matrizes estáveis ao calor podem prover IECs que podem ser regenerados pela remoção de proteínas de fusão compreendendo domínios de enzima gastos por autoclave e/ou passagem de água, soluções aquosas ou lipídeos não aquosos a uma temperatura que romperá a anexação não covalente de uma proteína de fusão(s) compreendendo o domínio da enzima gasto seguido por a reanexação de proteína(s) de fusão recém sintetizadas ou outras ativas.
Os IECs que são regeneráveis e os métodos de regenerar os IECs são assim providos aqui.
Como aqui utilizado, o termo “domínio da enzima gasto” se refere a um domínio da enzima que perdeu pelo menos 10%, 20% ou 50% de sua atividade enzimática original.
As proteínas de fusão compreendendo domínios de enzima gastos podem surgir após a conversão do substrato a um produto desejado pela proteína de fusão que é não covalentemente anexada à matriz.
Em certas modalidades, a remoção das proteínas de fusão compreendendo domínios de enzima gastos da matriz estável ao calor é realizada pela passagem de água, uma solução aquosa ou um lipídeo não aquoso a uma temperatura de pelo menos cerca de 90ºC ou 95ºC a 100ºC ou mais.
Em certas modalidades, a remoção de proteínas de fusão compreendendo os domínios de enzima gastos pode ser realizada com quaisquer dos lipídeos ou temperaturas mencionados anteriormente em conjunto com um desnaturante que rompe a ligação não covalente da proteína de fusão com a matriz estável ao calor.
Exemplos de tais desnaturantes incluem, entre outros, ureia, tioureia,
guanidina, dodecil sulfato de sódio, formamida e semelhantes.
[0038] Outro componente dos IECs providos aqui são moléculas de biotina ou análogos das mesmas que são anexadas às matrizes estáveis ao calor com as moléculas de ligante. Os análogos de biotina usados nos IECs podem incluir, entre outros, destiobiotina, 2'-iminobiotina, biotina sulfona, bisnorbiotina, tetranorbiotina, oxibiotina, qualquer derivado dos mesmos ou qualquer derivado de biotina que pode ser ligado por um domínio de ligação de biotina (BBD). Em certas modalidades, o análogo de biotina pode apresentar afinidade de ligação reduzida (por exemplo, uma maior constante de dissociação ou Ka) para o BBD particular da proteína de fusão que é não covalentemente ligada ao análogo de biotina e a matriz. Os exemplos não limitantes de análogos de biotina com afinidade de ligação reduzida para um BBD de estreptavidina incluem, entre outros, destiobiotina. A biotina ou os análogos de biotina são covalentemente ligados às matrizes por meio das moléculas de ligante. Em certas modalidades, a anexação covalente da biotina ou análogo de biotina é realizada por uma amida ligada entre um polímero de polietilenoimina (PEI) na superfície da matriz e a molécula ligante. As moléculas de ligante anexadas à superfície de uma matriz podem compreender um alcano, um grupo alquila, uma amida ou combinação dos mesmos. Em certas modalidades, e o alcano pode compreender um ou mais de um alcano(s) C2 a C6. Em certas modalidades, e o grupo alquila pode compreender um ou mais de um grupo alquila C2 a C6. Em certas modalidades, dois ou mais grupos alcanos C2 a C6 ou alquilas C2 a C6 são unidos por meio de uma ou mais ligações de amida na molécula ligante. Em certas modalidades, a anexação covalente da biotina ou análogo de biotina é realizada pela reação de um grupo amina de um polímero polietilenoimina (PED) na superfície da matriz e um grupo sulfo-NHS de uma molécula ligante que é covalentemente ligada a biotina. As moléculas de ligante anexadas à superfície de uma matriz podem compreender um espaçador alquila, um grupo sulfo-NHS que reagiu com um grupo amina da matriz ou combinação dos mesmos.
Os exemplos de derivados de biotina que compreendem adicionalmente os precursores da molécula ligante incluem, entre outros, vários biotina-N-hidroxisuccinimida ésteres.
Os biotina-N-hidroxisuccinimida ésteres comercialmente disponíveis que podem ser usados incluem os produtos Sulfo-NHS-Biotina, Sulfo-NHS-LC Biotina e Sulfo-NHS-LC-LC Biotina (Thermo, Carlsbad, CA, USA). Biotina-N-hidroxisuccinimida ésteres podem reagir com matrizes que têm grupos amina livres para ligar covalentemente a biotina e a molécula ligante à matriz por meio de uma ligação de amida para prover uma matriz funcionalizada.
Como aqui utilizado, uma “matriz funcionalizada” é uma matriz tendo uma biotina ou análogo de biotina covalentemente anexada a ela com uma molécula ligante.
Tais matrizes funcionalizadas incluem, entre outras, matrizes em que a biotina ou análogo de biotina covalentemente ligado a ela com uma ligação de amida à molécula ligante que é anexada à biotina ou análogo de biotina.
As matrizes com grupos amina livres podem ser preparadas por uma variedade de métodos.
Em certas modalidades, a matriz pode reagir com uma mistura de polietileno glicol (PEG) e polietilenoimina (PEI) para formar um revestimento de polímero com aminas livres providas pelo PEI.
O PEG e PEI podem ser revestidos na superfície da matriz misturando com água e curando sobre a superfície da matriz.
O revestimento de SWCNT com uma solução 10% em peso de poli(etilenoimina) (PEI, peso molecular médio -25 kDa) e poli(etileno glicol) (PEG, peso molecular médio -10 kDa) em razões iguais de 1:1 foi descrito por Star et al. (Nano Lett., Vol. 3, No. 4, 2003). Em certas modalidades, providas aqui, razões de PEG:PEI reduzidas (isto é, menos PEG que PEI) são usadas.
Em certas modalidades, as razões PEG:PEI 1 parte de PEG para 1,25 partes de PEI a 1 parte de PEG para 3,5 partes de PEI em peso, 1 parte de PEG para 1,5 partes de PEI a 1 parte de PEG para 2,5 partes de PEI em peso ou | parte de PEG para 1,8 partes de PEI a 1 parte de PEG para 2,2 partes de PEI em peso são usadas para revestir a matriz. Em certas modalidades, cerca de 1 parte de PEG para cerca de 2 partes de PEI em peso são usados para revestir a matriz. IECSs com quantidades aumentadas de domínios de enzima imobilizada podem ser obtidos usando tais razões PEG:PEI reduzidas. A remoção de PEG e PEI não reagidas podem ser realizadas enxaguando as matrizes tratadas com água, soluções aquosas e semelhantes. As matrizes tratadas com PEG/PEI que foram enxaguadas são, em certas modalidades, submetidas a uma subsequente etapa de aquecimento ou secagem. Biotina-N-hidroxisuccinimida ésteres compreendendo moléculas de ligante podem reagir com matrizes tratadas com PEG/PEL, rinsadas e secas para prover a matriz funcionalizada. À anexação não covalente da proteína de fusão à matriz funcionalizada pode ser realizada colocando a matriz funcionalizada em contato com a proteína de fusão.
[0039] As proteínas de fusão compreendendo domínios de enzima e BBDs podem ser construídas por técnicas de DNA recombinantes em que os ácidos nucleicos que codificam os domínios são unidos, tal que um único quadro de leitura aberto que codifica ambos os domínios seja criado. Como aqui utilizado, a frase “domínios de enzima” se refere a uma porção de uma enzima que pode converter qualquer substrato da enzima a um produto de reação. Assim, reconhece-se que um domínio da enzima pode, em certas modalidades, compreender uma parte menos que completa de uma enzima, desde que ela retenha pelo menos alguma atividade enzimática. Em certas modalidades, o domínio da enzima pode assim compreender uma deleção N- terminal, uma deleção C-terminal, uma deleção interna ou qualquer combinação de tais deleções de um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido de uma proteína contendo o domínio da enzima. Em certas modalidades, o domínio da enzima pode compreender um, dois, três ou mais substituições do resíduo de aminoácido. Em certas modalidades, o domínio da enzima pode compreender uma, duas, três ou mais substituições do resíduo de aminoácido em SEQ ID NO: 2, 3,4, 5,6,7,8,9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34. Em certas modalidades, o domínio da enzima pode compreender as sequências de SEQ ID NO: 2, 3,4, 5,6,7,8,9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34 tendo uma, duas, três ou mais e/ou um ou mais de uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, uma deleção interna ou qualquer combinação de tais deleções de um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido. Em certas modalidades, o domínio da enzima pode compreender uma proteína tendo pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2,3, 4,5,6,7,8,9,10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34. Em outras modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de enzimas de comprimento total ou madura que contém o domínio da enzima pode ser usada. Os ácidos nucleicos que codificam o BBD podem ser fundidos no quadro aos ácidos nucleicos que codificam o domínio da enzima para produzir seja uma proteína de fusão N-terminal ou C-terminal adequada para uso nos IECs providos aqui.
[0040] O Domínio de ligação de biotina (BBD) usado nas proteínas de fusão pode ser obtido de uma ampla variedade de proteínas ou pode ser modificado por engenharia. Como aqui utilizado, a frase “Domínio de ligação de biotina” ou “BBD” se refere a uma porção de uma proteína que pode ser ligar à biotina ou um análogo da mesma. Assim, reconhece-se que um BBD pode, em certas modalidades, compreender uma parte menos que completa de uma proteína, desde que ela retenha pelo menos alguma atividade de ligação de biotina ou análogo de biotina. Em certas modalidades, o BBD ou proteína compreendendo o BBD terá uma constante de dissociação (Ka) para a biotina ou análogo de biotina de pelo menos cerca de 7 x 10º M, 1 x 10ºM, 1 x 107 M, 1 x 10º M ou 1 x 10º M a cerca de 1x 10º M, 1 x 10º M, 1 x 10º M ou 1x 10º” M. Em certas modalidades, o domínio da enzima pode assim compreender uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, uma deleção interna ou qualquer combinação de tais deleções de um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido de uma proteína contendo o BBD.
Em outras modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a sequência de proteínas de comprimento total ou madura que contém o BBD pode ser usada.
Em certas modalidades, a proteína de comprimento total ou madura que é usada para o BBD que é usada pode compreender um BBD de avidina, BBD de estreptavidina, BBD de tamavidina, BBD de zebavidina, BBD de bradavidina, BBD de rizavidina, BBD de shwanavidina, BBD de xenavidina, uma quimera dos mesmos ou derivados dos mesmos tendo uma ou mais inserções, deleções ou substituições de resíduo de aminoácido.
Como aqui utilizado neste contexto, o termo “quimera” se refere a uma proteína compreendendo um BBD que tem sequências de aminoácidos de pelo menos duas proteínas que contêm um BBD.
Em certas modalidades, a proteína de fusão compreendendo o BBD será capaz de formar um homotetrâmero que se liga à biotina ou um análogo da mesma.
Em certas modalidades, a proteína compreendendo o BBD pode ser ligar à biotina ou um análogo da mesma como um monômero.
As substituições de aminoácido na estreptavidina que fornecem proteínas monoméricas que se ligam à biotina com um Ka de cerca de 1 x 10º M incluem, entre outros, substituições de aminoácido T90A e D128A (Qureshi MH, Wong SL.
Proteína Expr.
Purif. 25(3):409-15, 2002). As substituições de aminoácido em estreptavidina que fornecem proteínas que se ligam à biotina a um Ka menor que 1 x 10º M incluem, entre outros, W79A, W1I20A e W120F (Chilkoti A, et al.
PNAS-USA 1995;92(5):1754- 1758) e N23A, S27D e S45A (Howarth et al.
Nature Methods. 2006;3(4):267- 273). Em certas modalidades, contempla-se assim que as proteínas compreendendo estreptavidina (SEQ ID NO: 1) ou derivados das mesmas tendo uma, duas, três, quatro ou mais substituições, deleções, inserções de aminoácido ou qualquer combinação dos mesmos e que compreendem um
BBD podem ser usadas no IEC. Em certas modalidades, a proteína compreendendo o BBD usado no IEC terá pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 1.
