CN117017938A - 一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台及其制备方法和应用。多功能纳米平台为BPNpro，BPNpro为DSPE‑PEG2000‑DPCP/DPPC@BP。本发明开发了一种多功能BPNpro纳米剂来阻断肿瘤细胞中多种铁死亡防御蛋白的活性，用于强有力的铁死亡治疗。

Description

一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗癌药物技术领域，具体涉及到一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台及其制备方法和应用。
背景技术
铁死亡旨在诱导细胞过度脂质过氧化(LPO)，已被证明是抑制多种恶性肿瘤的关键机制。与传统的抗癌策略相比，细胞内氧化应激和随后的膜损伤使铁死亡能够克服多重耐药(MDR)并更有效地对抗癌症。许多基于芬顿反应攻击膜磷脂的金属离子铁死亡纳米疗法已经得到蓬勃发展。为了在临床前环境中提高实体瘤的根除程度，已经探索了将化疗、免疫疗法、光动力和光热疗法与铁死亡疗法相结合的联合治疗策略。例如，当前已经存在的负载Pt(IV)前药和铜锰氧化物的白蛋白纳米颗粒，用于结合铁死亡治疗和化疗。此外，还存在外泌体抑制剂GW4869和铁离子被封装在半导体聚合物中，形成金属-酚网络，用于协同免疫-铁死亡癌症治疗。然而，重金属离子的低生物安全性阻碍了它们的实际应用。此外，Nature已报道癌细胞可通过高效的铁死亡防御机制来对抗铁死亡。这些机制严重限制了这些铁死亡治疗的效果。
具体而言，细胞依赖于几种关键的防御途径/蛋白质来对抗铁死亡：例如，铁死亡抑制蛋白1(FSP1)通过从泛醌产生泛醇(CoQH2)来抑制脂质过氧化。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)利用谷胱甘肽(GSH)对脂质氢过氧化物进行解毒。此外，值得注意的是，最近发现二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)使用CoQH2可以有效抑制脂质过氧自由基。针对这些蛋白质的铁死亡疗法显示出巨大的潜力。过去几年有报道称，利用GPX4或FSP1抑制剂对抗癌症。但DHODH的使用很少被报道。此外，由于细胞依赖几种机制/蛋白质来对抗铁死亡，其中一种的抑制很可能会通过大量依赖另一种来补偿。据我们所知，还没有报道利用对两种关键的铁死亡防御蛋白的抑制来有效治疗癌症。在这里，我们报道了两种防御蛋白，即GPX4和DHODH的协同抑制作用，以诱导强烈的铁死亡和癌细胞死亡。
蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)技术由于其能够通过泛素化途径有效诱导蛋白质的翻译后敲除而引起了相当大的关注。PROTAC包含一个靶向E3泛素连接酶的单元和另一个用于结合靶蛋白的单元。从机制上讲，PROTAC通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)泛素化并降解靶蛋白。PROTAC随后被释放并进入下一个蛋白质降解循环。因此，与传统的小分子抑制剂、单克隆抗体和核酸相比，PROTAC具有较高的治疗效率和较低的给药剂量。到目前为止，已经报道了许多基于PROTAC蛋白降解的抗癌策略。然而，PROTAC很少被报道用于铁死亡防御蛋白的降解。
当前本领域已经意识到一些Bodipy衍生物具有良好的光热效应，可以用于药物的控制释放，Bodipy和小分子药物的结合在成像辅助的癌症治疗中越来越受欢迎。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台，其包括：多功能纳米平台为BPNpro，所述BPNpro为DSPE-PEG2000-DPCP/DPPC@BP。
本发明的另一个目的是提供一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法。
为解决上述问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法，其包括如下步骤：制备蛋白水解靶向嵌合体多肽即DPCP：制备组织蛋白酶B即CatB可裂解的DPCP；
制备DSPE-PEG2000-DPCP共聚物：将DPCP和DSPE-PEG2000-NH2进行酰胺缩合反应，得到DSPE-PEG2000-DPCP共聚物；
制备BPNpro：将氟硼二吡咯即BP探针、DSPE-PEG2000-DPCP和DPPC混合并纳米沉淀，以获得BPNpro。
作为本发明所述用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法的一种优选方案，其中：制备BPNpro中，BP、DSPE-PEG2000-DPCP和DPPC以1:20:100的质量比混合并纳米沉淀。
作为本发明所述用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法的一种优选方案，其中：BP为BTPA即BP的前体探针和化合物2混合后制得，化合物2为5-甲基-4-硝基-3-异恶唑羧酸加入冰浴冷却的无水二氯甲烷中，随后，逐滴加入草酰氯并加入1滴N,N-二甲基甲酰胺，将冰浴撤去使反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，通过室温水浴旋转蒸发溶剂以得到酰氯中间体，将其立即滴入冰浴冷却的无水二氯甲烷中，最后，将三乙胺和11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺在无水二氯甲烷中形成的混合物逐滴加入酰氯溶液中，并使反应混合物在室温下搅拌2小时，在减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚按照1:3的体积比混合作为洗脱剂进行纯化以得到化合物2。
作为本发明所述用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法的一种优选方案，其中：BP的制备中，原料包括BTPA、化合物2，BP为BTPA、化合物2和抗坏血酸钠溶解在二氯甲烷/甲醇混合溶液中，随后脱气，然后将硫酸铜溶解在甲醇中并脱气，最后，将硫酸铜溶液反应混合物中并在室温下搅拌过夜，在减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚混合溶液作为洗脱剂进行纯化以得到BP探针。
作为本发明所述用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法的一种优选方案，其中：BTPA的制备过程如下：在氮气气氛下，将化合物5和4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醛溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后，将反应混合物加热至120℃并在15分钟后逐滴加入乙酸和哌啶，反应24小时后，将得到的粗产物使用二氯甲烷和盐水洗涤并将收集的有机层使用无水硫酸钠干燥，在过滤并减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用二氯甲烷/石油醚按照1:2的体积比的混合溶液作为洗脱剂进行纯化以得到化合物BTPA。
作为本发明所述用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法的一种优选方案，其中：化合物5为化合物4和2,4-二甲基吡咯溶解在二氯甲烷中并加入三氟乙酸，随后，将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，向反应混合物中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌并在室温下搅拌过夜。最后，逐滴加入N,N-二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚络合物并在室温下搅拌过夜。粗产物使用二氯甲烷和盐水洗涤并将收集的有机层使用无水硫酸钠干燥。在过滤并减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚按照体积比1:90制得的混合溶液作为洗脱剂进行纯化制得。
