KR101046342B1 - 뇌졸중 예측용 ｌｉｐｇ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법 - Google Patents

뇌졸중 예측용 ｌｉｐｇ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뇌졸중 예측용 유전자 다형성 마커, 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간 내피 리파아제(endothelial lipase, LIPG)의 프로모터(promoter) 부위의 단일염기다형성인 rs9958947의 소수 대립유전자 T 또는 CT/TT 유전자형의 빈도가 정상인에 비해 뇌졸중 환자에서 유의적으로 증가하는 것을 확인함으로써 상기 유전자 다형성을 뇌졸중에 대한 마커로 이용하여 뇌졸중의 위험을 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 뇌졸중의 위험을 예측할 수 있으며, 뇌졸중을 위한 치료 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
LIPG, rs9958947, 뇌졸중, 유전자 다형성, 단일염기다형성, 연관성

Description

뇌졸중 예측용 ＬＩＰＧ 유전자 다형성 마커 및 이를 이용한 뇌졸중 예측 방법{A genetic polymorphic marker of LIPG for prediction of ischemic Stroke and the prediction method of ischemic Stroke using the same}
본 발명은 뇌졸중 위험 예측용 유전자 다형성 마커, 및 상기 유전자 다형성 마커를 이용한 뇌졸중 위험 예측 방법에 관한 것이다.
뇌졸중에 영향을 주는 유전 인자의 동정은 인종 및 지역적 배경에서 뇌졸중의 병인론과 관련된 많은 단서를 제공하는 것으로서 중요하다. 이런 지식은 뇌졸중에 대한 새로운 맞춤의학적 또는 민족을 기초로 하는 예방 또는 치료 약물을 개발하는데 기회를 제공한다. 최근 10년 동안, 유전체 관련성 연구(genome-wide association study, GWAS) 및 대조군 관련성 연구(control-case association study)로부터 5-리폭시게나제 활성 단백질 유전자(5-lipoxygenase activating protein gene, ALOX5AP), 포스포디에스테라제 4D 유전자(phosphodiesterase 4D gene, PDE4D)[Gretarsphotir et di., 2003; Hphgdphotir et di., 2004] 및 , 테di 키나 유di-에타(protein kinase i-eta, PRKiH)[Kubo et di., 2007] 등의 뇌졸중의 유전적 위험 인자를 동정하였다[Gretarsphotir et di., 2003; Hphgdphotir et di., 2004]pho굴러나, PDE4와 뇌졸중의 유전적 관련성은 아일랜드인을 포함하는 유럽xte는 관찰되었으나[Gretarsphotir et di., 2003], 일본인[Matsushita et di., 2009]과 한국인[Kim et di., 2009] 등의 아시아di또는 중앙 유럽x[Lohmussaar et di., 2005]te는 관찰되지 않았다. 이는 뇌졸중의 발생이 인종 및 지역i., 2매우 다양 PD나타나i-eta제시하는 것rspho, OX5상기 유전적 위험 인자는 특정 인종 및 지역을 기초중의 평가와 뇌 있다.
인간 내피 리파아제(endothelial lipase, LIPG)는 간성 리파아제(hepatic lipase) 및 지질단백 리파아제(lipoprotein lipase)를 포함하는 중성지방 리파아제(triglyceride lipase) 계열 중 하나이며, 인지질(phospholipid)을 가수분해하고 농도 의존적 이화작용을 통해 HDL 아포지질단백질(apolipoprotein)을 감소시킨다[Caren et al., 2009]. 면역학적 측면에서, LIPG는 대사 증후군의 조건 하에서 만성 염증에 대해 양성적으로 관련성이 있다. 또한, LIPG는 HDL과 음성적으로 관련성이 있으며, 비만 개체에서 비만, 중성지방 및 고혈압과 양성적으로 관련성이 있다[Badellino et al., 2006]. LIPG에서의 유전적 변이는 HDL 농도와 관련이 있음이 보고된 바 있다[Ordovas et al., 1999].
