WO2011010870A9 - 초기 폐암 환자의 생존예측을 위한 유전마커와 이를 이용한 생존예측 방법 - Google Patents

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  • polynucleotide according to the present invention or its complementary polynucleotide is a polymorphic sequence.
  • Polymorphic sequenc refers to a sequence comprising a polymorphic site representing a monobasic polymorphism in a nucleotide sequence.
  • the polymorphic site refers to a site where a monobasic polymorphism occurs in the polymorphic sequence.
  • the polynucleotide may be DNA or RNA.
  • polymorphism refers to a case in which two or more alleles exist in one locus.
  • a single base polymorphism means that only a single base differs from person to person. It is called single nucleotide polymorphism (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Preferred polymorphic markers have two or more alleles that exhibit a frequency of at least 1%, more preferably at least 10% or 20% in the selected population.
  • the expression level of CASP7 and / or CASP9 can be determined by identifying the expression level of the mRNA or protein encoded by the CASP7 and / or CASP9 gene.
  • "mRNA expression level measurement” is a process of confirming the presence and expression level of mRNA of lung cancer marker gene in a biological sample in order to predict the risk of lung cancer and the prognosis of lung cancer survival, and can be known by measuring the amount of mRNA. Analytical methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting (Northern) blotting), DNA chips and the like, but are not limited thereto.
  • the term "probe” refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA, which is short to several bases to hundreds of bases capable of specific binding with mRNA, and labeled to identify the presence of a specific mRNA.
  • Probes may be prepared in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, and the like.
  • the mRNA levels of the CASP7 and / or CASP9 gene can be observed to predict lung cancer risk and lung cancer survival prognosis. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.
  • the step of obtaining a nucleic acid from the sample of step a) may be carried out by conventional methods and separation methods, such as phenol / chloroform extraction method and protease K treatment method, and also by amplifying and purifying the target nucleic acid by PCR You can get it.
  • Ligase chain reaction (LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4, 560, 1989, Landegren et al., Science 241, 1077, 1988), transcription amplification (Kwoh et al., Proc. 89, Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)), self-sustaining sequence replication (Gurenlli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1874 (1990)) and nucleic acid based sequence amplification (NASBA).
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Abstract

본 발명은 CASP7 및/또는 CASP9 유전자의 다형성을 이용한 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마커 및 이를 이용한 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 CASP7 및/또는 CASP9 유전자의 다형성에 근거한 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 조성물, 이를 이용한 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 키트, 마이크로 어레이 및 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.

Description

초기 폐암 환자의 생존예측을 위한 유전마커와 이를 이용한 생존예측 방법
본 발명은 CASP7 및/또는 CASP9 유전자의 다형성을 이용한 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마커 및 이를 이용한 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후 예측 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 CASP7 및/또는 CASP9 유전자의 다형성에 근거한 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 조성물, 이를 이용한 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 키트, 마이크로 어레이 및 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.
폐암은 전세계적으로 암으로 인한 사망에서 30%를 차지할 정도로 암으로 인한 사망의 주요 원인중의 하나이다. 이 중 전체 폐암의 75% 이상이 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)이며, 평균 5년 생존율이 15%에 해당한다. 폐암의 높은 사망률은 일부 절제 불가능한 종양을 가진 환자의 높은 비율과 관련되어 있다(Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al: Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin 55:74-108, 2005.). 또한 절제 가능한 병기 NSCLC 환자 중에서 가장 좋은 예후를 가질지라도, 외과적으로 절제한 환자의 상당수가 암의 재발로 사망하고 있음이 보고되고 있다(Arriagada R, Bergman B, Dunant A, et al: Cisplatin-based adjuvant chemotherapy for completely resected non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 350:351-60, 2004.). 따라서 폐암 환자들에 대한 예후 인자를 이용할 경우, 예후의 평가, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화 할 수 있어 폐암 환자의 맞춤 치료가 가능할 것으로 기대되고 있다. 이에 폐암 환자의 예후를 예측할 수 있는 분자 마커를 동정하기 위한 집중적인 연구가 국내외적으로 현재 실시되고 있으나, 아직까지 뚜렷한 연구 결과가 없는 실정이다.
한편, 최근 완성된 인간 유전자 지도를 바탕으로 유전자의 다형성이 개개인의 외모, 지능, 성격 등을 결정할 뿐만 아니라 질병에 대한 감수성과 질병이 발생한 후 중증도와 진행속도 등을 결정할 것으로 예상되고 있으며, 인간 개개인의 특성이 다양한 만큼 그 특성을 결정하는 유전인자 또한 매우 다양할 것으로 예상되고 있다. 일반적으로 개체간의 유전적 차이는 개체간의 DNA 염기서열의 차이에 의해 초래되고 이러한 염기서열의 차이는 변이(mutation)와 다형성(polymorphism)으로 구분되는데, 다형성은 미세한 표현형의 차이(phenotypic change)를 초래하며 그 빈도가 인구의 1% 이상인 경우 다형성 유전형으로 정의된다.