作为本发明所述用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法的一种优选方案，其中：化合物4为3-溴丙炔添加到对羟基苯甲醛和碳酸钾在N,N-二甲基甲酰胺的溶液中。随后，将反应混合物在60℃下搅拌过夜，然后，通过滤除碳酸钾得到的粗产物溶解在二氯甲烷中并用盐水洗涤，将收集的有机层使用无水硫酸钠干燥，在过滤并减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚的混合溶液作为洗脱剂进行纯化制得。
本发明的另一个目的是提供一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的应用，其包括：BPNpro、BPNp1和BPNp2与细胞进行孵育。
作为本发明所述用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的应用的一种优选方案，其中：将用于铁死亡治疗的细胞置于0-200μg mL-1的用于铁死亡治疗的多功能纳米平台环境中。
本发明有益效果：
在此，我们提出了一种多功能纳米平台BPNpro，通过抑制DHODH和GPX4的酶活性用于有效的铁死亡治疗。如图1a所示，在一种实施方式中，通过简单的纳米沉淀方法将含有硝基异恶唑基团的BP包封在热响应性脂质体中，并用PROTAC肽(DPCP)进行表面修饰以形成最终的BPNpro纳米剂。这里，DPCP由组织蛋白酶B(CatB)(一种在肿瘤微环境中过表达的蛋白酶)可裂解肽、E3连接酶靶向肽和靶向DHODH的布喹那单位组成。此外，还使用DSPE-PEG2000-NH2和DPPC(一种热敏磷脂)构建了用于控制BP释放的热响应脂质壳。如图1b所示，在通过高的保留和通透效应到达肿瘤后，如第二种实施方式所示，BPNpro纳米颗粒的功能如下：i)降解DHODH。DPCP通过CatB的作用而被释放。它与DHODH特异性结合，并启动E3连接酶的募集。然后，DHODH被UPS降解，DPCP被释放并进入另一轮的DHODH降解。ii)抑制GPX4。在近红外(NIR)光照射后，BPNpro纳米颗粒产生的热量熔化脂质壳并释放BP。BP中的硝基异恶唑基团可以在细胞中被激活为腈氧化物亲电子基团，该基团与GPX4的硒代半胱氨酸残基共价结合以抑制其铁死亡防御活性。在不引入外部金属离子的情况下，DHODH和GPX4的失活会在肿瘤细胞中引发强烈的铁死亡。总的来说，开发了一种多功能BPNpro纳米剂来阻断肿瘤细胞中多种铁死亡防御蛋白的活性，用于强有力的铁死亡治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为BPNpro诱导的癌症铁死亡治疗示意图；
图中，图a为BPNpro的结构；图b为BPNpro介导的铁死亡治疗：(i)癌症特异性激活DPCP以降解DHODH；(ii)光热诱导的BP释放，导致GPX4失活；
图2为实施例1中化合物BP的合成路线；
图3为实施例1中BPNp1和BPNp2的结构示意图；
图4为实施例1中用于计算BP、DPCP、DPCPcontrol-1和DPCPcontrol-2负载能力的吸光度标准曲线；
图5为实施例1中化合物2在CDCl3中的1H NMR光谱(500MHz)；
图6为实施例1中化合物2在CDCl3中的13C NMR光谱(125MHz)；
图7为实施例1中化合物2的HRMS光谱；
图8为实施例1中化合物4在CDCl3中的1H NMR光谱(500MHz)；
图9为实施例1中化合物4在CDCl3中的13C NMR光谱(125MHz)；
图10为实施例1中化合物5在CDCl3中的1H NMR光谱(500MHz)；
图11为实施例1中化合物5在CDCl3中的13C NMR光谱(125MHz)；
图12为实施例1中BTPA在CDCl3中的1H NMR光谱(500MHz)；
图13为实施例1中BTPA在CDCl3中的13C NMR光谱(125MHz)；
图14为实施例1中BTPA的HRMS光谱；
图15为实施例1中BP在CDCl3中的1H NMR光谱(500MHz)；
图16为实施例1中BP在CDCl3中的13C NMR光谱(125MHz)；
图17为实施例1中BP的HRMS谱；
图18为实施例1中CD3OD中嵌合肽DPCP的1H NMR光谱(500MHz)；
图19为实施例1中嵌合肽DPCP的HRMS光谱；
图20为实施例1中嵌合肽DPCP的HPLC谱；
图21为实施例1中CD3OD中嵌合肽DPCPcontrol-1的1H NMR光谱(500MHz)；
图22为实施例1中嵌合肽DPCPcontrol-1的HRMS光谱；
图23为实施例1中嵌合肽DPCPcontrol-1的HPLC谱；
图24为实施例1中CD3OD中嵌合肽DPCPcontrol-2的1H NMR光谱(500MHz)；
图25为实施例1中嵌合肽DPCPcontrol-2的HRMS光谱；
图26为实施例1中嵌合肽DPCPcontrol-2的HPLC谱；
图27为实施例1中三种多肽和聚合物缀合的氢谱；
图中，图a为CD3OD中DSPE-PEG-DPCP的1H NMR光谱(500MHz)；图b为CD3OD中DSPE-PEG-DPCPcontrol-1的1H NMR光谱(500MHz)；图c为CD3OD中DSPE-PEG-DPCPcontrol-2的1H NMR光谱(500MHz)，分别显示了相应嵌合肽和DSPE-PEG-NH2的特征峰；
图28为实施例2中与布喹那偶联的嵌合肽DPCP的合成路线；
图29为实施例2中BPNpro、BPNp1和BPNp2的表征；
图中，图a为TEM图像；图b为DLS图像；图c为Zeta电位；图d为材料在PBS溶液(pH7.4)中的UV/Vis吸收；图e为在730nm激发的荧光发射光谱；
图30为实施例2中BPNpro的表征；
图中，图a为在10％胎牛血清(FBS)和PBS(pH 7.4)缓冲液中进行为期一周的直径的DLS研究；图b为在10％胎牛血清(FBS)和PBS(pH 7.4)缓冲液中进行为期一周的尺寸分布的DLS研究；
图31为实施例3中BPNpro、BPNp1和BPNp2的表征；
图中，图a为材料在PBS溶液中的温度变化(每个样品浓度为200μg mL-1)与近红外光照射时间(730nm、1.0W cm-2)之间的函数关系；图b为在没有或有15分钟光照(730nm、1.0Wcm-2)的情况下，从BPNpro中(200μg mL-1、PBS)释放BP；图c为BPNpro、BPNp1和BPNp2(100μg mL-1)在含有或不含有CatB(0.2U mL-1)的情况下的HPLC图谱；
图32为实施例3中五次激光开/关循环(730nm，1.0W cm-2，15分钟)后，BPNpro、BPNp1和BPNp2(各200μg mL-1)的光热稳定性；
图33为实施例3中BPNpro(200μg mL-1)在没有730nm激光照射的情况下释放BP；
图34为实施例4中体外BPNpro介导的铁死亡治疗；
图中，图a为无激光照射下BPNpro、BPNp1和BPNp2的细胞毒性研究(n＝3)；图b为激光照射(730nm，1.0W cm-2)15分钟下BPNpro、BPNp1和BPNp2的细胞毒性研究(n＝3)；图c为与材料(每个样品为40μg mL-1)孵育24小时的细胞的CLSM图像，红色荧光表示细胞质，蓝色荧光表示用Hoechst 33342染色的细胞核；图d为与材料(每个样品为40μg mL-1)孵育24小时的细胞的MFI(n＝3)，材料组与对照组：p＜0.001；图e为布喹那、DPCP、BPNpro、BPNp1或BPNp2孵育细胞的CLSM图像，绿色荧光表示DHODH抗体，蓝色荧光表示Hoechst 33342染色的细胞核；图f为布喹那、DPCP、BPNpro、BPNp1或BPNp2孵育细胞的MFI(布喹那和DPCP的浓度均为10μM，纳米材料浓度均为40μg mL-1，孵育时间为24小时，n＝3)，CA-074-Me、MLN4924和BU-4061T的预处理时间为6小时；图g为所提出的在CatB激活DPCP后诱导DHODH降解的机制；图h为不同处理后细胞内GPX4的蛋白印迹分析；图i为所提出的BP介导的GPX4共价抑制的机制；图j为使用PBS(对照)、BPNp1、BPNp2或BPNpro孵育24小时(纳米颗粒浓度均为100μg mL-1)，接着用NIR光照射15分钟(730nm、1.0W cm-2)，最后用PI/Calcein-AM对细胞染色(n＝3)的CLSM图像，红色荧光和绿色荧光分别代表死细胞和活细胞；