[0041] Os ácidos nucleicos que codificam as proteínas de fusão mencionadas anteriormente podem ser operacionalmente ligados aos promotores adequados e outras sequências incluindo, entre outros, regiões não traduzidas 5º e/ou 3º, sequências que codificam peptídeos sinal de secreção, sítios de ligação ao ribossoma, sequências de terminação, sequências de poliadenilação e semelhantes, incorporados em vetores de transformação adequados e introduzidos nas células hospedeiras adequadas que expressam a proteína de fusão. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica (por exemplo, E. coli) ou eucariótica (por exemplo, células de inseto, levedura, planta ou células de mamífero). Os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências regulatórias, selecionadas da base das células hospedeiras para ser usadas para expressão, que é operacionalmente ligada à sequência de ácidos nucleicos a ser expressa. Em um vetor de expressão recombinante, “operacionalmente ligado” entende-se que a sequência de nucleotídeos de interesse é ligada à(s) sequência(s) regulatória(s) de uma maneira que permite a expressão da sequência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo “sequência regulatória” deve incluir promotores, intensificadores, sítios de ligação ao ribossoma, terminadores de transcrição e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Sequências regulatórias incluem as que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de célula hospedeira e as que fornecem expressão induzível. Tais sequências operacionalmente ligadas como descrito anteriormente são adaptadas para uso em células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou eucarióticas (por exemplo, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), células de levedura, células de planta ou células de mamífero). Os exemplos de vetores de expressão de £. coli de não fusão induzível incluem, entre outros, pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) e pET 11d (Studier et al., Gene Expressão Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). A expressão do gene alvo do vetor pTrc depende da transcrição do RNA polimerase do hospedeiro de um promotor de fusão trp-lac híbrido. À expressão do gene alvo do vetor pET 11d pode depender da transcrição de um promotor de fusão T7 gnlO-lac mediado por um RNA polimerase será coexpresso (T7 gnl). Esta polimerase viral pode ser fornecida pelas cepas hospedeiras BL21(DE3) ou HMS174(DE3) de um profago residente à que abriga um gene T7 gn1 mediante o controle de transcrição do promotor lacUV
5. Os exemplos de vetores para a expressão em levedura 5. cerevisiae ou P. pastoris incluem, entre outros, pYepSecl (Baldari et al., (1987) EMBO |. 6:229-234), pMFa (Kurjan e Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (ThermoFischer, Carlsbad, CA) e pPicZ (ThermoFischer, Carlsbad, CA). Para a expressão em Pichia, um promotor induzível por metanol é preferivelmente usado. Em certas modalidades, o vetor de expressão é um vetor de expressão de baculovírus. Os vetores de baculovírus disponíveis para a expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo, células Sf 9) incluem a série pAc (Smith er al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) e a série pvL (Luckow e Summers (1989) Virology 170:31-39). Em certas modalidades, a proteína de fusão é expressa em células de mamífero usando um vetor de expressão de mamífero. Os vetores de expressão de mamífero incluem, entre outros, pCDMS8 (Seed (1987) Nature 329:840) e pMT2PC (Kaufman et al., (1987) EMBO J. 6:187- 195). Quando usado em células de mamífero, as funções de controle do vetor de expressão são frequentemente providas por elementos regulatórios virais. Por exemplo, os promotores comumente usados são derivados de poliomavírus, Adenovírus 2, citomegalovírus e vírus Simian 40. Outros sistemas de expressão adequados para as células tanto procarióticas quanto eucarióticas são descritos em Sambrook et al. (Molecular Cloning: À Laboratory Manual, 4º Ed., Cold Spring Harbor Press, 2012). A alteração da sequência de ácidos nucleicos do ácido nucleico a ser inserido em um vetor de expressão de maneira que os códons individuais para cada aminoácido sejam os mais comumente usados nesta célula hospedeira alvo (por exemplo, “otimização de códon” da célula hospedeira procariótica ou eucariótica) também é provida aqui.
[0042] Os vetores que fornecem expressão extracelular das proteínas de fusão também podem ser usados em certas modalidades. Em tais vetores, as sequências de sinal de secreção que fornecem a secreção das proteínas de fusão na célula hospedeira desejada são operacionalmente ligadas ao N- terminal da proteína de fusão. Os sinais de secreção procariótica que podem ser usados incluem, entre outros, peptídeos de sinal de fosfatase alcalina e semelhantes. Os sinais de secreção de mamífero incluem, entre outros, um peptídeo sinal tPA, um peptídeo sinal de fosfatase alcalina de mamífero e semelhantes. Os sinais de secreção de levedura incluem, entre outros, um peptídeo sinal tipo correspondente à levedura alfa, um peptídeo sinal de invertase de levedura ou peptídeo sinal de fosfatase alcalina de levedura e semelhantes. Os sinais de secreção de célula de inseto incluem, entre outros, um peptídeo sinal egt, um peptídeo sinal p67 ou outros peptídeos sinal úteis para a expressão de proteínas heterólogas, como descrito na Patente U.S.
5.516.657.
[0043] O DNA do vetor que codifica a proteína de fusão pode ser introduzido nas células procarióticas ou eucarióticas por meio de técnicas de transformação convencionais. Como aqui utilizado, o termo “transformação” inclui qualquer método em que um ácido nucleico exógeno é introduzido em uma célula. Os métodos de transformação assim incluem, entre outros,
coprecipitação com fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, lipofecção, entrega mediada por partícula, choque térmico, eletroporação, transfecção ou transdução viral. Para obter as células transformadas, um gene que codifica um marcador selecionável é geralmente introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Para as células procarióticas, os marcadores selecionáveis incluem, entre outros, os genes que conferem resistência aos antibióticos, os genes que conferem a capacidade de crescer na ausência de nutrientes de outra forma necessários e semelhantes. Para as células eucarióticas, os marcadores selecionáveis que conferem resistência aos fármacos incluindo, entre outros, G418, higromicina, ZEOCINTY e metotrexato e genes que conferem a capacidade de crescer na ausência de nutrientes de outra forma necessários e semelhantes podem ser usados.
[0044] As proteínas de fusão podem ser obtidas das células hospedeiras cultivando as células em condições em que a proteína de fusão é expressa e seja lisando ou de outra forma rompendo as células para liberar a proteína de fusão intracelular ou coletando a proteína de fusão dos meios de cultura quando as células hospedeiras secretarem a proteína de fusão. As condições nas quais a proteína de fusão é expressa incluem, entre outros, as condições nas quais a expressão da proteína de fusão é induzida (por exemplo, tais como por indução de um promoter que é operacionalmente ligado a um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão). Em certas modalidades, o IEC é preparado colocando quaisquer das matrizes mencionadas anteriormente em contato com biotina ou um análogo de biotina covalentemente ligado a uma proteína de fusão obtida de uma célula hospedeira ou dos meios de cultura nos quais a célula hospedeira cresceu para permitir a ligação não covalente da proteína de fusão à matriz. As condições de contato são adaptadas para permitir que o BBD da proteína de fusão se ligue à biotina ou análogo de biotina que é covalentemente ligada à matriz.
Em certas modalidades, o TEC pode ser colocado em contato com um lisado purificado brito ou minimamente purificado da célula hospedeira ou com os meios de cultura da célula hospedeira ou um concentrado dos mesmos que compreende a proteína de fusão. Em outras modalidades, o lisado celular, meios de cultura celular ou concentrado dos mesmos contendo a proteína de fusão podem ser submetidos a uma ou mais etapas de purifi8gcação ou enriquecimento. Os exemplos de tais etapas de purificação ou enriquecimento incluem, entre outros, pelo menos a remoção parcial de carboidratos, lipídeos, glicoproteínas, proteínas de peso molecular superior e/ou inferior à proteína de fusão e semelhantes, por meio de exclusão por tamanho, cromatografia líquida por alta pressão, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade e combinações das mesmas.
[0045] Em certas modalidades, o IEC provido aqui pode ser usado em um biorreator. Os biorreatores incluem, entre outros, aparelhos que fornecem o contato do IEC com os substratos dos domínios de enzima das proteínas de fusão imobilizadas continuamente, semicontinuamente, em modo de lote, em modo de lote alimentado ou em qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, as soluções contendo os substratos do domínio da enzima são passados através do biorreator contendo o IEC uma vez ou são passados através do biorreator contendo o IEC pelo menos duas, três ou mais vezes. Em certas modalidades, a passagem de soluções contendo substratos do domínio da enzima através do biorreator contendo IEC pode ser realizada em um sistema fechado para que a solução que originalmente continha o substrato seja passada através do biorreator pelo menos duas, três ou mais vezes ou até que o substrato seja eliminado. Além do mais, a celulose solúvel extraída de matéria-prima de biomassa usando um processo de pré-tratamento com lipídeo iônico (IL) pode ser hidrolisada por o complexo multienzimas imobilizado no sistema de biofiltro de fluxo contínuo. Em certas modalidades, a depleção do substrato de uma solução pode compreender reduções na concentração do substrato original de pelo menos 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%.
[0046] Em certas modalidades, o IEC provido aqui pode estar contido em um compartimento que é permeável a um substrato e um produto da atividade de domínio da enzima. Ainda em outras modalidades, o compartimento que é permeável a um substrato e um produto da atividade de domínio da enzima pode ser incorporado em um biorreator, incluindo, entre outros, quaisquer dos biorreatores mencionados anteriormente. Em certas modalidades, os invólucros usados desta maneira podem compreender uma membrana tendo um tamanho de poro com um corte de peso molecular (MWCO) que permitirá que o substrato entre no compartimento e permitirá que o produto de reação saia do invólucro. Como aqui utilizado, um “corte de peso molecular” ou “MWCO” de uma membrana se refere à menor massa molecular de uma molécula de soluto que será retida pela membrana em pelo menos 90% (isto é, pelo menos 90% da molécula de soluto que foi originalmente contida pela membrana é retida). As membranas usadas nestes invólucros podem ser selecionadas com base nas considerações incluindo, entre outros, os pesos moleculares do substrato e produto do domínio de membrana imobilizado, a presença de outros elementos na solução que são desejáveis para excluir do invólucro, taxas de difusão desejadas para o substrato e produto e semelhantes. Em certas modalidades, a membrana tem um MWCO de cerca de 1, 2 ou 5 kDa a cerca de 8, 10, 20, 50, 100, 300, 500 ou 1000 kDa. O IEC envolvido nestas membranas pode ser usado nos métodos de degradação de vários poluentes. Em certas modalidades, os domínios de enzima de um citocromo P450 XplA-XplB de Rhodococcus Spp., variantes de ou outros citocromos P450 que degradam hexa-hidro-1,3,5 a trinitro-1,3,5 a triazina (RDX) podem ser usados em um IEC para remover RDX. Em certas modalidades, os domínios de enzima de NADPH nitroredutase que reconhecem 2 ,4,6-trinitrotolueno (TNT), incluindo PnrA de
Pseudomonas putida, variantes dos mesmos ou outras enzimas NADPH nitroredutase para degradar TNT podem ser usados em um IEC para remover o TNT. Em certas modalidades, os domínios de enzima das enzimas que degradam o TNT divulgados em Esteve-Núfiez A, et al. Microbiology e Molecular Biology Reviews. 2001;65(3):335 a 352 podem ser usados. Em certas modalidades, os domínios de enzima de dioxina dioxigenase incluindo, entre outros, dxnA1-A2/DbfB de Sphingomonas spp., variantes dos mesmos ou outras dioxina dioxigenases podem ser usados em um IEC para remover dioxina. Em certas modalidades, os domínios de enzima cromato redutase incluindo, entre outros, os domínios de enzima cromato redutase ChrR de Pseudomonas putida, as variantes dos mesmos ou outros domínios de enzima cromato redutase para reduzir cromo 6+ a cromo 3+. Em certas modalidades, as matrizes usadas nos IEC mencionados anteriormente e nos métodos relacionados são fibra de matrizes de carbono.