단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)은 유전체(genome) 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 말한다. 이러한 SNP의 2/3는 염기서열 중 C와 T간의 변이인 것으로 알려져 있고, SNP 변이는 보통 유전체상의 염기서열에서 1000개당 한번 꼴로 나타난다고 알려져 있다. 또한 SNP은 인간의 유전체에서 발생하는 변이의 약 90%를 차지하고 있고, 비슷한 형질이나 같은 가계도를 가지고 있는 사람들은 동일하거나 또는 비슷한 SNP 패턴을 보이기 때문에 임상에서 개체의 질병에 대한 감수성(susceptibility)을 예측하는 지표로 사용될 수 있고, 약물에 대한 효과 및 부작용을 예측할 수 있는 지표로 사용될 수 있을 것이다. 나아가 개체의 유전적 특성에 적합한 진단 및 치료전략을 구사하는 맞춤의학(personalized medicine)에 이용될 수 있고, SNP의 패턴과 질병기록을 잘 통합할 수 있다면 여러 가지 질병의 치료를 위한 의료 통계를 구축할 수 있을 것이다.
따라서 최근 들어 이러한 유전자의 다형성을 이용한 질병들에 대한 감수성을 예측하고 진단하는 방법들이 개발되고 있으며, 특히 암과 관련된 유전자의 다형성과 암과의 연관성에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있다. 그 중에서, 아폽토시스의 조절과 발생에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려진 카스파제(caspase, CASP)에 관한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 예를 들면 다음과 같다. CASP 유전자의 일부 다형성이 잠재적인 기능을 가지며 몇몇 유형의 암 위험성과 관련이 있다는 것이 여러 연구들에 의해 밝혀졌다(상기 참고문헌 등 참조). CASP8 프로모터의 -652 6-뉴클레오티드(CTTACT) 결실 변이체(rs3834129, -652 6N del)는 CASP8 유전자의 발현을 감소시키고 다발성 암 위험과 관련이 있는 것으로 보고되었다(Sun T, Gao Y, Tan W, et al: A six-nucleotide insertion-deletion polymorphism in the CASP8 promoter is associated with susceptibility to multiple cancers. Nat Genetic 39:605-13, 2007.). CASP8 D302H (rs1045485G>C)와 IVS12-19G>A (rs3769818) 다형성에 관한 기능이 알려지지 않았지만 다양한 유형의 암 위험과 관련된 것으로 보고되었다(Macpherson G, Healey CS, Teare MD, et al: Association of a common variant of the CASP8 gene with reduced risk of breast cancer. J Natl Cancer Inst 96:1866-9, 2004.; Son JW, Kang HK, Chae MH, et al: Polymorphisms in the caspase-8 gene and the risk of lung cancer. Cancer Genet Cytogenet 169:121-7, 2006.; Li C, Zhao H, Hu Z, et al: Genetic variants and haplotypes of the caspase-8 and caspase-10 genes contribute to susceptibility to cutaneous melanoma. Human Mutat 29:1443-51, 2008.). CASP9 유전자의 -1263A>G (rs4645978) 및 -712C>T (rs4645981) 다형성 및 이들의 일배체형(haplotype)은 CASP9 발현에 영향을 주고 페암 위험을 조절하는 것으로 보고되었다(Park JY, Park JM, Jang JS, et al: Caspase 9 promoter polymorphisms and risk of primary lung cancer. Human Mol Genet 15:1963-71, 2006.). CASP10의 V410I(rs13010627G>A) 및I522L(rs13006529A>T) 다형성은 피부 흑색종 및 가족성 유방암 위험과 관련이 있는 것으로 보고되었다(Frank B, Hemminki K, Wappenschmidt B, et al: Association of the CASP10 V410I variant with reduced familial breast cancer risk and interaction with CASP8 D302H variant. Carcinogenesis 27:606-9, 2006. 등). 개시 CASP 유전자 다형성 외에 CASP3 -928A>G (rs12108497), 77G>A(5-UTR에서) 및 IVS5-4A>C (rs2705897) 다형성 및 이들의 일배체형은 폐암 위험과 관련있는 것으로 보고되었다(Jang JS, Kim KM, Choi JE, et al: Identification of polymorphisms in the caspase-3 gene and their association with lung cancer risk. Mol Carcinogenesis 47:383-90, 2008.). CASP7 rs2227310C>G 다형성은 증가된 폐암 위험과 관련있는 것으로 보고되었다(Lee WK, Kim JS, Kang HG, et al: Polymorphisms in the caspase 7 gene and the risk of lung cancer. Lung Cancer (in press).).