图35为实施例4中三种多肽处理细胞后的DHODH免疫荧光染色；
图中，图a为4T1细胞与DPCP、DPCPcontrol-1或DPCPcontrol-2(各10μM)孵育24小时后的共聚焦荧光图像，蓝色荧光显示Hoechst 33342，绿色荧光显示DHODH抗体；图b为相应的MFI，(n＝3)；
图36为实施例5中BPNpro的体外抗癌机制和血液相容性；
图中，图a为对照(PBS)、BPNp1、BPNp2或BPNpro孵育的细胞(材料浓度均为40μg mL-1，孵育时间为24小时)并光照15分钟(730nm，1.0W cm-2，n＝3)的CLSM图像，“+Fer-1”组：用Fer-1(100μM)预处理细胞12小时，绿色荧光显示C11-Bodipy581/591(10μM)染色的脂质过氧化物，蓝色荧光代表Hoechst 33342染色的细胞核；图b为相应的细胞内LPO水平的MFI，BPNpro组与对照组相比：p＜0.001；图c为BPNp1、BPNp2和BPNpro的溶血活性(n＝3)，阳性对照：1％Triton X-100溶液，插入的图片：红细胞与不同纳米颗粒孵育的照片(以10000rpm离心)；
图37为实施例5中在没有730nm激光照射的情况下，4T1细胞与对照(PBS)、BPNp1、BPNp2或BPNpro(各40μg mL-1)孵育24小时后的共聚焦荧光图像，绿色荧光为C11-Bodipy581/591(10μM)染色的LPO，蓝色荧光是Hoechst染色的细胞核；
图38为实施例6中基于BPNpro的铁死亡治疗的评估；
图中，图a为肿瘤模型建立和BPNpro介导的铁死亡治疗的时间表；图b为尾静脉注射BPNpro、BPNp1或BPNp2(1mg mL-1，200μL)后小鼠器官和肿瘤的NIR-II图像；图c为尾静脉给药BPNp1、BPNp2和BPNpro(200μg mL-1，200μL)24小时后，小鼠在光照射(730nm、1.0W cm-2)15分钟后的热成像；图d为监测期间，各组的相对肿瘤体积变化(*p<0.05、**p<0.01)；图e为治疗后各组的肿瘤照片；图f为各组肿瘤的H&E染色；图g为各组肿瘤的免疫荧光染色，绿色荧光表示DHODH抗体，蓝色荧光表示DAPI染色的细胞核；图h为肿瘤内GPX4的免疫荧光染色，红色荧光表示GPX4抗体，蓝色荧光表示DAPI染色的细胞核；图i为监测期间，不同治疗组小鼠的体重变化；
图39为实施例6中小鼠肿瘤NIR-II成像；
图中，图a为尾静脉注射BPNpro(1mg mL-1，200μL)后不同时间点肿瘤的NIR-II成像，激光：730nm，～89mW cm-2，曝光时间：200ms；图b为相应的MFI；
图40为实施例6中尾静脉注射生理盐水、BPNp1、BPNp2或BPNpro(200μgmL-1，200μL)并经(+L)或不经730nm激光照射(1.0W cm-2，15分钟)后第14天，4T1荷瘤BALB/c小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的组织学H&E染色图像；
图41为实施例6中注射不同纳米颗粒的健康BALB/c小鼠的血常规分析(n＝3)。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明实施例中使用的仪器和原料如下：
除非另有说明，否则所有化学品均购自安耐吉化学(中国)。细胞增殖检测试剂盒购自普洛麦格生物技术有限公司(中国，北京)。细胞培养基购自海克隆生物化学制品有限公司(中国，上海)。胰蛋白酶、青霉素-链霉素和胎牛血清(FBS)购自Gibco LifeTechnologies(美国)。布喹那购自毕得医药科技有限公司(中国，上海)。二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG2000-NH2)购自渝偲医药科技有限公司(中国，重庆)。脂质过氧化检测探针(C11-Bodipy581/591)购自安捷凯生物医药科技有限公司(中国，武汉)。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)一抗及其二抗购自碧云天生物技术有限公司(中国，上海)。二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)一抗及其二抗购自三鹰生物技术有限公司(中国，武汉)。
仪器表征：通过Bruker Avance III 500MHz光谱仪测试核磁共振氢谱和碳谱。质谱通过Bruker质谱仪(Bruker Daltonic flex analysis)测试。H-600透射电子显微镜(日立，日本)用于表征纳米颗粒的形态。通过Cary 50生物分光光度计记录紫外可见吸收光谱。使用FluoroLog-3荧光分光光度计在室温下测试荧光发射光谱。通过RDXL4SD四通道温度计和FLIR E6红外热成像仪测定光热活性。使用尼康ECLIPSE Ti显微镜获得共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。细胞活力数据由Synergy酶标仪(BioTek，USA)记录。近红外二区图像通过二维InGaAs相机采集。
实施例1
本实施例用于说明BPNpro的合成：
按照如下步骤进行制备：
首先，制备CatB可裂解的DPCP。接下来，DPCP和DSPE-PEG2000-NH2进行酰胺缩合反应，得到DSPE-PEG2000-DPCP共聚物。BP也通过Knoevenagel缩合反应和CuI介导的炔烃偶氮点击反应以高产率制备(图2)。最后，将BP、DSPE-PEG2000-DPCP和DPPC以1:20:100的质量比混合并纳米沉淀，以获得BPNpro，这是制备热响应脂质体的最佳进料比。两种对照纳米颗粒(BPNp1和BPNp2)也通过类似的方法制备，分别使用仅靶向DHODH的肽(DPCPcontrol-1)和仅靶向E3连接酶的肽(DPCPcontrol-2)(图3)。根据UV/Vis吸收光谱(图4)，计算出BP、DPCP、DPCPcontrol-1和DPCPcontrol-2的负载能力分别为0.6％、5.9％、3.3％和5.2％。高分辨率质谱(HRMS)、核磁共振(NMR)光谱和高效液相色谱(HPLC)分析的综合结果证实了所有化合物的成功合成，包括BP、DPCP、DPCPcontrol-1、DPCPcontrol-2、DSPE-PEG2000-DPCP、DSPE-PEG2000-DPCPcontrol-1和DSPE-PEG2000-DPCPcontrol-2(图5-27)。
将实施例1中BP、DSPE-PEG2000-DPCP和DPPC混合并纳米沉淀过程中质量比更改为1:20:50，则会导致出现BPNpro对温度的敏感度下降，从而导致其热响应性能不良的后果。
将实施例1中BP、DSPE-PEG2000-DPCP和DPPC混合并纳米沉淀过程中质量比更改为1:20:300，则会导致出现BPNpro对温度的响应过于敏感，从而导致BPNpro在生物应用中无法稳定存在。
实施例2
本实施例为实施例1中各原料的具体制备过程：