[0047] Em certas modalidades, o complexo de enzima imobilizada (IEC) poderia ser usado para construir um biorreator multienzimas ou sistema de biofiltro para a produção de biocombustível celulósico ou qualquer outro produto útil de uma reação catalisada pelas enzimas imobilizadas. Os métodos para usar esses biorreatores também são providos aqui. Um exemplo não limitante de como um IEC multienzimas poderia ser usado em biocombustível celulósico é mostrado na Figura 2. Em uma modalidade, o IEC poderia ser utilizado para converter diretamente os açúcares solúveis (por exemplo, celopentaose, celotriose e celobiose) a glicose. Além do mais, a celulose solúvel extraída de matéria-prima de biomassa usando um processo de pré- tratamento de lipídeo iônico (IL) pode ser hidrolizado para o complexo multienzimas imobilizado no sistema de biofiltro de fluxo contínuo. Em certas modalidades, os domínios de enzima recombinantes termo tolerantes, domínios de enzima que são tolerantes aos produtos químicos IL ou domínios de enzima que são tanto termo tolerantes quanto tolerantes ao IL. podem ser usados.
Em certas modalidades, os domínios de enzima tolerantes a IL podem apresentar menos que 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% de reduções na atividade enzimática em comparação a um domínio da enzima intolerante a IL quando exposto à mesma concentração do IL.
Em certas modalidades, os domínios de enzima termo tolerantes podem apresentar menos que 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% de reduções na atividade enzimática em comparação a um domínio da enzima termo sensível (por exemplo, domínio da enzima tipo selvagem) quando expostos à mesma temperatura.
Estas enzimas podem incluir, entre outros, endoglucanases, exoglucanases e fB-glicosidases de Trichoderma reesei e Aspergillus spp., endoglucanase termofílica, Cel5A Tma e endo-1 4-[-xilanase A de Thermotoga maritama, B-1,4- endoglucanase (Cel5A) de Thermoanaerobacter tengcongensis MBA, endoglucanase e 1,4-[-celobiosidase de Paenibacillus spp e proteína tipo alfa-L-arabinofuranosidase A de Bifidobacterium thermophilum.
Em certas modalidades, cloreto de 1-butil-3-metiylimidazólio, acetato de 1-etil-3- metilimimidazólio e cloreto de 1-alil-3-metilimimidazólio podem ser usadas como produtos químicos IL de pré-tratamento para as enzimas recombinantes imobilizadas.
Em certas modalidades, os produtos químicos IL de pré- tratamento — são — usados com B-l/4-endoglucanase (Cel5A) de Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 e Cel5A Tma, uma endoglucanase termofílica de Thermotoga maritama, que são resistentes a certos lipídeos iônicos IL [16, 22]. Em certas modalidades, o(s) domínio(s) da enzima pode(m) compreender as sequências de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 34 tendo uma, duas, três ou mais e/ou uma ou mais de uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, uma deleção interna ou qualquer combinação dessas deleções de um, dois, trêê ou mais resíduos de aminoácido.
Em certas modalidades, o(s) domínio(s) da enzima pode(m) compreender uma proteína tendo pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 34.
[0048] Em certas modalidades, a B-1,4-endoglucanase (Cel5SA) de Thermoanaerobacter tengcongensis MBA4, que também é acentuadamente resistente em lipídeos iônicos cloreto de 1-butil-3-metiylimidazólio e cloreto de 1-alil-3-metilimimidazólio, é usada no IEC ou usada em conjunto com os lipídeos iônicos no IEC. Foi mostrado que a tolerância de IL pode ser correlacionada à termoestabilidade e halotolerância. Em certas modalidades, os domínios de enzima de várias celulases isoladas de espécies de Aspergillus que mostraram ser halotolerantes, têm excelente tolerância aos ILs e podem ser usados no IEC. Em certas modalidades, menores concentrações de IL (25 a 50% p/v) em água são usadas com o IEC. Essas menores concentrações de ILs não são somente eficazes para pré-tratar biomassa, mas também protegem a estabilidade das enzimas durante 1 processo de sacarificação. Em certas modalidades, a estabilidade da celulase imobilizada também poderia ser melhorada adicionalmente revestindo as celulases imobilizadas com ILs hidrofóbicos, tais como butiltrimetilamônio bis(trifluorometilsulfonil)imida (INN 114][NTL2]). Os ILs hidrofóbicos ([N1 114][NTf2] foram usados para melhorar a estabilidade das celulases imobilizadas em ILs em 4 vezes. Esta estratégia foi usada com sucesso para a sacarificação de celulose dissolvida em cloreto de 1-butil-3-metilimidazólio ([Bmim][Cl]) (isto é, até 50% de hidrólise em 24 h) a 50ºC e teor de 1,5 p/v de água.
[0049] Também são providos aqui os IECs, Dbiorreatores compreendendo os mesmos e os métodos relacionados que podem converter sangue ou células sanguíneas do tipo A, B ou AB a sangue ou células sanguíneas tipo O. A conversão de antígenos do grupo sanguíneo A pelo produto do gene AagA de Clostridium perfringens que compreende um alfa-
N-acetilgalactosaminidase foi reportada (Calcutt et al.
FEMS Microbiology Letters. 214 (2002) 77-80). Em certas modalidades, as alfa-galactosidases que removem os resíduos de galactose, na extremidade não redutora da cadeia precursora de carboidrato e convertem o antígeno B em antígeno H são usadas no IEC.
Uma combinação de uma alfa-N- acetilgalactosaminidase e uma alfa- galactosidase pode ser usada para converter o sangue ou células sanguíneas A, B ou AB ao sangue ou células sanguíneas tipo O.
Em certas modalidades, o domínio da enzima usado no IEC pode compreender uma alfa-N- acetilgalactosaminidase, uma alfa-N- acetilgalactosaminidase de SEQ ID NO: 4 ou uma variante da mesma.
Em certas modalidades, o domínio da enzima variante pode compreender as sequências de SEQ ID NO: 4 tendo uma, duas, três ou mais e/ou uma ou mais de uma deleção N-terminal, uma deleção C- terminal, uma deleção interna ou qualquer combinação dessas deleções de um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido.
Em certas modalidades, o domínio da enzima variante pode compreender uma proteína tendo pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 4. As alfa-galactosidases contendo os domínios de enzima adequados para uso no IEC incluem, entre outros, os de grão de café (Zhu et al., (1996) Arch Biochem Biophys. 15;327(2):324-9; SEQ ID NO: 5), feijão (Davis er al., (1997) Biochem Mol Biol Int., Jul;42(3):453-67;) e soja (Davis er al. (1996) Biochem Mol Biol Int.
Jun;39(3):471- 85) e variantes dos mesmos.
Em certas modalidades, o domínio da enzima usado no IEC pode compreender uma alfa-galactosidase, uma alfa-galactosidase de SEQ ID NO: 5 ou uma variante da mesma.
Em certas modalidades, o domínio da enzima variante pode compreender as sequências de SEQ ID NO: 5 tendo uma, duas, três ou mais e/ou uma ou mais de uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, uma deleção interna ou qualquer combinação dessas deleções de um, dois, trêê ou mais resíduos de aminoácido.
Em certas modalidades, o domínio da enzima variante pode compreender uma proteína tendo pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 5. Em certas modalidades, o domínio da enzima usado no IEC pode compreender SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou variantes dos mesmos. Em certas modalidades, o domínio da enzima variante pode compreender as sequências de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 tendo uma, duas, três ou mais e/ou uma ou mais de uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, uma deleção interna ou qualquer combinação dessas deleções de um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido. Em certas modalidades, o domínio da enzima variante pode compreender uma proteína tendo pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10.
[0050] Outras aplicações dos sistemas de IEC providos aqui incluem, entre outros: adesivo de cicatrização de feridas (por exemplo, enzimas proteolíticas, tais como domínios de enzima papaína ou colagenase), células combustíveis (células combustíveis biológicas à base de enzima), conversão de amido a frutose (por exemplo, usando domínio de enzimas isomerases de amiloglicosidase e/ou amilase glicose), sistemas de administração de fármaco (por exemplo, proteínas antimicrobianas: lisozima, etc.), remoção de sabor, eliminador de mancha (domínios de enzima URINASE'Y ou protease imobilizados), biotensoativos e detergentes (domínios de enzima de proteases, lipases como biotensoativos e detergentes para uso industrial, por exemplo, umectantes, “desengraxantes, agentes de imersão em indústria de tingimento/alimento) e biofiltros (por exemplo, citocromo P450 de XplA- XplB de Rhodococcus spp. para remover RDX, PnrA de Pseudomonas putida para remover TNT, dioxina dioxigenase (dxnA1-A2/DbfB) de Sphingomonas Spp. para remover dioxina e cromato redutase ChrR de Pseudomonas putida para reduzir cromo 6+ a cromo 3+). Em certas modalidades, a lipase pode compreender as sequências de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26 tendo uma, duas, três ou mais e/ou uma ou mais de uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, uma deleção interna ou qualquer combinação dessas deleções de um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido. Em certas modalidades, o domínio da enzima variante pode compreender uma proteína tendo pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26. Em certas modalidades, o domínio da enzima compreende uma ou mais sequências compreendendo domínios de enzima que fornecem a degradação de atrazina que são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO:27-31 e 32. Em certas modalidades, os fragmentos de SEQ ID NO:27-31 e 32 que compreendem os domínios de enzima das sequências que fornecem atividade de degradação de atrazina são usados. Em certas modalidades, uma combinação de domínios de enzima que fornecem a degradação de atrazina que são selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO:27-31 e 32 são usados. Em certas modalidades, o domínio da enzima pode compreender as sequências de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33 tendo uma, duas, três ou mais e/ou um ou mais de uma deleção N-terminal, uma deleção C-terminal, uma deleção interna ou qualquer combinação dessas deleções de um, dois, trêê ou mais resíduos de aminoácido. Em certas modalidades, o domínio da enzima variante pode compreender uma proteína tendo pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 27, SEQID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33.
[0051] Os complexos de enzima imobilizada providos aqui também podem ser adaptados para aplicação a um indivíduo ou objeto em necessidade dos mesmos. Tais adaptações incluem, entre outros, o uso de materiais biocompatíveis como as matrizes do IEC. Em certas modalidades, os materiais biocompatíveis não obterão uma reação adversa no indivíduo. Os métodos de aplicação incluem, entre outros, qualquer administração parenteral (por exemplo, administração intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intraperitoneal ou intratecal), administração tópica, administração oral e administração mucosal (por exemplo, administração intranasal, inalação, retal, vaginal, bucal ou sublingual). Os indivíduos incluem, entre outros animais, humanos, plantas e partes de planta incluindo folhas, sementes, flores e semelhantes. Exemplos não limitantes de um indivíduo em necessidade incluem, entre outros, indivíduos que sofrem de infecção ao qual um IEC compreendendo uma proteína ou domínio da enzima antimicrobiana (por exemplo, lisozima) é aplicada.