종래의 카스파제 유전자의 다형성들은 주로 암에 대한 감수성을 진단하기 위한 용도로 연구되어 왔을 뿐, 카스파제 유전자의 다형성이 암 환자의 생존 결과와 관련되는지에 대하여는 연구되지 않았다. 이에 본 발명자들은 카스파제 유전자의 다형성과 폐암 환자의 생존 결과에 영향이 있는 것으로 착안한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 CASP7 유전자 및/또는 CASP9 유전자의 다형성의 부위를 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 다형성 마커의 증폭, CASP7 유전자 및/또는 CASP9의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 CASP7 유전자 및/또는 CASP9 유전자의 다형성 마커를 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 진단용 마커를 이용하여 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후를 예측 및 판단하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 유전자형에 따른 전체 생존 및 무병 생존 곡선을 나타낸다. (A) CASP7 rs2223710 GG 대 CC+GG 유전자형 (B) CASP9 rs4645981 TT 대 CC+TT 유전자형 및 (C) 두 개의 다형성(1 또는 2개의 불량 유전자형 대 불량 유전자형의 부존재)의 조합된 유전자형. 다변량 콕스 위험 모델에서의 P-값.
하나의 양태로서, 본 발명은 CASP7 유전자 및/또는 CASP9 유전자의 다형성 부위를 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마커에 관한 것이다.
보다 구체적인 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151 번째 염기가 C 또는 G이고 상기 1151 번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기(CASP9 유전자의 전사시작점으로부터 -712번째 염기)가 C 또는 T이고 상기 673번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 폐암 생존 예후 예측용 마커에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 상기 CASP7 유전자의 다형성 부위는 CASP7 유전자(진뱅크 번호: NM_033339.3)의 시작점으로부터 1151번째 염기에 해당하며, 상기 다형성 부위를 포함하고 있는 CASP7 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다. 한편, 상기 다형성 부위를 CASP7 -1151C>G또는 “CASP7 rs2227310C>G”로 표시한다.
또한, 본 발명에서 사용된 상기 CASP9 유전자의 다형성 부위는 CASP9 유전자(진뱅크 번호: AY214168)의 전사 시작점으로부터 712번째 염기에 해당하며, 상기 다형성 부위를 포함하고 있는 CASP9 유전자의 염기서열을 서열번호 2에 기재하였다. 한편, 상기의 다형성 부위를 CASP9 -712 C>T또는 “CASP9 rs4645981C>T”로 표시한다.
본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 60개, 보다 더 바람직하게는 40 내지 60개의 연속 염기로 구성된다.
본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열(polymorphic sequenc)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위(polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명에서 사용된 상기 CASP(caspase) 유전자는 시스테인 의존성 아스파테이트 특이 단백분해효소 패밀리로서 아폽토시스의 조절과 발생과 관련이 있는 유전자이다(Nicholson DW, Thornberry NA: Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci 22:299-306, 1997.; Budihardjo I, Oliver H, Lutter M, et al: Biochemical pathways of caspase activation during apoptosis. Annu Rev Cell Dev Biol 15:269-90, 1999.; Degterev A, Boyce M, Yuan J: A decade of caspases. Oncogene 22:8543-67, 2003.). CASP의 세포사멸촉진 기능에 기초하여 카스파제는 개시 및 작동 카스파제로 분류할 수 있는데, 개시 카스파제(initiator CASPs) (CASP8, CASP9 및 CASP10)은 아폽토시스 시그널을 전달하고 최종 세포사 프로그램을 실행하는 작동 카스파제(effector CASPs) (CASP3, CASP6 및 CASP7)를 활성화시킨다(Fuentes-Prior P, Salvensen GS: The protein structures that shape caspases activity, specificity, activation and inhibition. Biochem J 384:201-32, 2004. 등). 그러나 아직까지 CASP 유전자의 다형성과 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측에 관한 연구는 보고된 바 없다.
따라서 본 발명자들은 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 표적 유전자로 아폽토시스와 연관성이 있는 CASP 유전자를 선택하였고, 상기 CASP 유전자의 다형성 부위가 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측과 상관성이 있을 것이라고 추정하였다.
이에 본 발명자들은 새로운 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마커를 발굴하기 위하여 다양한 CASP 유전자의 다형성이 폐암 생존 예후와 상관관계를 가지고 있는지 조사하였다. 이를 위하여, 먼저 411명의 폐암 환자, 특히 비소세포암 환자를 선별하였고(실시예 1 참조), 이들로부터 DNA를 각각 추출한 후, PCR 등의 방법으로 여러 CASP 유전자로부터 유래된 9개의 다형성 부위를 확인하고 통계학적 분석 등을 통하여 폐암 생존 예후의 예측과의 상관관계를 조사하였다(실시예 2 참조).