化合物2的合成步骤：将化合物1即5-甲基-4-硝基-3-异恶唑羧酸(1.0g,5.81mmol)加入冰浴冷却的无水二氯甲烷(30mL)中。随后，逐滴加入草酰氯(1.0mL,11.6mmol)并加入1滴N,N-二甲基甲酰胺。将冰浴撤去使反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，通过室温水浴旋转蒸发溶剂以得到酰氯中间体，将其立即滴入冰浴冷却的无水二氯甲烷(35mL)中。最后，将三乙胺(1.1mL,14.5mmol)和11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺(1.27g,5.81mmol)在无水二氯甲烷(15mL)中形成的混合物逐滴加入酰氯溶液中，并使反应混合物在室温下搅拌2小时。在减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚(v/v,1:3)作为洗脱剂进行纯化以得到化合物2(1.79g)，产率：83％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)7.19(s,1H),3.82-3.53(m,14H),3.38(t,J＝5.0Hz,2H),2.84(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)171.86,156.60,153.18,70.59,70.47,70.35,69.95,69.18,50.64,39.92,13.39.HRMS:calcd.m/z＝372.14；found m/z＝395.12733.
化合物4的合成步骤：将3-溴丙炔(0.98g,8.2mmol)添加到化合物3即对羟基苯甲醛(1.0g,8.2mmol)和碳酸钾(6.5g,47mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(25mL)的溶液中。随后，将反应混合物在60℃下搅拌过夜。然后，通过滤除碳酸钾得到的粗产物溶解在二氯甲烷中并用盐水洗涤。将收集的有机层使用无水硫酸钠干燥。在过滤并减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚(v/v,1:30)作为洗脱剂进行纯化以得到化合物4(0.71g)，产率：57％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)9.95(s,1H),7.87(d,J＝8.7Hz,2H),7.10(d,J＝8.6Hz,2H),4.79(d,J＝2.4Hz,2H),2.57(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)190.75,162.34,131.87,130.57,115.16,77.54,76.38,55.93.
化合物5的合成步骤：将化合物4(1.0g,6.2mmol)和2,4-二甲基吡咯(1.33g,14mmol)溶解在二氯甲烷(150mL)中并加入三氟乙酸(0.05mL)。随后，将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，向反应混合物中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(1.41g,6.2mmol)并在室温下搅拌过夜。最后，逐滴加入N,N-二异丙基乙胺(3.62g,28mmol)和三氟化硼乙醚络合物(11.64g,82mmol)并在室温下搅拌过夜。粗产物使用二氯甲烷和盐水洗涤并将收集的有机层使用无水硫酸钠干燥。在过滤并减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚(v/v,1:90)作为洗脱剂进行纯化以得到化合物5(0.75g)，产率：32％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)7.19(d,J＝8.6Hz,2H),7.09(d,J＝8.7Hz,2H),5.98(s,2H),4.76(d,J＝2.4Hz,2H),2.56(d,J＝2.4Hz,1H),2.55(s,6H),1.42(s,6H).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)158.08,155.34,143.12,141.48,131.75,129.22,127.98,121.16,115.60,78.03,75.89,56.01,14.54.
BTPA的合成步骤：在氮气气氛下，将化合物5(0.38g,1.0mmol)和4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醛(0.82g,3.0mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中。然后，将反应混合物加热至120℃并在15分钟后逐滴加入乙酸(0.4mL)和哌啶(0.4mL)。反应24小时后，将得到的粗产物使用二氯甲烷和盐水洗涤并将收集的有机层使用无水硫酸钠干燥。在过滤并减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用二氯甲烷/石油醚(v/v,1:2)作为洗脱剂进行纯化以得到化合物BTPA(0.25g)，产率：28％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)7.59(d,J＝16.2Hz,2H),7.47(d,J＝8.7Hz,4H),7.30-7.26(m,7H),7.25-7.22(m,2H),7.17(d,J＝16.2Hz,2H),7.13(d,J＝7.4Hz,7H),7.09(d,J＝8.6Hz,2H),7.06(t,J＝7.3Hz,4H),7.02(d,J＝8.6Hz,4H),6.60(s,2H),4.76(d,J＝2.4Hz,2H),2.56(t,J＝2.4Hz,1H),1.47(s,6H),1.43(s,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)158.01,152.46,148.50,147.14,141.54,137.29,135.45,133.59,130.38,129.80,129.35,128.50,128.35,124.98,123.53,122.48,117.50,117.37,115.45,78.09,75.87,56.02,34.66,26.90,25.27,20.70,14.80.HRMS:calcd.m/z＝888.38；found m/z＝888.37853.
探针BP的合成步骤：将BTPA(0.2g,0.23mmol)、化合物2(0.26g,0.69mmol)和抗坏血酸钠(0.02g,0.07mmol)溶解在二氯甲烷/甲醇(v/v,1:10)中。随后，在室温下通过氩气鼓泡将反应混合物脱气30分钟。然后，将硫酸铜(0.02g,0.06mmol)溶解在甲醇(1.0mL)中并在室温下通过氩气鼓泡脱气30分钟。最后，通过注射器将硫酸铜溶液加入到原来的反应混合物中并在室温下搅拌过夜。在减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚(v/v,3:1)作为洗脱剂进行纯化以得到BP探针(0.24g)，产率：84％。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)7.87(s,1H),7.59(d,J＝16.2Hz,2H),7.46(d,J＝8.3Hz,4H),7.28(d,J＝7.7Hz,6H),7.25(s,1H),7.22(d,J＝8.1Hz,2H),7.12(d,J＝8.1Hz,10H),7.10(s,1H),7.06(t,J＝7.4Hz,5H),7.02(d,J＝8.4Hz,4H),6.59(s,2H),5.22(s,2H),4.55(t,J＝4.9Hz,2H),3.89(t,J＝4.9Hz,2H),3.68-3.56(m,14H),2.79(s,3H),1.47(s,4H),1.26(s,2H).13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)171.91,158.78,156.63,153.13,148.52,147.10,143.35,130.32,129.87,129.35,128.50,124.99,124.20,123.55,122.43,117.50,117.30,115.25,70.47,70.45,70.39,70.30,69.33,69.15,62.00,53.44,50.33,39.89,37.08,32.75,31.92,30.02,29.69,29.65,29.35,27.07,22.69,19.73,14.82,14.13,13.39.HRMS:calcd.m/z＝1260.52；found m/z＝1260.52098.