EXEMPLOS Exemplo 1 — Fabricação de matrizes biotiniladas
[0052] As matrizes foram funcionalizadas pelo processo de copolimerização de polietileno glicol (PEG) e polietilenoimina (PEI) PEG- PEI a temperatura ambiente, seguido por biotinilação. Ao contrário dos processos de copolimerização de PEG-PEI anteriores (Star et al. (2003), Nano Letters 3 (4), 459-463, DOI: 10,1021/n10340172), as razões de PEG para PEI maiores que 1:1, mas menores que 1:4 foram usadas em certos experimentos e mostraram suportar a maior atividade enzimática (Figura 19). Uma razão de PEG:PEI de 1:2 forneceu um IEC com atividade enzimática maior que a razão 1:1 ou uma razão 1:4 nestes experimentos. Para tratar 50 mg de material da matriz, 0,1 g de PEG e 0,2 g de PEI foram usados. As matrizes incluindo fibras de carbono multiparedes, agarose, carbono, poliestireno, sílica ou náilon foram primeiro submersas em uma solução 10% em peso de PEI (peso molecular médio —25.000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e PEG (peso molecular médio 10.000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em água durante a noite a temperatura ambiente seguido por enxague minucioso com água e cura. Após o processo de funcionalização, as matrizes funcionalizadas de amina (5 mg/mL) foram conjugadas por meio de seus grupos de exposição de amina à biotina usando o biotina 3-sulfo-N-hidroxisuccinimida éster (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO). Exemplo 2- Conversão enzimática para produção de biocombustível
[0053] Construção do vetor de expressão genética para a expressão de enzimas fundidas a estreptavidina - O vetor de expressão genética para expressão de enzima fundida a estreptavidina foi construído com sucesso (Figura 1). O gene de celulases resistentes ao lipídeo iônico e termofílicas, por exemplo, CelA3, B-l,4-endoglucanase (Cel5SA) de Termoanaerobacter tengcongensis MB4 (Liang, C., Xue, Y., Fioroni, M. et al. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 89: 315. doi:10,1007/s00253-010-2842- 6), endocelulase de Aspergillus niger, endoglucanase e 1,4-beta-celobiosidase de Paenibacillus spp., endoglucanase Il de Trichoderma reesei QM9414 (ATCC26921) (exceto a região do peptídeo sinal) será amplificado por PCR de extensão da sobreposição de splicing. Os fragmentos de PCR do gene serão colonados em um quadro de leitura aberto (ORF) que codifica estreptavidina designado construído no vetor de expressão de proteína (pETstra) que é regulado pelo sistema de expressão T7. O pETstra clonado pela celulase será introduzido em uma cepa de E. coli BL2I1(DE3) que é especificamente designada para a expressão de genes regulados pelo promotor T7.
[0054] Expressão e coleta de enzimas fundidas a estreptavidina — Uma cultura durante a noite de E. coli BL21(DE3) que carrega o pETstra clonado em EGII foi preparada inoculando um LB de 10 mL com antibiótico apropriado com uma única colônia e incubando em agitação a 37ºC. Dois litros de LB com antibiótico apropriado foram inoculados adicionando 10 mL de cultura durante a noite a cada litro e incubando a 37ºC até que a densidade óptica a 600 nm atingisse 0,6 a 1,0, Então, IPTG foi aplicado à cultura para a concentração final de 1 mM e a cultura induzida por IPTG foi incubada a 22ºC por 18 horas. A cultura expressa de proteína foi coletada por centrifugação a 5.000 rpm por 10 min e os precipitados foram coletados e armazenados a -80ºC durante a noite. Os precipitados foram ressuspensos com tampão de PBS e sonicados para romper as células. A prep sonicada foi então centrifugada e o sobrenadante foi coletado como extrato bruto. À concentração de proteína foi medida pelo método Bradford e a atividade enzimática determinada por um ensaio colorimétrico carboximetilcelulose CMC-vermelho do Congo usando a medição da absorbância a 530 nm para vermelho do Congo para a hidrólise de CMC por celulases. Nossos resultados preliminares (Figura 3) demonstraram melhor atividade enzimática quando a estreptavidina foi fundida ao N-terminal em comparação ao C-terminal as celulases particulares usadas neste exemplo.
[0055] Imobilização de enzimas fundidas a estreptavidina e regeneração das plataformas de polímero As matrizes de polímero usadas nestes experimentos foram as fibras de carbono multiparedes que foram derivatizadas por um processo de PEI:PEG essencialmente como descrito no Exemplo 1. As enzimas fundidas a estreptavidina, incluindo endoglucanases, exoglucanases e B-glicosidase, foram então imobilizadas às matrizes biotiniladas na razão de 1:5 para permitir que a ligação estreptavidina-biotina forte ocorresse (interação não covalente). Devido à resistência e à especificidade da interação entre a estreptavidina e a superfície biotinilada das matrizes, será permitido a imobilização do completo multienzimas no sistema de biofiltro de fluxo contínuo, mas a purificação cara e trabalhosa da enzima não será necessária (Figura 2). As matrizes de polímero funcionalizadas foram rapidamente regeneradas por um processo de regeneração térmico simples. Até hoje, seis ciclos de regeneração foram realizados. A matriz foi regenerada passando 80ºC de água quente por 10 min. Depois do processo de regeneração da matriz, novo banho de enzimas fundidas a estreptavidina foi imobilizado sobre as matrizes de polímero funcionalizadas novamente. Este projeto permite que o cartucho de biofiltro seja substituído, regenerado com enzima nova e reinstalado novamente.
[0056] Análise química — Para avaliar a eficiência de conversão, a estabilidade/meia-vida da enzima, os ciclos de regeneração da matriz, a despolimerização da celulose, os perfis de açúcar das celulases fundidas à estreptavidina — modificada por engenharia imobilizaday incluindo endoglucanases, exoglucanases e B-glicosidase são determinados.
[0057] As celulases imobilizadas com as matrizes de suporte (fibras de carbono multiparedes) foram adicionadas a 5% (p/v) de soluções de celulose com 5% da celulose tipo monocristalina 20 SIGMACELL'M preparada em um tampão de acetato de sódio 50 mM (pH = 5,0). Imediatamente após a mistura, as soluções foram agitadas e incubadas a 37ºC por exatamente 120 min (2 horas). Após a incubação, aso soluções foram transferidas em um banho de gelo para interromper a reação. As soluções foram centrifugadas a 3.000 rpm por 10 minutos a 4ºC e os sobrenadantes foram coletados para caracterização e análise dos açúcares.
[0058] A formação dos produtos de açúcar e intermediários incluindo glicose, celobiose, celotriose, celotetraose e celopentaose foi monitorada por um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho Alliance 2695 com espectrômetro de massa quadrupolo triplo Waters ACQUITY'TM TQD (HPLC- MS/MS). Neste processo analítico, 150 uL dos sobrenadantes foram primeiro derivatizados com 100 uL de 0,5 M de 3-metil-1-fenil-S-pirazolona (PMP) preparados em 0,5 N de NaOH. As soluções de derivatização foram aquecidas a 70ºC por 30 min até que a reação fosse completa. A solução derivatizada foi neutralizada com HCl 0,3 N e diluída com 1,65 mL de MeOH. Após o processo de derivatização, os açúcares derivatizados com PMP foram separados e analisados por um HPLC de fase reversa Waters Alliance 2695 equipado com uma coluna C8 Columbus PHENOMENEX'Y à base de sílica (4,6 mm por 150 mm, 5 um; PHENOMENEX'Y, Torrance, CA). A fase móvel inclui: (a) acetato de amônio 100 mM com 0,1% de ácido fórmico e (B) ACN com vazão: 0,8 mL/min. O sistema MS/MS foi operado usando ionização por eletroaspersão (EI) no modo de fon positivo com tensão do capilar de 1,5 kV (ES-). A fonte de ionização foi programada a 150ºC e a temperatura de dessolvatação foi programada a 450ºC. Os fons originais moleculares foram selecionados e os íons do produto usados para as quantificações foram determinados dos espectros obtidos da injeção de 30 uL de uma solução padrão contendo 1.000 ug/L dos padrões analíticos. Os dados analíticos foram processados usando o software Waters Empower (Waters, CA, USA). Os tempos de retenção detalhados e a quantificação dos íons selecionados para cada açúcar foram descritos na Tabela 1 e Figuras 4€ 5. Tabela 1. Os tempos de retenção e os fons de quantificação selecionados para análise de PMP-açúcares por HPLC-MS.
[0059] A expressão de celulases à base de estreptavidina foi realizada nas culturas de E. coli contendo os vetores de expressão e o extrato bruto das culturas foi processado e testado com relação à atividade enzimática da proteína. Os vetores de expressão que contêm ORF de eglIl com estreptavidina fundida seja no N-terminal ou no C-terminal expressaram a atividade enzimática de EGII. Os vetores de expressão sem ORF de eglIl inserido não apresentaram nenhuma atividade enzimática. (Figura 3) A expressão de celulases à base de estreptavidina foi controlada pela indução de IPTG. O extrato bruto da cultura sem indução de IPTG não apresentou nenhuma atividade — enzimática de fB-glicosidase, usando p-nitrofenil B-D- glucopiranosídeo como substrato, em comparação à amostra da cultura induzida por IPTG. (Figura 6). O extrato bruto de várias preparações de cultura foi ajustado para quantidades iguais de proteínas, analisado por eletroforese e transferido para um blot, usando anticorpo monoclonal antiestreptavidina para detectar a presença de proteína fundida por estreptavidina nas amostras. (Figura 7)
[0060] O baixo custo e a facilidade do processo de copolimerização de PEG-PEI rapidamente provê o grupo amina primário (NH) necessário para a seguinte reação de biotinilação. Entre o material de suporte de polímero selecionado usado nestes experimentos, o material de nanocarbono multiparedes biotinilado (MWCNT-G, 5 a 9 um), material de nanocarbono multiparedes (MWCNT-H, 2,5 a 20 um) tem a melhor capacidade de imobilizar a celulase fundida a estreptavidina (B-glicosidase), seguido por agarose biotinilada, material de nanocarbono de parede única (SWCNT 0,7 a 1,3 nm) e material de nanocarbono multiparedes (MWCNT-F, 0,5 a 10 um) (Figura 8). As concentrações de biotina foram confirmadas e quantificadas (Figura 9).
[0061] Os resultados dos experimentos de curso de tempo apresentaram maiores estabilidades enzimáticas quando as celulases foram imobilizadas sobre as matrizes de sílica biotinilada, agarose e carbono (Figuras 11 e 12). As celulases imobilizadas apresentaram maior estabilidade térmica em comparação à enzima livre (Figura 10) e a vida em prateleira das celulases foi aumentada de 4 dias para 8 dias quando elas foram imobilizadas nas matrizes de suporte (Figuras 11 e 12). Como um resultado da melhor estabilidade das enzimas imobilizadas, a produção de açúcares em comparação à enzima livre foi aumentada em torno de 400% a 700% durante um tempo de reação de 70 a 120 horas (Figuras 13, 14 e 22) e foi aumentada ainda mais após períodos maiores de teste (Figura 22).
[0062] As eficácias de conversão foram melhoradas adicionalmente quando os complexos de múltiplas enzimas foram desenvolvidos pelo método aqui. A imobilização tanto da endoglucanase quanto da B-glicosidase fundida à estreptavidina na mesma plataforma melhora a produção de glicose em 133 a 530% em comparação a qualquer enzima imobilizada sozinha (Figura 15).
[0063] As matrizes foram regeneradas com sucesso até 6 vezes (ainda em andamento) com um processo de regeneração térmica simples tratando a matriz com água a 80ºC por 10 min (Figuras 16 e 17). Os resultados sugeriram que os ciclos de regeneração não degradaram significativamente a superfície funcionalizada nas matrizes. Para a matriz de agarose, cerca de 86,17% da enzima recombinante poderia ser anexada à agarose após a primeira rodada de regeneração. A atividade enzimática foi mantida acima de 72% após 2 a 4 ciclos de regeneração e então foi diminuída abaixo de 50% na 6º regeneração (Figura 17). O experimento de regeneração foi interrompido devido à degradação da agarose após a 6º desanexação térmica. Para a matriz de carbono, a maior enzima ligada às partículas de carbono foi 91,5% na 2º rodada. A atividade de enzima ligada foi mantida acima de 50% até seis ciclos de regeneração, semelhante aos resultados com matriz de agarose. A matriz de carbono apresenta alta estabilidade térmica (Figura 18). Exemplo 3 — Conversão do tipo sanguíneo
[0064] Em outro exemplo, esta tecnologia foi usada para a conversão de tipos sanguíneos. O sangue não pode ser fabricado; ele somente pode vir de doadores. A maioria das células vermelhas do sangue dos doadores deve ser usada em 42 dias de coleta ou descartada. O tipo sanguíneo mais frequentemente solicitado é o sangue Tipo O Rh negativo (células vermelhas) que pode ser transferido para pacientes de todos os tipos sanguíneos. O Tipo O está sempre em grande demanda e frequentemente com pouco abastecimento. O sangue Tipo O Rh negativo, o sangue universal, é necessário em emergências para quem precisa de sangue imediatamente antes de seu tipo sanguíneo ser conhecido. Como observado, houve esforços anteriores para produzir o sangue tipo O utilizando processos enzimáticos para clivar o açúcar imunodominante A ou B das células vermelhas do sangue do grupo sanguíneo A ou B. Entretanto, as atuais tecnologias de conversão enzimática frequentemente exigem etapas de centrifugação e lavagem extensivas, antes de alcançar a condição ideal para a conversão enzimática e após remover os resíduos enzimáticos do sangue antes da transfusão para atender a condição de armazenamento de sangue para os protocolos padrão de transfusão. Estes processos antes e pós conversão resultaram em uma preocupação séria que converteu as células vermelhas do sangue (ECO RBC) que seriam danificadas e frágeis. A taxa de sobrevivência de ECO RBC caiu para 70% ou menos após o processo. Ao contrário, o IEC não exigiu as etapas de lavagem e centrifugação extensivas para garantir a finalização da remoção do antígeno que evita a perda das células vermelhas do sangue no processo. O sistema elimina os resíduos de enzima do sangue universal Tipo O convertido, desta forma eliminando completamente o risco da imunorreação.