그 결과 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151번째 염기의 유전자형이 적어도 하나의 C 대립유전자를 가진 CC 또는 CG일 경우 GG에 비하여 폐암 생존 예후가 우수하였으며, 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기의 유전자형이 T 대립유전자에 대하여 열성일 경우 폐암 생존 예후가 우수하였다. 또한, CASP7 유전자의 다형성 및 CASP9 유전자의 다형성을 조합시킨 경우 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151번째 염기의 유전자형이 GG인 경우 및/또는 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기의 유전자형이 TT인 경우 폐암 생존 예후가 우수하지 않았다(실시예 4, 표 3 및 4 참조).
본 발명에서 용어, “예후”는 폐암과 같은 신생물 질환의 예를 들어 발병, 재발, 전이성 확산, 및 약물 내성을 비롯한 폐암-기인성 사망 또는 진행의 가능성 등의 병의 경과 및 완치 여부를 의미한다. 본 발명의 목적상 예후는 폐암의 발병 위험성 및 폐암 발병 후의 생존 예후를 의미하며, 바람직하게는 폐암을 수술로 절제한 환자, 보다 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자의 예후를 의미한다. 폐암의 이상적인 치료법은 조기발견하여 수술로 완전히 암을 제거하는 것이지만, 폐암의 진단시 환자의 반수 이상이 수술을 할 수 없을 정도로 진행된 상태이므로 조기치료는 현실적으로 어렵다. 본 발명의 상기 방법을 이용하면 폐암 발병 위험성을 손쉽게 예측할 수 있으며, 폐암 발병 위험성을 관리함으로써 폐암을 조기발견하여 수술로 암을 완전히 제거하여 완치시킬 수 있다. 또한, 폐암 발병 후의 경우, 특히 비소세포암은 외과적 수술을 할 수 있을 만큼 진행되지 않은 경우라면 우선 수술을 시행하는데, 근치절제술을 시행할 수 있는 경우는 30%에 불과하다. 본 발명의 상기 다형성 마커를 이용하면 폐암의 이러한 예후를 손쉽게 판단할 수 있으며, 추가 필요한 치료 방법의 사용 여부를 손쉽게 결정할 수 있다. 이로써 폐암 발병 후의 생존율을 현저히 높일 수 있다.
본 발명에서 용어, "예측"이란 환자가 폐암 발병할 가능성이 있는지를 판별하고, 화학요법 또는 방사선 치료 등 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료, 예를 들어 특정 치료제, 및/또는 원발성 종양의 수술로 제거, 및/또는 암 재발 없이 특정 시기 동안 화학요법으로 치료된 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 폐암 발병 위험성이 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 폐암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측할 수 있다.
본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명에서 용어, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에서 용어, "폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 다형성 마커"란 폐암 발병 위험성, 발병한 폐암의 완치 여부, 혹은 경과를 예측할 수 있는 다형성을 가진 마커를 의미하며, 바람직하게는 상기에서 서술한 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 또한, 상기 환자는 폐암 발병 위험성을 판별하기 위한 환자 또는 폐암, 특히 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미한다. 상기 폐암을 수술로 절제한 환자는 바람직하게는 비소세포암, 편평상피암, 선암, 대세포암 등의 폐암을 수술로 절제한 환자를 의미하며, 보다 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자를 의미한다. 상기 폐암은 바람직하게 병리학적 병기가 제 I기를 의미한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151 번째 염기가 C 또는 G이고 상기 1151 번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기(CASP9 유전자의 전사시작점으로부터 -712번째 염기)가 C 또는 T이고 상기 673번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 CASP7 유전자 또는 CASP9의 유전자의 다형성 마커의 증폭, CASP7 유전자 또는 CASP9의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, “CASP7 유전자 또는 CASP9의 유전자의 다형성 마커의 증폭, CASP7 유전자 또는 CASP9의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정할 수 있는 제제”란 상기와 같은 CASP7 -1151C>G 또는 CASP9 -712 C>T 다형성 마커를 증폭을 통해 확인하거나, CASP7 유전자 또는 CASP9의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 수준을 확인하여, 폐암 생존 예후를 확인할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 마커를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 발현수준을 확인할 수 있는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 의미한다.