DPCP，DPCPcontrol-1和DPCPcontrol-2的合成：首先，将2-氯三苯甲基氯树脂(1.14mmolg-1)在无水DMF中浸泡1小时。随后，将DIPEA(10当量)和Fmoc-Gly-OMe(4当量)在DMF中的混合溶液逐滴加入树脂中，并在室温下在氮气气氛下搅拌3小时。用DMF洗涤树脂3次后，将树脂与MeOH/DPIA/DMF(v/v/v，1∶2∶7)反应30分钟以封端未反应的基团。然后将树脂与哌啶/DMF(v/v，1:4)孵育15分钟，以裂解Fmoc保护基并进行酰胺缩合。然后，将树脂与一系列Fmoc保护的氨基酸(3当量)、HOBT(3.6当量)、HBTU(3.6当量)和DIPEA(7.5当量)反应2小时，以进行氨基酸偶联。氨基酸偶联完成后，将树脂与布喹那(2当量)、HOBT(2.4当量)、HBTU(2.4当量)和DIPEA(5当量)的混合物反应过夜。依次用DMF、MeOH和DCM洗涤树脂后，在真空下干燥树脂30分钟。最后，通过使用TFA/H2O/1,2-乙二硫醇(v/v/v，95:2.5:2.5)将多肽DPCP从树脂上裂解1.5小时。通过HPLC对所获得的粗产物进行纯化以获得DPCP(70mg),得到的DPCP为HOOC-GGLFGPIYPALASGSG-布喹那，其中蛋白质序列如SEQ ID No.1所示，制备DPCP的过程如图28所示。1H NMR(500MHz,CD3OD,δ):8.17(dd,J＝9.3,5.1Hz,1H),8.04(d,J＝8.6Hz,1H),7.96(dd,J＝9.5,2.8Hz,1H),7.78(dd,J＝8.4,1.6Hz,3H),7.74-7.66(m,3H),7.59(td,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.48-7.39(m,1H),7.31(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.28-7.13(m,7H),7.02(dd,J＝8.6,3.2Hz,2H),6.68(dd,J＝8.5,2.0Hz,2H),4.68-4.52(m,5H),4.49-4.24(m,10H),4.18(q,J＝7.3Hz,1H),4.03(d,J＝16.8Hz,1H),3.99-3.83(m,9H),3.81-3.66(m,5H),3.64-3.47(m,4H),3.19-3.11(m,1H),3.08-2.97(m,3H),2.88(dd,J＝13.8,8.0Hz,1H),2.52(s,3H),2.13(d,J＝72.6Hz,4H),1.88(d,J＝7.0Hz,6H),1.60(d,J＝7.4Hz,9H),1.35(dd,J＝52.3,7.1Hz,8H),1.15-1.03(m,1H),0.97-0.84(m,16H),0.79(t,J＝7.4Hz,4H).HRMS m/z:[M]-calcd for C91H114F2N17O21,1818.84；found,1818.83687.对照嵌合肽DPCPcontrol-1和DPCPcontrol-2以类似的方式制备，DPCPcontrol-1为：HOOC-GGLFG-布喹那，其中氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，DPCPcontrol-2为：HOOC-GGLFGPIYPALASGSG-Ac，其中蛋白质序列如SEQ ID No.3所示。值得注意的是，DPCPcontrol-1不包含靶向E3连接酶的肽片段。1HNMR(500MHz,CD3OD,δ):8.13(dd,J＝9.3,5.2Hz,1H),7.93(dd,J＝9.7,2.8Hz,1H),7.76(dd,J＝8.2,1.6Hz,2H),7.68(d,J＝8.2Hz,2H),7.64(td,J＝8.9,2.8Hz,1H),7.58(td,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.45-7.38(m,1H),7.34-7.27(m,5H),7.26-7.19(m,2H),4.74(dd,J＝8.4,6.0Hz,1H),4.36-4.28(m,1H),4.18(d,J＝9.9Hz,2H),3.98-3.71(m,4H),3.31(p,J＝1.6Hz,3H),3.21(dd,J＝14.0,6.0Hz,1H),3.01(dd,J＝14.0,8.5Hz,1H),2.47(s,3H),1.75-1.52(m,3H),1.28(s,1H),0.89(dd,J＝14.9,5.8Hz,7H).HRMS m/z:[M]-calcd forC44H43F2N6O7,805.32；found,805.31558.DPCPcontrol-2是在没有布喹那单元的情况下制备的。1HNMR(500MHz,CD3OD,δ):7.25(s,6H),7.03(d,J＝8.5Hz,2H),6.70(d,J＝8.5Hz,2H),4.67-4.56(m,2H),4.52(q,J＝6.8Hz,1H),4.47-4.34(m,6H),4.28(td,J＝7.3,4.0Hz,2H),4.22(q,J＝7.3Hz,1H),4.03-3.85(m,11H),3.84-3.69(m,6H),3.67-3.43(m,4H),3.31(p,J＝1.6Hz,4H),3.15(dd,J＝14.1,6.6Hz,1H),3.05(ddd,J＝20.3,13.9,7.4Hz,2H),2.88(dd,J＝13.8,8.0Hz,1H),2.23(ddd,J＝12.5,10.5,5.0Hz,1H),2.07(d,J＝10.3Hz,2H),2.01(s,3H),1.89(d,J＝6.6Hz,6H),1.75-1.50(m,9H),1.41(d,J＝7.3Hz,4H),1.31(d,J＝7.0Hz,4H),1.10(d,J＝7.2Hz,1H),0.99-0.84(m,18H),0.80(t,J＝7.4Hz,4H).HRMS m/z:[M]-calcd for C70H103N16O21,1503.76；found,1503.75184.