[0065] O sistema de fluxo contínuo pode compreender enzimas recombinantes — geneticamente — fundidas com uma proteína que especificamente se liga à superfície funcionalizada de um sistema de biofiltro prontamente regenerado. As exoglicosidases imobilizadas recombinantes no sistema, tais como alfa-N- acetilgalactosaminidase ou alfa-galactosidase, removem os resíduos de N-acetilgalactosamina ou galactose, respectivamente, na extremidade não redutora da cadeia precursora de carboidrato e convertem o antígeno A ou B em antígeno H, produzindo assim as células vermelhas do sangue do grupo O. Com o sistema de fluxo contínuo, a produção de células vermelhas do sangue universal enzimaticamente convertidas pode ser garantida sem aplicar enzima em excesso.
[0066] Uma enzima alfa-N-acetilgalactosaminidase — Clostridium perfringens que converte sangue Tipo A Rh negativo ao sangue Tipo O universal foi primeiro identificado em 2000 (Hsieh, H.-Y., er al.. (2000), IUBMB Life, 50: 91-97. DOI 10,1080/713803702). Um gene aagA de Clostridium perfringens que codifica alfa-N-acetilgalactosaminidase foi amplificado por PCR e fundido com o gene da estreptavidina designado. Os fragmentos do gene de fusão foram clonados em pET303, um vetor de expressão T7 comercial adquirido da Invitrogen. O clone foi expresso em hospedeiro de E. coli de BL21(DE3) RIL e induzido por IPTG para a produção de proteína. A proteína de fusão de estreptavidina AagA recombinante foi isolada essencialmente como descrito no Exemplo 2 e aplicada a uma fibra de matriz de carbono funcionalizada com biotina preparada essencialmente como descrito no Exemplo 1 para imobilização. As fibras de carbono usadas nos métodos de derivatização de PEG:PEI foram fibras de grafite de 14” (Parte % 571; Fibre Glast Development Corporation, Brookville, OH).
[0067] Cerca de 5% de suspensão de células vermelhas do sangue tipo A foi preparada em solução CPD e colocada no saco estéril contendo fibras de carbono imobilizadas em AagA. A reação de conversão foi incubada a 25ºC com agitação por 2 horas. A suspensão de células convertidas foi coletada vertendo o saco. Uma subamostra de 1 mL da suspensão de célula convertida foi imunomarcada com anticorpo monoclonal anti-A ou anticorpo anti-H, então conjugado com IgG anticamundongo Alexa 488 e foi enviada para o ensaio de citometria de fluxo. Os resultados mostraram a diminuição do anticorpo anti-A e o aumento do anticorpo anti-H detectado nas células convertidas que forneceram células sanguíneas do tipo A foram convertidas a tipo O por nossa matriz imobilizada de enzima.
[0068] Nosso sistema demonstrou com sucesso a atividade específica da D-N-acetilgalactosaminidase imobilizada determinada quantificando a hidrólise de p-nitrofenol de 4-Nitrofenil N-acetil-a-D-galactosaminida (N4264, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (Figura 20).
Exemplo 4 — Conversão industrial de sangue
[0069] As RBCs do grupo A se submeterão a conversão enzimática usando uma ao-N-acetilgalactosaminidase recombinante de Clostridium perfringens, qualquer de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 10, uma alfa- galactosidase ou uma combinação dos mesmos que são imobilizados na matriz funcionalizada. O processo de conversão enzimática será realizado por técnicas assépticas em um recipiente vedado. O componente RBC será centrifugado para remover o plasma sobrenadante e as RBCs empacotadas serão então ressuspensas em um tampão isotônico de citrato de fosfato- cloreto de sódio (pH 6,5 a 7,0) ou um de soluções conservantes do sangue aprovadas pelo FDA. A preparação de RBC será adicionada no recipiente estéril contendo o IEC. A conversão enzimática será incubada seja a temperatura ambiente ou em ambiente frio. RBCs de ECO serão drenadas do conversor e coletadas em um recipiente estéril. As unidades de RBC convertidas serão armazenadas a 1ºC a 6ºC.
[0070] A remoção do antígeno A ou B será confirmada por imunomarcação com conjugados secundários mAb e Alexa 488 de murino anti-A ou anti-B seguido por citometria de fluxo para determinar a eficácia da conversão enzimática. O procedimento de imunomarcação será realizado no gabinete de biossegurança.
[0071] Em certos casos, espera-se a conversão completa de nosso sistema de fluxo contínuo incorporado por IEC; as suspensões de células vermelhas do sangue serão circuladas através do conversor de sangue enzimático para melhorar a eficácia da conversão em um curto período de tempo. Exemplo 5 — Produção de biodiesel
[0072] Em outro exemplo, um IEC será usado para a produção de Biodieseis. O consumo mundial anual de diesel é aproximadamente 934 milhões de toneladas, das quais o Canadá e os Estados Unidos consomem
2,14 e 19,06%, respectivamente (Marchetti, et al. (2008), Fuel Process. Technol., 89: 740-748. DOI: 10,1016/j.fuproc-2008-01-007). A maioria dos óleos atualmente são feitos de sojas, palma ou semente de colza. O processo enzimático é conhecido por ser uma técnica limpa e ecológica para a produção de biodiesel. Este processo pode simultaneamente converter tanto ácidos graxos livres quanto triglicerídeo em biodiesel. Este IEC permitirá a produção de sistema multienzimas imobilizado com uma ampla gama de lipases, tais como lipases de Rhizopus oryzae, lipases de Candida rugosa e lipases de SEQ ID NO: 19 a SEQ ID NO: 26 ou variantes dos mesmos para facilitar o processo de transesterificação enzimática para a produção de biodiesel.
Exemplo 6 — Produção de especialidades químicas
[0073] Em outro exemplo, o IEC será usado para a produção de especialidades químicas. Desde 2000, mais de 100 diferentes processos biocatalíticos enzimáticos foram implementados em indústrias farmacêutica, química, agrícola e de alimentos. As vantagens deste processo biocatalítico verde sobre os processos químicos tradicionais incluem menor custo, maior pureza do produto e eliminação dos produtos químicos tóxicos no processo de fabricação e resíduo. O processo enzimático também reduz significativamente o número de etapas sintéticas que seriam necessárias para a síntese convencional. Várias classes de enzimas incluindo cetoredutases, transaminases, amina oxidases, mono-oxigenases e acil transferases foram utilizadas para uma ampla gama de conversões químicas comuns no processo de fabricação dos produtos farmacêuticos e especialidades químicas, tais como FTelaprevir (Telavic, INCIVEK'M), Sitagliptiana (JANUVIATY), Simvastatina (Lipovas, ZOCOR'TY), Atazanavir (REYATAZ'Y), Esomeprazole (NEXIUM'!YM), Atorvastatina (LIPITOR'M), Montelukast (SINGULAIR'*M), Boceprevir (VICTRELIS"M) e S-metóxi-isopropilamina. Na indústria de alimentos, as enzimas, tais como isomerases de amiloglicosidase e amilase glicose, foram usadas para produzir xaropes de frutose (adoçantes) de amido de milho. Este IEC será utilizado para produzir os sistemas multienzimas com cetoredutases, transaminases, amina oxidases, mono-oxigenases ou acil transferases imobilizadas para aumentar o rendimento e a pureza e eliminar os produtos químicos tóxicos no processo de produção. Exemplo 7 - Adesivo ou pulverizador de cicatrização de ferida (por exemplo, enzimas proteolíticas)
[0074] Em outro exemplo, o IEC será usado para desenvolver os adesivos ou pulverizadores de cicatrização de ferida utilizando enzimas proteolíticas — produzidas e imobilizadas nas matrizes que foram funcionalizadas essencialmente, como indicado no Exemplo 2. A cicatrização da ferida é um processo fisiológico e multifatorial. Vários caminhos enzimáticos se tornam ativos durante o reparo e ajudam o tecido a cicatrizar. O IEC será usado para expressar e imobilizar as enzimas, peptídeo ou complexo antimicrobiano, tal como complexo GLG-enzima (glicose oxidase combinada com lactoperoxidase) em um adesivo de cicatrização de ferida. O PEG usado no processo salientado aqui é um polímero biocompatível com baixa imunogenicidade. As enzimas imobilizadas usadas no IEC no adesivo de cicatrização de ferida também incluiriam proteases, tal como papaína ou uma colagenase.
[0075] Os estudos anteriores apresentaram que as enzimas proteolíticas, tal como papaína imobilizada em pectina, podem ser usadas para o desenvolvimento do sistema pulverizador em aerossol eficaz para cicatrizar ferida nas áreas de debridamento enzimático do tecido necrótico e liquefação de muda. Este processo ajudará a remover o tecido morto ou contaminado em lesões agudas e crônicas, tais como úlceras diabéticas, úlceras de pressão, úlceras de varicose e feridas infectadas traumáticas, feridas pós-operatórias, queimaduras, carbúnculos e feridas de cisto pilonidal (Jáuregui er al. (2009),
Biotechnology and Bioprocess Engineering. 14: 450-456, DOL 10,1007/s12257-008-0268-0,). O IEC provido aqui pode ser usado para estabilizar as enzimas proteolíticas no pulverizador em aerossol. Exemplo 8 - Sistemas de administração de fármaco (por exemplo, proteínas antimicrobianas: lisozima etc.)
[0076] Em outro exemplo, este sistema IEC será usado para administrar fármacos, tais como proteínas antimicrobianas para várias aplicações práticas. O IEC será usado como plataformas para administrar proteínas, peptídeos ou anticorpos antimicrobianos para processos terapêuticos. Por exemplo, a lisozima demonstrou ter atividade antibacteriana contra os organismos, incluindo Listeria monocytogenes e certas cepas de Clostridium botulinum. As enzimas antimicrobianas imobilizadas como lisozima, lactoferrina ou seus complexos serão usados para, por exemplo, produtos de desinfecção ou embalagem de alimentos (segurança de alimentos). Exemplo 9 — Desenvolvimento de sistema de biocatalisador enzimático magnético
[0077] Em outro exemplo, esta tecnologia de plataforma enzimática será usada para desenvolver um sistema de nanobiocatalisador magnético de baixo custo e recuperável. As vantagens do sistema incluem grande área de superfície, biocompatibilidade, uma superfície modificável e fácil recuperação. O nanobiocatalisador magnético pode ser facilmente recuperado aplicando um campo magnético externo. As enzimas serão fundidas à estreptavidina, como indicado nos Exemplos anteriores.