CASP7 유전자 또는 CASP9 유전자의 다형성 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
CASP7 및/또는 CASP9의 발현 수준은 CASP7 및/또는 CASP9 유전자의 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측을 위하여 생물학적 시료에서 폐암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 폐암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, CASP7 유전자의 염기 서열이 진뱅크 접근번호 NM_033339.3 및 CASP9 유전자의 염기 서열이 진뱅크 접근번호 AY214168에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 CASP7 및/또는 CASP9 유전자의 mRNA 수준을 관찰하여, 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. 본 발명에서 용어, “항체”란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 CASP7 및/또는 CASP9에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 조성물을 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마커인 CASP7 -1151C>G 및/또는 CASP9 -712 C>T 다형성 마커를 증폭을 통해 확인하거나, CASP7 및/또는 CASP9의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후를 예측할 수 있다. 본 발명의 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 키트에는 CASP7 및/또는 CASP9의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 CASP7 및/또는 CASP9의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, CASP7 및/또는 CASP9 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 폐암 생존 예후 예측용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
다른 하나의 구체적인 일례로서, 본 발명에서 CASP7 및/또는 CASP9의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151 번째 염기 C 또는 G이고 상기 1151 번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기(CASP9 유전자의 전사시작점으로부터 -712번째 염기)가 C 또는 T이고 상기 673번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 CASP7 또는 CASP9 유전자의 다형성 마커 중의 하나 이상을 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마이크로어레이를 제공한다.
상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.
프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등(Science 254, 1497-1500(1991))에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하여 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5×SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.
본 발명의 폐암과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계, (b) 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151 번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기(CASP9 유전자의 전사시작점으로부터 -712번째 염기)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 중의 어느 하나 이상을 증폭하는 단계, 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 폴리뉴클레오티드 중 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151번째 염기의 유전자형 또는 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기의 유전자형 중의 어느 하나 이상의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법 중 a) 단계의 검체는 폐암 발병 위험성을 예측하고자 하는 환자 또는 폐암 생존 예후를 예측하기 위한 폐암 환자로서, 상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암으로, 바람직하게는 비소세포암을 수술로 절제한 환자이다. 상기 검체에서 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등으로부터 핵산을 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 a)단계의 검체로부터 핵산을 얻는 단계는 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리방법과 같은 통상의 방법과 분리방법에 의하여 수행될 수 있으며, 또한 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560, 1989, Landegren 등, Science 241, 1077, 1988), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc.89,Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)), 자가유지 서열 복제 (Gurenlli 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA89, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 방법 중 c)단계의 유전자형 결정은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행될 수 있다.
나아가, 각각의 검체로부터 상기 c) 단계의 유전자형 결정을 통해 수득한 CASP7 유전자 다형성 및 CASP9 유전자 다형성의 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선 분석(linear regression line analysis), 다중 기호 회귀 분석(multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio), 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.
상기 c) 단계에서 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151번째 염기의 유전자형 및/또는 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기의 유전자형을 결정하여 폐암 생존 예후를 예측하고자 할 때, 상기 c) 단계에서 결정된 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151번째 염기의 유전자형이 GG이거나 또는 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기의 유전자형이 TT일 경우에는 폐암 발병 위험성이 증가되고, 폐암 생존이 감소되는 것으로 판단할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 c) 단계에서 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151번째 염기의 염기가 G일 경우에는 폐암 발병 위험성이 높거나 폐암 생존 예후가 나쁜 것으로 판단하며, 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기의 염기가 T일 경우에는 폐암 발병 위험성이 높거나 폐암 생존 예후가 나쁜 것으로 판단할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: 연구 대상의 선정
본 발명의 모든 환자들(411명)은 병기 제I기, 제II기 또는 제III기(마이크로-침윤 N2)의 비소세포암 환자로, 경북대학교 병원(대한민국, 대구)에서 1997년 1월부터 2006년 12월 사이에 외과적인 치료 절제수술을 받은 환자들이다. 상기 환자들은 모두 한국인으로, DNA에 관한 영향을 회피하기 위하여 수술 전에 화학요법 또는 방사선요법을 받은 환자는 제외하였다. 수술시에 모든 조직들을 수거하고, 신속히 액체 질소로 동결시킨 후, 본 실험과 관련된 생물학적 분석(bioassay) 수행 전까지 -80℃에서 보관하였다. 폐암 환자의 조직학적 유형은 세계보건기구 분류(Brambilla E, Travis WD, Colby TV, et al: The new World Health Organization classification of lung tumors. Eur Respir J 18:1059-68, 2001.)에 따라 분류하였으며, 환자들은 248명(57.4%)의 편평상피암(squamous cell carcinomas, SQs) 환자, 152명(37.0%)의 선암(adenocarcinomas, ACs) 환자 및 11명(2.7%)의 대세포암(large cell carcinomas)으로 구성되었다. 종양의 병리학적 병기는 폐암 병기에 대한 국제 시스템(International System for Staging Lung Cancer)에 따라 결정하였으며, 환자들은 236명(57.4%)의 병기 제I기, 62명(15.1%)의 병기 제II기, 113명(27.5%)의 병기 제IIIA기로 구성되었다. 수술 전 모든 환자들로부터 서면 동의서를 받았으며, 경북대학교 병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받았다.