DSPE-PEG-DPCP，DSPE-PEG-DPCPcontrol-1和DSPE-PEG-DPCPcontrol-2的合成：将DPCP(36mg,0.02mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(10mg,0.05mmol)和羟基丁二酰亚胺(6mg,0.05mmol)的混合物溶解在四氢呋喃(10mL)中并在室温下搅拌1小时。随后，将该混合物溶液滴加到含有DSPE-PEG2000-NH2(100mg)的四氢呋喃(5mL)溶液中并在室温下搅拌48小时。然后，通过透析膜将得到的粗产物进一步透析72小时。最后，将得到的DSPE-PEG2000-DPCP在真空中进行冷冻干燥。此外，对照聚合物DSPE-PEG2000-DPCPcontrol-1和DSPE-PEG2000-DPCPcontrol-2也通过类似的方法制备而成。前者通过DSPE-PEG2000-NH2和DPCPcontrol-1制备而成，后者通过DSPE-PEG2000-NH2和DPCPcontrol-2反应得到。
纳米颗粒的合成：BPNpro纳米颗粒通过将DSPE-PEG2000-DPCP、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和BP进行纳米沉淀制备而成，BP通过π-π堆积和疏水作用被封装在脂质体的疏水核中。其中，BP、DSPE-PEG2000-DPCP和DPPC以1:20:100的质量比进行纳米沉淀以得到具有良好水溶性的BPNpro，这是制备热响应脂质体的最优进料比。具体步骤如下：将DSPE-PEG-DPCP(1mg)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC；5mg)和BP(0.05mg)的混合物溶于氯仿(5mL)中并减压除去溶剂以形成有机薄膜。然后，将有机薄膜在65℃水浴中水化15分钟并超声处理20分钟。使用聚偏氟乙烯针式过滤器(0.22μm)过滤后，通过超滤离心管(截留分子量：50kDa)将混合物溶液进一步纯化5次(5000rpm)以除去游离的药物。最后，将浓缩的BPNpro悬浮液进行冷冻干燥并称重。两种对照纳米颗粒(BPNp1和BPNp2)分别使用CatB可裂解的仅靶向DHODH的多肽(表示为DPCPcontrol-1)和CatB可裂解的仅靶向E3连接酶的多肽(表示为DPCPcontrol-2)代替DPCP通过类似的方法制备而成。根据UV/Vis吸收光谱，计算出BP、DPCP、DPCPcontrol-1和DPCPcontrol-2的负载能力分别为0.6％、5.9％、3.3％和5.2％。
制得的BPNpro、BPNp1和BPNp2的表征如图29所示。如图29a所示，从透射电子显微镜(TEM)图像中观察到，这些纳米颗粒是球形的并均匀分布。根据动态光散射(DLS)结果，BPNpro、BPNp1和BPNp2具有相似的流体动力学尺寸(≈122nm)(图29b)。在10％胎牛血清(FBS)和磷酸盐缓冲溶液(PBS)中室温储存一周后，BPNpro的流体动力学尺寸变化可以忽略不计(图30)。这表明BPNpro具有良好的胶体稳定性。此外，这些纳米颗粒具有类似的负zeta电位值(图29c)。从UV/Vis光谱中观察到，这些纳米颗粒在560和730nm处具有吸收带(图29d)。在用730nm激光激发后，荧光光谱在760nm处显示出类似的特征发射带，尾部延伸超过1000nm(图29e)。这些数据表明，不同肽的结合不会影响这些材料的物理特性。
实施例3
本实施例用以探寻BPNpro的体外光热性质、药物释放和CatB特异性激活
在730nm激光的连续照射下，BPNpro，BPNp1和BPNp2纳米颗粒溶液的温度在t＝15分钟时稳定在大约45℃(图31a)。在连续五个测试循环后，光热曲线的变化可以忽略不计(图32)，这证实了它们优异的光热稳定性。这些数据表明，不同肽的结合不会影响这些纳米粒子的光热性质。此外，证实了光热触发的BP释放。在连续730nm光照15分钟后，通过HPLC分析样品。结果清楚地表明，BP是从BPNpro中释放出来的(图31b)。相反，在没有光照射的情况下，即使经过长时间的孵育，BP的释放仍然可以忽略不计(图33)。为了评估BPNpro、BPNp1和BPNp2的癌症特异性激活，用HPLC分析了它们与CatB的相互作用(图31c)。BPNp1、BPNp2和BPNpro的洗脱峰分别在7.7、16.0和12.8分钟。相反，在没有CatB孵育的处理中，HPLC图谱显示没有信号。这证实了BPNpro的DPCP、BPNp1的DPCPcontrol-1和BPNp2的DPCPcontrol-2可以响应CatB原位释放。BPNpro、BPNp1和BPNp2的表征即在PBS溶液中的温度情况及相应实验组的HPLC图谱如图31所示。
实施例4
本实施例用以探明BPNpro的细胞摄取、体外DHODH和GPX4失活以及体外治疗效果。
首先，使用4T1小鼠乳腺癌细胞通过MTS细胞活性测定评估BPNpro、BPNp1和BPNp2的细胞毒性。将细胞与不同浓度的纳米颗粒孵育，细胞活力值均超过91％(图34a)，表明这些纳米颗粒具有可忽略不计的暗细胞毒性。然而，在730nm光照的存在下，4T1细胞活力值随着材料浓度的增加而逐渐降低(图34b)。在100μg mL-1纳米颗粒浓度下，与BPNp1或BPNp2孵育的细胞显示出降低的细胞活力(～43％)。
相反，与BPNp1和BPNp2相比，BPNpro表现出显著降低的细胞活力(12％)。BPNp1和BPNp2的细胞活力的类似降低可归因于光热释放的BP，其通过抑制GPX4活性诱导了细胞中的铁死亡。BPNpro的细胞活力的大大降低可归因于DPCP诱导的DHODH降解。GPX4和DHODH失活的联合作用诱导了更大程度的铁死亡。这些数据清楚地表明，BPNpro比BPNp1和BPNp2具有更强的治疗效果。
在激光辐照下，当纳米颗粒浓度变更为1μg mL-1时，可能会导致出现BPNpro、BPNp1和BPNp2对细胞杀伤效果不明显的不良后果；当纳米颗粒浓度变更为500μg mL-1时，可能会导致出现BPNpro、BPNp1和BPNp2对细胞杀伤作用相似而在抗癌功效方面无法区分孰强孰弱的不良后果。
将4T1癌细胞在含有BPNpro、BPNp1或BPNp2的培养基中培养24h，然后用Hoechst33342标记细胞核，并用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)进行细胞荧光成像。与PBS处理的对照组相比，在BPNpro、BPNp1或BPNp2孵育的细胞中可以清楚地观察到Bodipy探针的红色荧光信号(图34c)。相对平均荧光强度(MFI)分别为35.7、35.2和32.6(图34d)，这表明纳米颗粒具有相似的细胞摄取。细胞摄取显然不受不同肽缀合的影响。