[0078] As celulases (B-glicosidase) fundidas com estreptavidina foram imobilizadas com sucesso nas nanopartículas magnéticas de fon carbono funcionalizado (Figura 21). O processo de funcionalização envolveu 1) sonicar 2 mg de MWCNTs em 10 mL de solução de tolueno com 0,1% (v/v) oleolamina por 2 horas, 2) lavar os MWCNTs funcionalizados com oleilamina com etanol, 3) dispersar em tolueno e 4) adicionar nanopartículas magnéticas de óxido de ferro e hexano na reação seguido por sonicação branda por 5 mins. Os nanobiocatalisadores magnéticos de fon carbono foram recuperados com sucesso aplicando um campo magnético externo (Figura
21. Exemplo 10 - Sequências de proteínas de enzimas e sequências de DNAs Tabela 2 — Sequências de proteínas e sequência de DNA de SEQ ID NO: SEQID |Peptídeo maduro) Peptídeo maduro de estreptavidina NO: 1 |de estreptavidina| SEQID | ATCC26921 BGLI de Trichoderma reesei QU9414 sem peptídeo sinal: NO:2 SEQID | ATCC26921 EGII de Trichoderma reesei QU9414 sem peptídeo sinal: NO:3 N SEQID | ATCCI0543 Aagà de Clostridium perfringens: NO: 4 SEQID UniProtKB/ | Alfa-D-galactoside galacto-hidrolase de Coffea arabica (café) (sequência NO: 5 Swiss-Prot: madura): Q42656.1 SEQID | GenBank1ID: gene NAGA para alfa-N-acetilgalactosaminidase de Elizabethkingia NO: 6 AMO39444.1 meningoseptica comb. nov. SEQID | GenBankID: | Gene NAGA para alfa-N-acetilgalactosaminidase de Bacteroides fragilis, NO: 7 AMO39447.1 cepa ATCC25285D, clone 2 SEQID | GenBankID: jJGene NAGA para alfa-N-acetilgalactosaminidase de Shewanella oneidensis) NO: 8 AMO39445.1 cepa ATCC70050 SEQID | GenBankID: | Gene NAGA para alfa-N-acetilgalactosaminidase de Tannerella forsythia NO: 9 AMO39448.1 comb. nov., cepa ATCC43037 SEQID | GenBank1ID: |alfa-galactosidase A (sequência parcial) de Bacteroides fragilis, cepa 3397 NO: 10 | EXY33367.1 TIO SEQID JF826525 endoglucanase CelA3 (metagenômica) NO: 11 SEQID JF802029 uma endoglucanase Cel5K (metagenômica) NO: 12 SEQID Gene ID: Endoglucanase de Paenibacillus odorifer (cepa DSM 15391) NO: 13 31573201; NCBI: WP 038572972, 1 SEQID | GenelD: Endoglucanase (proteína hipotética) de Paenibacillus odorifer NO: 14 31571570; NCBI: WP 052097054, 1
SEQ1ID Gene ID: Paenibacillus 1 A-beta-celobiosidase NO: 15 31573200
NCBI |WP 080742725. 1 SEQ ID Gene ID: endo-1 4-beta-xilanase A de Termotoga maritima MSB8 NO: 16 | 896885; NCBLI: NP 227877.1 SEQID Gene ID: proteína tipo alfa-L-arabinofuranosidase A de Bifidobacterium NO: 17 31840121; termophilum RBL67
NCBI |WP 015450743. 1 NO: 18 SEQID | UniProtKB: lipase Rhizopus oryzae (ROL) NO: 19 | BIQ560 RHIO
R SEQID Gene ID: Lipase de Oryza sativa Japonica NO: 20 |4343234; NCBI: XP 015644618. 1 NO: 21 | ACN78942,1 SEQID | UniProtKB: LIPI, Lipase 1 de Diutina rugosa (Candida rugosa) NO: 22 P20261 NO: 23 P32946 NO: 24 P32947 SEQID | UniProtKB: | LIPA4, Lipase 4 de Diutina rugosa (Candida rugosa) NO: 25 P32948 NO: 26 P32949 NO: 27 P72156 SEQID UniProtKB: Hidroxidecloroatrazina etilamino-hidrolase (AtzB) de Pseudomonas sp. NO: 28 P95442 (cepa ADP) SEQID | UniProtKB: N-isopropilamelídeo isopropil amido-hidrolase (AtzC) de Pseudomonas sp. NO: 29 052063 (cepa ADP) SEQID UniProtKB: Amido-hidrolase de ácido cianúrico (AtzD) de Pseudomonas sp. (cepa NO: 30 P58329 ADP) NO: 31 Q936X3 NO: 32 Q936X2 SEQID GenBank PnrA Nitroredutase de Pseudomonas putida NO: 33 Proteína ID: SKB88864.1 SEQID NCBI: B-1,4-endoglucanase (Cel5A) de Termoanaerobacter tengcongensis MB4 NO: 34 |WP 011024808.) (Liang, C., Xue, Y., Fioroni, M. et al. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 1 89: 315. doi:10,1007/s00253-010-2842-6) SEQID NCBI: DNA que codifica a SEQ ID NO:4 B-1,4-endoglucanase (Cel5A) de NO: 35 |WP 011024808. |Termoanaerobacter tengcongensis MB4 (Liang, C., Xue, Y., Fioroni, M. er 1 al. Appl Microbiol Biotechnol (2011) 89: 315. doi:10,1007/s00253-010- 2842-6)
[0079] A abrangência e escopo da presente divulgação não deveriam ser limitados por nenhuma das modalidades exemplares descritas anteriormente, mas deveriam ser definidos somente de acordo com as seguintes reivindicações e seus equivalentes.
1. Shen-Long, T. Park, and W. Chen, Size-modulated synergy of cellulase clustering for enhanced cellulose hydrolysis. Biotechnol. J., 2013. 8: p. 257-
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2. Oswald, PR., et al., Properties of a thermostable fb-glucosidase immobilized using tris(hydroxymethyl)phosphine as a highly effective coupling agent. . Enzyme and Microbial Technology, 1998. 23: p. 14-19.
3. Cochrane, F.C., H.H. Petach, and W. Henderson, Application of tris(hydroxymethyl)phosphine as a coupling agent for alcohol dehydrogenase immobilization. Enzyme and Microbial Technology, 1996. 18: p. 373-378.
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Claims (5)
1. Complexo de enzima imobilizada (IEC), caracterizado pelo fato de que compreende uma matriz termicamente estável que é covalentemente afixada a uma molécula de biotina ou análogo da mesma com uma molécula ligante e uma proteína de fusão compreendendo um domínio de enzima e um domínio de ligação de biotina (BBD), em que o domínio de ligação de biotina é ligado não covalentemente à molécula de biotina ou análogo da mesma.
2. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita matriz termicamente estável compreende fibra de carbono, poliestireno, ácido polilático, poliuretano, sílica, náilon, ou polipropileno.
3. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita matriz termicamente estável é selecionada do grupo que consiste de fibra de carbono, poliestireno, ácido polilático, poliuretano, sílica, náilon e polipropileno.
4. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz termicamente estável é pelo menos parcialmente revestida com uma mistura de polietileno glicol (PEG) e polietilenoimina (PEL).
5. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula ligante é afixada a moléculas de polietilenoimina (PEI) revestindo a matriz.
6. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita matriz termicamente estável não compreende uma partícula magnética.
7. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito análogo de biotina compreende destiobiotina, 2'-iminobiotina, biotina sulfona, bisnorbiotina,
tetranorbiotina, oxibiotina, qualquer derivado das mesmas, ou qualquer derivado de biotina que pode ser ligado pelo BBD.
8. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a dita molécula ligante compreende um alcano, um grupo alquila, uma amida, ou combinação dos mesmos.
9. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima é selecionado do grupo que consiste de um hidrolase, cetorredutase, transaminase, amina oxidase, mono-oxigenase, e um domínio acil transferase.
10. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima é fundido tanto no N-término do BBD quanto no C-término do BBD.
11. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima é fundido no BBD com um adaptador de peptídeo.
12. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima é um domínio de hidrolase de glicosídeo.
13. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a hidrolase de glicosídeo é uma alfa-N-acetilgalactosaminidase, alfa-galactosidase, beta-glicosidase, uma celulase, uma endoglucanase, ou uma exoglucanase.
14. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas proteínas de fusão são imobilizadas na matriz.
15. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as proteínas de fusão compreendem um domínio de enzima que são cada uma independentemente selecionadas do grupo que consiste de um Dbeta-glicosidase, uma endoglucanase, e uma exoglucanase.
16. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domínio de enzima compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com uma beta-glicosidase (SEQ ID NO: 2), uma endoglucanase (SEQ ID NO: 3), uma alfa N-acetilgalactosaminidase (SEQ ID NO: 4), uma alfa- galactosidase (SEQ ID NO: 5), SEQ ID NO: 6-33, ou SEQ ID NO: 34.
17. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o BBD compreende um BBD de avidina, BBD de estreptavidina, BBD de tamavidina, BBD de zebavidina, BBD de bradavidina, BBD de rizavidina, BBD de shwanavidina, BBD de xenavidina, uma quimera dos mesmos, ou derivado dos mesmos tendo uma ou mais inserções, deleções, ou substituições de resíduo de aminoácido.
18. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o IEC ou matriz é biocompatível.
19. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima tem atividade proteolítica.
20. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima compreende um domínio de cetorredutase, transaminase, amina oxidase, mono-oxigenase, ou acil transferase.
21. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima: (1) reduz RDX (hexa-hidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina); (11) reduz 2,4,6-trinitrotolueno (TNT); (ii) reduz cromo 6+ a cromo 3+; ou (iv) tem atividade de 2,2',3-tri- hidroxibifenil dioxigenase.
22. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o IEC é contido em um encerramento que é permeável a um substrato e um produto de atividade do domínio de enzima de (1), (ii), (li), ou (iv), e compreendo domínio de enzima de (1), (11), (111), ou (lv), respectivamente.
23. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a matriz é fibra de carbono.
24. Complexo de enzima imobilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que é contido em um sistema de biorreator ou em um encerramento que é permeável a um substrato e um produto do domínio de conversão catalisada por enzima do substrato.
25. Complexo de enzima imobilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que é adaptado para aplicação a um sujeito ou objeto que necessita do mesmo.
26. Aparelho biorreator compreendendo o complexo de enzima imobilizada (IEC) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que é configurado para passagem de um líquido compreendendo o substrato através do IEC.
27. Aparelho biorreator de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que é configurado para fluxo contínuo do dito líquido através do IEC.
28. Biorreator de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que é configurado para recirculação do líquido através do IEC.
29. Método para conversão enzimática de um substrato a um produto desejado, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de expor o substrato ao complexo de enzima imobilizada como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25 em condições onde o substrato é convertido ao produto desejado por exposição ao complexo de enzima imobilizada.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de recuperar o produto.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente; (i) remover as proteínas de fusão ligadas não covalentemente da matriz após conversão do substrato a um produto desejado; e (ii) ligar proteínas de fusão à matriz.
32. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende celulose e em que o domínio de enzimas de pelo menos uma proteína de fusão é selecionado do grupo que consiste de uma f-glicosidase, uma endoglucanase, e um domínio de exoglucanase.
33. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende células de sangue total ou sangue vermelho e em que o domínio de enzima de pelo menos uma proteína de fusão é selecionado do grupo que consiste de um o-N- acetilgalactosaminidase, a-galactosidase, ou uma combinação dos mesmos.
34. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima: (1) reduz RDX (hexa-hidro-1,3,5- trinitro-1,3,5-triazina); (11) reduz 2,4,6-trinitrotolueno (TNT); (ii) reduz cromo 6+ a cromo 3+; (iv) tem atividade de 2,2',3-tri-hidroxibifenil dioxigenase; ou (v) tem enzimática atividade de SEQ NO: 27, SEQ NO: 28, SEQ NO: 29, SEQ NO: 30, SEQ NO: 31, SEQ NO: 32, ou SEQ NO: 33.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o IEC é contido em um encerramento que é permeável a um substrato e produto do domínio de enzima de (1), (11), (li), (Iv), ou (Y) e compreendo domínio de enzima de (1), (ii), (111), (iv), ou (v), respectivamente.