LIPG 유전자는 뇌 조직에서 발현되는데, 카이닌산(kainate)에 의해 유도되는 손상 부위에서 LIPG mRNA가 증가하지만 국소 뇌졸중 마우스 모델에서는 증가하지 않는 것으로 보아 LIPG 발현이 조건에 따라 다르게 조절된다는 것을 알 수 있다[Paradis et al., 2004]. 최근에, LIPG의 584C>T 다형성이 특히 일본인 여성에서 허혈성 뇌경색과의 관련성이 보고된 바 있다[Yamaguchi, 2006]. 그러나, LIPG 프로모터 단일염기다형성(rs9958947)과 뇌졸중에 대한 연관성 보고는 없었다.
이에, 본 발명자들은 뇌졸중 환자군-대조군 연관성 분석을 통해, LIPG 프로모터 부위의 단일염기다형성인 rs9958947에서 소수 대립유전자 T의 빈도 및 CT+TT 유전자형의 빈도가가 정상인에 비해 뇌졸중 환자에서 유의적으로 증가하여 상기 다형성이 뇌졸중에 대한 민감도에 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 특히 한국인에서 rs9958947과 뇌졸중의 연관성이 잘 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해 상기 다형성을 뇌졸중에 대한 위험 인자로서 사용할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 LIPG(endothelial lipase)의 프로모터 부위의 단일염기다형성인 rs9958947을 이용하여 뇌졸중의 위험을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 LIPG의 프로모터 부위를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs9958947에 있어서, 25번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 LIPG의 프로모터 부위를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs9958947에 있어서, 25번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드, 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어레이를 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 폴리뉴클레오티드의 소수 대립유전자 T의 빈도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 소수 대립유전자 T의 빈도에 비해 높은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 폴리뉴클레오티드의 유전자형 CT+TT의 빈도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 유전자형 CT+TT의 빈도에 비해 높은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 인간 LIPG 프로모터 부위의 단일염기다형성인 rs9958947의 소수 대립유전자 T 또는 CT+TT 유전자형의 빈도가 정상인에 비해 뇌졸중 환자, 특히 한국인에서 유의적으로 증가하며, 이런 rs9958947과 허혈성 뇌졸중의 연관성이 다중 인자에 대한 적용 후에 현저하게 나타나는 것을 확인함으로써, 상기 유전자 다형성을 마커로 이용하여 뇌졸중의 위험을 신속하고 용이하게 예측할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 LIPG(endothelial lipase)의 프로모터 부위를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs9958947에 있어서, 25번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진 뇌졸중 위험 예측용 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP) 마커를 제공한다.
본 발명에서는 허혈성 뇌졸중 환자와 정상인을 대상으로 정맥혈을 채취한 후, 게놈 DNA를 정제한 다음, 정제된 게놈 DNA로부터 단일-염기 연장 반응(single-base extension reaction)을 수행하여 rs9958947의 유전자형을 결정하였다.
본 발명에서는 rs9958947 다형성과 뇌졸중의 연관성을 알아보기 위해, 허혈성 뇌졸중 환자와 정상인을 대상으로 다중 로지스틱 회귀분석(Multiple logistic regression)을 이용하여 연관성을 분석하였다. 그 결과, rs9958947의 소수 대립유전자 (T)가 뇌졸중 환자에서 유의적으로 보다 더 높은 빈도를 나타내었다. 또한, 우성 모형(dominant model)에서 CT/TT 유전자형을 갖는 대상의 수가 뇌졸중 환자군에서 증가하였다.
본 발명에서는 rs9958947 다형성과 뇌졸중의 연관성이 여러 임상적 인자에 의해 영향을 받는지 알아보기 위해, 여러 임상적 인자를 적용한 후 상기와 같이 다중 로지스틱 회귀분석을 수행하였다. 그 결과, rs9958947과 허혈성 뇌졸중의 유전적 연관성은 성(sex), 연령(age), 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연, 음주, 허리, TC, HDL 등의 다중 인자에 대한 적용 후에 현저히 나타났다.