由于BPNpro含有靶蛋白为DHODH的DPCP，因此这表明BPNpro可以有效诱导细胞内DHODH降解。因此，通过免疫荧光染色测定细胞内DHODH的表达水平。将细胞分别与布喹那、DPCP、BPNpro、BPNp1和BPNp2孵育24小时。与PBS处理的对照组相比，DHODH抗体[与Coralite488(一种绿色荧光探针)标记的二抗]的信号在用DPCP或BPNpro孵育的细胞中显著减弱(DHODH抗体及其二抗的使用体积分别为5μL和500μL)。然而，在与布喹那、BPNp1、BPNp2、DPCPcontrol-1或DPCPcontrol-2孵育的细胞中，绿色荧光信号没有显著变化(图34e和图35)。与PBS处理组相比，用DPCP或BPNpro孵育的细胞中DHODH抗体的MFI分别显著降低81.7％和86.8％。相反，在与布喹那、BPNp1、BPNp2、DPCPcontrol-1或DPCPcontrol-2孵育的组中，DHODH抗体的MFI的减少可以忽略不计(图34f和图35)。这些数据证实了DHODH的有效降解归因于BPNpro中缀合的DPCP。
为了阐明DHODH的降解途径，使用相应的酶抑制剂选择性地抑制了UPS。首先，分别使用26S蛋白酶体抑制剂(BU-4061T)、NEDD8激活酶抑制剂(MLN4924)和CatB抑制剂(CA-074-Me)预孵育细胞。其中，MLN4924通过抑制其核心亚基(Cullin蛋白)的Neddylation来抑制E3连接酶活性，BU-4061T通过与催化亚基共价结合来抑制26S蛋白酶体的活性。然后，用各种抑制剂处理后的这些细胞与BPNpro一起孵育。与PBS孵育的对照相比，BPNpro孵育的细胞中的绿色荧光和MFI不再减少(图34e-f)。根据文献报道，如图34g所示，提出的BPNpro诱导DHODH降解的机制如下：首先，CatB裂解并释放DPCP。随后，DPCP与DHODH特异性结合，并启动E3连接酶的募集。然后，E2泛素结合酶被募集。在NEDD8激活酶的作用下，泛素直接从E2结合酶转移到DHODH以形成泛素链。最后，26S蛋白酶体被募集并降解DHODH。DPCP随后被释放并进入下一个DHODH降解循环。
由于BP含有一个可以与硒代半胱氨酸残基共价结合的硝基异恶唑基团，因此推测BPNpro可以有效下调细胞内GPX4的活性。因此，采用Western blotting分析研究了不同处理后4T1癌细胞GPX4的蛋白水平。为了进行比较，使用不含硝基异恶唑基团的BP通过相同的方法制备了对照纳米颗粒(BTPANpro)。在没有光照射的情况下，BPNpro和BTPANpro没有引起GPX4的显著下调(图34h)。与对照组(PBS)和BTPANpro组相比，激光照射后，BPNpro诱导细胞内GPX4水平显著下调。这表明，由于BP中的硝基异恶唑基团，光热诱导的BP的释放显著抑制了4T1癌细胞中的GPX4。根据文献报道，如图34i所示，所提出的BP介导的GPX4抑制的细胞内激活机制如下：在光热诱导BP释放到细胞中后，首先，硝基异恶唑基团进行开环水解，形成不稳定的酮中间体；随后，酮中间体进行类Retro-Claisen缩合，释放乙酸形成硝基酮肟；紧接着，其发生闭环脱水，形成呋咱中间体；然后，呋咱中间体进行开环互变异构反应，形成腈氧化物；最后，腈氧化物亲电基团与GPX4的硒代半胱氨酸残基共价结合以形成加合物，最终实现对GPX4有效的抑制。
鉴于DHODH的有效降解和GPX4的抑制，利用Calcein-AM/PI(细胞存活/死亡指示剂)染色实验进一步证实BPNpro对4T1癌细胞的治疗作用。如图34j所示，在没有NIR光照射的情况下，用BPNp1、BPNp2或BPNpro孵育的细胞清楚地显示出来自Calcein-AM的绿色荧光信号。相反，从光照后的CLSM图像中可以清楚地观察到这些纳米颗粒孵育的细胞中来自PI的红色荧光信号。其中，在近红外光照射下，BPNp1和BPNp2由于释放的BP触发了LPO而诱导细胞死亡。正如预期的那样，BPNpro通过进一步降解DHODH实现了最有效的铁死亡疗法。
实施例5
本实施例用以说明铁死亡治疗的潜在机制：
为了阐明BPNpro介导的铁死亡治疗机制，使用C11-Bodipy581/591检测纳米颗粒孵育的4T1癌细胞中脂质过氧化物(铁死亡生物标志物)的含量。C11-Bodipy581/591是一种广泛使用的LPO特异性传感器，可被细胞内脂质过氧化物氧化，并显示亮绿色荧光信号。与PBS处理的对照组相比，用BPNp1或BPNp2孵育的组的CLSM图像在730nm激光照射后显示出约7.8倍强的绿色荧光信号(图36a-b)。这表明BPNp1和BPNp2在细胞中诱导了明显的LPO。这是由于光热触发的BP释放有效抑制了GPX4并导致脂质氢过氧化物的积累。相反，从CLSM图像中观察到，在没有光照射的情况下，BPNp1和BPNp2组表现出与对照组相似的弱绿色荧光信号(图37)。这证实了光热释放的BP具有促进细胞内LPO的能力。此外，在730nm激光照射后，与BPNp1和BPNp2组相比，从CLSM图像中可以清楚地观察到，BPNpro组表现出相当强的绿色荧光信号(图36a-b)，这表明BPNpro在细胞中诱导了更高的LPO水平。这是因为与BPNp1中仅靶向的DHODH的DPCPcontrol-1和BPNp2中仅靶向的E3连接酶的DPCPcontrol-2对比，BPNpro中的DPCP可以同时靶向DHODH和E3连接酶。DPCP随后通过UPS实现了对DHODH的降解和清除，最终导致CoQH2的减少和LPO的积累。有趣的是，与BPNp1和BPNp2组相比，在没有光照射的情况下，BPNpro组显示出类似的弱绿色荧光信号(图37)。这是因为GPX4的铁死亡防御活性被保留下来，并在没有光热诱导的BP释放的情况下起到解毒脂质过氧化物的作用。与对照组相比，BPNpro组在730nm激光照射后显示出约12.1倍强的绿色荧光信号(图36b)。这表明与BPNp1和BPNp2相比，BPNpro具有最强的诱导铁死亡的能力。这是因为BPNpro介导的GPX4抑制和DHODH降解诱导的铁死亡在细胞中引发了最大程度的LPO。用铁死亡抑制剂(Fer-1)预处理细胞后，激光照射后，BPNpro孵育的细胞的CLSM图像中的绿色荧光减少了约7倍。这些数据清楚地证实，BPNpro的强大抗癌功效归因于高LPO水平诱导的铁死亡。此外，小鼠红细胞在与这些纳米颗粒孵育后没有表现出显著的溶血作用(图36c)。这表明这些材料具有良好的血液相容性，可用于随后的体内生物学研究。
实施例6
本实施例用以说明BPNpro的生物分布、热成像、治疗效率评估、DHODH和GPX4下调以及生物安全性：
考虑到BPNpro在细胞水平上的优异性能，我们接下来通过使用4T1荷瘤BALB/c小鼠来探索其体内抗癌功效。首先，用4T1细胞对小鼠进行皮下接种以建立肿瘤模型。如图38a所示，7天后，通过尾静脉将BPNpro、BPNp1或BPNp2注射到荷瘤小鼠中。然后使用730nm的激光照射肿瘤部位。最后，连续记录14天的肿瘤生长率。
为了确定激光照射的最优时间点，在注射BPNpro后的不同时间点进行了近红外二区(NIR-II)成像实验。可以观察到，肿瘤部位在24h时最亮(图39)。这表明纳米颗粒在24h时实现了最大的肿瘤积聚。因此，光照射最优时间点确定为材料注射后的24h。此外，生物分布研究表明，BPNpro、BPNp1和BPNp2主要积聚在脾脏和肝脏，其次是肿瘤(图38b)。