36. Método para produzir um complexo de enzima imobilizada, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) afixar covalentemente biotina ou um análogo da mesma que compreende adicionalmente uma molécula ligante a uma matriz termicamente estável selecionada do grupo que consiste de uma fibra de carbono, ácido polilático, poliuretano, poliestireno, sílica, náilon, e polipropileno reagindo a dita matriz com polietileno glicol (PEG) e polietilenoimina (PEL) a uma razão de 1 parte de PEG para 1,25 parte de PEI para | parte de PEG para 3,5 partes de PEI em peso e reagindo a matriz tratada com PEG/PEI com um éster N-hidróxi- succinimida de biotina ou um análogo de biotina para obter uma matriz funcionalizada; (b) remover qualquer PEI, PEG não reagido, e ésteres de biotina ou o análogo de biotina da dita matriz funcionalizada; e, (c) afixar não covalentemente pelo menos uma proteína de fusão compreendendo um domínio de enzima e um domínio de ligação de biotina (BBD) a uma biotina ou análogo de biotina que é covalentemente afixada à matriz funcionalizada por meio de uma molécula ligante.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente; (i) remover as proteínas de fusão ligadas não covalentemente da matriz após conversão do substrato a um produto desejado pela proteína de fusão afixada; e (11) ligar uma proteína de fusão à matriz.
38. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima de pelo menos uma proteína de fusão é selecionado do grupo que consiste de um a-N-acetilgalactosaminidase, ou a- galactosidase, ou qualquer combinação das mesmas.
39. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a enzima é selecionada do grupo que consiste de uma hidrolase, cetorredutase, transaminase, amina oxidase, mono-oxigenase, e um acil transferase.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o domínio de cetorredutase, transaminase, amina oxidase,
mono-oxigenase, ou acil transferase tem um composto precursor de telaprevir, composto precursor de sitagliptina, ou composto precursor de sinvastatina como um substrato.
41. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o dito análogo de biotina compreende destiobiotina, 2º- iminobiotina, biotina sulfona, bisnorbiotina, tetranorbiotina, oxibiotina, qualquer derivado das mesmas, ou qualquer derivado de biotina que pode ser ligado pelo BBD.
42. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a dita molécula ligante compreende pelo menos um grupo alquila C2 a C6 e pelo menos um grupo amida.
43. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a dita razão de PEG para PEI é 1 parte de PEG para 1,5 parte de PEI a 1 parte de PEG para 2,5 partes de PEI em peso.
44. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima de pelo menos uma proteína de fusão é selecionado do grupo que consiste de uma beta-glicosidase, uma endoglucanase, e um domínio de exoglucanase.
45. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a hidrolase é uma hidrolase de glicosídeo selecionada do grupo que consiste de um a-N-acetilgalactosaminidase, a-galactosidase, B- glicosidase, uma celulase, uma endoglucanase, e uma exoglucanase.
46. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima tem atividade proteolítica.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima com atividade proteolítica é atividade colagenase.
48. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o domínio de enzima: (1) reduz RDX (hexa-hidro-1,3,5-
trinitro-1,3,5-triazina); (11) reduz 2,4,6-trinitrotolueno (TNT); (li) reduz cromo 6+ a cromo 3+; (iv) tem atividade de 2,2',3-tri-hidroxibifenil dioxigenase; ou (v) degrada atrazina e compreende um domínio de enzima de SEQ NO: 27, SEQ NO: 28, SEQ NO: 29, SEQ NO: 30, SEQ NO: 31, SEQ NO: 32, ou SEQ NO: 33.
49. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas proteínas de fusão são imobilizadas na matriz.
50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas proteínas de fusão compreendem um domínio de enzima que são cada um independentemente selecionado do grupo que consiste de um beta-glicosidase, uma endoglucanase, e uma exoglucanase.
51. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que pelo menos um domínio de enzima compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com uma beta-glicosidase de SEQ ID NO: 2, uma endoglucanase de SEQ ID NO: 3, uma alfa N-acetilgalactosaminidase de SEQ ID NO: 4, uma alfa-galactosidase de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6-33, ou SEQ ID NO: 34.
52. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o BBD compreende um BBD de avidina, BBD de estreptavidina, BBD de tamavidina, BBD de zebavidina, BBD de bradavidina, BBD de rizavidina, BBD de shwanavidina, BBD de xenavidina, uma quimera dos mesmos, ou derivado dos mesmos tendo uma ou mais inserções, deleções, ou substituições de resíduo de aminoácido.
53. Complexo de enzima imobilizada, caracterizado pelo fato de que é produzido pelos métodos como definido em qualquer uma das reivindicações 36 a 52.
54. Complexo de enzima imobilizada de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o IEC compreende um emplastro de cicatrização de ferida e em que o domínio de enzima domínio de enzima tem atividade proteolítica.
55. Complexo de enzima imobilizada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, 14, 17, 18 ou 25, caracterizado pelo fato de que o IEC compreende um emplastro de cicatrização de ferida e o domínio de enzima tem atividade proteolítica.
56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizado pelo fato de que o substrato é uma ferida, e em que o IEC compreende um emplastro de cicatrização de ferida, e o domínio de enzima tem atividade proteolítica.
57. Biorreator, caracterizado pelo fato de que compreende: um complexo de enzima imobilizada (IEC) que compreende uma ou mais proteínas de fusão imobilizadas ligadas a matrizes de fibra de carbono biotiniladas funcionalizadas para formar uma plataforma regenerativa termicamente —* estável “para enzimas recombinantes geneticamente modificadas, geneticamente fundidas tanto em um recipiente vedado quanto em um sistema de fluxo contínuo.
58. Biorreator de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que inclui: uma enzima compreendendo pelo menos uma porção de estreptavidina.
59. Biorreator de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que as matrizes biotiniladas compreendem polipropileno, propileno, ou análogo dos mesmos.
60. Biorreator de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que as enzimas recombinantes geneticamente modificadas que são expressas por quadro aberto de leitura (ORF) que codifica enzima clonado em um quadro de leitura aberto que codifica o Domínio de Ligação de Biotina (BBD) construído em vetor de expressão de proteína (pETstra) regulado por um sistema de expressão T7.
61. Biorreator de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que as enzimas recombinantes geneticamente modificadas são configuradas como enzimas fundidas a estreptavidina, antígenos, anticorpos, ou peptídeos, e que são expressas por um sistema de expressão de proteína e afixadas a uma superfície funcionalizada.
62. Biorreator de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a superfície funcionalizada é um andaime biocompatível.
63. Biorreator de acordo com a reivindicação 60 ou 61, caracterizado pelo fato de que é configurado como um sistema de reator multienzimático de fluxo contínuo.
64. Biorreator de acordo com a reivindicação 60 ou 61, caracterizado pelo fato de que o biorreator compreende adicionalmente um dispositivo biocatalítico configurado para produzir um ou mais agentes terapêuticos.
65. Biorreator de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente IEC que uma ou mais proteínas de fusão imobilizadas ligadas às matrizes de fibra de carbono biotiniladas funcionalizadas para formar uma plataforma regenerativa termicamente estável "para enzimas recombinantes geneticamente modificadas, geneticamente fundidas tanto em um recipiente vedado quanto em um sistema de fluxo contínuo.
66. Método para usar um biorreator, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas para métodos de regeneração de Complexos de Enzima Imobilizada após a recirculação de um líquido através de um Complexo de Enzima Imobilizada.
67. Método de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente as etapas para: expor o substrato ao IEC em condições, recuperar um produto desejado enzimaticamente convertido de um substrato, remover uma ou mais proteínas de fusão ligadas não covalentemente de uma matriz após conversão do substrato ao produto desejado, e ligar proteínas de fusão à matriz.
68. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais etapas para configurar um biofiltro para maximizar a área superficial exposta a enzimas recombinantes geneticamente modificadas para formar o complexo de enzima imobilizada em que o substrato é convertido ao produto desejado.
69. Sistema de biorreator multienzimático de fluxo contínuo, caracterizado pelo fato de que compreende: uma ou mais enzimas recombinantes geneticamente modificadas, geneticamente fundidas com adaptadores de estreptavidina, específicas para um sistema de biofiltro regenerado tendo uma ou mais plataformas funcionalizadas incluindo um revestimento selecionado de um grupo que consiste de carbono, agarose, poliestireno, polipropileno, poliuretano, sílica, e náilon.
70. Sistema de biorreator multienzimático de fluxo contínuo de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o sistema de biorreator inclui um ou mais Complexos de Enzima Imobilizada e o biofiltro para formar IEC é termicamente estável.
71. Complexo de enzima imobilizada (IEC), caracterizado pelo fato de que compreende: um ou mais materiais funcionalizados regenerados, e pelo menos uma enzima imobilizada expressa por quadro aberto de leitura (ORF) que codifica enzima clonado em um quadro aberto de leitura (ORF) que codifica Domínio de Ligação de Biotina (BBD) construído em vetor de expressão de proteína (pETstra) regulado por um sistema de expressão T7.
72. Complexo de enzima imobilizada (IEC) de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a enzima fundida em BBD é uma enzima fundida em estreptavidina.
73. IEC de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a enzima fundida em estreptavidina é selecionada do grupo que consiste de endoglucanases, exoglucanases, e B-glicosidase.
74. Complexo de enzima imobilizada (IEC) de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que as enzimas fundidas em BBD são imobilizadas em uma plataforma biotinilada em uma razão de cerca de 1:5.
75. Complexo de enzima imobilizada (IEC) de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que é em fibras de carbono de múltiplas paredes biotiniladas.
76. Complexo de enzima imobilizada (IEC) de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que as enzimas fundidas a estreptavidina são imobilizadas em uma plataforma biotinilada em uma razão para permitir que ligação de estreptavidina-biotina ocorra em uma interação não covalente suficiente para eliminar purificação de enzima.
77. Complexo de enzima imobilizada (IEC) de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que um ou mais materiais funcionalizados regenerados são associados com uma batelada fresca de enzimas fundidas a estreptavidina.
78. Complexo de enzima imobilizada (IEC) de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que um cassete genético que é projetado para guiar bactéria E. coli na produção de uma enzima recombinante com um BBD geneticamente fundido que é afixada a um cartucho de biofiltro.
79. Complexo de enzima imobilizada (IEC) de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que o cartucho de biofiltro é configurável para ficar de conformidade com a vazão em um sistema de biorreator correspondente.
80. Complexo de enzima imobilizada (IEC) de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que é configurado para formar uma plataforma de múltiplas enzimas para imobilizar cetorredutases, transaminases, amina oxidases, mono-oxigenases ou acil transferases.
81. Sistema de biorreator, caracterizado pelo fato de que compreende: um sistema de expressão de enzima tendo uma ou mais enzimas fundidas em BBD imobilizadas em pelo menos um meio de suporte em malha biotinilada, um biofiltro, que é rapidamente regenerado para produzir uma plataforma de polímero funcionalizada, em que o biofiltro é imobilizado com celulases tolerantes a líquido iônico.
82. Sistema de biorreator de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o biofiltro compreende adicionalmente celulose solúvel extraída de carga de alimentação de biomassa e um processo de pré- tratamento de líquido iônico hidrolisado por uma ou mais enzimas recombinantes termofílicas marcadas com BBDs.
83. Sistema de biorreator com o biofiltro imobilizado com celulases tolerantes a líquido iônico de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que é adicionalmente configurado em que uma ou mais enzimas recombinantes termofílicas são selecionadas do grupo que consiste de endoglucanases, exoglucanases, B-glicosidases de Trichoderma reesei, B-glicosidases de Aspergillus spp., endoglucanase termofílica, Cel5A Tma de Thermotoga maritima, f- 1,4- endoglucanase (Cel5A) de Thermoanaerobacter - tengcongensisº MB4, endoglucanase e 1,4-B- cellobiosidase de Paenibacillus spp..
84. Sistema de biorreator com o biofiltro imobilizado com celulases tolerantes a líquido iônico de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que é configurado adicionalmente para converter simultaneamente ácidos graxos livres e triglicerídeo em biodiesel, tendo um sistema de expressão de enzima imobilizado com uma ou mais lipases para facilitar transesterificação enzimática.