즉, LIPG의 프로모터 부위의 다형성인 rs9958947의 소수 대립유전자 T 또는 유전자형 CT/TT의 빈도가 대조군과 허혈성 뇌졸중 환자 사이에 통계학적으로 유의적인 차이가 있음을 확인하였다.
따라서 본 발명의 rs9958947 단일염기다형성이 뇌졸중에 대한 민감도에 영향을 주는 것을 알 수 있으며, 이를 뇌졸중의 위험을 예측하는 다형성 마커로 이용할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다형성 마커를 구성하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드, 또는 그의 cDNA를 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 rs9958947에 있어서, 25번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그들과 혼성화 하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조 일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이 용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다형성 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트를 제공한다.
상기 프라이머쌍은 상기 다형성 부위를 증폭할 수만 있다면 크기 및 주형에 결합하는 위치가 제한되지 않으며, 당업자라면 통상의 프라이머 선정용 소프트웨어를 이용하여 용이하게 프라이머의 고안이 가능하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 마이크로어레이를 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트는 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(streptavidin-like phosphatase conjugate), 화학형광물질(chemifluorescence) 및 화학발광물질(chemiluminescence)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키트는 추가적으로 반응 시약을 포함할 수 있으며, 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다.
또한, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 본 발명의 다형성 마커의 소수 대립유전자 T의 빈도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 소수 대립유전자 T의 빈도에 비해 높은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 대립유전자의 빈도 측정은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립 유전자 혼성화 방법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 및 실시간 PCR로 구성된 군으로부터 선택되는 것에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 본 발명의 다형성 마커의 유전자형 CT+TT의 빈도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 유전자형 CT+TT의 빈도에 비해 높은 피 검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 유전자형의 빈도 측정은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, PCR 연장 분석, 실시간 PCR 분석, FRET 분석 및 MALDI-TOF를 이용한 서열 분석(MALDI-TOF based mini-sequencing assay)로 구성된 군으로부터 선택되는 것에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 개체는 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서는 rs9958947 다형성과 뇌졸중의 연관성을 다중 로지스틱 회귀분석을 이용하여 연관성을 분석한 결과, rs9958947의 소수 대립유전자 (T)의 빈도가 뇌졸중 환자에서 정상인에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내었고, CT/TT 유전자형의 빈도가 뇌졸중 환자에서 정상인에 비해 유의적으로 높은 수치를 나타내었으며, 이런 결과는 성(sex), 연령(age), 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연, 음주, 허리, TC, HDL 등의 다중 인자에 대한 적용 후에 뚜렷하게 유효하였다.
따라서, rs9958947의 소수 대립유전자 (T)의 빈도 또는 유전자형 CT/TT의 빈도의 변화를 측정함으로써 뇌졸중의 위험을 예측할 수 있음을 알 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것은 아 니다.
<실시예 1> 실험 대상의 선정
본 발명자들은 실험 대상으로 유전적으로 관련이 없는 뇌경색(cerebral infarction, CI) 환자군(n=656) 및 대조군(n=488)을 대한민국 12개의 병원으로부터 모집하였다. 모든 환자들은 기본적인 건강검진 및 CT/MRI 검사를 받았다. 뇌졸중(stroke) 징후를 가진 사람들은 대조군에서 제외시켰다. 또한, 당뇨병을 가진 환자들은 위험인자의 효과와 혼동하는 것을 최소화하기 위해, 대조군과 뇌경색 환자군 모두에서 제외시켰다. 성별에 따른 차이는 존재하지 않았으며, 모든 환자들로부터 서면 동의서를 받았다. 실험 프로토콜은 한국한의학연구원의 기관감사위원회(Institutional Review Board)와 환자들을 모집한 지역 병원에 의해 승인받았다.