실시예 2: 다형성 선택과 유전형
잠재적인 기능성이 있거나 발암 위험성과 관련이 있는 것으로 보고된 CASP3, CASP7, CASP8, CASP9 및 CASP10의 11개 다형성 중에서 9개(CASP3 rs12108497, 77G>A 및 rs2705897; CASP7 rs2227310; CASP8 rs3834129 and rs3769818; CASP9 rs4645978 및 rs4645981; 및 CASP10 rs13006529)가 조사되었으며, CASP8 rs1045485 및 CASP10 rs13010627은 아시아인에서 매우 드물거나 존재하지 않으므로 제외하였다. rs12108479, rs3834129, rs3769818, rs4645978 및 rs4645981 다형성의 유전자형을 이전 연구에서 보고된 바와 같은 방법(Son JW, Kang HK, Chae MH, et al: Polymorphisms in the caspase-8 gene and the risk of lung cancer. Cancer Genet Cytogenet 169:121-7, 2006.; Park JY, Park JM, Jang JS, et al: Caspase 9 promoter polymorphisms and risk of primary lung cancer. Human Mol Genet 15:1963-71, 2006.; Jang JS, Kim KM, Choi JE, et al: Identification of polymorphisms in the caspase-3 gene and their association with lung cancer risk. Mol Carcinogenesis 47:383-90, 2008.)을 사용하여 PCR-RFLP 분석으로 확인하였다. CASP3 77G>A, rs2705897, rs2227310 및 rs13006529 유전자형은 이전 연구에서 보고된 바와 같은 방법(Jang JS, Kim KM, Choi JE, et al: Identification of polymorphisms in the caspase-3 gene and their association with lung cancer risk. Mol Carcinogenesis 47:383-90, 2008.; Lee WK, Kim JS, Kang HG, et al: Polymorphisms in the caspase 7 gene and the risk of lung cancer. Lung Cancer (in press).)으로 형광표지부합화탐침 (fluorescence-labeled hybridization probes) (LightCycler 480, 로쉬 진단, 독일, 만하임)을 사용하여 PCR 및 융해곡선 분석으로 확인하였다. 정확한 결과를 도출하기 위해, 유전자형 분석은 환자에 대한 지식 없이 수행하였다. 또한, 시료의 약 10%를 임의로 선택하여 다시 다른 사람에 의해 유전자형을 분석하게 하였으며, 그 결과 100% 일치된 결과를 얻었다. 유전자형 결과를 한번 더 확인하기 위해, 선택된 PCR-증폭 DNA 시료(각 유전자형에 대하여 n=10)를 DNA 염기서열 분석(sequencing)으로 확인한 결과 또한 유전자형 분석과 100% 일치하였다.
실시예 3: 통계학적 분석
유전자형 및 병기 전체에 걸쳐 카테고리별 변수에 대한 χ2 테스트를 사용하여 인구통계학 및 임상학적 정보를 비교하였다. 적합도 검정(goodness-of-fit) χ2 테스트를 사용하여 1 자유도(one degree of freedom)로 하디-웨인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)을 테스트하였다. 다형성 간의 연관 비평형(linkage disequilibrium, LD) 계수는 하플로뷰(HaploView, http://broad.mit.edu/mpg/haploview)로 D’ 및 r2로 측정하였다. 일배체형(haplotype) 및 그 빈도는 상 프로그램(Phase program)을 사용하여 바에시안 알고리즘(Bayesian algorithm)을 기초로 계산하였다(Stephens M, Smith MJ, Donnelly P: A new statistical method for haplotype reconstruction from population data. Am J Hum Genet68:978-89, 2001.). 전체 생존(overall survival, OS)을 수술한 날부터 어떤 원인으로 죽는 날까지 또는 마지막 추적 조사 날까지로 추정하였다. 무병생존(disease-free survival, DFS)을 수술한 날부터 어떤 원인으로 재발 또는 사망하는 날까지로 계산하였다. 생존 분석은 카프란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 계산하였다. 전체 다른 유전자형에서 OS 또는 DFS의 차이를 로그-순위 검정법(log-rank test)을 사용하여 비교하였다. 위험비(Hazard ratio, HR) 및 95% 신뢰구간(confidence intervals, CIs)을 다변량 콕스의 비례위험모형(multivariate Cox proportional hazards models)을 사용하여 계산하였고, 이를 연령(≤63세 대 >63세), 성별(남자 대 여자), 흡연 상태(비흡연자 대 흡연경험자), 및 병리학적 병기(제I기 대 제II IIIA기)로 보정하였다. 모든 분석은 윈도우 프로그램을 위한 통계 분석 시스템 9.1 버전(Statistical Analysis System for Windows, version 9.1) (SAS Institute, 미국)을 사용하여 수행하였다.