在确定了纳米颗粒的最大肿瘤富集时间后进行体内铁死亡治疗。在通过尾静脉注射BPNpro、BPNp1或BPNp2后24小时，用激光(730nm、1.0W cm-2)照射小鼠的肿瘤。光照15分钟后观察到肿瘤温度逐渐升高至约48摄氏度(图38c)。在相同的照射时间点，BPNpro、BPNp1或BPNp2组的肿瘤温度值相似。这可能是因为这些纳米颗粒具有相似的肿瘤积累和光热特性。随后，对BPNpro的抗癌作用进行了探索。不同治疗组的相对肿瘤体积变化如图38d所示。与生理盐水处理的对照组相比，在没有光照射的情况下，注射BPNp1、BPNp2或BPNpro的组的肿瘤生长没有显著抑制。相比之下，BPNp1和BPNp2组在激光照射下获得了较好的治疗效果。与生理盐水治疗的对照组相比，相对肿瘤体积最终分别减少了2.5倍和2.3倍。这清楚地证实了光热诱导的BP释放对治疗的贡献。在光照下观察到BPNpro治疗组的肿瘤生长受到显著抑制。与生理盐水治疗的对照组相比，相对肿瘤体积减少了20.4倍。GPX4和DHODH活性的下调被认为是BPNpro优异疗效的主要原因。在完成疗效评估后，从小鼠身上取出肿瘤进行拍照(图38e)。在没有光照的情况下，盐水注射组和纳米颗粒注射组的肿瘤大小相似。BPNp1和BPNp2注射组的肿瘤在光照后变小。相比之下，BPNpro注射组在光照后的肿瘤最小。随后，对肿瘤进行苏木精和伊红(H&E)染色。相对于其他治疗组，光照的BPNpro组的肿瘤显示出明显的细胞核收缩(图38f)。这些数据清楚地证实了BPNpro优异的肿瘤治疗效果。
分别使用DHODH抗体[与Coralite488标记的二抗一起]和GPX4抗体[与Cyanine3(一种红色荧光探针)标记的二抗一起]检测瘤内DHODH和GPX4。BPNpro组的绿色荧光显著降低(图38g)，这表明DHODH显著降解。图38h显示了GPX4的免疫荧光染色。光照射的BPNpro组显示出非常弱的红色荧光，这表明肿瘤内GPX4受到极大干扰。在14天的监测期内，各组的体重没有异常变化(图38i)。心、肝、脾、肺和肾保持正常的生理形态(图40)。血常规结果表明，全身给药BPNpro后，健康小鼠的这些血液参数没有异常变化(图41)。这些数据无疑证明了所提出的抗癌策略具有良好的疗效和良好的生物安全性。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台，其特征在于：所述多功能纳米平台为BPNpro，所述BPNpro为DSPE-PEG2000-DPCP/DPPC@BP。
2.一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
制备蛋白水解靶向嵌合体多肽即DPCP：制备组织蛋白酶B即CatB可裂解的DPCP；
制备DSPE-PEG2000-DPCP共聚物：将DPCP和DSPE-PEG2000-NH2进行酰胺缩合反应，得到DSPE-PEG2000-DPCP共聚物；
制备BPNpro：将氟硼二吡咯即BP探针、DSPE-PEG2000-DPCP和DPPC混合并纳米沉淀，以获得BPNpro。
3.根据权利要求2所述的用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法，其特征在于：所述制备BPNpro中，BP、DSPE-PEG2000-DPCP和DPPC以1:20:100的质量比混合并纳米沉淀。
4.根据权利要求2所述的用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法，其特征在于：所述BP为BTPA即BP的前体探针和化合物2混合后制得，所述化合物2为5-甲基-4-硝基-3-异恶唑羧酸加入冰浴冷却的无水二氯甲烷中，随后，逐滴加入草酰氯并加入1滴N,N-二甲基甲酰胺，将冰浴撤去使反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，通过室温水浴旋转蒸发溶剂以得到酰氯中间体，将其立即滴入冰浴冷却的无水二氯甲烷中，最后，将三乙胺和11-叠氮-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺在无水二氯甲烷中形成的混合物逐滴加入酰氯溶液中，并使反应混合物在室温下搅拌2小时，在减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚按照1:3的体积比混合作为洗脱剂进行纯化以得到化合物2。
5.根据权利要求2或4所述的用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法，其特征在于：所述BP的制备中，原料包括BTPA、化合物2，所述BP为BTPA、化合物2和抗坏血酸钠溶解在二氯甲烷/甲醇混合溶液中，随后脱气，然后将硫酸铜溶解在甲醇中并脱气，最后，将硫酸铜溶液反应混合物中并在室温下搅拌过夜，在减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚混合溶液作为洗脱剂进行纯化以得到BP探针。
6.根据权利要求5所述的用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法，其特征在于：所述BTPA的制备过程如下：在氮气气氛下，将化合物5和4-(N，N-二苯基氨基)苯甲醛溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后，将反应混合物加热至120℃并在15分钟后逐滴加入乙酸和哌啶，反应24小时后，将得到的粗产物使用二氯甲烷和盐水洗涤并将收集的有机层使用无水硫酸钠干燥，在过滤并减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用二氯甲烷/石油醚按照1:2的体积比的混合溶液作为洗脱剂进行纯化以得到化合物BTPA。
7.根据权利要求5或6所述的用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法，其特征在于：所述化合物5为化合物4和2,4-二甲基吡咯溶解在二氯甲烷中并加入三氟乙酸，随后，将反应混合物在室温下搅拌过夜。然后，向反应混合物中加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌并在室温下搅拌过夜。最后，逐滴加入N,N-二异丙基乙胺和三氟化硼乙醚络合物并在室温下搅拌过夜。粗产物使用二氯甲烷和盐水洗涤并将收集的有机层使用无水硫酸钠干燥。在过滤并减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚按照体积比1:90制得的混合溶液作为洗脱剂进行纯化制得。
8.根据权利要求5或6所述的用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的制备方法，其特征在于：所述化合物4为3-溴丙炔添加到对羟基苯甲醛和碳酸钾在N,N-二甲基甲酰胺的溶液中。随后，将反应混合物在60℃下搅拌过夜，然后，通过滤除碳酸钾得到的粗产物溶解在二氯甲烷中并用盐水洗涤，将收集的有机层使用无水硫酸钠干燥，在过滤并减压除去挥发物后，将粗产物通过硅胶柱色谱法使用乙酸乙酯/石油醚的混合溶液作为洗脱剂进行纯化制得。
9.一种用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的应用，其特征在于：所述纳米平台BPNpro与细胞进行孵育用于抑制铁死亡防御。
10.根据权利要求9所述的用于铁死亡治疗的多功能纳米平台的应用：将用于铁死亡治疗的细胞置于0-200μg mL-1的用于铁死亡治疗的多功能纳米平台环境中。
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