<실시예 2> 실험 대상의 임상적 특성 분석
본 발명자들은 실험 대상의 임상적 특성을 통계학적으로 분석하였다. 구체적으로, 임상적 분석에 있어서, 공복혈당(fasting blood sugar, FBS) 및 혈청 지질[예를 들면, 총 콜레스테롤(TC), 트리글리세라이드(triglyceride, TG) 및 HDL]은 자동화된 생화학 분석기(biochemical analyzer)를 이용하여 획득하였다. LDL을 계산하는 Friedwald 공식[LDL-C = TC-(HDL-C + TG/5)]은 대상의 트리글리세라이드 수준이 400 mg/dL 이하인 경우에만 적용하였다.
통계학적 분석은 SAS 소프트웨어 버전 9.1.3(SAS Institute Inc, NC, U.S.A) 을 이용하였다. 범주형 변수(categorical variable)는 카이스퀘어 테스트(Chi-square test)로 비교하였다. 모든 연속변수(continuous variable)는 Kolmogorov-Smirnov 정규분포성 테스트(normality test)를 수행하였다. 연속변수의 차이는 모수적 테스트(Parametric test)(Student's t-test 및 분산분석법[ANOVA]) 또는 비모수적 테스트(non-parametric test)(Wilcoxon rank-sum test 및 Kruskal-Wallis test)를 이용하여 결정하였다. 이하, 실험에서 통계학적 분석은 이와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 뇌졸중 환자군이 대조군에 비해 남성과 연장자를 더 많이 포함하였다. 전형적인 뇌졸중 위험인자인 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연 및 음주 상태는 뇌졸중 환자군이 대조군에 비해 더 높았다. 또한, 비만지표인 허리둘레는 뇌졸중 환자군이 대조군에 비해 유의성 있게 더 높았다. 또한, 뇌경색 환자군은 대조군에 비해 더 낮은 TC 및 HDL 수준을 보여주었다. 그러나 대조군과 뇌경색 환자군의 모든 지질 수준은, 지질학 및 동맥경화증에 대한 한국 권장 지질 수준 지침에 따른 정상 혈중 지질 범위(TC=200 mg/dL 이하, TG=150 mg/dL 이하, HDL-C=40 mg/dL 이상, LDL-C=130 mg/dL 이하) 내에 있었다.
실험대상의 통계학적 및 임상적 특성
특성 대조군 (N=488) 환자 (N=656) P P*
성 (M/F) 213/275 350/306 0.0012
나이 62 (55, 68) 68 (59, 74) <.0001 <.0001
HT (Y/N)a 68/418 366/284 <.0001
HL (Y/N)a 24/460 52/589 0.0369
IHD (Y/N)a 9/475 37/605 0.0011
Smoking(1/2/3)b 28/266/191 195/104/355 <.0001
Drinking(1/2/3)b 154/31/299 241/56/357 0.0447
Waist(cm) 83.88±8.39 86.0 (80.0, 92.0) 0.0003 0.0002
FBS 98.0 (92.0, 105.0) 98.0 (89.0, 109.5) 0.4284 0.8887
TC 198.0 (177.0, 224.0) 187.0 (163.0, 212.0) <.0001 <.0001
TG 129.0 (89.0, 180.0) 121.0 (88.0, 179.0) 0.7947 0.7063
HDL 51.5 (43.2, 59.9) 41.0 (33.7, 49.0) <.0001 <.0001
LDL 117.1 (98.8, 141.6) 117.6 (95.4, 138.6) 0.4301 0.4376
통계적으로 유의성 있는 p값을 굵은 글씨로 표시하였다.
*Wilcoxon Two-sample Test.
a1HT(hypertension): 고혈압; HL(hyperlipidemia): 고지혈증; IHD(ischemic heart disease): 허혈성 심질환.
b1=현재 흡연중, 2=금연중, 3=흡연한적 없음.