실시예 4: 환자의 특성 및 임상 예견
환자들의 임상학적 특징 및 병리학적 특징, 및 그들의 전체 생존(OS) 및 무병생존(DFS)과의 연관을 하기 표 1에 나타내었다. 167명(40.6%)이 사망하였고, 모든 환자에 대해 계산한 전체 5년 생존(OS) 및 무병생존(DFS)은 각각 49.3%(95% CI = 42.9% ~ 55.3%) 및 40.8% (95% CI = 34.9% ~ 46.7%) 이었다. 단일변량 분석에 의해 병리학적 병기가 전체 생존(OS) 및 무병생존(DFS)과 유의적으로 연관되어 있다는 것을 알 수 있었다(모두 P<0.001).
표 1
Figure PCTKR2010004779-appb-T000001
실시예 5: 유전자형 빈도와 전체생존(OS) 및 무병생존(DFS)에 대한 영향
조사된 다형성에 관한 기술적 정보를 표 2에 나타내었다. 9개의 다형성의 유전자형 분포를 하디-웨인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)으로 분석하였다. 9개의 다형성의 어느 것도 환자- 또는 종양-연관 인자인 연령, 성별, 흡연상태, 조직학적 하위유형, 또는 병리학적 병기와 같은 인자들과 유의적인 연관이 없었다(데이터는 제시하지 않음).
표 2
Figure PCTKR2010004779-appb-T000002
9개의 다형성 중 2개의 다형성(CASP7 rs2227310C>G 및 CASP9 rs4645981C>T)만이 전체 생존(OS) 및 무병생존(DFS) 모두에 유의적으로 연관되어 있었다(변이대립유전자(variant allele)에 대한 열성 모델 하에서 OS에 대한 로그-순위 P는 각각 0.0006 및 0.039임 및 DFS에 대한 로그-순위 P는 모두 0.0008임 표 2 참조). 본 발명의 연구 개체에서의 생존 결과에 관한 CASP7 rs2227310 및 CASP9 rs4645981 다형성 영향을 표 3 및 도 1에 나타내었다. CASP7 rs2227310 GG 유전자형은 rs2227310 CC 또는 CG 유전자형보다 더 나쁜 OS 및 DFS를 나타내었다 (OS에 대한 조정된 HR[aHR] = 1.62, 95% CI = 1.15-2.27, P = 0.006; 및 DFS에 대한 HR[aHR] = 1.56, 95% CI = 1.15-2.14, P = 0.005). 또한, CASP9 rs4645981C>T는 변이 T 대립유전자에 대한 열성 모델 하에서 OS 및 DFS에 관한 유의적인 효과를 나타내었다.
[규칙 제91조에 의한 정정 14.01.2011]　
표 3
Figure WO-DOC-TABLE-3
본 발명자들은 CASP7 rs2227310C>G 및 CASP9 rs4645981C>T 다형성을 조합시킨 경우의 효과를 분석하기 위하여 탐색검정을 실시하였다. CASP7 rs2227310 GG 및 CASP9 rs4645981 TT 유전자형을 불량 유전자형으로 고려하였을 때, 1 또는 2개의 불량유전자를 가진 환자들은 불량유전자를 가지지 않은 환자들과 비교하여 더 나쁜 OS 및 DFS를 나타내었다(OS에 대한 aHR = 1.75, 95% CI = 1.26-2.44, P = 0.0009; 및 DFS에 대한 aHR = 1.70, 95% CI = 1.26-2.30, P = 0.0005; 표 4 및 도 1 참조).
[규칙 제91조에 의한 정정 14.01.2011]　
표 4
Figure WO-DOC-TABLE-4
조직학적 하위유형(histologic subtype) 및 병리학적 병기(pathologic stage)로 환자를 분류한 후에 유전자형의 조합과 환자의 생존의 관련성을 조사하였다. 종양을 조직학적으로 분류할 때, 1 또는 2개의 불량 유전자형의 존재는 SQ를 가진 환자에서 불량 유전자의 부존재에 비해 유의적으로 더 나쁜 생존을 나타내었으나(OS에 대한 aHR = 1.93, 95% CI = 1.26-2.97, P = 0.003; 및 DFS에 대한aHR = 1.74, 95% CI = 1.16-2.60, P = 0.007), AC를 가진 환자에서는 그러하지 않았다(OS에 대한 aHR = 1.43, 95% CI = 0.82-2.48, P = 0.20; 및 DFS에 대한aHR = 1.43, 95% CI = 0.88-2.32, P = 0.15). 종양을 병리학적으로 분류할 때, 1 또는 2개의 불량 유전자형의 존재는 병기 제I기의 환자에서 불량 유전자의 부존재에 비해 유의적으로 더 나쁜 생존을 나타내었다(OS에 대한aHR = 2.17, 95% CI = 1.31-3.61, P = 0.003; 및 DFS에 대한 aHR = 1.86, 95% CI = 1.17-2.95, P = 0.009); 그러나 조합된 유전자형은 병기 제II기 제IIIA기의 환자에서 생존에 대하여 유의적인 효과를 나타내지 않았다(OS에 대한 aHR = 1.50, 95% CI = 0.97-2.33, P= 0.07; 및 DFS에 대한 aHR = 1.51, 95% CI = 0.62-3.67, P = 0.36).