85. Sistema de biorreator com o biofiltro imobilizado com celulases tolerantes a líquido iônico de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um meio de suporte em malha biotinilada e um filtro para hidrolisar uma celulose solúvel extraída de uma carga de alimentação de biomassa.
86. Sistema de biorreator com o biofiltro de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que é configurado adicionalmente como um sistema de múltiplas enzimas que é imobilizado com uma ou mais lipases para facilitar o processo de transesterificação enzimática para converter simultaneamente ácidos graxos livres e triglicerídeo em biodiesel, e em que as lipases são selecionadas de um grupo que consiste de uma lipase Rhizopus oryzae, lipase Candida rugosa, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, e SEQ ID NO: 26.
87. Aparelho de conversão de grupo sanguíneo de fluxo contínuo, caracterizado pelo fato de que compreende: um IEC com uma ou mais enzimas recombinantes geneticamente modificadas geneticamente fundidas, em que as enzimas recombinantes geneticamente fundidas são associadas com uma proteína que liga especificamente uma superfície funcionalizada de um cartucho de biofiltro configurável, e uma bomba para controlar vazões que permitem maximização de rendimento de conversão de sangue.
88. Aparelho de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma plataforma para distribuir proteínas antimicrobianas, peptídeos, ou anticorpos para uso terapêuticos em que uma ou mais enzimas recombinantes são enzimas antimicrobianas imobilizadas.
89. Aparelho de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que as enzimas antimicrobianas imobilizadas são selecionadas do grupo que consiste de lactoferrina, complexo de lactoferrina, ou lisozima, e em que as enzimas antimicrobianas têm atividade antibacteriana contra pelo menos um dos subtipos Listeria monocytogenes e Clostridium botulinum.
90. Aparelho de reator de múltiplas enzimas de distribuição de fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende: uma ou mais proteínas de fusão imobilizadas incluindo estreptavidina, ligadas a matrizes de material de nanotubo biotinilado funcionalizado para formar uma plataforma regenerativa termicamente estável para produzir um ou mais ciclos de enzimas recombinantes geneticamente modificadas geneticamente fundidas, em uma plataforma comum.
91. Aparelho de reator de múltiplas enzimas de distribuição de fármaco de fluxo contínuo de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que enzimas fundidas a estreptavidina, antígenos, anticorpos, ou peptídeos são expressas por um sistema de expressão de proteína e ligadas a uma superfície funcionalizada selecionada de um grupo que consiste de múltiplas paredes de carbono e polipropileno, e em que a superfície funcionalizada é um andaime biocompatível.
92. Aparelho de reator de múltiplas enzimas de distribuição de fármaco de fluxo contínuo de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o biorreator compreende adicionalmente um dispositivo biocatalítico — configurado — para formar um sistema — magnético nanobiocatalíetico que é recuperado aplicando um campo magnético externo.
93. Aparelho de reator de múltiplas enzimas de distribuição de fármaco de fluxo contínuo de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que uma ou mais celulases expressas são fundidas com estreptavidina e imobilizadas em nanopartículas de carbono-íon magnéticas funcionalizadas.
94. Sistema para cicatrização de ferida, caracterizado pelo fato de que compreende: um IEC para conjugação de enzimas biorreativas contendo uma enzima antimicrobiana, peptídeo, ou complexo de enzima em um emplastro de cicatrização de ferida.
95. Sistema para cicatrização de ferida de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que a enzima recombinante, peptídeo ou complexo são geneticamente fundidos com uma proteína que é especificamente ligada a uma superfície funcionalizada de um cartucho de biofiltro, em que o cartucho de biofiltro é configurado para formar um emplastro afixável.
96. Sistema para cicatrização de ferida de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o complexo de enzima recombinante é uma glicose oxidase combinada com lactoperoxidase (GLG- complexo de enzima).
E
E = W
PET o " | Si a Ei
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A EEN — E E) e Ss É : e | Ss u Ss: ss = sd Oo Eq 8 X VA 8 Do ss AM: A os fc ne fo = S EB: 88 FS oi E 2 D oa Es =
Enzimas fundidas à estreptavidina À Meios de suporte de malha EFE AAÂ biotinilada (podem ser Es EEE rapidamente regenerados) iUvd [1 EN 7 | y |] 7 Es fe Y
EEE l Matéria-prima dissolvida em produtos químicos iônicos Il. Extração de lignin (como fonte da energia térmica para acionar o sistema) Ill. — Celulose dissolvida W. Biofiltro imobilizado com celulases tolerantes à IL V Coleta de açúcar Figura 2
1 Ensaio da atividade de EGI|
0.9 O NTEGI| 08 “O CTEGI
0.7 —r- pNTstra 06 —€ pSstraCT Bos| pera Ss 04 03
0.2 01 0 91 0.2 04 06 0.8 12
1.2 Proteína (mg) Figura 3
H
O OH
H
O OH o
OH
HQ
O OH o
OH
HO OH OH OH OH
O OH o o o o 0 - OH Ho D O > Ow oOD)D OH
O O D D D D o Ho OH Ho OH HO OH HO O
2. Celotetaose OH qo
1. Celopentaose < Ç < o o o HO >: orm> o> OH
D D D
HO OH HO OH HO OH Ho 3. Celotriose
HO 0 OH
HO OH 0 0 0 OH OH
OH
OH OH OH 5. Glicose 4, Celobiose
' HOHXC O AN Ho MA HOH3C / Ho CH
HO OH OH HO HC: Ha Peso molecular: 164.16 OH CH3
À o NÓ 7 0 Nx. Peso molecular: 510.54 / mz: 510.21 (100.0%), 511.21 (29.6%), 512.22 (5.4%) CH3 Peso molecular: 174.20 Figura SA si s Ss! si s <M
SR Ss 8 s € sã = ..« ". à. 8 Ss s < As = > = 3 2 8 gs : = A. Tm 8 2 s 3 So = X =
S s |! 8 = s z s 38 = o Ps. Ss Ss oO CO 2. ss: T2:5 mM ss o secE3ã g2:3 o ss 8 Fe E > s ss Ss OD es > u 2)
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ÕÔ s o o ã& sx SS € = Ss = = s e co e o o O O O O o O e eeesvsveeeese x x x x k XxX XxX & A é é 3 ÀS ÃA É anpPNISUAUI
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AZ 2 8 QN e = 8 O = = Ss Ss CL raoy
Figura 7
Lo 1% 1 2 3 é 2 2 455 = = Es Co o%& : : ; 4 à à é à 4 ft £ o 1d Ati É | Podo o S bo 1 à à ár () = 3 = E 0 dd ad: õ 2 é bodoio doi ii || esmsespsemoo à 5 i 1 1 éitlii13 === o == o S & dd; 4 da; [ q ousimaltod Pi boiioii ii | oevenena e à dd $$ à = 2 S : x 3 i : : 3 : s o 8 da a a: 5 ss 2 é iodo io [| vovensoa — FF 5 E ao oo A o ! D 2 (OD Po to DMR 9/1 LR in 2 o
SP SPSPSPS (uruquy/n) og sp apepiany
Ensaio de detecção de biotina em plataformas 900 800 700 — 600 = =D 500 o = 400 2 MO 30% —— DA AAA =i——— 200 - os o agarose SWCNT** MWCNT-F MWECNT-G** — MWCNT-H Figura 9 o T T T i T e fosses Qyneçisdtsenacmana faia) E X io À i i Ss ó [oca aaa fo o Quim fm BS o E ij Po Í Í Z Ss = ss i A i i E 3 DO TB festa drrtrnêrntennnnnn derreta ronfmimeiemamemíent$[;—-— E = E RR Í Es i i Í 2 iL O = i bs i i i E õ à: Í io F e == == = 2º = ãs3 ãs às ES 3 Ss ES 3 s = s 3 s s 8 SR = = BONEeWIZUS Apepiany
S : i i i Í :
KR i i i i i Ss Í i Í Í Í i 2 i i i i i i F —- 2 Í Í Í Í Í i x fe i i i i i i o o 2 Í j > E i i o o j i ic o i i T E Tr T E u = ? Po e es < es s e e e s s s s s s s s s Ss 3 s s & Ex
(%) Bonewizua apepiany
= É AS E = a ol Doe Ss LA ——————— o = o Po TIRA fe - e NR] dd 1 1 F N tt à É Cc $ é 8 & 4 3 3 ml E E ii Dj à | ii & à 2 2 2 222 R
EFSFFEFSFENRNES gFsSsSsRFSESS eBonegwIZzuUa apepiany
Produção de glicose —- Glicose conj Conj. vs. celulase livre CO6151 O Glicose livre
450.0 & 100.0 |. ZE
0.0 0 10 20 30 40 50 Tempo de reação (horas) Produção de glicose —- Glicose conj Conj. vs. celulase livre CO6151 O Glicose livre 4500 : z 100.0 + mim om mom emma .........
0.0 0 10 2 30 4 50 60 TO Tempo de reação (horas) Figura 13
Celobiose —O- EGll imobilizado --O- EGII livre 6000% : ; ! w 4000% fomnecsereemereereeemrsenseecerceeee———A focereneemeedoeeeeee————— & i ; Í E 2000% oc vir ee e— 1000% |---, sm mm do mg menme—— grama o/ CE i i i é 0 50 100 150 200 Tempo (h) Celotriose —O— EGll imobilizado --0- EGII livre 4000% 7 7 7 s :Í i i Ss 2500% orem eemen— mm mm 2 2000% [im a E orem emma = 1500% — free] 3 1000% Fcis, Free meme deem 500% |--, QUAD: Mr ta O oe i i i o E) 100 150 20 Tempo (h) Figura 14
35 Ã
30 ii E 25 o 2 w 20 o DP) 25s
10 o
EGII EGIIH+bGL1 bGL1 Combinação de enzima Figura 15
= 2º = = es 2º R º = 3 E Ss ” &ã ES 8 8 =) ep '& ow Ss + - - - = Ss = o Í Í Í Í i | — Ss ms i i i i i e O [2 Es) w UU = =2 = ke Ez Ss SF OS o oO = <S Rg = o ; 3 TF H Tt Po u o : + : : : o S j j i i i ú s i i i : H o > & É E | g E Rg
E N i i : : i s i i i i i = RR ss =| — x E RE E RE E RR 3 3 3 à3 à às 3S ss 3 SS R Bonêwizua apepiany o e = gs to o Sõ a e nn 3 = s s Po : : : : : : : : ; >= : : i i : : : : : E o qo o = 8 oO o oi nº | = O 3 Ss = — S Ss. i FA i i FS i i o EE ; à: dd 4 é 4 é ii E 8 a ão fl o — o uu À : S SW oO = 2 il8% 5 o 2 & Po po Pp É o i i i i i i i i i & a i i H à i i i À i E = o = = e : eco oa Ss ss ba ec ococoooooooo sssetetssgfçsasãss (%) Bongwizua apepiany
Reusabilidade das enzimas; recuperação/reutilização ou (ensaio de phNPG de SWCNT ligado à BGL1)
3 01 = 800 t-- fossa AA A. [ssstiemento pp” 2
0
SWCNT-IR = SWCNT2R — SWCNT-3R —SWCNTAR — SWCNT-SR Figura 18
= o mm (11) (12) (14) PEG;PEI Figura 19
Ensaio de Enzima Cinética XD 80 E o 37 ——2.5mM pNP-NAG q 60 É 50 —— 1mM pNP-NAG cs W 30 8 S 20 = 10 < o o 2 4 6 8 Proteína (mg) Figura 20
BGL1 imobilizada em carbono-ferro É UU Osmar O 006 01 01 02 02% 03 038 04 04 =O- com enzima =O- sem enzima Figura 21
Ensaios de cursos de tempo de enzima BGL1 ligada ao CT 3 2 O Enzima ligada ao CF = O Enzima livre = 0 mA [A [A] E 0 2 4 8 10º Tempo (Dia) Figura 22
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