<실시예 3> DNA 정제 및 유전자형(genotyping) 분석
본 발명자들은 하룻밤 동안 금식시킨 실험 대상으로부터 EDTA(BD Biosciences, FranklinLakes, NJ, U.S.A.)가 포함된 정맥혈 검체 용기(Venous Blood Collection Tube)를 이용하여 정맥 전혈을 채취하였다. 상기 전혈로부터 15분 동안 1,500 g에서 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 그런 다음, 제조사의 지시에 따라 GeneAll genomic isolation kit(GeneAll co., Seoul, Korea)를 이용하여 림프구를 포함하는 연막(buffy coat)으로부터 게놈 DNA를 정제하였다. 상기 정제된 게놈 DNA로부터 MassARRAYTM(Sequenom, San Diego, CA, USA)와 하기 표 2에 기재된 증폭/연장 PCR 프라이머를 이용한 단일-염기 연장 반응(single-base extension reaction)에 의해 rs9958947의 유전자형을 결정하였다(rs9958947의 염기서열: GAGAGACAGAGTGGGAACAACATATC[C/T]GGGGGTGATATTTACCATCGCACAC; 서열번호 1). 유전자형 정확도의 검사는 대상 검체의 5%를 차지하는 52개의 DNA 샘플 중, rs9958947을 포함하는 게놈 부위의 전장 서열에 의해 수행되었다.
rs9958947 유전자형에 사용되는 프라이머
SNP 프라이머 ID 서열
rs9958947 PCR 5'-ACGTTGGATGTGAAGAGAGAGACAGAGTGG-3' (서열번호: 2)
5'-ACGTTGGATGGGCGGGCTTTAGTTTTTTAG-3' (서열번호: 3)
genotyping 5'-ACAGAGTGGGAACAACATATC-3' (서열번호: 4)
또한, 대조군에서 rs9958947의 빈도가 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)을 만족하는지 여부는 P 값이 0.01 이상을 갖는 것으로 판단하였고, HapAnalyzer 소프트웨어 버전.1.0.1(http://hap.ngri.go.kr/)을 이용하여 결정하였다.
그 결과, 대조군에서 rs9958947의 소수 대립유전자 (T)의 빈도는 0.438이었으며, 이는 HWE(chi square value=0.127, P-value=0.7214)을 만족하였다.
<실시예 4> rs9958947과 임상 인자와의 연관성 조사
본 발명자들은 뇌졸중 발병과 rs9958947에 대한 연관성을 알아보기 위해, 다중 로지스틱 회귀분석(Multiple logistic regression)을 이용하여 분석하였다. 다중 로지스틱 회귀분석에 있어서, rs9958947과 뇌졸중 질환 상태 및 위험률(odds ratio, OR)은 95% 신뢰구간(confidence intervals, CI)으로 산출하였으며, 통계학적 유의성은 p<0.05로 판정하였다.
그 결과, 하기 표 3에서 보는 바와 같이, 성(sex) 및 연령(age)이 적용된 다중 회귀 모형에서 대립유전자 빈도는 거의 차이가 없으며(p=0.3340) 유전자형 빈도는 우성 모형에서 약간 증가 하였으나 통계학적으로 유의적인 차이는 나타나지 않았다(우성 모형에서 p=0.1240; 열성 모형에서 p=0.9222).
대립유전자 빈도
대립 유전자 대조군 CI *OR [95% CI] P
T 555 (56.86) 732 (55.79) 1.089
[0.916-1.294]		 0.3340
C 421 (43.14) 580 (44.21)
유전자형 빈도
모형 유전자형 대조군 CI *OR [95% CI] p
*Do TT 165 (33.81) 194 (29.57) 1.225
[0.946-1.588]		 0.1240
TC+CC 323 (66.19) 462 (70.43)
*R TT+TC 390(79.92) 538 (82.01) 0.985
[0.723-1.341]		 0.9222
CC 98 (20.08) 118 (17.99)
데이타는 빈도(%)로 나타내었다.
*OR은 성(sex) 및 연령(age)을 적용한 후의 데이타이다.
*DO 및 R은 각각 우성(dominant) 및 열성(recessive)를 나타낸다.
통계적으로 유의성 있는 p값을 굵은 글씨로 표시하였다.