실시예 6: 다변량 분석(multivariate analysis)
콕스의 비례위험모형(Cox’s proportional hazard model)을 사용한 다변량 분석에서 rs2227310 및 rs4645981의 조합된 유전자형(1 또는 2개의 불량 유전자형 대 0개의 불량 유전자형의 OS에 대한 HR = 1.66, 95% CI = 1.22-2.26, P = 0.001; 및 1 또는 2개의 불량 유전자형 대 0개의 불량 유전자형의 DFS에 대한 HR = 1.74, 95% CI = 1.24-2.44, P = 0.001)과 병리학적 병기(제II기 또는 제IIIA기, 대 제I기의 OS에 대한 HR = 2.43, 95% CI = 1.83-3.23, P < 0.001; 및 제II기 또는 제IIIA기, 대 제I기의 DFS에 대한HR = 2.16, 95% CI = 1.56-2.97, P < 0.001)는 NSCLCs 환자의 생존에 관한 독립적인 예후 인자임을 나타내었다 (표 5 참조).
표 5
Figure PCTKR2010004779-appb-T000005
본 발명에 따른 폐암 발병 위험성 및 생존 예후의 예측 기술은 폐암 미발병 환자에서의 폐암 발병 위험성을 미리 예측하여 폐암 발병 위험성이 높은 환자에 대하여 적절하고 특별한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 폐암 발병 위험성 및 생존 예후의 예측 기술은 폐암이 발병한 환자에 대하여 손쉽게 환자의 예후를 평가하고, 치료법의 선발 및 평가를 위한 수단 및 치료를 표적화함으로써 폐암 발병 환자의 생존율을 높일 수 있다.

Claims (15)

  1. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151 번째 염기가 C 또는 G이고 상기 1151 번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기(CASP9 유전자의 전사시작점으로부터 -712번째 염기)가 C 또는 T이고 상기 673번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암인 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마커.
  3. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151 번째 염기 C 또는 G이고 상기 1151 번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기(CASP9 유전자의 전사시작점으로부터 -712번째 염기)가 C 또는 T이고 상기 673번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 CASP7 유전자 또는 CASP9의 유전자의 다형성 마커의 증폭, CASP7 유전자 또는 CASP9의 유전자의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 다형성 마커를 증폭시킬 수 있는 제제는 프라이머인 것을 특징으로 하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 CASP7 또는 CASP9 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 CASP7 또는 CASP9 단백질에 특이적인 항체인 조성물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암인 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 조성물.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 키트.
  10. 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151 번째 염기 C 또는 G이고 상기 1151 번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서, 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기(CASP9 유전자의 전사시작점으로부터 -712번째 염기)가 C 또는 T이고 상기 673번째 염기를 포함하는 20-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 CASP7 또는 CASP9 유전자의 다형성 마커 중의 하나 이상을 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후의 예측용 마이크로어레이.
  11. (a) 검체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계, (b) 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151 번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기(CASP9 유전자의 전사시작점으로부터-712번째 염기)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 중의 어느 하나 이상을 증폭하는 단계, 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 폴리뉴클레오티드 중 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151번째 염기의 유전자형 또는 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기의 유전자형 중의 어느 하나 이상의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 폐암 발병 위험성 및 폐암 생존 예후를 예측하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 c) 단계에서 서열번호 1의 CASP7 유전자의 1151번째 염기의 유전자형이 GG일 경우에는 폐암 발병 위험성이 높거나 폐암 생존 예후가 나쁜 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 c) 단계에서 서열번호 2의 CASP9 유전자의 673번째 염기의 유전자형이 TT일 경우에는 폐암 발병 위험성이 높거나 폐암 생존 예후가 나쁜 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 c)단계의 유전자형 결정은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 폐암은 편평상피암, 소세포암, 선암, 대세포암 또는 비소세포암인 방법.
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