반면에, 하기 표 4에서 보는 바와 같이, rs9958947과 허혈성 뇌졸중의 유전적 연관성은 성(sex), 연령(age), 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연, 음주, 허리, TC, HDL 등의 다중 인자에 대한 적용 후에 관찰되었다. 즉, rs9958947에서 소수 대립유전자 T의 빈도 및 CT+TT 유전자형의 빈도가가 정상인에 비해 뇌졸중 환자에서 유의적으로 증가하였다.
대립유전자 빈도
대립유전자 빈도
대립 유전자 대조군 CI *OR [95% CI] P
T 555 (56.86) 732 (55.79) 1.300
[1.000-1.691]		 0.0499
C 421 (43.14) 580 (44.21)
유전자형 빈도
모형 유전자형 대조군 CI *OR [95% CI] p
*Do TT 165 (33.81) 194 (29.57) 1.632
[1.094-2.435]		 0.0164
TC+CC 323 (66.19) 462 (70.43)
*R TT+TC 390(79.92) 538 (82.01) 1.174
[0.734-1.879]		 0.5024
CC 98 (20.08) 118 (17.99)
데이타는 빈도(%)로 나타내었다.
*OR은 성(sex), 연령(age), 고혈압, 고지혈증, 허혈성 심질환, 흡연, 음주, 허리, TC 및 HDL을 적용한 후의 데이타이다.
*DO 및 R은 각각 우성(dominant) 및 열성(recessive)를 나타낸다.
통계적으로 유의성 있는 p값을 굵은 글씨로 표시하였다.
이와 같이, 뇌졸중 발병과 rs9958947 다형성과의 연관성 분석 결과, LIPG 프로모터 부위의 단일염기다형성(rs9958947)의 대립유전자 및 유전자형 분포가 대조군과 허혈성 뇌졸중 환자 사이에 통계학적으로 유의적인 차이가 있음을 확인하였다. 따라서, LIPG 프로모터 부위의 단일염기다형성(rs9958947)이 허혈성 뇌졸중에 대한 민감도에 영향을 주는 것을 알 수 있다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 뇌졸중의 위험을 예측 또는 진단하는 칩 또는 키트 개발, 및 뇌졸중의 위험을 예측 또는 진단하는 방법을 개발하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (10)

  1. LIPG(endothelial lipase)의 프로모터(promoter) 부위를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs9958947에 있어서, 25번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍을 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  2. 제 1항에 있어서, 형광물질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  3. 제 1항에 있어서, 반응 시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  4. LIPG(endothelial lipase)의 프로모터(promoter) 부위를 구성하는, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 rs9958947에 있어서, 25번째 염기를 포함하고 20 내지 100개의 연속 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 인코딩되는 폴리펩티드, 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어 레이를 포함하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  5. 제 4항에 있어서, 형광물질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  6. 제 4항에 있어서, 반응 시약을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측용 키트.
  7. 1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 청구항 제 1항의 폴리뉴클레오티드의 소수 대립유전자 T의 빈도를 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 소수 대립유전자 T의 빈도에 비해 높은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 단계 2)의 대립유전자의 빈도는 시퀀싱 분석, 마이크로어 레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립 유전자 혼성화 방법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 및 실시간 PCR 분석으로 구성된 군으로부터 선택되는 것에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측 방법.
  9. 1) 피검체로부터 분리된 혈액 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    2) 단계 1)의 게놈 DNA 상에 존재하는 상기 청구항 제 1항의 폴리뉴클레오티드의 유전자형 CT+TT의 빈도를 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 측정 결과가 정상인의 유전자형 CT+TT의 빈도에 비해 높은 피검체를 뇌졸중 발생 위험이 높은 개체로 판정하는 단계를 포함하는 뇌졸중 위험 예측 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 단계 2)의 유전자형의 빈도는 시퀀싱 분석, 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR 연장 분석, 실시간 PCR 분석, FRET 분석 및 MALDI-TOF를 이용한 서열 분석(MALDI-TOF based mini-sequencing assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 위험 예측 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Neurobiol Dis. 2004 Mar;15(2):312-25. *
Stroke. 2002 May;33(5):1420-3. *

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